ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƯỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU N
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH
QUINOLON TRONG TÔM VÀ NƯỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
HÀ NỘI, 2015
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
ĐÀO THỊ VÂN KHÁNH
XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH QUINOLON
TRONG TÔM VÀ NƯỚC NUÔI TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC
KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ: 60440118
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS LÊ THỊ HỒNG HẢO
Trang 3MỤC LỤC
MỞ ĐẦU - 3
Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU - 5
1 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon - 5
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon - 5
1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính - 7
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon - 8
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước - 8
1.2.2 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trên thế giới - Error! Bookmark not defined 1.3 Các phương pháp xác định hàm lượng các chất nhóm quinolon - 10
1.3.1 Phương pháp miễn dịch enzym (ELISA) - 10
1.3.2 Phương pháp vi sinh vật - 11
1.3.3 Phương pháp hóa lý - 13
2.1 Mục tiêu nghiên cứu - Error! Bookmark not defined 2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu - 22
2.2.1 Đối tượng nghiên cứu - 22
2.2.2 Nội dung nghiên cứu - 22
2.3 Phương pháp nghiên cứu - Error! Bookmark not defined.
not defined.
2.3.2 Phương pháp lấy mẫu - Error! Bookmark not defined.
2.3.3 Xử lý số liệu - Error! Bookmark not defined.
2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng trong nghiên cứu - Error! Bookmark not defined.
Trang 42.4.1 Thiết bị và dụng cụ - Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.
3.1.1 Khảo sát bước sóng kích thích và phát xạ của các chất - 27
3.1.2 Khảo sát pha động - 29
3.1.3 Khảo sát khoảng tuyến tính của các chất chuẩn - 36
3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu phân tích Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Giai đoạn làm sạch mẫu sử dụng cột chiết pha rắn (SPE) - Error!
Bookmark not defined.
3.3 Thẩm định phương pháp - Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Độ đặc hiệu - Error! Bookmark not defined.
3.3.2 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Error! Bookmark
not defined.
3.3.3 Độ lặp lại, độ thu hồi - Error! Bookmark not defined.
3.4 Kết quả phân tích đánh giá dư lượng kháng sinh - Error! Bookmark not defined.
3.4.1 Thu thập mẫu tôm nuôi và nước nuôi tôm Error! Bookmark not defined.
3.4.2 Kết quả phân tích mẫu - Error! Bookmark not defined.
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN - Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO - 10
Trang 5
MỞ ĐẦU
Vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm của toàn xã hội, của mọi quốc gia trên toàn thế giới Thực phẩm không đảm bảo vệ sinh không những ảnh hưởng đến sức khỏe con người mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất lao động, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội
Trong những năm gần đây sự xuất hiện dư lượng kháng sinh trong thủy hải sản và thịt gia súc, gia cầm đã ít nhiều ảnh hưởng đến sức khỏe của người dân Tác hại của thực phẩm có tồn dư kháng sinh đối với sức khỏe con người đã được nhiều nghiên cứu chỉ ra như: tạo ra vi khuẩn kháng kháng sinh, gây dị ứng, gây quái thai, gây rối loạn nội tiết và gây ung thư ở người Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), Việt Nam nằm trong danh sách các nước có có tỷ lệ sử dụng kháng sinh cao nhất thế giới hiện nay, không chỉ sử dụng cho con người, các chất kháng sinh còn được sử dụng rộng rãi trong ngành chăn nuôi Quinolon (hay còn được gọi
là fluoroquinolone) là một họ kháng sinh có phổ tác dụng diệt khuẩn rộng, hiệu quả cao nên chúng được sử dụng rộng rãi không chỉ để chữa bệnh cho người mà còn được dùng để chữa bệnh cho gia cầm và thủy sản trong công nghiệp Hậu quả là giảm hiệu quả của các kháng sinh quinolon đối với các chủng vi khuẩn gây khó khăn và tốn kém trong điều trị cho người bệnh Theo thông báo của WHO năm
1999 có tới 11.000 người bị nhiễm khuẩn Campylobacter đã kháng quinolon do ăn
thịt gà có chứa quinolon (năm 1998 là 8.000 người)
Có nhiều phương pháp để xác định tồn dư kháng sinh nhóm quinolon như: phương pháp miễn dịch enzym (ELISA); phương pháp vi sinh vật (test vi sinh vật), phương pháp lý hóa Phương pháp lý hóa sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau như sắc
ký lỏng, điện hóa hòa tan, điện di mao quản, các phương pháp đều có độ chính xác,
Trang 6độ chọn lọc cao, phát hiện được một lượng nhỏ kháng sinh tồn dư trong thực phẩm Phương pháp được sử dụng nhiều nhất là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) sử dụng các loại detector như detector UV, detector huỳnh quang (FLD) và detector khối phổ (MS)
Việc ứng dụng phương pháp HPLC phân tích nhóm quinlon trong các mẫu môi trường và thực phẩm đã được làm nhiều trên thế giới nhưng ở Việt Nam sử dụng phương pháp HPLC với detector huỳnh quang vẫn còn hạn chế đặc biệt là tách
Xuất phát từ tình hình thực tế, trên cơ sở các nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước đã được công bố, với mục đích gia tăng số lượng chất xác định, sử dụng thiết
bị sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Xác định đồng thời một số kháng sinh nhóm quinolon trong tôm và nước
nuôi tôm bằng phương pháp sắc lỏng hiệu năng cao”
Trang 7Chương I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1 1 Tổng quan về kháng sinh nhóm quinolon
1.1.1 Cấu tạo của kháng sinh nhóm quinolon
Công thức cấu tạo chung của nhóm quinolon là hợp chất vòng thơm có chứa nitơ, vị trí thứ 4 có gắn nhóm keton, vị trí thứ 3 có gắn nhóm carboxylic Các dẫn xuất của quinolon gồm những hợp chất ở các vị trí 1, 2, 6, 8 được gắn thêm các nhóm thế Vị trí 1: có thể gắn thêm nhóm alkyl hoặc aryl; Vị trí 6: có thể gắn thêm
F; Vị trí 2, 6, 8 có thể gắn thêm một nguyên tử N [38, 39, 47, 52, 54]
Hình 1.1: Công thức cấu tạo chung của quinolon
Do có nhóm carboxylic ở vị trí số 3 nên các chất nhóm quinolon mang tính acid Một số quinolon có thêm nhóm amin khác nên có thêm tính base Chúng tan trong lipid và thấm được qua màng tế bào Có thể chia nhóm quinolon thành hai loại dựa trên pKa: acidic quinolon (AQ) và piperazinyl quinolon (PQ)
- Acidic quinolon: chỉ có một giá trị pKa trong khoảng 6,0 đến 6,9 Trong nước chúng tồn tại ở dạng trung hòa hoặc dạng anion Thường AQ gồm những quinolon thuộc thế hệ thứ nhất
khoảng 7,2–8,9 Trong nước chúng có thể tồn tại ở ba dạng khác nhau: dạng cation, dạng trung hòa và dạng anion; một số PQ là danofloxacin, difloxacin, norfloxacin, ofloxacin, benofloxacin, marbofloxacin, acid pipemidic
Trang 8Hình 1.2: Cân bằng acid - base của nhóm acidic quinolon
Hình 1.3: Cân bằng acid base của nhóm piperazinyl quinolon
pKa2:7,7
pKa2:8,2
Trang 96 Oxolinic acid pKa:6,9
1.1.2 Cơ chế tác dụng và độc tính
Kháng sinh nhóm này phân bố đồng đều cả trong dịch nội và ngoại bào, phân
bố hầu hết các cơ quan: phổi, gan, mật, xương, tiền liệt tuyến, tử cung, dịch não tủy và qua được hàng rào nhau thai Fluoroquinolon đào thải chủ yếu qua đường tiết niệu ở dạng còn nguyên hoạt chất và tái hấp thu thụ động ở thận [16, 52]
Cơ chế tác động của fluoroquinolon lên vi khuẩn là ức chế tổng hợp acid nucleic Sự nhân đôi DNA bắt đầu bằng phản ứng tách chuỗi DNA ra làm hai, mỗi bên là một khuôn để gắn nucleotid thích hợp theo nguyên tắc bổ sung Enzym DNA polymeras xúc tác sự tổng hợp các liên kết giữa các nucleotid; enzym DNA gyrase nối các DNA trong quá trình tổng hợp và tạo thành các vòng xoắn Các quinolon (nalidixic acid và các fluoroquinolon) ức chế mạnh sự tổng hợp DNA trong giai đoạn nhân đôi do ức chế enzym DNA gyrase Cơ chế tác động này hiệu quả trên cả vi khuẩn gram dương và gram âm Nhưng cũng có thể do cơ chế ức chế tổng hợp acid nucleic này mà kháng sinh nhóm fluoroquinolon được cho là có nguy cơ gây đột biến gen, gây sẩy thai khi sử dụng cho động vật mang thai do đó khuyến cáo là không nên sử dụng kháng sinh nhóm fluoroquinolon cho động vật mang thai, động vật sinh sản và làm giống Ngoài ra các nghiên cứu trên động vật còn non cho thấy các kháng sinh thuộc nhóm này gây hủy hoại các khớp sụn [34, 54] do đó các kháng sinh nhóm quinolon không được sử dụng trong điều trị bệnh cho trẻ em
1.1.3 Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon
Ngày 26/6/1990 Uỷ ban An toàn thực phẩm Châu Âu chính thức ban hành Quyết định 2377/1990[26] trong đó qui định mức giới hạn tối đa các chất kháng
Trang 10sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật trong đó giới hạn nhóm quinolon trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật bao gồm:
Bảng 1.2: Giới hạn cho phép kháng sinh nhóm quinolon theo EEC No.2377/1990
(*) Giới hạn cho phép trong cá 100ppb
quy định Danh mục các loại kháng sinh cấm sử dụng và hạn chế sử dụng [1], theo
khẩu vào thị trường Mỹ và Bắc Mỹ, ciproxacin và ofloxacin bị cấm sử dụng trong chăn nuôi thú y, các chất nằm trong danh mục hạn chế sử dụng bao gồm:
Bảng 1.3: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Thông tư 08/VBHN-BNNPTNT
Hiện nay, theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007
về quy định mức giới hạn ô nhiễm hóa học và vi sinh vật trong thực phẩm, Bộ Y tế cũng đã đưa ra mức giới hạn của 4 kháng sinh nhóm quinolon là danofloxacin, enrofloxacin, flumequine, sarafloxacin
Bảng 1.4: Giới hạn hàm lượng kháng sinh quinolon theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT
Trang 11Danofloxacin 0 - 20 50 (gan lợn); 100 (thịt)
1.2 Tình hình sử dụng và tồn dƣ kháng sinh nhóm quinolon
1.2.1 Tình hình sử dụng và tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong nước
Mặc dù các kháng sinh nhóm quinolon đã được các cơ quan chức năng quản
lý chặt nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm trong nước và ngay cả thực phẩm xuất khẩu vẫn bị phát hiện có chứa tồn dư loại kháng sinh này Việc tồn dư kháng sinh ở hàm lượng cao cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong thời gian dài với hàm lượng lớn đồng thời người chăn nuôi không đảm bảo thời gian cách ly hợp lý đối với vật nuôi trước khi thu hoạch
Nhiều nghiên cứu trong nước đã khảo sát tình hình sử dụng các loại kháng sinh trong chăn nuôi, hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy sự lạm dụng kháng sinh
là rất phổ biến và tồn dư trong thực phẩm (kể cả đối với những chất đã bị cấm sử dụng) vẫn chiếm tỷ lệ đáng kể [4, 5, 6, 8, 9] Người chăn nuôi sử dụng nó dưới nhiều hình thức khác nhau hoặc phối trộn trực tiếp vào trong thành phần của thức ăn hoặc đưa vào môi trường nuôi như một hình thức phòng bệnh Theo nghiên cứu của Takahiro Yamaguchi đối với các mẫu lợn, bò, gà, tôm và cá nuôi thu thập tại các tỉnh Thái Bình, Hà Nội, Khánh Hòa, TP HCM năm 2012-2013 của cho thấy có tới 7,7% số mẫu được kiểm nghiệm phát hiện nhiễm enrofloxacin (ERFX) với hàm lượng từ 12–77ppb điều này cho thấy mặc dù đã bị cấm nhưng bằng con đường nào
đó các kháng sinh này vẫn đi vào mẫu thực phẩm để đến với người tiêu dùng [57]
Theo báo cáo của chính phủ Úc năm 2008, thủy sản nhập khẩu của Việt Nam vào thị trường nước này được giám sát rất chặt chẽ và đã phát hiện những lô hàng nhiễm kháng sinh quinolon bao gồm ERFX và ciprofloxacin (CPFX) với mức nhiễm lần lượt là 8,5 – 35 và 2,0 – 33ppb [12]
Các nghiên cứu trên cho thấy thực trạng sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi
và tồn dư các chất này trong sản phẩm thực phẩm không có dấu hiệu cải thiện, theo báo cáo kết quả công tác quản lý chất lượng an toàn thực phẩm 9 tháng đầu năm
2015 của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn có tới 1,01% mẫu thủy sản nhiễm
Trang 12dư lượng hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng vượt ngưỡng cho phép và 7,6% mẫu thịt có dư lượng hóa chất, kháng sinh vượt ngưỡng
Đối với các mẫu môi trường, tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu đánh giá thực trạng tồn dư kháng sinh nhóm quinolon trong môi trường Theo nghiên cứu năm
2006 của TS Dương Thị Hồng Anh về phân tích đánh giá sự có mặt của các kháng sinh họ fluoroquionolon trong nước thải bệnh viện, đã phát hiện thấy hàm lượng kháng sinh ciproxacin và norfloxacin trong nước thải chưa xử lí và đã xử lí tại bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2014), Thông tư Ban hành Danh mục thuốc, hóa chất kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng, Hà Nội
2 Dương Hồng Anh, Phạm Ngọc Hà, Hoàng Thị Thương, Nguyễn Hoàng
Tùng(2006), “Phân tích đánh giá sự có mặt của kháng sinh họ quinolon
trong nước thải bệnh viện”, Đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội năm 2005
3 Dương Hồng Anh, Phạm Ngọc Hà (2014), “Xác định dư lượng kháng sinh
Floquinolone trong nước, bùn và tôm tại khu vực nuôi tôm quảng canh
Giao An, Giao Thủy, Nam Định”, Tạp chí Khoa học ĐHQG Hà Nội: Khoa học tự nhiên và công nghệ, 31(1), tr 1-7
4 Phạm Kim Đăng và cộng sự (2008), “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân
tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone trong tôm tại một số tỉnh ven biển
khu vực phía Bắc”, Tạp chí Khoa học và phát triển, VI (3), tr.261-267
5 Hồ Thị Thu Hà(2012), Nghiên cứu sự phân bố, tồn dư một số kháng sinh thường
dùng ở gà và sử dụng chế phẩm actisô làm tăng khả năng đào thải góp phần đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm, Luận án tiến sỹ, Đại học Nông
Nghiệp Hà Nội
6 Nguyễn Thị Thanh Nga (2011), Nghiên cứu quy trình xác định dư lượng
ciprofloxacin và enprofloxacin trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC-MS/MS, Luận văn thạc sỹ, Đại học KHTN, Hồ Chí Minh
Trang 137 Nguyễn Thị Thu Thủy (2009), Nghiên cứu xác định Ciprofloxacin (CIP) trong
một số dược phẩm bằng phương pháp điện hóa, Luận văn thạc sỹ, Đại học
KHTN Hà Nội
8 Dương Thị Toan, Nguyễn Văn Lưu (2015), “Tình hình sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trại chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc
Giang”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, 13(15), tr 717-722
9 Huỳnh Thị Tú, Nguyễn Thanh Phương, Frédéric Silvestre, Caroline Douny,
Châu Tài Tảo, Guy Maghuin-Rogister, Patrick Kestemont (2006), “Khảo sát tình hình sử dụng thuốc - hóa chất trong nuôi tôm và sự tồn lưu của
enrofloxacin và furazolidone trong tôm sú (Penaeus monodon), Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 4, tr 70-78
10 Trần Minh Phú, Đào Thị Hồng Sen, Đỗ Thị Thanh Hương, Trần Thị Thanh
Hiền (2008), “Xác định thời gian tồn lưu enrofloxacin trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)”, Tạp chí Khoa học, 2, pp.215-218
11 Nguyễn Văn Ri (2009), Giáo trình Các phương pháp tách, Khoa hóa học
Trường Đại học khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
TIẾNG ANH
12 Australian Quarantine and Inspection Service(2008), Update on the border
testing of imported seafood, Canberra City
amount of enrofloxacin by adsorptive cathodic stripping voltammetry using
copper(II) as an intermediate”, Alanta, 78(3), pp.942–948
14 Affo W, Mensah-Brown H, Awuku J F, Markwo A (2013), “Quantitative
Analysis of Ciprofloxacin Sodium ChloridePharmaceutical Infusions Using
Ultraviolet-visible Spectroscopy”, ARPN Journal of Science and Technology, 3(3), pp.217-225
15 Buket Er., Fatma Kaynak Onurdağ, Burak Demirhan, Selda özgen özgacar,
Aysel bayhan Ȫktem, Ufuk Abbasoğlu (2013), “Screening of quinolone
