Nghiên cứu quy trình tách chiết, phân tích ADN và tế bào phôi thai tự do trong máu ngoại vi mẹ để chẩn đoán trước sinh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Triệu Tiến Sang NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ

ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Triệu Tiến Sang

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT, PHÂN TÍCH ADN VÀ TẾ BÀO PHÔI THAI TỰ DO TRONG MÁU NGOẠI VI MẸ

ĐỂ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62420121

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Trần Văn Khoa

2 PGS.TS Đinh Đoàn Long

Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,

được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Trần Văn Khoa và

PGS.TS Đinh Đoàn Long

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Nghiên cứu sinh

Triệu Tiến Sang

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS

Trần Văn Khoa – Chủ nhiệm Bộ môn Sinh học và Di truyền y học – Học viện

Quân y, Trưởng phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế bào –Trung tâm nghiên

cứu Sinh Y dược – Học viện Quân y và PGS.TS Đinh Đoàn Long – Chủ nhiệm

Bộ môn Y dược học cơ sở , Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia

Hà Nội đã tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành luận

án tiến sĩ

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân – Chủ

nhiệm Bộ môn Di truyền học, các thầy cô giáo Bộ môn Di truyền học và Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội đã chỉ bảo tận tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận án

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Hoàng Văn Lương – Phó

giám đốc Học viện Quân y, Giám đốc Trung tâm Nghiên cứu Sinh y Dược –

HVQY; PGS.TS Nguyễn Duy Bắc, Phó Phòng Công nghệ Gen và Di truyền tế

bào và các đồng chí, đồng nghiệp tại Bộ môn Sinh học và Di truyền y học; cùng các đồng chí tại Phòng Công nghệ gen và Di truyền tế bào – Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học – Học viện Quân y đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Trung tâm Nghiên cứu gen và protein – Đại học Y Hà Nội, Phòng Xét nghiệm Di truyền – Bệnh Viện Từ Dũ và Trung tâm Nghiên cứu Sinh Y Dược – Học viện Quân y đã cung cấp mẫu phục vụ cho các nghiên cứu của luận án

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả những người thân, bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Nghiên cứu sinh Triệu Tiến Sang

CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa Tiếng Việt

ADN Deoxyribonucleic Acid Acid Deoxyribonucleic

AF Amniotic Fluid Dịch ối

AFP Alpha-fetoprotein Alpha-fetoprotein

AIHW Australian Institute of Health and

Welfare

Viện sức khỏe và phúc lợi Úc

ATP Adenosine Triphosphate Adenosine Triphosphate

Bp Base pairs Cặp bazơ

FISH Fluorescence in-situ hybridization Lai tại chỗ huỳnh quang

fNRBCs Fetal nucleated red blood cells Tế bào hồng cầu có nhân của

phôi thai

HCĐ Down syndrome Hội chứng Down

Kb Kilo base Kilo base

KSSG Khoảng sáng sau gáy

MACS Magnetic activated cell sorting Phân loại tế bào hoạt hóa từ tính

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi nhờ polymerase

PUBS Percutaneous umbilical cord

STR Short Tandem Repeat Lặp lại liên tiếp đoạn ngắn

Taq –

polymerase

Thermus aquaticus polymerase

TBE Tris - Boric – EDTA Tris - Boric – EDTA

TOP Termination of pregnancy Đình chỉ thai

UV Ultra Violet Tia cực tím

β hCG Beta_human chronic

gonadotropin

Beta_human chronic gonadotropin

2 Bảng 1.2 Các Kít sử dụng kỹ thuật NIPT ứng dụng tại Mỹ 34

3 Bảng 2.1 Thành phần hóa chất của bộ QIAamp ADN blood Mini

6 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen mồi ngoài và

mồi trong gen SRY và chu trình nhiệt nhân gen GAPDH

51

7 Bảng 2.5 Trình tự mồi và đầu dò của phản ứng định lượng huỳnh

quang gen DYS14 và GAPDH

52

8 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime-PCR 53

9 Bảng 2.7 Công thức và ứng dụng của các chất gắn trên bề mặt

hạt từ tính

54

10 Bảng 2.8 Các locus STR trên các NST 13, 18, 21 và NST X, Y 57

11 Bảng 2.9 Thành phần và thể tích của phản ứng QF-PCR 58

12 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt của phản ứng QF-PCR 58

13 Bảng 2.11 Các thành phần cho 1 mẫu điện di 59

14 Bảng 2.12 Chu trình nhiệt biến tính sản phẩm PCR cho điện di

mao quản

59

15 Bảng 2.13 Phân tích tỷ lệ các peak huỳnh quang STR 61

16 Bảng 2.14 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR

hoặc Realtime PCR

62

17 Bảng 3.1 Nồng độ ADN (ng/µl) của phương pháp tách bằng

nhiệt và phương pháp tách bằng bộ Kít Qiagen

63

18 Bảng 3.2 Kết quả số bản copy gen DYS14 (A: copy/ml) và nồng

độ gen DYS14/GAPDH (B: %) ở các tuần 6 đến 12 của thai kỳ

của các trường hợp thai nam

71

19 Bảng 3.3 Kết quả số bản copy gen GAPDH (A: copy/ml) ở các

tuần 6 đến 12 của thai kỳ của các trường hợp thai nữ

72

20 Bảng 3.4 So sánh kết quả của kỹ thuật Nested PCR, Realtime 75

PCR với siêu âm ở tuần thứ 16/ sau sinh (A)

21 Bảng 3.5 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và

Realtime-PCR ở 6 tuần tuổi thai

76

22 Bảng 3.6 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và

Realtime-PCR ở 7 tuần tuổi thai

76

23 Bảng 3.7 Độ nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật Nested PCR và

Realtime-PCR ở tuổi thai >8 tuần

77

24 Bảng 3.8 Độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 kỹ thuật Realtime PCR

và Nested PCR ở các tuần tuổi thai

77

25 Bảng 3.9 Kết quả nhân gen SRY (trước sinh: A) và kiểm chứng

sau sinh (B) của 189 mẫu nghiên cứu tuổi thai từ 7+6 đến 9+2

85

26 Bảng 3.10 Kết quả nồng độ ADN biến thiên sau sinh 87

27 Bàng 3.11 Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ

mang thai nam bình thường

98

28 Bảng 3.12 Nồng độ ADN phôi thai tự do trong huyết tương mẹ

mang thai nam bất thường

99

29 Bảng 3.13 Kết quả sàng lọc bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 107

30 Bảng 3.14 Kết quả sàng lọc bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 110

31 Bảng 3.15 Chu trình nhiệt của phản ứng nhân gen RhD 111

32 Bảng 3.16 Kết quả chẩn đoán nhóm máu Rh của thai nhi ở tuần

thứ 8

112

33 Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm trên các tế bào phôi thai tự do 116

DANH MỤC CÁC HÌNH

STT TRANG

1 Hình1.1: Các bước chình của kỹ thuật FISH 24

2 Hình 1.2: Nguyên tắc của phản ứng Nested PCR (PCR lồng) 25

3 Hình 1.3 Phương pháp Real-time PCR với mẫu dò TaqMan 26

4 Hình 1.4 Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong

Realtime-PCR

27

5 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 48

6 Hình 2.2 Trình tự đoạn gen DYS14 53

7 Hình 2.3 Trình tự đoạn gen GAPDH 53

8 Hình 2.4 Các chất gắn trên bề mặt ha ̣t từ tính 54

9 Hình 2.5 Phân tích kết quả QF-PCR bình thường 59

10 Hình 2.6 Phân tích tính kết quả tỷ lệ giữa các alen 60

11 Hình 2.7 Ảnh phân tích kết quả QF-PCR locus bị Trisomy 61

12 Hình 3.1 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu 65

13 Hình 3.2 Ảnh điện di của gen SRY và GAPDH của các mẫu nghiên cứu

15 Hình 3.4 Phân tích đường chuẩn của gen DYS14 và gen GAPDH 70

16 Hình 3.5 Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 6 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

mẫu 321

19 Hình 3.8 Ảnh điện di các mẫu ở tuổi thai 8 tuần tuổi từ mẫu 269 đến

mẫu 321

80

24 Hình 3.9 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 269 81

25 Hình 3.10 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 277 82

26 Hình 3.11 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 296 83

27 Hình 3.12 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN tự do của trường hợp 551 84

28 Hình 3.13 Biểu đồ biến thiên nồng độ ADN phôi thai tự do sau khi sinh 88

29 Hình 3.14 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF64

(tương ứng mẫu nghiên cứu BT05) nam bình thường

90

30 Hình 3.15 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF 61

(tương ứng với mẫu DT 02) nam mang hội chứng Down

92

31 Hình 3.16 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR điện di mao

quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT02 với các cặp mồi extra

Marker 21

93

32 Hình 3.17 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu QF56

(tương ứng với mẫu DT03) mang hội chứng Klinefelter

94

33 Hình 3.18 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT03

(QF56) với các mồi extra marker trên locus X, Y

95

34 Hình 3.19 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu DT08

mang hội chứng Edward

96

35 Hình 3.20 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 831 101

36 Hình 3.21 Ảnh nhuộm FISH tế bào phôi thai của mẫu số 837 102

37 Hình 3.22 Ảnh điện di mao quản của sản phẩm QF-PCR của mẫu

nghiên cứu 964 với các locus trên NST giới tính X, Y

104

38

39

40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT

[1] Trịnh Văn Bảo (2004), Dị dạng bẩm sinh, NXB Y học

[2] Trịnh Văn Bảo (2002-2007), “Tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh

tại bộ môn y sinh học- di truyền đại học y Hà Nội”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.114-120 [3] Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương (2010), Di truyền y học, Nhà xuất bản

giáo dục

[4] Trịnh Văn Bảo (2006), “Tư vấn di truyền-một biện pháp có hiệu quả để phòng

chữa bệnh tật di truyền”, Tạp chí Nghiên cứu y học, 40(1), tr.72-75

[5] Nguyễn Huy Cận, Bùi Thị Tía (1967), “Tật bẩm sinh ở sơ sinh tại Bệnh viện C từ

1963 đến 1966”, Nội san Sản phụ khoa, 2, tr.6 -8

[6] Huỳnh Thị Kim Chi (1994), Tình hình DTBS tỉnh Sông Bé và vai trò của các yếu

tố nguy cơ gây DTBS tại địa phương, Luận văn tốt nghiệp BSCK cấp II, Trường

Đại học Y khoa Hà Nội

[7] Nguyễn Trần Chiến, Trần Văn Khoa (2011), Di truyền y học, NXB Quân đội nhân

dân

[8] Đào Thị Chút (1994), Nhận xét 30 trường hợp DTBS tại bệnh viện phụ sản Hải phòng, Luận văn tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa cấp II Trường Đại học Y khoa Hà

Nội

[9] Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả chọc hút nước

ối trong chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện phụ sản trung ương”, Nội san Sản Phụ khoa, số đặc biệt, tr.348-356

[10] Trần Danh Cường (2005), “Một số nhận xét về kết quả siêu âm hình thái thai nhi

trong chẩn đoán trước sinh tại bệnh viện Phụ sản Trung ương”, Nội san Sản Phụ Khoa, số đặc biệt, tr.336-347

[11] Trần Danh Cường (2007), “Hình ảnh siêu âm ở thai nhi bất thường nhiễm sắc

thể”, Báo cáo toàn văn, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.156-167

[12] Phạm Gia Đức (1971), “Tình hình DTBS qua 12 năm 1958 đến 1970 tại Viện bảo

vệ bà mẹ và trẻ sơ sinh và phương huớng nghiên cứu hiện nay” Y học Việt Nam,

1, tr.21-29

[13] Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), “Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh Thalassaemia

tại bệnh viện Từ Dũ”, Hội nghị quốc tế tư vấn di truyền- sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Hà Nội, tr.214-218

[14] Phan Thị Hoan (2002), “Phân tích một số yếu tố nguy cơ sinh con DTBS ở một

số nhóm dân cơ miền Bắc Việt Nam”, Tạp chí Di truyền học và ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm trường đại học Y Hà nội,

tr.25-34

[15] Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Việt Hùng, Trịnh Văn Bảo, Trần Thị Thanh Hương

(2004), “Chẩn đoán xác định một số dị tật thai nhi trong phân tích nhiễm sắc thể tế

bào ối nuôi cấy”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 28(2), tr.5-12

[16] Mai Thu Liên, Phùng Như Toàn, Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007), Kết quả nuôi

cấy gai nhau tại Bệnh viện Từ Dũ, Báo cáo hội nghị quốc tế tư vấn di truyền sàng lọc và chẩn đoán trước sinh, Đại học Y Hà nội

[17] Nguyễn Thị Phượng (2002), “DTBS và bệnh di truyền tại Viện

nhi quốc gia Hà Nội”, Tạp chí di truyền học và ứng dụng, chuyên san di truyền - y học, số đặc biệt chào mừng 100 năm Trường Đại học Y Hà Nội,

tr.16-24

[18] Ngô Gia Thạch, Trịnh Văn Bảo, Dương Tử Kỳ, Thái Phương Liên

(1986), “Các DTBS qua điều tra 6661 trẻ sơ sinh” Thông tin di truyền y học, 1, tr.20-25

TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI

[19] Abudu O.O., Awonuga A.O (1989), “Fetal macrosomia and pregnancy outcome

in Lagos”, Int J Gynaecol Obstet., 28(3), pp 257-62

[20] Adinolfi M (2001), “Prenatal detection of chromosomal disorders by QF-PCR”,

Lancet, 358, pp 1030-1031

[21] Akolekar, Kirstin F., Ramesh K (2011), “Fetal RHD Genotyping in Maternal

Plasma at 11–13 Weeks of Gestation”, Fetal Diagn Ther., 29, pp 301–306

[22] Alen Chan K.C (2004), “Size Distribution of maternal and Fetal DNA in

maternal Plasma”, Clin Chimi., 50, pp 88-92

[23] Andonova S., Dimitrova V., Boneva I., Kremensky I (2008), “A case of a

bloodstained amniotic fluid sample from a pregnant woman with Down

syndrome analyzed by QF-PCR after low-speed centrifugation”, Prenat Diagn.,

28(5), pp 457-9

[24] Aykut A., Onay H., Sagol S., Gunduz C., Ozkinay F., Cogulu O (2013),

“Determination of fetal rhesus d status by maternal plasma DNA analysis”,

Balkan J Med Genet., 16(2), pp 33-8

[25] Babochkina, Mergenthaler S., Dinges T.M., Holzgreve W., and Hahn S (2005),

“Direct detection of fetal cells in maternal blood: a reappraisal using a combination of two different Y chromosome-specific FISH probes and a single X

chromosome-specific probe”, Arch Gynecol Obstet., pp 1-4

[26] Bayrak-Toydemir P., Pergament E., Fiddler M (2003), “Are fetal cells in

maternal plasma Really there? We think they are”, J Hum Genet., 48, pp

665-667

[27] Benn P (2002), “Advance in prenatal screening for Down syndrome: General

principles and second trimester testing”, Clin Chimi Acta., 323, pp.1-16

[28] Bianchi D., Flint A., Pizzimenti M., Knoll J., Latt S (1990), “Isolation of fetal

DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood”, Proc Natl Acad Sci USA., 87, pp 3279-3283

[29] Bianchi D., Mahr A., Zickwolf G., Houseal T., Flint A., Klinger K (1992),

“Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral

blood”, Hum Genet., 90, pp 368-370

[30] Bianchi D., Simpson J., Jackson L (2002), “Fetal gender and aneuploidy

detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data National

Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study”, Prenat Diagn., 22, pp 609-615

[31] Bianchi D., Williams J., Sullivan L (1997), “PCR quantitation of fetal cells in

maternal blood in normal and aneuploid pregnancies”, Am J Hum Genet., 61,

pp 822-829

[32] Bianchi D., Zickwolf, Gretchen K., Weil, Gary J (1996), “Male fetal progenitor

cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum”, Proc Natl Acad Sci USA, 93, pp 705-708

[33] Bischoff F (1998), “Prenatal diagnosis of fetal cell isolated from maternal blood:

Five-color fluorecent in situ hybridization analysis on flow-sorter cells for

chromosomes X, Y, 13, 18 and 21”, Am J Obstet Gynecol., 170(1), pp

203-209

[34] Bombard, Akolekar, Farkas, (2011), “Fetal RHD genotype detection from

circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma in non-sensitized RhD

negative women”, Prenat Diagn., 31, pp 802–808

[35] Boyd P., Chamberlain P., Hicks N (1998), “6-year experience of prenatal

diagnosis in an unselected population in Oxford, UK”, Lancet, 352, pp

1577-1581

[36] Buchanan A., Sachs A., Toler T., Tsipis J (2014), “NIPT: current utilization and