Cải biến gen mã hóa enzyme phytase từ nấm mốc aspergillus niger nhằm tăng khả năng hồi tính của phytase sau khi bị biến tính ở nhiệt độ cao

--- Đặng Thị Kim Anh CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA

-

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Đặng Thị Kim Anh

CẢI BIẾN GEN MÃ HÓA ENZYME PHYTASE TỪ NẤM MỐC

Aspergillus niger NHẰM TĂNG KHẢ NĂNG HỒI TÍNH CỦA PHYTASE SAU KHI BỊ BIẾN TÍNH Ở NHIỆT ĐỘ CAO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS Vũ Nguyên Thành

TS Trần Văn Tuấn

Hà Nội – Năm 2015

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Vũ Nguyên Thành, Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này Thầy cũng chính là tấm gương đầy nhiệt huyết, say mê nghiên cứu khoa học giúp tôi tiếp cận, trau dồi kiến thức mới từ đó có thể định hướng, giải quyết các vấn đề trong quá trình nghiên cứu

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Trần Văn Tuấn cùng các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi cũng nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh Tôi xin chân thành cảm ơn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị nghiên cứu viên và các bạn sinh viên làm việc tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc tại Trung tâm

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, khích

lệ động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 25 tháng 06 năm 2015

Học viên

Đặng Thị Kim Anh

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 21 CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

1.2.1 Phân loại enzyme phytase Error! Bookmark not defined 1.2.2 Nguồn phytase Error! Bookmark not defined.

1.3.1 Trong chăn nuôi Error! Bookmark not defined 1.3.2 Trong công nghệ thực phẩm Error! Bookmark not defined 1.3.3 Trong công nghiệp giấy Error! Bookmark not defined 1.3.4 Trong cải tạo đất Error! Bookmark not defined 1.3.5 Trong tổng hợp các dẫn xuất myo-inositol phosphateError! Bookmark not

defined.

VÀ A FUMIGATUS E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED CHƯƠNG 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ERROR!

BOOKMARK NOT DEFINED

2.1.NGUYÊNLIỆU E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

2.1.1 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.1.2 Vi sinh vật Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.1.4 Môi trường nuôi cấy Error! Bookmark not defined.

2.2.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

2.2.1 Phương pháp Mega-PCR Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel agarose bằng bộ kit GenJET TM Gel

Extraction Error! Bookmark not defined 2.2.3 Ghép nối plasmid Error! Bookmark not defined.

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

2.2.4 Biến nạp sản phẩm ghép nối plasmid vào E coli bằng sốc nhiệt Error!

Bookmark not defined.

2.2.5 Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kit GenJET TM Plasmid

Miniprep Error! Bookmark not defined.

2.2.6 Chuyển gen vào tế bào nấm men Pichia pastoris bằng phương pháp biến

nạp xung điện Error! Bookmark not defined 2.2.7 Tách chiết DNA tổng số của Pichia pastorisError! Bookmark not defined 2.2.8 Phương pháp nuôi biểu hiện nấm men Pichia pastoris Error! Bookmark

not defined.

2.2.9 Phương pháp điện di protein SDS - PAGE Error! Bookmark not defined 2.2.10 Xác định hoạt tính phytase Error! Bookmark not defined 2.2.11 Lọc enzyme bằng thiết bị Viva Flow 200 Error! Bookmark not defined 2.2.12 Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký tương tác kỵ nước Error!

Bookmark not defined.

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬNERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

3.1.CẢIBIẾNTRÌNHTỰGENMÃHÓAPHYTASE E RROR ! B OOKMARK NOT

3.1.1 Phân tích đặc tính các gen phyA đã được tách dòng tại Viện Công nghiệp

Thực phẩm liên quan tới tính bền nhiệt Error! Bookmark not defined 3.1.2 Tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin bằng Mega-PCRError! Bookmark

not defined.

3.1.3 Tạo plamid chứa gen phyA-P12 mang đột biến điểmError! Bookmark not

defined.

3.2.CHUYỂNGENPHYAVÀOTẾBÀONẤMMENPICHIA PASTORISERROR !

3.2.1 Chuyển gen vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp biến nạp

xung điện Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kiểm tra gen mã hóa phytase trong genome của Pichia pastoris Error!

Bookmark not defined.

3.2.3 Sàng lọc các thể biến nạp sinh phytase tái tổ hợp Error! Bookmark not

defined.

3.3.THUHỒIVÀTINHSẠCHENZYMEPHYTASETÁITỔHỢP E RROR !

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

3.4.XÁCĐỊNHCÁCĐẶCTÍNHCỦAENZYMEPHYTASETÁITỔHỢPSAU KHICẢIBIẾNGEN E RROR ! B OOKMARK NOT DEFINED

3.4.1 Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp Error! Bookmark not defined 3.4.2 Kiểm tra độ bền với các dải pH của phytase tái tổ hợp Error! Bookmark

not defined.

3.4.3 Xác định nhiệt độ tối ưu của phytase tái tổ hợp Error! Bookmark not

defined.

3.4.4 Kiểm tra khả năng hồi tính của phytase tái tổ hợp sau khi bị biến tính ở

nhiệt độ cao Error! Bookmark not defined.

KẾT LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED KIẾN NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 PHỤ LỤC ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BMGY Buffered Glycerol Complex Medium

BMMY Buffered Methanol Complex Medium

cDNA complementary Deoxyribonucleic acid

FTU Đơn vị hoạt tính phytase

HIV Human Immunodeficiency Virus

NRRL

Northern Regional Research Laboratory (hiện là National Center for Agricultural Utilization Research)

(Bảo tàng giống Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ)

PCR Polymerase Chain Reaction

rpm Revolutions per minute

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TEMED Tetramethylethylenediamine

YPD Yeast Extract-Peptone-Dextrose

YPDS Yeast Extract-Peptone-Dextrose-Sorbitol

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 19 Bảng 2.2 Danh sách các chủng phục vụ trong nghiên cứu tách dòng gen mã hóa

phyA 20

Bảng 2.3 Thành phần gel chạy điện di protein 27 Bảng 2.4 Tương quan giữa hàm lượng phospho vô cơ và OD700nm 28

Bảng 3.1 Hoạt tính phytase tái tổ hợp của các thể biến nạp nuôi biểu hiện trên vi

đĩa 24 giếng 41

Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi enzyme phytase tái tổ hợp bằng phương pháp lọc luân

hồi Viva Flow 200 với kích thước màng 5 kDa 42

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của myo-inositol - 1, 2, 3, 4, 5, 6 - hexakis dihydrogen

phosphate (axit phytic) 3

Hình 1.2 Cấu trúc protein của 4 nhóm enzyme phytase 5

Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của enzyme phytase từ Aspergillus fumigatus 14

Hình 1.4 Các cấu trúc đóng vai trò trong khả năng hồi tính của phytase

A fumigatus 16

Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc của vector pPICZαA, B, C 18

Hình 2.2 Phương pháp Mega-PCR cơ bản 22

Hình 3.1 Mô tả thí nghiệm tạo đột biến điểm thay thế 4 axit amin trên gen phyA 31

Hình 3.2 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 1 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 32

Hình 3.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR, Mega – PCR 2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 33

Hình 3.4 Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối gen phyA mang 4 đột biến điểm vào vector pPICZαA 34

Hình 3.5 Điện di kiểm tra sản phẩm cắt giới hạn trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 35

Hình 3.6 Kết quả phân tích trình tự 5 plasmid pPICZαA/phyA/AAS1 - 5 sau khi tạo đột biến điểm bằng phần mềm Bioedit 7.2.5 36

Hình 3.7 Trình tự gen mã hóa phyA bền nhiệt từ Aspergillus niger CNTP 5131 và vị trí liên kết trong pPICZαA của chủng tái tổ hợp Pichia pastoris CNTP 9057 37

Hình 3.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn bằng MssI trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 39

Hình 3.9 Kết quả biến nạp vector pPICZαA/phyA/P12 và pPICZαA/phyA/AAS5 vào tế bào Pichia pastoris X33 bằng phương pháp xung điện 39

Hình 3.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi T-EcoRI-F/ phyA-Stop-XbaI-R2 trên gel agarose 1% trong đệm TAE ×0.5 40

Hình 3.11 Kết quả điện di phytase tái tổ hợp trên gel SDS – PAGE 12% 43

Hình 3.12 Xác định pH tối ưu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin

45

Hình 3.13 Đánh giá độ bền pH của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit amin 46

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

Hình 3.14 Xác định nhiệt độ tối ƣu của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin 47

Hình 3.15 Đánh giá độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp sau khi thay thế 4 axit

amin 48

K21-Sinh học thực nghiệm Đặng Thị Kim Anh

MỞ ĐẦU

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng phospho dự trữ chủ yếu

của thực vật Axit phytic có thể chiếm 65 – 80% lượng phospho trong các loại ngũ cốc, hạt các cây họ đậu và họ cải Ngoài chức năng dự trữ phospho, axit phytic còn liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khoáng như Ca, Mg, Fe, Zn Axit phytic có tính chất kháng tiêu hóa do khả năng liên kết với các protein, enzyme trong dịch tiêu hóa của động vật

Enzyme phytase (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate phospho-hydrolase) có vai trò quan trọng trong chăn nuôi Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân axit phytic thành những gốc phospho đơn vô cơ và các dẫn xuất đơn giản của

myo-inositol Do vậy, khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase không chỉ có tác

dụng làm tăng khả năng hấp thu phospho, các nguyên tố khoáng mà còn cải thiện khả năng tiêu hóa các hợp chất khác, đồng thời làm giảm lượng phospho thải ra ngoài, góp phần bảo vệ môi trường

Phytase thương phẩm hiện nay được sản xuất chủ yếu dựa trên nguồn gen từ

nấm mốc Aspergillus niger Phytase từ A niger có một số ưu điểm như hoạt động ở

pH thấp, phù hợp với môi trường axit của dịch dạ dày, có tính đặc hiệu cơ chất với

phytate cao, và bền với tác động của pepsin Phytase từ A niger có nhược điểm là

kém bền nhiệt Trong công đoạn ép viên, thức ăn chăn nuôi thường được gia nhiệt

tới 70-80°C để diệt Salmonella Chính vì vậy, enzyme bổ sung vào thức ăn chăn

nuôi phải đáp ứng yêu cầu về độ bền nhiệt

Để đáp ứng yêu cầu kỹ thuật ngày càng cao, enzyme công nghiệp thường được cải biến theo hướng thay đổi cấu trúc nội tại Một số nghiên cứu cấu trúc của

phytase bền nhiệt từ A fumigatus cho thấy liên kết hydro và tương tác ion trong cấu

trúc không gian có vai trò đảm bảo khả năng “đàn hồi” nhiệt của enzyme Phytase

của A niger không có những liên kết này nên dễ dàng bị bất hoạt và không có khả

năng hồi tính Việc cải biến trình tự axit amin của phytase có thể gia tăng tính “đàn hồi” nhiệt của enzyme

Một trong những hướng nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm là khai thác nguồn gen thiên nhiên Việt Nam nhằm tạo enzyme tái tổ hợp phục vụ ứng dụng trong chăn nuôi Với phytase,

đã có 24 gen từ các loài khác nhau thuộc chi Aspergillus được tách dòng và nghiên

K21-Sinh học thực nghiệm 22 Đặng Thị Kim Anh

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt

1 Nguyễn Thùy Châu, (2009), “Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để

bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp”, Báo cáo

dự án khoa học kỹ thuật-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ

điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch

2 Vũ Duy Giảng, (2004), “Enzyme thức ăn”, Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 3, tr 11-13

3 Đỗ Thị Ngọc Huyền, (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và

Công nghệ Việt Nam

4 Đỗ Hữu Phương, (2004), “Vai trò của enzyme trong chăn nuôi” Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, 1, tr 25-26

5 Nguyễn Văn Viết, (2008), Nghiên cứu biểu hiện gene phyC có nguồn gốc từ Bacillus subtilis trên E coli BL21 (DE3) và bước đầu ứng dụng enzyme tái tổ hợp cho chăn nuôi, Luận văn thạc sỹ khoa học sinh học, Trường đại học Sư

phạm Hà nội

6 Ngô Thanh Xuân, Mai Thị Hằng, Nguyễn Phương Linh, Đinh Thị Mỹ Hằng,

Vũ Nguyên Thành, (2012), “Phân tích trình tự gene (phyA) mã hóa phytase

thành thục từ một số chủng Aspergillus niger”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,

10(1), tr 115-122

Tiếng anh

7 Anderson R J., (1914), “A contribution to the chemistry of phytin”, J Biol Chem., 17, pp 171 –190

8 Anno T., Nakanishi K., Matsuno R., Kamikubo T., (1985), “Enzymatic

elimination of phytate in soybean milk”, J Japan Soc Food Sci Techno.l, 32,

pp 174-180

9 Baruah K., Pal A K., Sahu N P., Jain K K., Mukherjee S C., Debnath D., (2005), “Dietary protein level, microbial phytase, citric acid and their

K21-Sinh học thực nghiệm 23 Đặng Thị Kim Anh

interactions on bone mineralization of Labeo rohita (Hamilton) juveniles”, Aquacult Res., 2005, 36, pp 803–812

10 Baruah K., Sahu N P., Pal A K., Debnath D., Yengkokpam S., Mukherjee S C., (2007), “Interactions of dietary microbial phytase, citric acid and crude

protein level on mineral utilization by Rohu, Labeo rohita (Hamilton), juveniles”, J W Aquacult Soc., 38, pp 238–249

11 Billington D C., (1993), “The Inositol Phosphates Chemical Synthesis and

Biological Significance”, Verlag Chemie Weinheim., 26, pp 38-42

12 Cheng C., Lim B L., Turner B L., Richardson A E., Mullaney E J., (2005),

“Beta-propeller phytases in the aquatic environment: characterization of a

novel phytase from Shewanella oneidensis MR-1 In Inositol Phosphates in the

Soil-Plant-Animal System: Linking Agriculture and Environment”

Proceedings of the Bouyoucos Conference to Address the Biogeochemical Interaction of Inositol Phosphates in the Environment; USA, pp 55–56

13 Copper J R., Gowing H S., (1983), “Mammalian small intestine phytase”, Br

J Nutr., 50, pp 673-678

14 Correa R L T., Queiroz V M., Araujo F E., (2014), “Cloning, recombinant

expression and characterization of a new phytase from Penicillium chrysogenum”, Microbiol Res., pp 201-213

15 Craxton A., Caffrey J J., Burkhart W., Safrany S T., Shears S B., (1997)

“Molecular cloning and expression of a rat hepatic multiple inositol

polyphosphate phosphatase”, Biochem J., 328, pp 75-81

16 Dalal R C., (1978), “Soil organic phosphorus”, Adv Agronom., 29, pp 83–

117

17 Davies N T., Vahoung G V and Kritchevsky D., (1982), “Effects of phytic

acid on mineral availability”, In Dietary Fiber in Health and Disease, Eds

Plenum Press, New York, pp 125-138

18 Dawei F., Huoquing H., Huiying L., Yaru W., Peilong Y., Kun M., (2008), “A

highly pH-stable phytase from Yersinia kristeensenii: Cloning, expression, and characterization”, Enz Microbiol Tech., 42, pp 499-505