VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VNVIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 3.1HĐ số 04/HĐ-VAST.TB ngày 04 tháng 8 năm 2014 Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH, ĐÁNH GI
Trang 1VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 3.1(HĐ số 04/HĐ-VAST.TB ngày 04 tháng 8 năm 2014)
Tên chuyên đề:
NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH, ĐÁNH GIÁ CÁC YẾU TỐ SINH THÁI ẢNH HƯỞNG TỚI HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG CỦ BÌNH VÔI
TRỒNG Ở VƯỜN PILOT
Thuộc đề tài: “Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái Bình”
Mã số: VAST.NĐP.07/14-15
Người báo cáo: TS Nguyễn Văn Dư
Trang 2VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ(HĐ số 04/HĐ-VAST.TB ngày 04 tháng 8 năm 2014)
Tên chuyên đề:
NGHIÊN CỨU, PHÂN TÍCH, ĐÁNH GIÁ CÁC YẾU TỐ SINH THÁI ẢNH HƯỞNG TỚI HÀM LƯỢNG ROTUNDIN TRONG CỦ BÌNH VÔI
TRỒNG Ở VƯỜN PILOT
Thuộc đề tài: “Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái Bình”
Trang 3MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2
1.1 Tổng quan về cây Bình vôi 2
1.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Bình vôi (Stephania spp.) 2
1.1.2 Phân bố, kỹ thuật trồng Bình vôi và chế biến 2
1.2 Các yếu tố sinh thái ảnh hưởng tới sinh trưởng của thực vật 3
1.2.1 Ánh sáng 3
1.2.2 Nhiệt độ 3
1.2.3 Nước và độ ẩm 4
1.2.4 Không khí-Gió 4
1.2.5 Các chất khí và pH 5
CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7
2.1 Mục tiêu nghiên cứu 7
2.2 Nội dung nghiên cứu 7
2.3 Phương pháp nghiên cứu 7
2.3.1 Thu thập mẫu vât: 7
2.3.2 Phương pháp phân tích hóa: 7
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 10
3.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Thái Bình 10
3.2 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Hòa Bình 10
3.3 Kết quả phân tích hàm lượng Rotundin trong củ Bình vôi 12
3.3.1 Hàm lượng rotundin trong củ Bình vôi trồng tại vườn thuốc công ty Dược Khải Hòa (Thái Bình) 12
3.3.2 Hàm lượng rotundin trong củ Bình vôi trồng tại vườn Bảo tồn cây thuốc thuộc công ty Bio-Farm (Hòa Bình): 13
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 16
4.1 Kết luận 16
4.2 Kiến nghị 16
TÀI LIỆU THAM KHẢO 17
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Bình vôi có tên khoa học là Stephania spp., họ Tiết dê
(Menispermaceae), là một cây dược liệu được sử dụng phổ biến trong y học cổtruyền Củ Bình vôi được thái lát mỏng phơi khô, sắc uống hoặc tinh chế bột,ngâm rượu uống hoặc chế dạng chè thuốc với liều 3-6 g/ngày để chữa mất ngủ,
ho hen, kiết lỵ, đau bụng Ngoài ra Bình vôi còn được dùng để chữa đau dạ dày,đau răng, viêm họng, mụn nhọt, sốt rét, phong thấp, tê đau, phù thận, v.v Cónhiều tác dụng như vậy do củ cây Bình vôi có các alkaloid là L-tetrahydropalmatin (rotundin), stepharin, roemerin, cycleanin, có dược tính cao.Trong đó quan trọng nhất là rotundin Tuy nhiên, người ta thấy hàm lượngrotundin thì khác nhau ở từng loài, và ngay trong một loài nhưng củ rotundin thu
ở những vùng khác nhau cũng có hàm lượng rotundin khác nhau
Các mẫu Bình vôi ngoài tự nhiên nhóm nghiên cứu thu thập được và cácmẫu Bình vôi trồng ở các điều kiện sinh thái khác nhau đều cho những giá trị vềhàm lượng totundin khác nhau Câu hỏi nghiên cứu khoa học ở đây là có mốiquan hệ nào giữa các điều kiện sinh thái và hàm lượng rotundin
Trong chuyên đề này, chúng tôi bàn luận tới những yếu tố sinh thái như ánhsáng, thổ nhưỡng, và nhiệt độ ảnh hưởng như thế nào tới hàm lượng rotundincủa loài Bình vôi được trông ở điều kiện đồng bằng và trồng ở điều kiện miềnnúi dưới chân núi đá vôi
Trang 5CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về cây Bình vôi
1.1.1 Đặc điểm hình thái của cây Bình vôi (Stephania spp.)
Cây thảo leo bằng thân quấn, sống lâu năm Thân nhẵn, thường có màuxanh, phần gốc hóa gỗ Rễ phình to thành củ có thể rất to ( nặng trên 20kg ) vỏngoài xù xì màu nâu, nâu đen, hình dáng thay đổi tùy theo nơi củ phát triển Láhình khiên, mọc cách, cuống lá dài, dính vào phiến lá khoảng 1/3, phiến lá hìnhtim hoặc gần như tròn có cạnh hoặc tam giác tròn, mép lá nguyên hoặc hơi lượnsong, hai mặt nhẵn, gân lá xuất phát từ chổ đính của cuống lá, nổi rõ ở mặt dướilá.Cụm hoa hình xim tán mọc ở kẽ lá hoặc ở những cành già đã rụng lá; hoa đựcvà hoa cái khác gốc; hoa đực có 6 lá đài xếp thành hai vòng, 3 cánh hoa màuvàng cam; bộ nhị hàn liền thành một tục với 6 bao phấn màu vàng nhạt xếpthành vòng tròn Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang quay ra xung quanh.Hạt phấn nhỏ màu vàng; hoa cái có một lá đài; hai cánh hoa, bầu hình trứng.Quả hạch hình cầu hơi dẹt, khi chín có màu đỏ hoặc da cam, hạt cứng hình móngngựa, hình trứng hoặc hình gần tròn tùy theo loài Mùa hoa: tháng 2-6; mùa quảvào tháng 7-10
1.1.2 Phân bố, kỹ thuật trồng Bình vôi và chế biến.
Ở Việt Nam cả 3 miền Bắc Trung Nam đều có Bình vôi Nhưng phổ biếnnhất ở các vùng núi đá vôi như Tuyên Quang, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ,Lạng Sơn, Quảng Ninh, Thanh Hóa, Lâm Đồng, Vũng Tàu, Bà Rịa Riêng loài
Stephania pierei Diels tập trung chủ yếu ở các tỉnh ven biển Bình Định, Phú
Yên, Ninh Thuận Trên thế giới, Bình vôi phân bố ở nhiều nước như Ấn Độ,Trung Quốc, Lào, Căm Pu Chia, Thái Lan và các nước Đông Nam châu Á, …Cây Bình vôi có nơi sống tương đối đa dạng nhưng tập trung ở vùng núiđặc biệt là địa hình núi đá vôi Trong tự nhiên, lúc cây còn bé thích sống dướitán nhưng lại khá ưa sáng khi cây trưởng thành Phần củ thường phình to và lộtrên mặt đất hay khe đá
Trang 6Người dân tộc Dao ở Ba Vì trồng nhiều cây Bình vôi để làm thuốc Ở đây,cây Bình vôi được trồng dưới các cây lớn hoặc trồng và làm dàn tre cho các câyBình vôi leo Các thầy thuốc vào rừng, gặp các cây Bình vôi tái sinh, đưa về sưutập vào vườn cây thuốc, chờ cho cây ra hoa, quả, lấy hạt và đem gieo.
Hiện ta đang thu hái củ Bình vôi chủ yếu từ nguồn mọc hoang dại Khi thu
về cạo sạch vỏ nâu đen, thái lát mỏng đem phơi hoặc sấy khô hoặc đem chiếtrotundin
Có thể trồng Bình vôi bằng hạt hoặc phần đầu của củ Thu hái quả chín vàokhoảng tháng 8-10, lấy hạt bảo quản trong cát ẩm rồi gieo hạt vào mùa xuân(tháng 2-3) Ngoài ươm cây giống từ hạt, có thể cắt phần đầu của củ để làmgiống Mỗi đầu có thể xẻ làm 4 mảnh cũng trồng vào mùa xuân Thu hoạch câytrồng sau 2-3 năm, thời gian càng lâu năng suất càng cao
1.2 Các yếu tố sinh thái ảnh hưởng tới sinh trưởng của thực vật
1.2.1 Ánh sáng
Ánh sáng giúp cho cây xanh thực hiện chức năng quang hợp Mỗi loài thựcvật có cường độ quang hợp cực đại ở cường độ ánh sáng khác nhau Người taphân ra hai nhóm thực vật: cây ưa sáng (gồm những thực vật có cường độ quanghợp cực đại khi cường độ chiếu sáng lớn, như cây gỗ ở rừng thưa, cây bụi ởsavan, bạch đàn, phi lao, lúa, đậu phọng …); cây ưa bóng (gồm những thực vật
có cường độ quang hợp cực đại khi cường độ chiếu sáng thấp, như lim, vạn niênthanh, lá dong, ràng ràng …)
Ánh sáng tác động rõ rệt đến sự sinh sản của thực vật Thời gian chiếu sángcàng dài thì cây ở các vùng ôn đới (cây dài ngày) phát triển nhanh, ra hoa sớm;ngược lại phần lớn các cây nhiệt đới (cây ngắn ngày) ra hoa muộn
Ánh sáng đã tạo nên các đặc điểm thích nghi về hình thái, giải phẩu và sinh lý ởcác sinh vật
Trang 7một biên độ nhiệt nhất định Vì vậy, có sinh vật rộng nhiệt, sinh vật hẹp nhiệt, cóđộng vật đẳng nhiệt, động vật biến nhiệt.
Nhiệt độ trên trái đất phụ thuộc vào năng lượng mặt trời và thay đổi theo cácvùng địa lý, theo những chu kỳ trong năm Nhiệt độ có thể tác động trực tiếphoặc gián tiếp đến sự sinh trưởng phát triển và sự phân bố các cá thể, quần thể,quần xã Nhiệt độ còn ảnh hưởng đến các yếu tố khác của môi trường như độ
ở các vùng bờ ao, đầm lầy, ruộng lúa …); thực vật cần độ ẩm trung bình (cầnnhiệt độ, ánh sáng, dinh dưỡng vừa phải và phổ biến khá rộng); thực vật chịuhạn (những cây vừa chịu nóng, ưa sáng và có khả năng tự tích lũy nước hoặcđiều tiết nước, ít thoát hơi nước, như họ xương rồng, họ thầu dầu, họ dầu, họ hòathảo …)
Nước có vai trò quan trọng trong đời sống của các sinh vật Trong cơ thể sinhvật thì khoảng 60-90% khối lượng là nước Nước cần cho các phản ứng sinh hóadiễn ra trong các cơ quan, mô và tế bào của các sinh vật, nước là nguyên liệu chocây quang hợp, là phương tiện vận chuyển của các chất vô cơ, hữu cơ, vậnchuyển máu và chất dinh dưỡng ở động vật Nước còn tham gia vào quá trìnhtrao đổi năng lượng và điều hòa nhiệt độ cơ thể
Độ ẩm tương đối là yếu tố quyết định tốc độ mất nước do bay hơi, là một yếu tốsinh thái quan trọng đối với thực vật ở trên cạn Trên thực tế, ảnh hưởng của độ
ẩm tương đối thường khó tách rời ảnh hưởng của nhiệt độ
1.2.4 Không khí-Gió
Gió có ảnh hưởng rõ rệt đến nhiệt độ, độ ẩm của môi trường dẫn đến sự thay đổithời tiết, ảnh hưởng đến sự thoát hơi nước của thực vật Gió có vai trò rất quantrọng trong phát tán vi sinh vật, bào tử, phấn hoa, quả, hạt thực vật … đi xa
Trang 8Nhân dân ta có câu ca dao "Gió Đông là chồng lúa chiêm, gió Bắc là duyên lúamùa" để nói lên mối quan hệ giữa lúa và gió Gió Đông Nam thổi từ biển Đôngvào làm cho thời tiết ấm, nhiều hơi nước, gây mưa Lúa chiêm theo thời vụ trướcđây (ở đồng bằng Bắc bộ) là thứ lúa được cấy từ trước tết âm lịch, gặt vào tháng
6 Khi gió Đông thổi tới (cuối mùa xuân), trời ấm, có mưa làm cho lúa chiêmtươi tốt, đẻ nhánh khỏe và trổ bông Gió Bắc là gió Đông bắc từ vùng cao ápXibêri tới mang tính chất lục địa khô và lạnh Lúa mùa theo thời vụ cũ là thứ lúađược cấy từ cuối tháng 6, gặt vào cuối tháng 10, tháng 11 Khi gió Bắc đến sớm(cuối tháng 10) khí hậu trở nên mát mẻ, có lợi cho sinh trưởng và phát triển củalúa mùa Ngoài ra, có gió thì lúa mới thụ phấn được
Loài cỏ lăn sống trên bãi biển có quả xếp tỏa tròn quanh một trục, khi gió thổimạnh, cụm quả bị gẫy và lăn trên bãi cát, lăn đến đâu rụng quả đến đấy, nhờ đómà chúng phân bố rất rộng trên các bãi biển nhiệt đới châu Á, châu Phi, châuĐại dương Gió giúp cho sự vận chuyển của nhiều động vật, như chồn bay, cầybay có khả năng lượn nhờ gió v.v…
Tuy nhiên, nếu gió mạnh sẽ gây hại cho động vật, thực vật và phá hủy môitrường (gió mạnh, bão làm hạn chế khả năng bay của động vật Ong mật chỉ baykhi gió có tốc độ 709 m/giây, muỗi 3,6 m/giây)
Không khí cung cấp khí oxy (O2) cho sinh vật hô hấp sinh ra năng lượng dùngcho cơ thể Thực vật lấy khí cacbonic (CO2) từ không khí dưới tác dụng của ánhsáng mặt trời tạo ra chất hữu cơ Không khí chuyển động (gió) có ảnh hưởng đếnnhiệt độ, độ ẩm
1.2.5 Các chất khí và pH
CO2 và pH: CO2 cùng với nước tham gia tổng hợp chất hữu cơ, là chất đệm giữ
pH môi trường nước trung tính Trong môi trường nước, CO2 tồn tại ở dạng:Ca(HCO3)2 CaCO3 + CO2 + H2O
O2 cần cho sự hô hấp của các sinh vật (trừ sinh vật kị khí bắt buộc) Nguồn oxytrong thủy vực là do oxy khuếch tán từ không khí (nhờ gió và sự chuyển độngcủa nước)
Nitơ (N2): Là thành phần bắt buộc của protid-chất đặc trưng cho sự sống, cungcấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu tạo ADP, ATP
Phospho (P): Thiếu phospho, động vật mềm xương, còi xương, liệt nửa thân sau
Tỉ lệ thích hợp đối với N/P trong nước là 1/23
Trang 9Canxi (Ca): Hàm lượng Ca cao ngăn chặn sự rút các nguyên tố khác nhau
ra khỏi đất Ca cần cho sự thâm nhập của NH4+ và NO3-vào rễ Tôm có thể sốngđược ở nước lợ hoặc nước ngọt hoàn toàn nhưng phải giàu Ca
Trang 10CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu, phân tích các yếu tố sinh thái làm ảnh hưởng tới hàm lượngrotundin của củ Bình vôi trồng ở quy mô vườn pilot
2.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu yếu tố ánh sáng ảnh hưởng tới sinh trưởng và hàmlượng Rotundin của cây Bình vôi
Nội dung 2: Nghiên cứu các yếu tố nước và độ ẩm ảnh hưởng tới sinhtrưởng và hàm lượng rotundin của củ cây Bình vôi
Nội dung 3: Nghiên cứu yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng tới sinh trưởng và hàmlượng Rotundin của cây Bình vôi
Nội dung 2: Nghiên cứu yếu tố về độ pH ảnh hưởng tới sinh trưởng và hàmlượng Rotundin của cây Bình vôi
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Thu thập mẫu vât:
- Mẫu vật được thu thập từ Vườn trồng thí nghiệm tại vườn Dược liệu củaCông ty Dược Khải Hà (Thái Bình) và tại công ty dược Bio-Pharm (Hòa Bình).Mỗi nơi lấy 10 mẫu củ của 10 cá thể
- Các mẫu thu thập là cùng một loài Stephania glabra (Roxb.) Mier, được
trồng và chăm sóc với chế độ bón phân và tưới nước như nhau tại 2 địa điểm nếutrên
2.3.2 Phương pháp phân tích hóa:
Trang 11 Điều kiện phân tích và tiến hành
Chuẩn bị mẫu
Mẫu củ bình vôi (500 gam củ tươi) sau khi thu hái, đem băm nghiền nhỏ vàngâm trong dung dịch axit sunfuric nồng độ 3-4% trong 24h Dịch chiết axítđược lọc qua vải, vắt kiệt bã Bã lại được tiếp tục ngâm trong dung dịch axíttrên Lặp lại quá trình trên 3 lần Các dịch chiết được gom lại và trung hòa bằngdung dịch NaOH 8-10% đến pH 10 – 11 thu được tủa alkaloid toàn phần Đểlắng tủa, lọc qua giấy lọc, phơi sấy khô, cân khối lượng và nghiền mịn thu đượcbột alkaloid toàn phần
- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,05g bột alkaloid toàn phần cho vàobình tam giác dung tích 50 ml, thêm 40 ml ethanol 96 độ, chiết siêu âm thời gian
30 phút Lọc, thu dịch chiết vào bình định mức 50 ml, tráng giấy lọc bằng 5 mlethanol 96 độ, bổ sung ethanol 96 độ đến vạch định mức, lắc đều được dungdịch chấm sắc ký
-Dung dịch đối chiếu: Hòa tan chính xác khoảng 2 mg rotundin chuẩn 99,8%trong 10ml ethanol 96 độ (TT) để được dung dịch có nồng độ khoảng 0,2 mg/ml
Điều kiện phân tích
- Hệ thống sắc ký lớp mỏng CAMAG gồm có máy chấm kính CAMAG –linomat Máy đo mật độ densitometry CAMAG TLC SCANNER 3, được sửdụng với sự hỗ trợ của phần mềm WinCATS Bản mỏng HP TLC plate silicagel
60 F254 Merck, kích thước 20 × 10 cm
- Hệ dung môi sắc ký: n-hexan - ethyl acetat (2:1).
- Phát hiện: Đo TLC scanning, hấp thụ =283nm
- Chấm thang chuẩn rotundin 99,8% với các lượng chấm: 2, 4, 6, 8, 10µl; cácmẫu thử chấm 4-20 µl tùy mẫu, chấm nhắc lại 2-3 lần đối với mỗi mẫu thử
- Lớp mỏng được triển khai đến 85 mm Kính sau đó được lấy ra, để bay hơihết dung môi trong tủ hút, thời gian 15 phút Tiến hành đo scanning ở bước sóng283nm, tốc độ quét 20 mm/s Hàm lượng rotundin trong mẫu thử được xác định
từ kết quả đường chuẩn đã xây dựng Hàm lượng % rotundin trong mẫu thử tínhtheo khối lượng khô kiệt được tính theo công thức:
m.V.100.100
Hàm lượng % = - [1]
Trang 12trong đó: m: lượng mẫu thử đo được (µg), v: lượng mẫu thử chấm trên máy
(µl), V: thể tích dịch chiết mẫu thử (50 ml), P: Khối lượng mẫu thử đem cân (g),B: Hàm ẩm của lược liệu (%)
Trang 13CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU3.1 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Thái Bình
Vị trí địa lý: Tỉnh Thái Bình là một tỉnh ven biển, nằm ở phía đông nam
đồng bằng châu thổ sông Hồng, từ 20º17´ vĩ Bắc đến 20º49´ vĩ Bắc, từ 106º06´kinh Đông đến 106°39´ kinh Đông, diện tích tự nhiên 1546 km² (năm 2003)
Thủy văn :
Tỉnh Thái Bình nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, nên hàng năm đón nhậnmột lượng mưa lớn (1.700-2.200mm), lại là vùng bị chia cắt bởi các con sônglớn, đó là các chỉ lưu của sông Hồng, trước khi chạy ra biển
Đặc điểm khí hậu: Khí hậu Thái Bình mang tính chất cơ bản là nhiệt đới
ẩm gió mùa Thái Bình có nhiệt độ trung bình 23º-24ºC, tổng nhiệt độ hoạt độngtrong năm đạt 8400-8500ºC, số giờ nắng từ 1600-1800h, tổng lượng mưa trongnăm 1700-2200mm, độ ẩm không khí từ 80-90% Gió mùa mang đến Thái Bìnhmột mùa đông lạnh mưa ít, một mùa hạ nóng mưa nhiều và hai thời kỳ chuyểntiếp ngắn
Đặc điểm địa hình: Nền địa hình Thái Bình là đồng bằng được hình thành
cách đây không lâu Đường bờ biển hiện nay chỉ mới được bồi đắp trong vòng100-200 năm trở lại đây
Thổ nhưỡng: Đất đai Thái Bình được hình thành về cơ bản là do sự bồi đắp
phù sa của hệ thống sông lớn: Sông Hồng, sông Trà Lý (1 chỉ lưu của sôngHồng), sông Luộc (cũng là một chi nhánh của sông Hồng), sông Thái Bình
3.2 Điều kiện tự nhiên của tỉnh Hòa Bình
Địa hình: Đặc điểm nổi bật của địa hình tỉnh Hoà Bình là đồi, núi dốc theo
hướng Tây Bắc - Đông Nam, chia thành 2 vùng rõ rệt:
- Phía Tây Bắc (vùng cao): Bao gồm các dải đồi núi lớn, bị chia cắt nhiều,
độ cao trung bình so với mực nước biển từ 500-600m, nơi cao nhất là đỉnh núiPhu Canh (huyện Đà Bắc) cao 1.373m Độ dốc trung bình từ 30-350, có nơi dốc