VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 2.4.1 HĐ số ngày tháng năm 2014 Tên chuyên đề: NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU
Trang 1VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ 2.4.1 (HĐ số ngày tháng năm 2014)
Tên chuyên đề:
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU
NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ
Thuộc đề tài: “Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái Bình”
Mã số: VAST.NĐP.07/14-15
Người thực hiện: TS Nguyễn Văn Dư
Hà Nội, 2014
Trang 2VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN
BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ (HĐ số ngày tháng năm 2014)
Tên chuyên đề:
NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN KHỬ TRÙNG TẠO MẪU
NUÔI CẤY MÔ TỪ CHỒI NGỦ
Thuộc đề tài: “Nghiên cứu và xây dựng quy trình chiết tách hoạt chất rotundin
trong cây bình vôi trồng ở qui mô sản xuất thử, áp dụng tại tỉnh Thái Bình”
Mã số: VAST.NĐP.07/14-15
Người thực hiện
(Ký, họ tên)
Chủ nhiệm đề tài
(Ký, họ tên)
Xác nhận cơ quan
(Ký, họ tên và đóng dấu)
TS Nguyễn Văn Dư
Trang 3MỤC LỤC
MỤC LỤC 3
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2
1.1 Nghiên cứu về nhân giống các loài trong chi Bình vôi 2
CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4
1.2 Mục tiêu nghiên cứu 4
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4
1.4 Nội dung nghiên cứu 4
1.5 Phương pháp nghiên cứu 4
2.4.1 Phương pháp luận 4
2.4.2 Phương pháp thực nghiệm 4
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 9
1.6 Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro 9
3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro 11
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - TỒN TẠI - KHUYẾN NGHỊ 14
1.7 Kết luận 14
1.8 Khuyến nghị 14
TÀI LIỆU THAM KHẢO 15
Trang 4ĐẶT VẤN ĐỀ
Chi Bình vôi (Stephania) gồm nhiều loài cây thuốc quý có tác dụng an
thần, chữa ho, sốt, lỵ, dạ dày, chữa mất ngủ, chúng còn được sử dụng để chữa bệnh ung thư một trong những căn bệnh của thế kỷ Hiện nay các tài liệu mô tả
về các đặc điểm sinh vật học, sinh thái học của các loài Bình vôi rất hạn chế
Trong đó loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) đang bị suy giảm nghiêm
trọng trong tự nhiên Do vậy việc hiểu biết một số đặc điểm sinh vật học của loài cây này có ý nghĩa lớn nhằm góp phần bảo tồn nguồn gen và phát triển loài cây thuốc quý hiếm này Bên cạnh đó, sự hiểu biết về tầm quan trọng, lợi ích và công tác nhân giống, đặc biệt là nhân giống sinh dưỡng loài cây này không chỉ giúp cho công tác bảo tồn mà còn có thể tạo ra nguồn nguyên liệu đảm bảo cả số lượng và chất lượng cho việc sản xuất hóa dược với quy mô lớn Chính vì những lý do trên đây, trong đề tài tiến hành thực hiện nội dung
nghiên cứu “Nghiên cứu điều kiện khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ” nhằm cung cấp thêm những thông tin về phương pháp khử trùng tạo mẫu
nuôi cấy mô từ chồi ngủ của cây Bình Vôi, góp phần tạo cơ sở cho các bước tiếp theo của quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật loài cây Bình Vôi
Trang 5CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Nghiên cứu về nhân giống các loài trong chi Bình vôi
Trong vài năm trở lại đây, nhiều nghiên cứu nhân giống Bình vôi bằng các phương pháp vô tính các loài thuộc chi Stephania đã được quan tâm chú trọng nhiều Trong đó, 2 phương pháp phổ biến là nhân giống bằng giâm hom và nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô Điển hình trong số những nghiên cứu đó có:
“Nghiên cứu đặc điểm sinh vật học và nhân giống loài Bình vôi
(Stephania rotunda Lour.) bằng phương pháp giâm hom” của tác giả Nguyễn
Văn Dũng, Đại học Lâm Nghiệp Việt Nam Trong Nghiên cứu này, tác giả đã
đi đến một số kết quả bước đầu:
- Thể nền 1 sử dụng công thức 100% là cát sạch cho kết quả tốt hơn thể nền 2 sử dụng công thức 70% cát sạch + 30% đất tầng B đã được xử lý Trong chất kích thích Kinetin thì ta chọn nồng độ 10ppm là công thức tốt nhất
- Kết quả nghiên cứu khẳng định, công thức sử dụng chất kích thích Kinetin cho tỷ lệ ra chồi và chiều dài chồi tốt hơn chất kích thích BAP
Với các phương pháp thực nghiệm nuôi cấy mô, 2 tác giả là Trịnh Ngọc Nam, Nguyễn Văn Linh có Đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro và khảo sát
hợp chất alkaloid rotundine từ cây Bình vôi (Stephania rotunda Lour.)” Trong
đề tài này, các tác giả đã nghiên cứu và thử nghiệm thành công việc nhân
giống loài Bình vôi (Stephania rotunda Lour.) bằng phương pháp nuôi cấy mô
và đi đến một số kết luận sau:
Khả năng tạo mô sẹo từ khúc cắt thân đạt hiệu quả cao trên môi trường
MS bổ sung 2,4-D 5 mg/l, BA 0,2 mg/l
Môi trường có hàm lượng khoáng cao thích hợp cho quá trình tạo mô sẹo
từ khúc cắt thân
Trang 6Trên môi trường MS bổ sung BA 1,0 mg/l, NAA 0,2 mg/l, quá trình hình thành chồi từ chồi ngủ xẩy ra thuận lợi
Ở tất cả các mẫu thí nghiệm (thân, củ, mô sẹo) đều có alkaloid rotundine Trong đó, củ có hàm lượng rotudin cao nhất
Trang 7CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2 Mục tiêu nghiên cứu
- Bước đầu xây dựng được kỹ thuật khử trùng tạo mẫu nuôi cấy mô từ chồi ngủ Bình vôi bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu của đề tài là cây Bình vôi (Stephania rotunda
Lour.)
- Vật liệu nghiên cứu: Chồi ngủ cây Bình Vôi
- Phạm vi nghiên cứu: Phòng nuôi cấy mô hợp tác xã Linh Dược Sơn, thành phố Hòa Bình nơi có loài Bình vôi này phân bố tự nhiên
1.4 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro
1.5 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp luận
- Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng.
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm.
- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)
- Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.
2.4.2 Phương pháp thực nghiệm
Trang 8Sử dụng chồi ngủ làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng và cấy vào môi trường MS cơ bản Khi mẫu tái sinh và bật chồi, sau 2-3 tuần cắt chồi
và cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Khi các chồi dài khoảng 3-5 cm thì tiến hành cắt và cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, những chồi không
đủ kích thước thì tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh
Các môi trường thí nghiệm được chỉnh pH đến 5,8 sau đó khử trùng ở
120oC trong thời gian 20 phút.
Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 oC
Đề tài tiến hành 2 thí nghiệm với các phương pháp bố trí thí nghiệm như sau:
2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Có nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ
nguồn bệnh và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro, nhưng hai loại hóa
chất được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả cao là HgCl2 và NaClO
- Phương pháp khử trùng:
Khử trùng ngoài box cấy: Phần thân mang chồi được đựng trong ống
phancol, lắc rửa mạnh bằng nước sạch và dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy sao cho hết
xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch
Khử trùng trong box cấy: Phần thân được rửa bằng nước cất vô trùng, lắc
mạnh trong 1-2 phút để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt, lặp lại 3 lần Sau
đó tiến hành rửa bằng cồn 70 % trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô
Trang 9trùng (rửa 3 lần) Sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% hoặc NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 4-5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám trên bề mặt tránh gây độc cho chồi
Cấy mẫu vào môi trường: Phần thân sau khi xử lý được đưa ra đĩa vô
trùng, dùng giấy thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của phần thân, sau đó cấy lên môi trường: MS + 8g/l Agar + 30g/l sucrose Thí nghiệm được
bố trí như ở bảng 2.1
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến
khả năng tạo mẫu sạch in vitro
Công
thức
Hóa chất Thời
gian (phút)
Tổng
số mẫu cấy (mẫu)
Mẫu sạch Mẫu sạch tái sinh Thời
gian mẫu nẩy chồi (ngày)
Số mẫu sạch (mẫu)
Tỷ lệ mẫu sạch (%)
Số mẫu sạch nẩy chồi
Tỷ lệ mẫu sạch nẩy chồi (%)
KT1
HgCl 2
0,1%
4 30
KT4 Javen
60%
(NaClO)
6 30
2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro
Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng
được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy
Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là
Trang 10việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất Trong thí nghiệm
này, sử dụng chồi ngủ cây in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng
cơ bản khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6), các loại môi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar +
30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái
sinh chồi Bình Vôi in vitro Thí nghiệm được bố trí trong bảng 2.2.
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình
Vôi in vitro
Công thức
thí nghiệm
Môi trường dinh dưỡng
Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi)
Số mẫu tái sinh chồi
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Số chồi TB/mẫu
Chất lượng chồi
(Gamborg) 45 MT5 N6 (Chu) 45
Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant
2.5 Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập
2.5.1 Chỉ tiêu thu thập
+ Thí nghiệm nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro:
Tổng số mẫu cấy
Tổng số mẫu cấy x100 (%)
Số mẫu cho mỗi thí nghiệm ≥ 30 mẫu, Thời điểm thu thập số liệu sau 2
tuần nuôi cấy
Trang 112.5.2 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel
Dùng phương pháp phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel
2007, các bước tiến hành như sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single factoc hoặc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất dữ liệu và độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok
Trang 12CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
1.6 Công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro
Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy
in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối
với các bước tiếp theo Vì vậy, cần phải tìm ra công thức khử trùng tối ưu để
nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nảy chồi của mẫu sạch.
Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau
mà hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro thu được khác nhau Trong nghiên cứu này,
đã sử dụng phần thân mang chồi cây Bình Vôi để tạo cây in vitro sau đó lấy vật
liệu sinh dưỡng cho nhân giống Kết quả thí nghiệm thu được như ở bảng 3.1
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo
mẫu sạch in vitro
Công
Thời gian (phút)
Tổng số mẫu cấy (chồi)
Thời gian mẫu nẩy chồi (ngày)
Số mẫu sạch (chồi)
Tỷ lệ mẫu sạch (%)
Số mẫu sạch nẩy chồi
Tỷ lệ mẫu sạch nẩy chồi (%) KT1
HgCl 2
0,1%
KT4 Javen
60%
(NaClO)
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố cho thấy Ftính (65,3) > Fcrit (3,1) Như vậy có sự ảnh hưởng rõ rệt giữa các công thức khử trùng, điều này cho thấy loại hóa chất sử dụng để khử trùng và thời gian khử trùng có ảnh
hưởng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro của mẫu Bình Vôi.
Trang 13Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% tỷ lệ mẫu sạch cao (83,3 – 100%) nhưng tỉ lệ mẫu tái sinh lại thấp Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nẩy chồi giảm xuống rất thấp chỉ đạt 13,3 % ở công thức KT2 khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút và thời gian nảy chồi cũng chậm hơn Ở công thức KT1 khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút tỷ lệ mẫu sạch đạt cao nhất đạt 83,3 % và tỷ lệ mẫu nẩy chồi cũng cao nhất đạt 73,3%, thời gian lên chồi là 10 ngày nuôi trên môi trường
Khi khử trùng mẫu cấy với hoá chất là Javen 60% đem lại kết quả tốt hơn cho tỉ lệ mẫu sạch và tỉ lệ mẫu tái sinh cao Thời gian khử trùng 12 phút, tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh cao nhất đạt 100%, sau 6 ngày nuôi bộ phận sinh dưỡng nảy chồi Với thời gian khử trùng là 6 và 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp hơn chỉ đạt 73,3% và 86,6%
Từ kết quả trên cho thấy, khử trùng bằng Javen 60% cho kết quả tốt hơn
so với HgCl2 0,1%, nguyên nhân là do HgCl2 là chất khử trùng mạnh có độc tính cao đối với tế bào nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch tăng nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm và thời gian nảy chồi cũng chậm hơn
Vậy công thức khử trùng tốt nhất cho phần thân mang chồi ngủ là sử dụng Javen 60% trong thời gian 12 phút cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh đều đạt 100%, sau 6 ngày nuôi nảy chồi
Trang 14Hình 3.1 Bộ phận sinh dưỡng cây Bình Vôi nảy chồi trên môi trường MS
A Mẫu được khử trùng bằng Javen 60% trong 12 phút; B.Mẫu được khử trùng bằng
HgCl 2 0,1% trong 4 phút.
3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi
Bình Vôi in vitro
Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng
được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy
Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất Trong thí nghiệm
Trang 15này, sử dụng chồi của cây in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng
cơ bản khác nhau, gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6) (Bảng 3.2), các loại môi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi trường dinh dưỡng thích
hợp cho tái sinh chồi Bình Vôi in vitro Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2
tuần nuôi cấy và được thể hiện trong bảng 3.2 dưới đây
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình
Vôi in vitro
CTTN
Môi trường dinh dưỡng
Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi)
Số mẫu tái sinh chồi
Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)
Số chồi TB/mẫu
Chất lượng chồi
MT4 (Gamborg)B5 45 20 66,67 1,68
-MT5 N6 (Chu) 45 16 57,78 1,44
-Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant
Kết quả phân tích phương sai một nhân tố về ảnh hưởng của môi trường
dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro, cho kết quả như sau:
F tính = (24,4) > F crit = (3,4), chứng tỏ môi trường dinh dưỡng khác nhau có ảnh
hưởng rõ rệt đến khả năng tái sinh chồi Bình Vôi in vitro.
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, Chồi Bình Vôi được cấy vào môi trường 1/2MS cho số chồi trung bình chỉ đạt 1,71 chồi/mẫu và chất lượng chồi ở mức trung bình (chồi yếu, lá xanh vàng, phiến lá hẹp, mỏng) Ở công thức môi trường MS thì mẫu cấy có khả năng tái sinh tốt nhất, tỷ lệ mẫu tái sinh đạt
