Nghiên cứu tạo que thử để phát hiện nhanh một số độc tố ruột của tụ cầu khuẩn trong thực phẩm

Tôi xin được cảm ơn tới các thầy cô lãnh đạo và cán bộ, nghiên cứu viên Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tôi cơ sở vậ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể các nhà khoa học hướng dẫn luận án Các số liệu và kết quả thí nghiệm trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng 05 năm 2015

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành Luận án này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người

thầy hướng dẫn: Thầy thuốc nhân dân, PGS.TS BS Nguyễn Thị Khánh Trâm, Cục An toàn Thực phẩm, Bộ Y tế, TS Lê Quang Hòa, Viện Công nghệ Sinh học và

Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, đã tận tình định hướng, chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện Luận án

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS Bùi Thị Việt Hà và các thầy cô giáo, các cán bộ của Bộ môn Vi sinh vật học, các thầy cô giáo của Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình trang bị kiến thức cho tôi trong suốt những năm qua

Tôi xin được cảm ơn tới các thầy cô lãnh đạo và cán bộ, nghiên cứu viên Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện giúp tôi cơ sở vật chất để thực hiện các thí nghiệm cho Luận án này

Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự hỗ trợ và động viên của các thầy cô giáo lãnh đạo và cán bộ viên chức của Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, tạo điều kiện cho tôi về thời gian và vật chất, tinh thần để tôi hoàn thành khóa học, tôi xin được cảm ơn sự giúp đỡ quí báu này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban Chủ nhiệm khoa Sinh học, Phòng Sau đại học và Ban Giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giúp tôi hoàn thành các hồ sơ trong suốt quá trình học tập và bảo vệ luận án

Trong suốt những năm qua, tôi luôn nhận được sự động viên, giúp đỡ về vật chất và tinh thần của gia đình, những người thân, sự đồng cảm của bạn bè, đồng nghiệp, đây là nguồn động lực lớn giúp tôi hoàn thành khóa học và Luận án này Tôi xin được trân trọng biết ơn sự giúp đỡ quí báu đó

Hà Nội, ngày tháng 04 năm 2015

NGHIÊN CỨU SINH

Trần Thị Sao Mai

MỤC LỤC MỤC LỤC 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5 DANH MỤC HÌNH ẢNH Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG 9 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

1.1.TỤ CẦU KHUẨN Error! Bookmark not defined 1.1.1 Đặc điểm sinh học của tụ cầu vàng Error! Bookmark not defined 1.1.2 Những yếu tố ảnh hưởng tới sản sinh độc tố ruột của tụ cầu Error! Bookmark not defined

1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do tụ cầu Error! Bookmark not defined

1.1.3.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm do độc tố ruột tụ cầu trên thế giới Error! Bookmark not defined

1.1.3.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam Error! Bookmark not defined

1.2 ĐỘC TỐ RUỘT CỦA TỤ CẦU Error! Bookmark not defined 1.2.1 Đặc điểm sinh hóa, hóa lý và di truyền của độc tố ruột của tụ cầu Error! Bookmark not defined

1.2.2 Cấu trúc phân tử của độc tố ruột tụ cầu Error! Bookmark not defined 1.2.3 Hoạt tính sinh học của các độc tố ruột tụ cầu Error! Bookmark not defined

1.2.3.1 Hoạt tính siêu kháng nguyên Error! Bookmark not defined 1.2.3.2 Hoạt tính gây nôn Error! Bookmark not defined 1.2.3.3 Cơ chế gây viêm dạ dày - ruột do độc tố tụ cầuError! Bookmark not defined

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU Error! Bookmark not defined

1.3.1 Phép thử sinh học Error! Bookmark not defined 1.3.2 Phương pháp sinh học phân tử Error! Bookmark not defined 1.3.3 Phương pháp miễn dịch Error! Bookmark not defined

1.3.3.1 Phương pháp khuếch tán trên gel (Microslide Double Diffusion ) Error! Bookmark not defined

1.3.3.2 Phương pháp miễn dịch phóng xạ - RIA (Radio Immunoassay) Error! Bookmark not defined

1.3.3.3 Ngưng kết hạt latex (Reversed Passive Latex Aggulutination - RPLA) Error! Bookmark not defined

1.3.3.4 Các phương pháp dựa trên kỹ thuật ELISA Error! Bookmark not defined

1.4 KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG Error! Bookmark not defined

1.4.1 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch Error! Bookmark not defined

1.4.1.1 Các hợp phần trong hệ thống sắc ký miễn dịchError! Bookmark not defined 1.4.1.2 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký miễn dịchError! Bookmark not defined 1.4.1.3 Phân loại que thử nhanh ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch Error! Bookmark not defined

1.4.2 Một số nghiên cứu tạo que thử phát hiện độc tố ruột tụ cầu trong thực

phẩm .Error! Bookmark not defined 1.5 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG VÀ ỨNG DỤNG CỦA IGY Error! Bookmark not defined

1.5.1 Kháng thể lòng đỏ trứng IgY Error! Bookmark not defined 1.5.2 Sản xuất kháng thể IgY Error! Bookmark not defined 1.5.3 Các phương pháp tinh chế kháng thể IgY Error! Bookmark not defined 1.5.4 Ứng dụng của IgY trong chẩn đoán miễn dịch Error! Bookmark not defined

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU Error! Bookmark not defined

1.6.1 Sản xuất độc tố ruột tụ cầu trực tiếp từ S aureus Error! Bookmark not

2.2.2 Hóa chất và sinh phẩm Error! Bookmark not defined 2.2.3 Máy, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.3.1 Phương pháp sản xuất độc tố ruột tụ cầu SEC1 tái tổ hợpError! Bookmark not defined

2.3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn S aureus Error! Bookmark not defined

2.3.1.2 Khuếch đại gen sec 1 bằng kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined 2.3.1.3 Tinh sạch sản phẩm PCR Error! Bookmark not defined

2.3.1.4 Xây dựng vector biểu hiện mang gen sec 1 Error! Bookmark not defined

2.3.1.5 Biến nạp plasmid pGS-21a-sec 1 vào tế bào E coli BL 21 Error! Bookmark not defined

2.3.1.6 Biểu hiện protein SEC 1 tái tổ hợp Error! Bookmark not defined

2.3.1.7 Tinh sạch protein tái tổ hợp SEC 1 Error! Bookmark not defined 2.3.1.8 Phương pháp điện di biến tính protein (SDS-PAGE) Error! Bookmark not defined

2.3.1.9 Phương pháp định lượng protein bằng đo mật độ quang Error! Bookmark not defined

2.3.1.10 Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC 1 tái tổ hợp bằng kỹ thuật

Western blot Error! Bookmark not defined

2.3.2 Phương pháp sản xuất kháng thể IgY kháng BSA và kháng thể IgY kháng

5 loại độc tố SE (A+B+C1+D+E) Error! Bookmark not defined

2.3.2.1 Gây miễn dịch Error! Bookmark not defined 2.3.2.2 Tinh sạch kháng thể IgY từ lòng đỏ trứng Error! Bookmark not defined

2.3.3 Chế tạo que thử phát hiện nhanh một số độc tố ruột tụ cầu Error! Bookmark not defined

2.3.3.1 Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED

và SEE) của tụ cầu Error! Bookmark not defined 2.3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thửError! Bookmark not defined

2.3.4 Sử dụng que thử nhanh phát hiện độc tố ruột tụ cầu trên một số nhóm mẫu

thực phẩm đã gây nhiễm độc tố SE Error! Bookmark not defined 2.3.5 PHƯƠNG PHÁP Xử LÝ Số LIệU Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

3.1 SẢN XUẤT VÀ TINH CHẾ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU SEC1 TÁI TỔ HỢP Error! Bookmark not defined

3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ S aureus Error! Bookmark not defined

3.1.2 Khuếch đại gen sec1 bằng kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined

3.1.3 Xây dựng vector biểu hiện pGS-21a mang gen sec 1Error! Bookmark not defined

3.1.4 Kết quả biểu hiện gen mã hóa cho protein SEC1 tái tổ hợp Error! Bookmark not defined

3.1.5 Xác định các điều kiện biểu hiện gen sec1 thích hợp trong E.coli Error!

Bookmark not defined

3.1.6 Tinh sạch protein SEC1 tái tổ hợp Error! Bookmark not defined

3.1.7 Kiểm tra tính kháng nguyên của protein SEC1 tái tổ hợp bằng phản ứng

Western Blot Error! Bookmark not defined 3.2 CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÒNG ĐỎ TRỨNG IgY Error! Bookmark not defined 3.2.1 Lựa chọn loài gà và cách chăm sóc gà Error! Bookmark not defined 3.2.2 Cách gây miễn dịch và thu hoạch trứng Error! Bookmark not defined 3.2.3 Kết quả tách chiết và tinh sạch kháng thể IgY Error! Bookmark not defined

3.3 CHẾ TẠO QUE THỬ Error! Bookmark not defined

3.3.1 Thiết kế bộ que thử nhanh phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) Error! Bookmark not defined

3.3.3.1 Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch kiểm chứng Error! Bookmark not defined

3.3.3.2 Tối ưu hóa lượng kháng thể cần cố định lên vạch thử nghiệm Error! Bookmark not defined

3.3.3.3 Tối ưu hóa lượng kháng nguyên cộng hợp cần sử dụngError! Bookmark not defined

3.3.2 Xác định giới hạn phát hiện và tính ổn định của que thử Error! Bookmark not defined

3.3.2.1 Xác định giới hạn phát hiện của que thử với các độc tố ruột SEA, SEB, SEC 1 ,

SED và SEE Error! Bookmark not defined 3.3.2.2 Xác định tính ổn định của que thử Error! Bookmark not defined

3.4 SỬ DỤNG QUE THỬ ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘC TỐ RUỘT TỤ CẦU TRÊN

THỰC PHẨM ĐƢỢC GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM Error! Bookmark not defined

3.4.1 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên sữa đƣợc gây nhiễm thực nghiệm Error! Bookmark

not defined

3.4.1.1 Xác định độ pha loãng sữa để thử nghiệm Error! Bookmark not defined

3.4.1.2 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED và

SEE) trên sữa được gây nhiễm thực nghiệm Error! Bookmark not defined

3.4.2 Sử dụng que thử để phát hiện một số độc tố ruột của tụ cầu (SEA, SEB, SEC1, SED và SEE) trên thịt đƣợc gây nhiễm thực nghiệm Error! Bookmark not defined

3.4.2.1 Xác định độ pha loãng thịt để thử nghiệm Error! Bookmark not defined

3.4.2.2 Kết quả phát hiện một số độc tố ruột (SEA, SEB, SEC 1 , SED và SEE) trên thịt

được gây nhiễm thực nghiệm Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED KẾT LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED TÀI LIỆU THAM KHẢO 6

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

- APC - Antigen Presenting Cell - Tế bào trình diện kháng nguyên

- BSA - Bovine Serum Albumin - Albumin huyết thanh bò

- CFU - Colony forming unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc

- CNS - Coagulase negative staphylococci - Tụ cầu không sinh coagulase

- ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay - Phương pháp miễn dịch hấp phụ

gắn enzym

- Fab - Fragment of antigen binding - Mảnh gắn kháng nguyên

- Fc - Fragment crystalizable - Mảnh kết tinh

- FCA - Freud’s Complete Adjuvant - Tá dược Freud hoàn toàn

- FIA - Freud’s Incomplete Adjuvant - Tá dược Freud không hoàn toàn

- GALT - Gut Associated Lymphoid Tisue - Mô limpho ở ruột

- kDa - Kilo Dalton

- MCP-1 - Monocyte Chemoattractant Protein 1

- MHC-II - Major histocompatibility complex - Phức hợp tương thích mô chính

- PBS - Phosphate Buffered Saline- - Muối đệm phosphate

- PCR - Polymerase Chain Reaction

- PEG - Polyetylen Glycol

- RPLA -Reversed Passive Latex Aggulutination - Kỹ thuật ngưng kết hạt latex

- SE - Staphylococcal Enterotoxin - Độc tố ruột tụ cầu

- SPA - Staphylococcus aureus Protein A - Protein A của tụ cầu

- TCR - T-Cell antigen Receptor - Thụ thể của tế bào T

- TNF - Tumor Necrosis Factor - Yếu tố hoại tử khối u

- TSST - Toxic Shock Syndrome Toxin

- TSST-1 - Toxic Shock Syndrome Toxin-1 - Độc tố gây hội chứng sốc do độc

TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT

1 Lê Huy Chính (2007), Vi sinh vật y học, NXB Y học, Hà Nội

2 Nguyễn Văn Dịp (1993), Ứng dụng những nguyên lý về vi sinh vật học và di truyền học để xác định tính chất dich tễ của Staphylococcus aureus, Luận án

Tiến sĩ y học, Đại học Y khoa Hà Nội, Hà Nội

3 Lê Quang Hòa, Trần Thị Sao Mai, Nguyễn Hồng Nhung, Nguyễn Thị Khánh Trâm, Tô Kim Anh (2012), “Sản xuất và thử nghiệm bộ sinh phẩm ELISA phát

hiện nhanh độc tố ruột dạng A của tụ cầu”, Tạp chí Y học thực hành (842),

BK-SETA”, Kỷ yếu hội nghị khoa học An toàn vệ sinh thực phẩm lần thứ 5-2009,

tr 469 – 474

6 Nghiêm Ngọc Minh (2011), “Biểu hiện và tinh sạch protein nội độc tố

Staphylococcal enterotoxin (SEB) trong các chủng Staphylococcus aureus phân lập từ các vụ ngộ độc thực phẩm”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 86 (10), pp

179-183

7 Đoàn Thị Nguyện (2009), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam

8 Nguyễn Đỗ Phúc, Trần Linh Thước (2008), “Tạo kháng thể đa dòng và xây dựng

quy trình ELISA phát hiện độc tố ruột nhóm A của Staphylococcus aureus”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh (12), tr 272-277

9 Tim Sunnary (2013), Nghiên cứu chế tạo globulin miễn dịch từ trứng gà (IgY) kháng trực khuẩn mủ xanh, Luận án tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y 103, Hà Nội

10 Đặng Đức Trạch (1984), Miễn dịch học, University of Amsterdam

TIẾNG ANH

11 Agro-Bio (2011), Protocol for the production of chicken polyclonal antibodies

specific IgY, Version 2011/01

12 Antonina A Votintseva, Rowena Fung, Ruth R Miller, Kyle Knox, Heather

Godwin, David H Wyllie, Rory Bowden, Derrick W Crook, A Sarah Walker

(2014), Prevalence of Staphylococcus aureus protein A (spa) mutants in the community and hospitals in Oxfordshire, BioMed Central, United Kingdom

13 Antonsson, P., Wingren, A.G., Hansson, J., Kalland, T., Varga, M., Dohlsten, M

(1997), “Functional Characterization of the Interaction Between the Superantigen

Staphylococcal Enterotoxin A and the TCR” Journal of Immunology 158, pp

4245–4251

14 Asao, T., Kumeda, Y., Kawai, T., Shibata, T., Oda, H., Haruki, K., Nakazawa,

H., Kozaki, S (2003), “An extensive outbreak of staphylococcal food poisoning due to low-fat milk in Japan: Estimation of enterotoxin A in the incriminated

milk and powdered skim milk’’, Journal of Epidemiology Infectionous 130, 33–

40

15 Asenjo, J.A and B.A Andrews (2009), “Protein purification using

chromatology: selection of type, modelling and optimization of operating

condition”, Journal of Molecular Recognit 22(2), pp 65-76

16 Atanmassova V, Meindl A và Ring C (2001), “Prevalence of Staphylococcus

aureus and staphylococci enterotoxin in raw pork and uncooked smoked ham – a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR”, International Journal of Food Microbiology 68: 105-113

17 Audrey W Jarvis, R C Lawrence, and G G Pritchard (1973), “Production of

Staphylococcal enterotoxins A, B and C under conditions of controlled pH and

aeration”, Journal of Infection and Immunity 7(6), pp 847-854