Xác định tỷ lệ nhiễm enterovirus ở bệnh nhi vào điều trị tại bệnh viện nhi trung ương năm 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Khúc Thị Rềnh Hoa XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ENTEROVIRUS Ở BỆNH NHI VÀO ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG NĂM 2011 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nộ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Khúc Thị Rềnh Hoa

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ENTEROVIRUS Ở BỆNH NHI VÀO ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG

ƯƠNG NĂM 2011

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Khúc Thị Rềnh Hoa

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ENTEROVIRUS Ở BỆNH NHI VÀO ĐIỀU TRỊ TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG

ƯƠNG NĂM 2011

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số:60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHÙNG THỊ BÍCH THỦY

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Với tất cả sự kính trọng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Phùng Thị Bích Thủy – Trưởng khoa Nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm -

Bệnh viện Nhi Trung Ương Chị đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp và tác phong làm việc nghiêm túc, đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Chị đã xây dựng ý tưởng và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn tới tất cả các bạn đồng nghiệp trong khoa Nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh truyền nhiễm - Bệnh viện Nhi Trung Ương đã giúp đỡ động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học và các thầy cô giáo bộ môn Vi sinh – Trường đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã cho tôi những ý kiến quý báu, giúp đỡ để tôi có thể bảo vệ thành công đề tài này

Và cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đồng nghiệp đã luôn yêu thương, khuyến khích, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này

Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó

Hà Nội, tháng 11 năm 2015

Khúc Thị Rềnh Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH DO ENTEROVIRUS Error! Bookmark not defined

1.1.1 Giới thiệu chung về bệnh do Enterovirus (EVs) gây ra Error! Bookmark not defined

1.1.2 Dịch tễ học bệnh do Enterovirus gây ra Error! Bookmark not defined 1.2 ENTEROVIRUS Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phân loại Error! Bookmark not defined 1.2.2 Cấu trúc của Enterovirus Error! Bookmark not defined 1.2.3 Quá trình sao chép của EVs Error! Bookmark not defined

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN EV TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Error! Bookmark not defined 1.3.1 Mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 1.3.2 Phương pháp nuôi cấy virus Error! Bookmark not defined 1.3.3 Phương pháp huyết thanh học Error! Bookmark not defined 1.3.4 Phương pháp sinh học phân tử Error! Bookmark not defined CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Cỡ mẫu Error! Bookmark not defined 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.4.Thời gian nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined

2.3 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN

CỨU Error! Bookmark not defined 2.3.1 Mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 2.3.2 Sinh phẩm và hóa chất Error! Bookmark not defined 2.3.4 Các bước tiến hành chẩn đoán Error! Bookmark not defined CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH EV ĐƯỢC CHẨN ĐOÁN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

SINH HỌC PHÂN TỬ Error! Bookmark not defined 3.1.1 Tỷ lệ dương tính EVs chẩn đoán theo phương pháp RT-PCR Error! Bookmark not defined

3.1.2 Tỷ lệ EVs dương tính chẩn đoán theo phương pháp realtime RT-PCR

Error! Bookmark not defined

3.2 TỶ LỆ DƯƠNG TÍNH EV71 CHẨN ĐOÁN THEO PHƯƠNG PHÁP SINH

HỌC PHÂN TỬ Error! Bookmark not defined 3.2.1 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán theo phương pháp RT-PCR Error! Bookmark not defined

3.2.2 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán theo phương pháp realtime RT-PCR

Error! Bookmark not defined

3.3 So sánh tỷ lệ dương tính EVs và EV71 được chẩn đoán bằng hai phương

pháp RT-PCR và realtime RT-PCR Error! Bookmark not defined 3.4 TỶ LỆ PHÂN BỐ EVs VÀ EV71 THEO GIỚI TÍNH Error! Bookmark not defined

3.4.1 Tỷ lệ phân bố EVs theo giới tính Error! Bookmark not defined 3.4.2 Tỷ lệ phân bố EV71 theo giới tính Error! Bookmark not defined 3.5 TỶ LỆ PHÂN BỐ EVs VÀ EV71 THEO NHÓM TUỔI Error! Bookmark not defined

3.5.1 TỶ lệ phân bố EVs theo nhóm tuổi Error! Bookmark not defined 3.6.2 Tỷ lệ phân bố EV71 theo nhóm tuổi Error! Bookmark not defined 3.6 TỶ LỆ PHÂN BỐ EVs VÀ EV71 THEO MÙA Error! Bookmark not defined

3.6.1 Tỷ lệ phân bố EVs theo mùa Error! Bookmark not defined 3.6.2 Tỷ lệ phân bố EV71 theo mùa Error! Bookmark not defined 3.7 Tỷ lệ phân bố EVs và EV71 theo địa dƣ Error! Bookmark not defined 3.8 Tỷ lệ trẻ nhiễm EVs và EV71 với các triệu chứng nhập viện Error! Bookmark not defined

3.9 Tỷ lệ gây biến chứng do EVs và EV71 ở trẻ Error! Bookmark not defined KHUYẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.2 Tình trạng nhiễm Poliovirus trên thế giới 8

Bảng 2.1 Sinh phẩm và hóa chất dùng trong nghiên cứu 37 Bảng 2.2 Trình tự mồi và probe được sử dụng trong nghiên cứu 38 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đoán EV 40 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR EV 41 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đoán EV 42 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR EV 42 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng RT-PCR chẩn đoán EV71 43 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR EV71 43 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng Realtime RT-PCR chẩn đoán EV71 44 Bảng 2.10 Chu trình nhiệt cho phản ứng realtime RT-PCR EV71 44 Bảng 3.1 Tỷ lệ dương tính EV chẩn đoán đoán bằng phương pháp RT-PCR 47

Bảng 3.2 Tỷ lệ dương tính EV chẩn đoán bằng phương pháp realtime

Bảng 3.3 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR 51

Bảng 3.4 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán bằng phương pháp realtime

Bảng 3.5 So sánh kết quả chẩn đoán EV bằng hai phương pháp RT-PCR và

Bảng 3.6 Nồng độ EVs các mẫu phát hiện thêm bằng kỹ thuật realtime

Bảng 3.7 So sánh kết quả chẩn đoán EV71 bằng hai phương pháp RT-PCR 57

và realtime RT-PCR

Bảng 3.8 Chu kỳ ngưỡng các mẫu dương tính EV71 phát hiện thêm bằng kỹ

Bảng 3.15 Tỷ lê phân bố EVs và EV71 theo địa dư 68

Bảng 3.16 Tỷ lệ nhiễm EVs và EV71 với các nguyên nhân nhập viện khác

Bảng 3.17 Tỷ lệ biến chứng ở trẻ nhiễm EVs và EV71 71

DANH MỤC HÌNH

Hình Tên hình Tran

g

Hình 1.1 Bản đồ biểu thị chỉ số xuất hiện thường xuyên và tỷ lệ mắc của

Hình 1.2 Sự tổ chức cấu trúc vỏ capsit của mô ̣t EV 14

Hình 1.3 Hê ̣ gen của EV P1, P2, P3 là các sản phẩm của quá trình cắt nối

protein ban đầu của phân tử polyprotein 16 Hình 1.4 Cấu trúc vỏ và cấu trúc hệ gen của EV 18

Hình 1.5 Mô ̣t đoa ̣n trình tự axit amin VP1 (đoa ̣n 150 - 200) của các chủng

Hình 1.6 Các kiểu gen EV71lưu hành từ năm 1970 - nay 19

Hình 1.7 Mối liên hệ của các subgenogroup EV71 trong khu vực Châu Á

Hình 1.10 Tác dụng của EV71 trên các tế bào thận khỉ rherus 26

Hình 1.12 Biểu đồ quan hệ giữa chu kỳ và tín hiệu huỳnh quang trong phản

Hình 1.14 Biểu đồ phản ứng định lượng Realtime PCR 33 Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR chẩn đoán EV 46 Hình 3.2 Tỷ lệ dương tính EV chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR 47

Hình 3.3 Kết quả Realtime RT-PCR chẩn đoán EV 48

Hình 3.4 Tỷ lệ dương tính EV chẩn đoán bằng phương pháp realtime

Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR chẩn đoán EV71 50 Hình 3.6 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR 52 Hình 3.7 Kết quả realtime RT-PCR chẩn đoán EV71 53

Hình 3.8 Tỷ lệ dương tính EV71 chẩn đoán bằng phương pháp realtime

Hình 3.9 Đồ thị phản ứng realtime RT-PCR đo nồng độ EVs 56

Hình 3.16 Tỷ lệ phân bố EVs và EV71 theo địa dư 69

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt

1 Cục Y tế dự phòng - Bộ Y tế(2011), “Báo cáo tình hình bệnh tay chân miệng trên toàn quốc và các biện pháp phòng chống dịch đã triển khai"

2 Trương Hữu Khanh và cộng sự (2003), “ Viêm não cấp ở trẻ em nhận dạng tác

nhân EV71 ” Tạp chí y học thực hành, số 462/2003 Bộ Y tế xuất bản, tr 210 -

214

3 Ngô Thị Hiếu Minh (2010), “Nghiên cứu dịch tễ, lâm sàng, cận lâm sàng bệnh tay chân miệng trẻ em ở viện Nhi Trung ương”.Luận văn thạc sỹ y học, Đại học

y, Hà Nội

4 Tăng Chí Thượng, Nguyễn Thanh Hùng, Đỗ Văn Niệm, Trương Hữu Khanh,

Bạch Văn Cam, Nguyễn Bạch Huệ, Lê Anh Tuấn, Lê Phan Kim Thoa, (2008)

"Đặc điểm dân số học và biểu hiện lâm sàng bệnh chân tay miệng do

Enterovirus",tạp chí y học thực hành, 15(3), tr 87-93

Tài liệu tiếng Anh

5 Armando M., De Palma, Inge Vliegen, Erik De Clercq, Johan Neyts, (2008),

"Selective Inhibitors of Picornavirus Replication" Medicinal Research Reviews DOI 10.1002/med.20125

6 Atkinson W., Hamborsky J., McIntyre L., Wolfe S (2009), "Poliomyelitis"

Epidemiogy and Prevention of Vaccine- Preventable Diseases (11), pp 231-44

7 Baek KA., Yeo SG et al.(2011), “Epidemics of enterovirus infection in

Chungnam, Korea 2008 and 2009”, (2010),Virol.J8: 297, doi: 10.1186/1743-422X-8-297

8 Chatterjee S., Quarcoopome CO., Apenteng A (1970), "Unusual type of

epidemic conjunctivitis in Ghana" Br Jophthalmol 54, pp 628-630

9 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2006), "Update on

vaccine-derived polioviruses" MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55 (40), pp 1093–1097

10 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2008), "Progress toward interruption of wild poliovirus transmission-worldwide, January 2007–April

2008" MMWR Morb Mortal Wkly Rep 57 (18), pp 489–494

11 Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (1994) "International Notes

Certification of Poliomyelitis Eradication - the Americas, 1994" MMWR Morb Mortal Wkly Rep 43 (39): 720–722

12 Douglas Douglas D Richman,Richard J Whitley,Frederick G Hayden, (2002),

clinnical virology, American Society for Microbiology, Washington DC.

13 General News "Major Milestone reached in Global Polio Eradication: Western Pacific Region is certified Polio-Free".Health Educ Res 16 (1): 109.doi:10.1093

14 Harley A., Rotbart, (2002), "Clinical Significance, Diagnosis, and Treatment of Picornavirus Infections", Clinical Virology, pp 357-365

15 Hawley HB., Morin DP., Geraghty ME., Tomkow J., Philips CA (1973),

"Coxsackievirus B epidemic at boy's summer camp isolation of virus from

swimmim water Jama med, 226(1), pp 33-36

16 Hayward JC et al (1989), "Outbreak of poliomyelitis-like paralysis associated

with enterovirus 71" Pediatric Infectious Disease Journal, 8(9), pp 611–616

17 Jang SK., H-G Krausslich, MJH Nicklin, GM Duke, AC Palmenberg, and E Wimmer, (1988), "A Segmentof the 5'Nontranslated Region of Encephaomyocarditis Virus RNA Directs Internal Entry of Ribosomes During

in Vitro Translation." J Virol, 62, pp 2636-43

18 Jenista JA., Powell KR., Menegus MA., (1984), "Epidemiologgy of neonatal

enterovirus infection", J Pediatr, 104, pp 685-90

19 Jeon JS., Kim JK., Yu J., Kim JW (2014), "Epidemic trends of Enterovirus

Infection from Pediatric Patients in Cheonan, Korea" J Clin lab Anal, doi: 10.1002/jcla.21830

20 Kinnunen E., T.Hovi., M Stenvik, O Hellstrom, J Porras, M.Kleemola, and M

L Kantanen, (1987), "Localized outbreak of enteroviral meningitis in adult"

Acta Neuro, 75, pp 346-351

21 Karen Meerovitch, Jerry Pelletier, and Nahum Sonenberg (1989), "5'-noncoding region of poliovirus RNA: implications for internal translation initiation",

Genes & Development, 3(7), pp 1026-1034

22 Mastny, Lisa, (1999), "Eradicating Polio: A Model for International

Cooperation" World watch Insitute

23 McMinn P., Stratov I, et al (2001), Neurological manifestations of enterovirus

71 infection in children during an outbreak of hand foot mouth disease in

Western Australia Clin infect Dis 201(32), pp 236-242

24 Melnick, J L (1990), "Enterovirus: Poliovirus, coxsakieviruses, echoviruses,

and newer enterovirus" In B N field, field virology, pp 549-605

25 Nishimura Y et al.(2009), “Human P- selectin glycoprotein ligand-1 is a

functional receptor for EV71”, Nature Medicine, 15(7), pp.794-798

26 Nino Khetsuriani, MD, Ashley LaMonte-Fowlkes, MPH, M Steven Oberste, PhD, Mark A Pallansch, PhD Enterovirus Surveillance - United States,

1970-2005 Division of Viral Diseases, National Center for Immunization and Respiratory Diseases

27 Ngoc TB Nguyen, Hau V Pham, Cuong Q Hoang, Tien M Nguyen, Long T Nguyen, Hung C Phan, Lan T Phan, Long N Vuand Nguyen N Tran Minh (2014), "Epidemiological and clinical characteristics of children who died from

hand, foot and mouth disease in Vietnam, 2011" BMC Infectious Diseases , 14,

pp 341

28 Noordhoek GT., Weel JF., Poelstra E., Hooghiemstra M., Brandenburg AH (2008), "Clinical validation of a new real-time PCR assay for detection of enteroviruses and parechoviruses, and implications for diagnostic procedures"

J Clin Virol, 41(2), pp 75-80

29 Oberste MS., Maber K., Kilpartrick DR et al (1999), "Typing of human enterovirus by partial sequencing of VP1" J Clin microbial, 37, pp 1288 -

1293

30 Ooi EE, et al (2002), Seroepidemiology of human enterovirus 71, Singapore

31 Ooi MH, et al (2010), Clinical features, diagnosis and management of human

enterovirus 71 infection Lancet Neurology, 9(11), pp 1097–1105

32 Ooi MH, et al (2007), "Evaluation of different clinical sample types in diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-and-mouth disease"

Journal of Clinical Microbiology, 45(6), pp 1858–1866

33 Perez-Velez CM et al (2007), “Outbreak of neurologic EV71 disease a

diagnostic challenge”, Clin.Infect.Dis, 45, pp 950-957

34 Phan Van Tu, Nguyen Thi Thanh Thao, David Perera, Truong Khanh Huu, Nguyen Thi Kim Tien, Tang Chi Thuong, Ooi Mong How, Mary Jane Cardosa, and Peter Charles McMinn, (2007), "Epidemiologic and Virologic Investigation

of Hand, Foot, and Mouth Disease, Southern Vietnam, 2005" Emerging Infectious Diseases, 13 (11), pp 1733-1741

35 Piyada Linsuwanon,Jiratchaya Puenpa, Sheng-Wen Huang, Ya-Fang Wang, John Mauleekoonphairoj, Jen-Ren Wang and Yong Poovorawan, (2014), " Epidemiology and seroepidemiology of human enterovirus 71 among Thai

populations" Journal of Biomedical Science.doi:10.1186/1423-0127-21-16

36 Qunying Mao, Yiping Wang, Xin Yao, Lianlian Bian, Xing Wu, Miao Xu, and Zhenglun Liang, (2014),"Coxsackievirus A16 Epidemiology, diagnosis,

and vaccine" Hum Vaccin Immunother 10(2), pp 360–367

37 RomeroJR, Steven Hinrichs, Deborah Perry, Robert Kruger, Merrill Magelli, (1998), "Impact of Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

Diagnosis of Enterovirus Infections on the Care of Febrile Children" Pediatric Research 43, pp 156–156

38 Ru WP., Kang K., You AG., Xia SL (2010), "Analysis on clinical and

epidemiological characteristics of severe cases infected by EV71" Chinese journal of experimental and clinical virology, 24(6), pp 448-450

39 Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH (1974), "An apparently new enterovirus

isolated from patients with disease of the central nervous system" Journal of Infectious Diseases, 129(3), pp 304– 309