Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Dương Thị Nhàn NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR

ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Dương Thị Nhàn

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT LÀM GIÀU NHẰM XÁC ĐỊNH

SALBUTAMOL TRONG MẪU NƯỚC TIỂU VÀ THỊT LỢN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN SỬ DỤNG DETECTOR

ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC

Chuyên ngành : Hóa Phân Tích

Mã số : 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM THỊ NGỌC MAI

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em thực hiện luận luận văn này

Em xin chân thành cám ơn nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Quỳnh Hoa đã hỗ trợ em trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn GS Peter C Hauser, TS Mai Thanh Đức và ThS Bùi Duy Anh đã thiết kế lắp đặt và hỗ trợ các trang thiết bị cũng như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Em xin chân thành cám ơn công ty 3SAnalysis đã cung cấp thiết bị CE-C4D cho nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian em học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, các anh, chị nghiên cứu sinh, các bạn học viên, các em sinh viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần, tận tình giúp đỡ em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 05 tháng 12 năm 2015

Học viên

Dương Thị Nhàn

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Tổng quan về Salbutamol Error! Bookmark not defined 1.1.1 Giới thiệu chung về Salbutamol Error! Bookmark not defined 1.1.2 Vấn đề sử dụng Salbutamol trên thế giới Error! Bookmark not defined 1.1.3 Vấn đề sử dụng Salbutamol ở Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2 Các phương pháp xác định Salbutamol Error! Bookmark not defined 1.2.1 Phương pháp điện hóa 5

1.2.2 Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 6

1.2.3 Các phương pháp sắc ký 7

1.2.3.1 Các phương pháp sắc ký lỏng 7

1.2.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 8

1.2.4 Các phương pháp điện di mao quản 8

1.3 Phương pháp xác định Salbutamol bằng CE-C 4

DError! Bookmark not defined

1.3.1 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của hệ CE cơ bảnError! Bookmark not defined

1.3.2 Giới thiệu về detector đo độ dẫn không tiếp xúc C4DError! Bookmark not defined

1.3.3 Một số công trình xác định Salbutamol bằng CEError! Bookmark not defined

1.4 Các phương pháp làm giàu chất phân tích Error! Bookmark not defined

1.4.1 Phương pháp chiết lỏng – lỏng Error! Bookmark not defined

1.4.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) Error! Bookmark not defined

1.4.2.1 Nguyên tắc của chiết pha rắn Error! Bookmark not defined

1.4.2.2 Cơ chế của chiết pha rắn Error! Bookmark not defined

1.4.2.3 Các loại cột SPE Error! Bookmark not defined

1.4.2.4 Một số công trình làm giàu Salbutamol bằng chiết pha rắnError! Bookmark not defined

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM Error! Bookmark not defined

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.1.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2.1 Phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined

2.2.2 Phương pháp lấy mẫu phân tích Error! Bookmark not defined

2.2.3 Phương pháp xử lý mẫu Error! Bookmark not defined

2.2.4 Quy trình xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắnError! Bookmark not defined 2.2.5 Quy trình xử lý mẫu thịt bằng phương pháp chiết pha rắnError! Bookmark not defined

2.3 Trang thiết bị và hóa chất Error! Bookmark not defined

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng Error! Bookmark not defined

2.3.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined

2.3.2.1 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined

2.3.2.2 Hóa chất dung môi Error! Bookmark not defined

2.3.2.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất Error! Bookmark not defined

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tíchError! Bookmark not defined 2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)Error! Bookmark not defined

2.4.2 Độ lặp lại của phương pháp Error! Bookmark not defined

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương phápError! Bookmark not defined

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 Đánh giá phương pháp phân tích CE-C 4 D Error! Bookmark not defined

3.1.1 Xây dựng đường chuẩn cho Salbutamol Error! Bookmark not defined

3.1.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn phát hiện (LOQ) của thiết bịError! Bookmark not defined 3.1.3 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị Error! Bookmark not defined

3.2 Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện chiết pha rắn làm giàu Sabutamol trong

mẫu nước tiểu Error! Bookmark not defined

3.2.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết Error! Bookmark not defined

3.2.2 Khảo sát đệm chiết Error! Bookmark not defined

3.2.3 Khảo sát quá trình rửa tạp Error! Bookmark not defined

3.2.4 Khảo sát dung môi rửa giải Error! Bookmark not defined

3.2.5 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol trong mẫu nước tiểu bằng kĩ

thuật CE-C4D kết hợp chiết pha rắn Error! Bookmark not defined

3.2.5.1 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương phápError! Bookmark not defined

3.2.5.2 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp Error! Bookmark not defined

3.2.5.3 Đánh giá độ đúng của phương pháp Error! Bookmark not defined

3.2.6 Phân tích mẫu thực tế Error! Bookmark not defined

3.3 Nghiên cứu, tối ưu các điều kiện trong quá trình chiết pha rắn làm giàu

Sabutamol trong mẫu thịt lợn Error! Bookmark not defined

3.3.1 Chuẩn bị mẫu Error! Bookmark not defined

3.3.2 Khảo sát lựa chọn cột chiết Error! Bookmark not defined

3.3.3 Khảo sát lựa chọn quy trình rửa tạp Error! Bookmark not defined

3.4 Đánh giá phương pháp phân tích Salbutamol trong mẫu thịt bằng kĩ thuật

CE-C 4 D Error! Bookmark not defined

3.4.1 Đánh giá hiệu suất thu hồi Error! Bookmark not defined

3.4.2 Đánh giá độ lặp của phương pháp phân tích Salbutamol bằng CE-C4DError! Bookmark not defined 3.4.3 Kết quả phân tích mẫu thịt lợn thực tế Error! Bookmark not defined

3.5 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MSError! Bookmark not defined

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 11

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phương pháp phân tích Salbutamol Error! Bookmark not defined Bảng 3.1 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ của Salbutamol Error!

Bookmark not defined

Bảng 3.2 Giới hạn phát hiện của Salbutamol xác định bằng phương pháp điện di

mao quản CE-C4

D Error! Bookmark not defined

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CE-C4D trong định lượng

Salbutamol Error! Bookmark not defined Bảng 3.4 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiếtError! Bookmark not

defined

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn

Salbutamol Error! Bookmark not defined

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp dựa trên thêm chuẩn

Salbutamol Error! Bookmark not defined

Bảng 3.7 Kết quả phân tích hàm lượng Salbutamol trong 08 mẫu nước tiểu được

cung cấp Error! Bookmark not defined Bảng 3.8 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng loại cột chiếtError! Bookmark not

defined

Bảng 3.9 Kết quả hiệu suất thu hồi của từng quy trình rửa tạpError! Bookmark

not defined

Bảng 3.10 Khảo sát đánh giá độ thu hồi Error! Bookmark not defined

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp dựa trên thêm chuẩn

Salbutamol Error! Bookmark not defined Bảng 3.12 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS Error!

Bookmark not defined

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản Error!

Bookmark not defined

Hình 2.1 Các bước chiết pha rắn Error! Bookmark not defined Hình 2.2 Ảnh chụp hệ thiết bị CE-C4D triển khai tại Việt NamError! Bookmark

not defined

Hình 3.1 Đường chuẩn của Salbutamol Error! Bookmark not defined

Hình 3.2 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng (1) cột C18,(2) cột SCX

3ml và (3) cột SCX 6ml Error! Bookmark not defined

Hình 3.3 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khảo sát đệm chiết (1) đệm photphat

pH = 6, (2) đệm axetat pH=5,2 Error! Bookmark not defined

Hình 3.4 Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa tạp khác nhau (1; 2; 3; 4

tương ứng với quy trình 1; 2; 3; 4) Error! Bookmark not defined

Hình 3.5 Điện di đồ kết quả khảo sát với các quy trình rửa giải (1; 2; 3 tương ứng

với quy trình 1; 2; 3) Error! Bookmark not defined Hình 3.6 Điện di đồ giới hạn phát hiện Salbutamol trong mẫu nước tiểu Error!

Bookmark not defined

Hình 3.7 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng(1) cột C18 , (2) cột SCX

3ml và (3) cột SCX 6ml Error! Bookmark not defined

Hình 3.8 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp

khác nhau (1; 2; 3 tương ứng với quy trình 1; 2; 3).Error! Bookmark not defined

Hình 3.9 Điện di đồ so sánh kết quả phân tích khi sử dụng các dung dịch rửa tạp

khác nhau (4; 5; 6 tương ứng với quy trình 4; 5; 6).Error! Bookmark not defined

Hình 3.10 Điện di đồ kết quả phân tích mẫu thịt thực tếError! Bookmark not

defined

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

C4D Detector đo độ dẫn kết nối kiểu tụ điện

CE Phương pháp điện di mao quản

EOF Dòng điện di thẩm thấu

GC-MS Sắc ký khí khối phổ

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao – khối phổ…

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực

LC-ESI-MS/MS Sắc ký lỏng ghép với ion hóa khối phổ

Ppm Parts per million: phần triệu

%RSD % độ lệch chuẩn tương đối

UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

LỜI MỞ ĐẦU

Sử dụng chất tạo nạc mà phổ biến là Salbutamol trong chăn nuôi hiện nay đang là vấn đề nóng của nước ta Lợn ăn thức ăn có chứa Salbutamol sẽ tăng trọng nhanh, tỉ lệ nạc cao, thịt có màu đỏ tươi Tuy nhiên thịt lợn chứa dư lượng Salbutamol gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng như làm tăng huyết áp, tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa Mặc dù vậy, một số người chăn nuôi và các thương lái vì lợi nhuận đã bất chấp sức khỏe của người tiêu dùng, sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi gây hoang mang trong dư luận, Để đảm bảo sức khỏe cho người dân, lấy lại niềm tin của người tiêu dùng vào ngành chăn nuôi lợn cũng như đảm bảo tính công bằng cho những người chăn nuôi chân chính, việc nghiên cứu phát triển quy trình phân tích, kiểm tra hàm lượng Salbutamol có trong thức ăn chăn nuôi và các đối tượng chăn nuôi, thực phẩm là cần thiết Việc xác định Salbutamol ở nước ta chủ yếu được thực hiện tại các phòng thí nghiệm bằng phương pháp HPLC với quy trình phân tích phức tạp, giá thành phân tích cao Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D) gần đây được biết đến là một phương pháp phân tích mới với nhiều ưu điểm, đã được nghiên cứu, ứng dụng để phân tích Salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi [9, 20] Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn khá phức tạp và thường có hàm lượng Salbutamol thấp mà giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp CE-C4D còn hạn chế nên việc phân tích Salbutamol bằng phương pháp CE-C4D trong các nền mẫu này gặp khó khăn [12, 14] Vì vậy, việc nghiên cứu kỹ thuật làm sạch mẫu và làm giàu Salbutamol trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn sẽ làm tăng độ nhạy của phương pháp, giúp xác định được hàm lượng nhỏ của Salbutamol trong mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn bằng phương pháp CE-C4D, góp phần quản lý việc sử dụng Salbutamol trong chăn nuôi Do đó chúng tôi đã lựa

chọn đề tài “Nghiên cứu kỹ thuật làm giàu nhằm xác định Salbutamol trong mẫu nước tiểu và thịt lợn bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc”

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2002) - 54/2002/QĐ-BNN – ngày

20/06/2002 – Một số loại kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng trong sản xuất và

kinh doanh thức ăn chăn nuôi

2 Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2012) - 649/BNN-CN – ngày

15/03/2012- Kiểm soát chất cấm trong chăn nuôi

3 Nguyễn Thị Ánh Hường (2010), Nghiên cứu xác định các dạng asen vô cơ

trong nước ngầm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, Luận án Tiến sĩ Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên -

ĐHQGHN

4 Phạm Luận (2005), Cơ sở lý thuyết của Sắc kí điện di mao quản hiệu năng cao,

Giáo trình giảng dạy dành cho sinh viên chuyên ngành Hóa Phân tích, Trường

ĐH Khoa học Tự Nhiên Hà Nội

5 Phạm Luận, Xử lý mẫu phân tích, Giáo trình giảng dạy dành cho sinh viên

chuyên ngành Hóa Phân tích, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên Hà Nội

6 Nguyễn Văn Ri (2011), Các kỹ thuật phân tích Điện di, Sách chuyên đề cao

học, Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQG Hà Nội

7 Nguyễn Văn Ri (2011), Các phương pháp tách sắc ký, Sách chuyên đề cao

học, Đại học khoa học Tự nhiên-ĐHQG Hà Nội

8 Tạ Thị Thảo (2010), Bài giảng chuyên đề thống kê trong hóa phân tích, ĐH

Quốc gia Hà Nội

9 Đoàn Thị Tươi, Nguyễn Thị Hằng, Nguyễn Thị Quỳnh Hoa, Phạm Thị Ngọc Mai, Nguyễn Thị Ánh Hường, Mai Thanh Đức (2015), “Xác Định salbutamol và ractapamine bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng derector độ dẫn không tiếp xúc (CE-C4D)”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 20, Số 2

Tiếng Anh

10 Andy Zhai Agilent Technologies Co.Ltd, “Determination of β2-Agonists in

Pork with SPE Cleanup and LC-MS/MS Detertion”, Food Safety

11 AOAC International (2007), How to meet ISO 17025 requiremments for

method varification, USA

12 ChangYing Guo, Hong Zheng, Li-Gang Deng, Xiao Lu, Shan-Cang Zhao, Jiang-Sheng Mao, Yu-Tao Wang, Guo-Sheng Yang, Hassan Y.Aboul-Enein (2010), “UPLS-ESI-MS-MS Determination of three β2-Agonists in Pork”

Chromatography, 72, pp.79-84

13 Chen Huijing, Fan Sai, Miao Hong, Zhao Yunfeng, Wu Yongning (2012),

“Simultaneous Detection of Residues of 25β-Agonists and 23β2-Blockers in Animal Foods by High Performance Liquid Chromatography Coupled with

Linear Ion Trap Mass Spectrometry”, Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 60, pp 1898−1905

14 Dujuan Zhang, Yanni Teng, Keguang Chen, Sha Liu, Chunmin Wei, Benjie Wang, Guiyan Yuan, Rui Zhang, Xiaoyan Liu and Ruichen Guo (2011),

“Determination of β β2-Agonists in Pork Using Agilent SampliQ SCX Solid-Phase Extraction Cartridges and Liquid Chromatography-Tandem Mass

Spectrometry”, Biomedical Chromatography

15 Fabiana S Felix, Maria S.M Quintino, Alexandre Z Carvalho, Lúcia H.G Coelho, Claudimir L do Lago, Lúcio Angnes (2006), “Determination of Salbutamol in syrups by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (CE-C4D)”,Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40,

pp 1288–1292.)

16 J Pleadin, A Vulic, N Persi, S Terzic, M Andrisic and I Zarkovic (2013),

“Rapid Immunoassay Method for the Determination of Clenbuterol and

Salbutamol in Blood”, Journal of Analytical Toxicology, pp.1-5

17 Mukesh Maithani and ranjit singh (2011), “Development and validation of a

stability- Indicating HPLC method for the simultaneous determination of

salbutamol sulphate and theophylline in pharmaceutical dosage forms”, J Anala

Bioanal Techniques, pp.1-5