nghiên cứu và sản xuất nước giải khát từ trà xanh lên men

1.3 Mục tiêu nghiên cứu Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sẽ - Tìm hiểu khả năng lên men của vi khuẩn A.xylinum trong môi trường dịch trà trích ly - Đề xuất quy trình công nghệ lê

ĐỀ TÀI NCKH SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NƯỚC GIẢI KHÁT TỪ TRÀ XANH LÊN MEN

ĐỀ TÀI NCKH CẤP SINH VIÊN

NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT NƯỚC GIẢI

KHÁT TỪ TRÀ XANH LÊN MEN

MÃ SỐ: SV2010 - 49

NGƯỜI CHỦ TRÌ : PHẠM QUANG HUY

NGƯỜI THAM GIA : LÊ THỊ THÙY LINH

: ĐỒN MINH TUẤN

ĐƠN VỊ : KHOA CNHH&TP

TP HỒ CHÍ MINH – 2010

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 1

Mục Lục

I Tổng quan 4

1 Nhìn nhận đề tài 4

1.1 Đặt Vấn đề 4

1.2 Luận điểm mới của đề tài 4

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 4

1.4 Phạm vi đề tài 4

2 Nguyên liệu 5

2.1 Nước 5

2.2 Polyphenol 5

2.3 Flavonols và flavonol glycoside 8

2.4 Flavone 8

2.5 Acid phenolic và depside 8

2.6 Amino acid 8

2.7 Các hợp chất màu 9

2.8 Carbohydrate 10

2.9 Acid hữu cơ 10

2.10 Caffeine và các alkaloid khác 11

2.11 Khoáng 11

2.12 Vitamin 13

2.13 Enzyme 13

2.14 Dầu thơm 14

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 2

3 Giống vi sinh vật 15

3.1 Đặc điểm 15

3.2 Sinh hoá 16

II Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17

1 Vật liệu 17

1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

1.2 Dụng cụ - thiết bị - hóa chất 17

2 Phương pháp 18

3 Các phương pháp thí nghiệm 20

3.1 Chuẩn bị nguyên liệu 20

3.2 Phương pháp xác định các thông số cho quá trình trích ly 20

3.3 Phương pháp xác định tỷ lệ giống cấy 20

3.4 Phương pháp xác định các thông số của quá trình lên men 21

3.5 Thu nhận dịch lên men 22

3.6 Phương pháp khảo sát các thông số thanh trùng 22

3.7 Khảo sát tỷ lệ hương bổ sung 23

III Kết quả và bàn luận 24

1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly 24

2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi - cơ chất đến quá trình trích ly 25

3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly 27

4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấy đến quá trình lên men 28

5 Khảo sát ảnh hưởng của độ Brix ban đầu đến quá trình lên men 29

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 3

6 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 31

7 Khảo sát thời gian lên men 31

8 Khảo sát nhiệt độ lên men 32

9 Khảo sát các thông số của chế độ thanh trùng 33

9.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng 33

9.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thanh trùng 35

10 Khảo sát cảm quan sản phẩm 38

10.1 Xác định nồng độ chất hương bổ sung vào sản phẩm sau khi lên men phù hợp với thị hiếu người tiêu dùng 38

10.2 Đánh giá chất lượng cảm quan của sản phẩm 40

IV Kết luận và kiến nghị 42

1 Kết luận 42

2 Kiến nghị 44

Tài liệu tham khảo 45

Phụ lục 47

số quốc gia như: Ấn Độ, Nga, Mỹ, Trung Quốc, Nhật, Canada …Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được công dụng của sản phẩm này Tuy nhiên nhìn chung sản phẩm này trên thị trường còn chưa xuất hiện Đặc biệt, ở Việt Nam chưa được nhiều người biết đến Chính vì lý do trên, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu và sản xuất nước giải khát từ trà xanh lên men”, với mong muốn đưa ra một sản phẩm mới về trà đóng chai, sử dụng phương pháp lên men

1.2 Luận điểm mới của đề tài

Đưa ra được một sản phẩm nước giải khát mới, góp phần đa dạng hóa sản phẩm trà xanh đóng chai Sử dụng được lá trà xanh là nguyên liệu chính

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi sẽ

- Tìm hiểu khả năng lên men của vi khuẩn A.xylinum trong môi trường dịch trà trích ly

- Đề xuất quy trình công nghệ lên men trà xanh

- Đưa ra được sản phẩm trà xanh lên men đóng chai

1.4 Phạm vi đề tài

Do thời gian, trang thiết bị còn hạn chế, nên chúng tôi chỉ tiến hành:

- Khảo sát quá trình trích ly trà xanh nguyên liệu

- Khảo sát các điều kiện lên men

- Khảo sát quá trình thanh trùng sản phẩm

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 5

2 Nguyên liệu [TLTK 5, 10]

Thành phần hóa học trong lá trà

Trà xanh ngày nay được sử dụng làm thức uống rất phổ biến Thành phần các chất trong

lá trà rất đa dạng và có rất nhiều chất có hoạt tính tốt cho sức khỏe Nắm bắt được những thành phần hóa sinh trong trà để làm cơ sở cho việc nghiên cứu, tìm ra những sản phẩm mới từ trà nhằm tận dụng được những đặc tính tốt của trà

2.1 Nước

Nước là thành phần chủ yếu trong búp trà Nước có liên quan đến quá trình biến đổi hóa sinh trong búp trà và đến hoạt động của các men, là chất quan trọng không thể thiếu được để duy trì sự sống của cây Hàm lượng nước trong búp trà thay đổi theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái, tiêu chuẩn hái,…

2.2 Polyphenol

Tổng hàm lượng polyphenol trong búp trà non khoảng 20 – 35%, và trong lá trà tươi là khoảng 11 – 20% Polyphenol là một nhóm hợp chất phenolic mà trong đó catechin là thành phần chủ yếu Đây chính là thành phần chính tạo nên màu sắc và vị của dịch trà Nó cũng là thành phần cơ bản tạo nên chất lượng của trà

Polyphenol trong trà được chia làm 6 nhóm hợp chất là flavonols, hydroxy-4-flavonols, anthocyanins, flavones, flavonols and phenolic acids Trong số 6 nhóm trên thì nhóm Flavonols (mà chứa chủ yếu là catechin) là thành phần quan trọng nhất chiếm từ 60 – 80% tổng lượng polyphenol trong trà Khoảng 90 – 95% các flavonol này chịu tác động của quá trình oxy hóa tạo

ra các sản phẩm góp phần tạo màu và mùi vị cho dung dịch trà Các polyphenol là những hợp chất không màu và tan trong nước

Catechin, thành phần chiếm một lượng lớn trong tổng hàm lượng polyphenol là thành phần chính đóng vai trò tạo nên vị đắng và vị chát cho trà Thành phần này chính là tiền chất tạo nên theaflavin trong trà đen Các catechin chủ yếu trong lá trà đã được tìm thấy như EC, (-)-

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 6

ECG, (-)-EGC, (-)-EGCG, (+)-C, (+)-GC Ngoài ra còn có nhiều loại catechin khác chiếm tỷ lệ khá thấp trong lá trà Trong số những catechin này thì (-)-ECC và (-)-EGCG có vị đắng và chát nhiều hơn so với (-)-EGC và (-)-EC Tỷ lệ các catechin trong trà do yếu tố di truyền quyết định Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào các mùa khác nhau trong năm và các yếu tố môi trường Lượng catechin trong trà vào mùa hè (thường trà cho lá to hơn) thường cao hơn vào mùa xuân (thường cho lá nhỏ hơn) Lượng catechin trong lá trà giảm cũng đồng nghĩa với việc hàm lượng các chất

xơ tăng cao hơn Do vậy, những búp trà non thường cho chất lượng cao hơn bởi hàm lượng catechin nhiều hơn trong những lá già, có hàm lượng catechin ít và xơ nhiều Hàm lượng catechin trong trà chính là yếu tố quyết định đến phẩm chất của trà

Hình 1 Hình dạng tinh thể của các catechin khác nhau [TLTK 10]

Bảng 1 - Các catechin có trong trà [TLTK 10]

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 7

Hình 2 – Cấu trúc tinh thể của một số catechin Bảng 2 – Cấu trúc tinh thể và một số đặc tính vật lý của catechin trong trà

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 8

2.3 Flavonols và flavonol glycoside

Trong trà hàm lượng flavonol và flavonol glycoside không cao Flavonol trong trà gồm 3 chất chính là kaempherol, quercetin and myricetin Cả 3 flavonol này có thể tồn tại độc lập hoặc liên kết với nhóm glycoside Nhóm glycoside có thể là glucose, rhamnose hay galactose

Flavonol chính là hợp chất tạo nên tính chống oxy hóa trong trà

2.4 Flavone

Có khoảng 18 loại flavone đã được tìm thấy trong trà, trong đó có một số chất quan trọng như: vitexin, isovitexin, 3 isomers của C-glycosyl apigenin, saponarin, vicemin-2, theiferin A và theiferin B Các flavone này đều tan trong nước và tạo nên màu vàng cho dịch nước trà

2.5 Acid phenolic và depside

Các acid phenolic tồn tại trong trà là acid gallic, acid chlorogenic và acid courmaryl quicnic Depside quan trọng nhất trong trà là 3-galloyl quinic acid (còn gọi là theogallin) Các chất trên tồn tại trong trà với hàm lượng rất cao, do vậy, nó đang rất được quan tâm, nghiên cứu

về những tính năng của nó đến các đặc tính của trà Hàm lượng chất này thu được trong dịch trích trà xanh là khoảng 0.4 – 1.6 g/kg trọng lượng khô

2.6 Amino acid

Trong trà có khoảng 2 – 4% là các loại amino acid Trong đó, theanin (5-N-ethyl glutamine) là chất đáng chú ý nhất khi xét đến các amino acid trong trà Nó chiếm 50% tổng lượng amino acid tự do có trong trà Hợp chất này được tìm thấy trong trà dưới dạng tinh thể

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 9

không màu Theanine có hai đồng phân quang học là L-theanine và theanine Trong đó, theanine chiếm tỷ lệ khoảng 1,85% tổng lượng theanine Trà nếu có hàm lượng D-theanine thấp (< 1%) thì chất lượng của trà sẽ cao Tỷ lệ D-theanine trong trà sẽ tăng lên đáng kể nếu được dự trữ trong điều kiện nhiệt độ cao Tiền chất tổng hợp nên theanine trong trà là acid glutamic và ethylamine Quá trình sinh tổng hợp theanine được tiến hành từ rễ cây trà và sau đó được chuyển đến các lá non Do vậy, các amino acid trong trà tập trung chủ yếu trong rễ cây trà, nhưng không

D-có trong hạt trà Theanine trong trà hoạt động với vai trò là chất bảo vệ enzyme từ sự khử bởi sản phẩm polyphenolic

Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng theanine có tác dụng làm giảm huyết áp, và làm giảm stress ở những người làm việc căng thẳng

Ngoài ra, còn có 26 loại amino acid khác thường kết hợp với protein trong trà Các amino acid đó là acid glutamic, arginine, glutamine, aspartic acid, glycine, serine, asparagine, lysine,

threonine, histidine, α-alanine, ß-alanine, tyrosine, proline, hydroxyproline, valine,

S-methylmethionine, tryptophan, leucine, isoleucine, phenylalanine, glutanyl methylamide, aminobutylic acid, γ-N-ethylasparagine, cysteic acid, và pipecolic acid Trong số đó, hàm lượng của bốn amino acid đầu (glutamic, arginine, glutamine, aspartic acid) trong khoảng 200 – 280 mg/100 g trà đã được chế biến Hàm lượng cao của các amino acid này trong trà ảnh hưởng đến chất lượng trà, nâng cao chất lượng của trà Những amino acid này cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị đặc trưng của trà

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 10

neoxanthin Trong đó, ß-carotene, lutein, zeaxanthin là những hợp chất quan trọng nhất Tổng

lượng carotenoid trong lá trà theo nghiên cứu là khoảng 0.03 – 0.06% khối lượng chất khô Các

lá trà già chứa nhiều carotenoid hơn lá non Hàm lượng của ß-carotene, lutein, zeaxanthin gia

tăng đáng kể trong quá trình trưởng thành của lá Lượng carotenoid trong lá trà giảm đi trong suốt quá trình chế biến trà

2.8 Carbohydrate

Các loại đường cũng được tìm thấy trong lá trà Các đường tự do này chiếm khoảng 3 – 5% khối lượng chất khô, bao gồm glucose, fructose, raffinose, và stachyose Các đường này thay đổi dưới tác động của các điều kiện trồng trà và dưới điều kiện được che phủ Trong điều kiện tự nhiên, hàm lượng đường tự do trong trà cao hơn trong điều kiện trồng trọt dưới bóng râm Các monosaccharide và disaccharide trong trà là thành phần tạo nên vị ngọt cho dịch trích trà Các polysaccharide trong trà được chia thành hai loại là hemicellulose, cellulose (6 – 8% khối lượng chất khô) và các chất trích polysaccharide khác bao gồm các cặn đường, glucose, galactose, mannose, arabinose, xylose, ribose, và rhamnose Cellulose và hemicellulose có tác động đến tính chất dai của lá trà Hàm lượng cellulose và hemicellulose càng thấp thì lá trà càng dẻo, dai.Tính chất này ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chế biến trà Trà càng dai thì thành phẩm trà

có chất lượng càng cao Một lượng nhỏ tinh bột cũng được tìm thấy trong lá trà Các thành phần polysaccharide này đã được nghiên cứu là có tác dụng làm giảm hàm lượng đường trong máu, do vậy, sẽ rất hữu ích trong việc điều trị bệnh đái tháo đường

2.9 Acid hữu cơ

Trong búp non của trà cũng có chứa một số acid hữu cơ bao gồm cả acid dicarboxylic và acid tricarboxylic như acid succinic, acid oxalic, acid quinic, acid malic, acid citric,…Một số acid hữu cơ là thành phần tạo hương cho sản phẩm nước trà Một số acid không phải là hợp chất mang hương nhưng nó có thể chuyển hóa để tạo hương cho dịch nước trà thông qua các phản ứng oxy hóa hoặc các phản ứng khác Tổng lượng acid hữu cơ trong búp trà theo như nghiên cứu thì chiếm khoảng 0.5 – 2.0% khối lượng chất khô của búp trà tươi Trong số các acid hữu cơ có trong lá trà thì acid quinic là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất, kế đến là acid oxalic

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 11

2.10 Caffeine và các alkaloid khác

Hàm lượng caffeine trong búp trà tươi khoảng 2 – 5% Caffeine là một trimethyl dẫn xuất của purine 2,6-idol Hàm lượng caffeine trong trà chịu nhiều ảnh hưởng bởi loại trà và phương pháp tác động đến trà trong quá trình thu hái cũng như chế biến Caffeine này không bị biến đổi nhiều trong quá trình chế biến, hàm lượng caffeine giảm đi chủ yếu là do tác động từ quá trình chế biến nhiệt Hàm lượng caffeine trong búp non trà cao nhất vào mùa xuân và giảm dần cùng với sự phát triển của lá Hàm lượng caffeine trong lá thứ nhất và lá thứ hai chiếm khoảng 3.4% khối lượng chất khô cao hơn trong lá trà già (khoảng 1.5% khối lượng chất khô)

Bên cạnh đó, các methyl – xanthine khác như theobromine và theophylline, xanthine, hypoxanthine, và guanine cũng được tìm thấy trong búp trà non nhưng với một lượng rất nhỏ

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 12

Tỷ lệ trích ly của các thành phần chất khoáng khác nhau thì khác nhau trong suốt quá trình trích ly dịch trà Ví dụ như các nguyên tố bromine, potassium, có khả năng trích ly rất tốt trong dịch nước trà, trong khi một số nguyên tố khác thì chỉ có thể trích ly với một lượng rất nhỏ vào trong dịch trà

Cây trà là loại cây tập trung hàm lượng flourine cao Flourine trong lá trà thường cao, khoảng 100 – 200 mg/kg khối lượng chất khô trong cây trà, khoảng 300 – 400 mg/kg trong lá trà vào khoảng 1000 mg/kg trong lá trà già Flourine có vai trò ngăn ngừa các bệnh về men răng

Cây trà cũng là loại cây chứa hàm lượng nhôm cao Hàm lượng nhôm trong búp non trà cao hơn rất nhiều so với các loại cây trồng khác Lượng nhôm trong lá trà có khoảng 200 – 1500 mg/kg Tuy nhiên, hàm lượng này chỉ được trích ly một phần nhỏ vào dịch nước trà

Nguyên tố đồng cũng là một nguyên tố quan trọng trong lá trà bởi vì enzyme polyphenol oxidase chứa trong khoáng này Trong lá trà có chứa một lượng khoảng 12 – 18 mg/kg Tuy nhiên, hàm lượng đồng có thể gia tăng đến hàng trăm lần trong quá trình chế biến trà Manganese là một thành phần quan trọng tham gia vào hoạt động của hệ enzyme catalyses như DNAase, choline esterase, phosphotatase, phosphohexokinase, adenosine kinase, pectin kinase, trans-glutaminase, polymerase,…Trà là loại cây trồng rất giàu Mn với hàm lượng từ 200 đến

1200 mg/kg Hàm lượng Mn trong lá trà già nhiều hơn trong các cành non Trong quá trình trích

ly, khoảng 35% Mn được trích vào trong dịch trà

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 13

Bảng 3 – Thành phần khoáng trong lá trà

( Nguồn [TLTK 10]

2.12 Vitamin

Trà cũng có chứa nhiều loại vitamin như vitamin nhóm B, vitamin K, vitamin E,…Trong

đó, đặc biệt là vitamin C, hàm lượng vitamin C trong trà cao khoảng 150 – 300 mg/100g trà

2.13 Enzyme

Thành phần protein trong trà được xác định chủ yếu là do sự hiện diện của các enzyme, các enzyme này có vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình chế biến trà, trong đó, đặc biệt là enzyme polyphenol oxidase

- Chủng Acetobacter xylinum có nguồn từ Philippine Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi

khuẩn acetic Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae

- A.xylinum là loại vi khuẩn hình que dài khoảng 2μm, gram âm, đứng riêng lẽ hoặc xếp

thành chuỗi, có khả năng di động nhờ tiên mao

Hình 3 Vi khuẩn A.xylinum

- A.xylinum sinh trưởng ở điều kiện pH nhỏ hơn hoặc bằng 5, nhiệt độ khoảng 28-32oC và

có thể tích luỹ 4.5% acid acetic

- Có khả năng tạo thành váng hemicellulose khá dày trên môi trường lỏng, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4

- Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi

chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 16

3.2 Sinh hoá [TLTK 3]

- Đặc trưng sinh hóa của A.xylinum là việc sinh tổng hợp lớp màng cellulose trên môi

trường lỏng và sinh ra acid acetic

- A.xylinum hấp thụ đường glucose, saccharose từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào vi

khuẩn, glucose sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme Enzyme này có thể polyme hoá glucose thành cellulose

- A.xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy có bổ sung các chất dinh

dưỡng cần thiết Cellulose là những polysaccharide không tan trong nước mà tan trong môi trường kiềm Đó cũng là thành phần chính của màng tế bào thực vật

- Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môi trường lỏng

Vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide Lượng các oligo và các polysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào

- Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide

có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide Đơn vị monosaccharide được hoạt hoá thường là dẫn xuất của các uridin diphosphat (UDP-X)

- Sự tổng hợp diễn ra theo các phản ứng sau:

…X-X-X-X- + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP

n nhánh (n+1) nhánh -Cơ chế quá trình sinh tổng hợp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh hiện chưa rõ Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các enzyme transferase

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 19

Sơ đồ nghiên cứu

Chuẩn bị nguyên liệu

Xác định thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly trà

xanh

Xác định tỷ lệ giống cấy phù hợp

Khảo sát các thông số kỹ thuật của quá trình lên men

Thu dịch lên men

Khảo sát các thông số kỹ thuật của chế độ thanh trùng

Khảo sát cảm quan tỷ lệ hương bổ sung

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 20

3 Các phương pháp thí nghiệm

3.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Lá trà xanh được nhặt bỏ cuống, loại lá hư sâu, mang rửa nước, để ráo Sau đó mang cân định lượng và vò để quá trình trích ly diễn ra hiệu quả hơn

3.2 Phương pháp xác định các thông số cho quá trình trích ly [4, 11, 14]

Vì sản phẩm sau khi hoàn thành sẽ là một dạng nước giải khát, do đó chúng tôi lựa chọn dung môi trích ly là nước Để xác định được thông số quá trình, chúng tôi tiến hành những thí nghiệm sau:

- Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly [TLTK 4]

Nguyên tắc: Cân chính xác 10 gram trà, bổ sung nước theo tỷ lệ 1:15, sau đó tiến hành

trích ly ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 80oC, 85oC, 90oC, 95oC, 100oC Thời gian trích ly là

45 phút, sau đó tiến hành lọc và đo hàm lượng polyphenol theo phương pháp Prussian Blue

- Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi : cơ chất đến quá trình trích ly

[TLTK 4]

Nguyên tắc: Cân khoảng 10 gram trà, sau đó cho vào erlen Cho nước vào erlen theo tỷ lệ

từ 1:5 đến 1:30 Tiến hành trích ly trong 45 phút, nhiệt độ 850C Lưu ý: nước phải được nâng nhiệt lên đến 850C trước khi cho vào bình trích Sau đó tiến hành lọc lấy dịch trích, đem xác định hàm lượng polyphenol theo phương pháp Prussian Blue

- Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly

Nguyên tắc: Cân chính xác 10 gram trà, bổ sung nước theo tỷ lệ 1:15, tiến hành trích ly ở

900C, với các chế độ thời gian khác nhau: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 phút Sau đó lọc lấy dịch, mang xác định hàm lượng polyphenol theo phương pháp Prussian Blue

Phương pháp Prussian Blue [ TLTK 6 ]

Lấy 0.1 ml dung dịch (chất chuẩn hoặc mẫu cần đo đã pha loãng đến nồng độ thích hợp) cho vào ống nghiệm, cho tiếp 3ml nước cất, lắc đều, tiếp theo cho nhanh 1ml K3Fe(CN)6 và 1 ml FeCl3, lắc đều dung dịch Để yên dung dịch trong 15 phút, sau đó bổ sung chất ổn định cho đủ 10ml, đo độ hấp thu A tại bước sóng 700nm

3.3 Phương pháp xác định tỷ lệ giống cấy

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 21

Đặc trưng của giống vi khuẩn A.xylinum là tạo váng cellulose trên bề mặt canh trường lên

men, chính vì vậy việc xác định số lượng giống cấy là rất khó khăn Tuy nhiên, sự gia tăng khối

lượng màng cellulose trong quá trình lên men lại tỷ lệ thuận với số lượng A.xylinum có trong

dịch lên men Do đó, chúng tôi xác định số lượng vi khuẩn lên men gián tiếp thông qua khối lượng màng cellulose

Nguyên tắc: Cân chính xác khối lượng màng cellulose cho vào dịch trích ly Sau đó rửa qua nước

muối vô trùng 3 lần Đem sấy đến khối lượng không đổi bằng thiết bị sấy đối lưu Cân chính xác khối lượng màng cellulose như trên, chuẩn bị 10 erlen, mỗi erlen chứa 350ml dịch trước lên men, cho vào lên men Sau mỗi ngày, lấy lớp màng cellulose từ 1 erlen ra, mang rửa nước muối, sấy đến khối lượng không đổi So sánh sự chênh lệch khối lượng giữa các mẫu

Lưu ý: Tiến hành lên men với 3 khối lượng màng cellulose ban đầu khác nhau

3.4 Phương pháp xác định các thông số của quá trình lên men [TLTK 3, 4, 9, 10]

Quá trình lên men là quá trình quan trọng nhất, do đó để đưa ra một quy trình công nghệ

phù hợp, việc kiểm soát quá trình này là rất cần thiết Vì loài A.Xylinum có khoảng nhiệt độ sinh

trưởng tối ưu là 300C Do đó, chúng tôi có định nhiệt độ lên men ở nhiệt đô phòng ( 29-310

C) giảm chi phí năng lượng và đầu tư thiết bị Sau khi đã cố định nhiệt độ, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm sau:

- Thí nghiệm: Khảo sát hàm lượng chất khô hòa tan ảnh hưởng đến quá trình lên men

[TLTK 3 4]

Nguyên tắc: Bổ sung saccharose vào dịch trích ly với các tỷ lệ sao cho dịch trích ly đạt

nồng độ: 5%, 7.5%, 10% (xác định bằng Brix kế), sau đó tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng, thời gian lên men là 10 ngày Trong quá trình lên men, đo sự biến đổi hàm lượng đường sót

- Thí nghiệm: Khảo sát pH ảnh hưởng đến quá trình lên men [TLTK 3, 4]

Nguyên tắc: Chỉnh pH vào dịch trích ly với các tỷ lệ, sao cho pH đầu là: 5.5, 5, 4.5, sau

đó tiến hành lên men ở nhiệt độ phòng, thời gian lên men là 10 ngày Trong quá trình lên men,

đo sự biến đổi pH trong quá trình lên men

- Thí nghiệm: Khảo sát thời gian lên men

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 22

Nguyên tắc: Tiến hành thu dịch trích ly, bổ sung vào dịch trích ly saccharose với tỷ lệ tối

ưu ở thí nghiệm “Khảo sát hàm lượng chất khô hòa tan ảnh hưởng đến quá trình lên men” Sau

đó tiến hành lên men trong 11 ngày Trong quá trình lên men, tiến hành đo hàm lượng đường sót

và pH từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 11

3.5 Thu nhận dịch lên men [ TLTK 3]

Do lên men trà xanh là lên men bề mặt trong môi trường lỏng, do đó phương pháp thu nhận dịch lên men tương đối đơn giản, cụ thể là: sau khi xác định được thời điểm dừng quá trình lên men, chúng tôi tiến hành tách sinh khối ra khỏi dịch lên men Dùng vải lọc, lọc thô dịch lên men 3 lần Tiếp theo, tiến hành lọc chân không dịch lên men

3.6 Phương pháp khảo sát các thông số thanh trùng [TLTK 3, 4, 7]

Để sản phẩm có thể thương mại hóa, thì yêu cầu bắt buộc là thời gian bảo quản sản phẩm phải đủ dài và đảm bảo chất lượng sản phẩm không bị biến đổi Vì vậy khảo sát chế độ bảo quản

là yêu cầu bắt buộc Do sản phẩm có pH thấp, nên chúng tôi chỉ khảo sát các thông số thanh trùng mà không tiệt trùng Trong khâu bảo quản, số lượng tổng VSV hiếu khí là chỉ tiêu phản ánh mức độ hư hỏng của sản phẩm một cách khách quan Bên cạnh đó, khi xử lý thanh trùng thì làm lượng polyphenol, cũng như cảm quan của sản phẩm cũng bị ảnh hưởng theo, vì vậy việc xác định các thông số thanh trùng sẽ dựa vào: hàm lượng polyphenol, cảm quan sản phẩm và tổng số VSV hiếu khí Chúng tôi tiến hành xác định tổng số VSV hiếu khí thông qua những thí nghiệm dưới đây:

- Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thanh trùng

Nguyên tắc: Mang sản phẩm sau khi đóng chai thủy tinh 330ml, thanh trùng ở các nhiệt

độ khác nhau: 700

C, 800C, 900C, 950C Thời gian thanh trùng 25 phút Sau khi thanh trùng đem

để ở nhiệt độ thường 3 tuần Tiếp đến mang tiến hành xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

- Thí nghiệm: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thanh trùng

Nguyên tắc: Mang sản phẩm sau khi đóng chai thủy tinh 330ml, thanh trùng ở các chế độ

thời gian khác nhau: 15 phút, 20 phút, 25 phút, 30 phút, 35 phút, 40 phút Nhiệt độ thanh trùng chọn từ thí nghiệm phía trên Sau khi thanh trùng đem để ở nhiệt độ thường 3 tuần Tiếp đến mang tiến hành xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 23

Nguyên tắc xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí [TLTK 6]

Sử dụng môi trường thạch tryptone glucose (Plate count agar) để nuôi cấy mẫu thực phẩm trong điều kiện hiếu khí ở nhiệt độ 300C, trong thời gian 48 giờ (Có thể sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient agar))

+ Chuẩn bị mẫu: Lấy 25ml mẫu cho vào erlen 250ml Tiếp đó, cho vào erlen 225ml nước

pepton hoặc nước vô khuẩn Ta thu được dung dịch có độ pha loãng 10-1 Sử dụng nước pepton hoặc nước vô khuẩn với các hệ số pha loãng là 10-2, 10-3…

+ Cấy mẫu: Mỗi mẫu thực phẩm cần được nuôi cấy ít nhất với ba độ pha loãng khác

nhau, sử dụng 2 hộp đĩa petri cho mỗi độ pha loãng Có thể sử dụng phương pháp đổ hộp hoặc cấy gạt để gieo cấy

+ Nuôi cấy: Nhiệt độ nuôi cấy là 300C Sau 48 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các hộp đĩa petri và tính kết quả sơ bộ Sau 72 giờ, tiến hành đếm số khuẩn lạc một lần nữa rồi tính kết quả chính thức

+ Cách tính kết quả

 Tiến hành đếm khuẩn lạc trên đĩa petri

 Cách tính kết quả: xem phần phụ lục

3.7 Khảo sát tỷ lệ hương bổ sung

Dịch lên men khi thu được của bất kỳ quá trình lên men nào cũng mang hương đặc trưng Đối với trà lên men, mùi đặc trưng tương đối khó chấp nhận với sản phẩm đóng chai Vì vậy chúng tôi bổ sung hương nhằm tạo ra giá trị cảm quan tốt cho sản phẩm Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp một yếu tố kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, mỗi đơn vị thí nghiệm là 350 ml Các nghiệm thức thí nghiệm:

Nghiệm thức 1: nồng độ chất hương bổ sung vào sản phẩm là 0.1ml

Nghiệm thức 2: nồng độ chất hương bổ sung vào sản phẩm là 0.3ml

Nghiệm thức 3: nồng độ chất hương bổ sung vào sản phẩm là 0.5ml

Nghiệm thức 4: nồng độ chất hương bổ sung vào sản phẩm là 0.7ml

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 24

III Kết quả và bàn luận

1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình trích ly Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với điều kiện như sau:

- Dung môi trích ly: nước

- Tỷ lệ dung môi : cơ chất là 15:1

- Thời gian trích ly: 45 phút

Thí nghiệm này dựa trên sự thay đổi độ hấp thu OD khi thực hiện đo các mẫu, có điều kiện trích ly khác nhau về nhiệt độ Khi đo chúng tôi thu được kết quả như sau:

Bảng 5 – Hệ số hấp thu OD qua các chế độ nhiệt độ trích ly

Đồ thị OD biểu diễn quá trình trích ly qua các chế độ nhiệt khác nhau

0 0.5

1 1.5

2 2.5

Hình 4 Đồ thị biểu diễn quá trình trích ly qua các chế độ nhiệt khác nhau

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 25

Thông qua đồ thị, chúng tôi nhận thấy, ở 800C khả năng trích ly vẫn còn có thể tăng lên được nữa, điều này là do ở chế độ này cấu trúc thành tế bào vẫn còn chịu đựng tốt, ngăn cản dịch bào tràn ra ngoài Do nguyên liệu sử dụng là lá trà, vì vậy vách tế bào có

C, nồng độ chất trích ly tỷ lệ nghịch với nhiệt độ Bởi vì,

đồ thị trên biểu diễn cho hệ số hấp thu OD của polyphenol, mà polyphenol gồm chủ yếu

là catechin, catechin thì không bền nhiệt Vì thế, khi trích ly ở nhiệt độ cao, vì một phần polyphenol trích ly được sẽ bị phân hủy, làm giảm độ OD Khi tiến hành xử lý số liệu, dựa vào bảng ANOVA (phụ lục 3) cũng cho thấy các chế độ xử lý nhiệt này có sự khác biệt và chế độ 850C là chế độ trích ly tốt nhất

2 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi - cơ chất đến quá trình trích ly

Quá trình trích ly, phụ thuộc vào nhiều yếu tố, ngoài nhiệt độ, thì tỷ lệ dung môi, loại dung môi…cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình này Dung môi trong đề tài này luôn

cố định là nước Trong thí nghiệm chúng tôi tìm ra sự tương quan giữa nồng độ chất trích

ly với tỷ lệ dung môi trích ly Điều kiện thí nghiệm cố định là:

- Dung môi trích ly: nước

- Nhiệt độ trích ly: 850C

- Thời gian trích ly: 45 phút

Thí nghiệm dựa trên sự thay đổi độ hấp thu OD khi thực hiện đo các mẫu, có điều kiện trích ly khác nhau về tỷ lệ dung môi Khi đo chúng tôi thu được kết quả như sau:

Bảng 6- Hệ số hấp thu OD qua các tỷ lệ trích ly khác nhau

Dựa vào bảng kết quả trên, chúng tôi xây dựng đồ thị biểu diễn sự thay đổi OD như sau:

OD trung

ĐH SPKT TP.HCM SV 2010 - 49 26

Đồ thị biểu diễn giá trị OD theo tỷ lệ dung môi : cơ chất

2.1 2.15 2.2 2.25 2.3 2.35 2.4 2.45 2.5 2.55 2.6

OD

Hình 5 Đồ thị biểu diễn giá trị OD theo tỷ lệ dung môi : cơ chất

Quan sát đồ thị, chúng tôi nhận thấy, ở tỷ lệ 1: 5, OD thấp có nghĩa là nồng độ các chất trích ly thấp Bởi vì với một lượng dung môi thấp, khi trích ly sẽ nhanh chóng làm cho dung dịch đạt trạng thái bão hòa, chất trích ly không thoát ra được nữa, do có sự cân bằng về nồng độ Ở chế độ từ 1:10 đến 1:20, OD tăng lên một cách đáng kể và đạt giá trị lớn nhất tại tỷ lệ 1:20 ( OD = 2.55) Theo chúng tôi, tại tỷ lệ này (thời gian trích ly là 45 phút) thì dung môi vừa đủ để quá trình trích ly diễn ra nhanh, hiệu quả nhất, hay nói cách khác động lực quá trình trích ly được đảm bảo

Ngay sau đó, đối với các tỷ lệ 1:25, 1:30, độ hấp thu OD đo được giảm rõ rệt Điều này được giải thích là: ở các tỷ lệ này, hàm lượng polyphenol trích ly ra được tăng không đáng kể so với tỷ lệ 1:20, nhưng thể tích dung môi lại có sự chênh lệch đáng kể (1:20, 1:25, 1:30), làm cho nồng độ chất trích ly giảm OD là thông số thể hiện nồng độ polyphenol trong dung dịch, điều này có nghĩa là từ tỷ lệ dung môi cơ chất 25:1 trở đi, nồng độ chất trích ly không tăng nữa mà còn giảm Nếu càng tăng thể tích dung môi thì hiệu quả trích ly càng giảm (đồ thị cũng cho thấy tỷ lệ 1:25 trích ly tốt hơn so với tỷ lệ 1:30) Tiến hành xử lý số liệu, dựa vào bảng ANOVA (phu lục 4) cũng cho thấy các tỷ lệ trích ly này có sự khác biệt và tỷ lệ 1:20 là tỷ lệ trích ly tốt nhất