Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn photobacterium damselae nhược độc phục vụ chế tạo vắc xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên cá biển

Một trong những bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được chủng vi khuẩn nhược độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng xuất huyế

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

VIệN ĐạI HọC Mở HÀ NộI KHOA CÔNG NGHệ SINH HọC -





 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG VI KHUẨN

PHOTOBACTERIUM DAMSELAE NHƯỢC ĐỘC PHỤC VỤ CHẾ TẠO

VẮC-XIN PHÒNG BỆNH TỤ HUYẾT TRÙNG TRÊN CÁ BIỂN

Giáo viên hướng dẫn : PGS.TS Phạm Thị Tâm Sinh viên thực hiện : Đỗ Thị Tuyết Nhung

Hà Nội – 2016

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 ii

LờI CảM ƠN

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ thuộc Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em có thể thực tập và hoàn thành đề tài này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS

Phạm Thị Tâm Giảng viên Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại Học Mở Hà

Nội, người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và dìu dắt em trong suốt quá trình

em thực tập và hoàn thành đề tài

Em không thể quên gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, những người thân, các anh chị khóa trước, bạn bè đã luôn bên em, tận tình giúp đỡ, cổ vũ động viên trong suốt thời gian em thực tập và hoàn thiện đề tài

Trong quá trình thực tập không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đóng góp ý kiến để em tiếp thu và hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn!

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

P.damselae Photobacterium damselae

BHI Broth Brain Heart Infusion Agar

Sucrose

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 iv

MụC LụC

LờI CảM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MụC LụC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn P.damselae 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới 3

1.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam 4

1.2 Tổng quan về bệnh tụ huyết trùng ở cá biển 4

1.3 Tổng quan về Photobacterium damselae 6

1.3.1 Phân loại khoa học 6

1.3.2 Đặc điểm hình thái 7

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 7

1.3.4 Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh 9

1.3.5 Nghiên cứu tạo Vac-xin vi khuẩn cho cá biển: 11

1.4 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc 13

1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước: 14

1.4.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn: 15

1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc 17

1.4.3.1 Tác nhân vật lý 17

1.5 Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xương 24

1.5.1 Miễn dịch đặc hiệu 24

1.5.2 Miễn dịch tự nhiên 25

PHầN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

2.2 Vật liệu nghiên cứu 26

2.2.1 Hóa chất 26

2.2.2 Môi trường và dung dịch nuôi cấy 26

2.2.3 Thiết bị 27

2.2 Nội dung nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.1 Phương pháp vi sinh 29

2.3.2 Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 29

2.3.2.1 Phương pháp gây đột biến bằng tia cực tím 29

2.3.2.2 Phương pháp gây đột biến bằng kháng sinh rifampicin 31

2.3.4 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm 31

PHầN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Kết quả tạo chủng đột biến nhược độc 33

3.1.1 Đánh giá khả năng gây bệnh của chủng gốc Photobacterium damselae 33

3.1.2 Đánh giá sơ bộ các dòng vi khuẩn được gây đột biến 35

3.1.2.1 Dòng vi khuẩn được gây đột biến bằng tác nhân tia UV 35

3.1.2.1 Dòng vi khuẩn được gây đột biến bằng tác nhân kháng sinh rifampicin 37

3.2 Đánh giá mức độ an toàn của các chủng đột biến 39

3.3 Đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

1 KẾT LUẬN 42

2 KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

Viện đại học mở Hà Nội Khoa công nghệ sinh học

DANH MụC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử 7

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine 19

Hình 1.3: Tác động tia UV làm cho DNA có một chỗ phình trong cấu trúc 20

Hình 1.4: Cấu trúc RNA polymerase (RNAP) 22

Hình 1.5 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP 23

Hình 1.6 Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB 23

Hình 2.1 Minh họa thí nghiệm chiếu tia UV 30

Hình 2.2 Vị trí tiêm cá ở gốc vâyCHƯƠNG III 32

Hình 3.1 Cá rô chết ở lô tiêm chủng DX3 35

về các vùng khí hậu ,thời tiết,chế độ thuỷ học Ven bờ có nhiều đảo ,vùng vịnh và hàng vạn hécta đầm phá, ao hồ sông ngòi nội địa,thêm vào đó lại có

ưu thế về vị trí nằm ở nơi giao lưu của các ngư trường chính, đây là khu vực được đánh giá là có trữ lượng hải sản lớn, phong phú về chủng loại và nhiều đặc sản quí Việt Nam có thế mạnh về khai thác và nuôi trồng thuỷ sản trên cả

3 vùng nước mặn, ngọt ,lợ Do đó thủy sản là một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của Việt Nam,có giá trị ngoại tệ xuất khẩu đứng hàng thứ tư trong các ngành kinh tế quốc dân (sau dầu, gạo, hàng may mặc)

Theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản,năm 2015 là một năm khó khăn của ngành nông nghiệp nói chung trong đó có thủy sản Đó là bất lợi chính từ thời tiết và thị trường Nhưng ngành thủy sản vẫn đạt được những kết quả khả quan trên nhiều phương diện Với tổng sản lượng thủy sản hơn 6,56 triệu tấn; trong đó, khai thác 3,03 triệu tấn, nuôi trồng 3,53 triệu tấn; diện tích nuôi trồng là 1,28 triệu ha; kim ngạch xuất khẩu khoảng 6,72 tỷ USD

Trong những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển đặc biệt là nghề nuôi cá biển Nghề nuôi cá biển phải kể đến là nuôi

cá lồng đang phát triển mạnh mẽ trên khắp thế giới Trong khi ở vùng ôn đới việc nuôi cá hồi (Salmon) đạt được mức tăng trưởng cao thì ở vùng nhiệt đới nhiều loài cá đang được nuôi phổ biến như cá chẽm, cá mú, cá hồng

Qua thống kê cho thấy, nghề nuôi cá rất phát triển nhưng bên cạnh đó người dân cũng gặp không ít khó khăn Một trong số những khó khăn đó là vấn đề bệnh dịch Theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên cá biển thường là virus, nấm, vi khuẩn trong đó nguy hiểm nhất là bệnh tụ huyết trùng (xuất huyết nhiễm trùng) do vi khuẩn

Photobacterium damselae gây ra Vi khuẩn tấn công và gây bệnh trên cá biển

nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển từ ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm

Trong thực tế, để khắc phục tình trạng nhiễm bệnh của cá người dân sử dụng thuốc clorin để xử lý môi trường tại khu vực nuôi hoặc sử dụng kháng

sinh để khống chế vi khuẩn Tuy nhiên việc làm này không đem lại hiệu quả, tình trạng cá nuôi nhiễm bệnh vẫn tiếp diễn gây thiệt hại nghiêm trọng cho cư dân nuôi trồng Do đó, người ta nghĩ ra phương pháp phòng bệnh cho cá trước khi nhiễm bệnh bằng sử dụng vắc-xin Việc nghiên cứu ra một loại vắc-xin phòng bệnh là vô cùng cần thiết Một trong những bước quan trọng để nghiên cứu ra vắc-xin là phải tạo được chủng vi khuẩn nhược độc, làm cơ sở ban đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ( xuất huyết nhiễm trùng) ở cá biển

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc phục

vụ chế tạo vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng trên cá biển.” làm cơ sở ban

đầu hướng đến việc sản xuất vắc-xin phòng bệnh tụ huyết trùng ở cá biển

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được chủng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc có khả

năng tạo kháng thể bảo hộ ở cá

3 Nội dung nghiên cứu

 Tạo được dòng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc bằng kỹ

thuật đột biến sử dụng tia UV

 Tạo được dòng vi khuẩn Photobacterium damselaenhược độc bằng kỹ

thuật đột biến sử dụng kháng sinh rifampicin

 Đánh giá lại mức độ gây bệnh qua lây nhiễm trên cá

 Đánh giá mức độ an toàn của chủng đột biến

 Đánh giá khả năng tạo kháng thể bảo hộ cho cá sử dụng vi khuẩn nhược độc

4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại Viện Đại học mở Hà Nội

Thời gian thực hiện: 07/2015 – 06/2016

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 3

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử phát hiện bệnh do vi khuẩn P.damselae

1.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh trên thế giới

Trùng là hiện tượng nhiễm trùng do vi khuẩn cũng được gọi là pseudotuberculosis bởi vì trong trường hợp mạn tính, bệnh biểu hiện trong một số cơ quan nội tạng ở cá những nốt sần màu trắng do vi khuẩn tích lũy

Đó chính là các vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae subsp.piscicida

(trước đây là Pasteurella piscicida) là yếu tố gây bệnh của huyết trùng[30]

Bệnh lần đầu tiên được phát hiện từ các quần thể cá rô trắng (Morone americanus) hoang dã và cá vược (Morone saxatilis) vào năm 1963 khi xảy ra bệnh dịch ở vịnh Chesapeake, Hoa Kỳ Sniezsko và đồng nghiệp đã đặt các vi sinh vật gây bệnh phân lập được từ quần thể cá này vào chi Pasteurella trên cơ

sở đặc tính hình thái và sinh hóa của chúng Sau đó, Jansen và Surgalla đã kiểm tra các vi sinh vật và phát hiện đủ sự phân biệt về đặc điểm sinh lý, từ

đó đề xuất tên mới cho chủng vi sinh vật gây bệnh là Pasteurella piscicida[30]

Căn bệnh dần bùng phát và gây ảnh hưởng lớn về kinh tế cả ở Nhật Bản, và ở khu vực Địa Trung Hải, do nó gây ra thiệt hại trong các trang trại cá tráp và cá chẽm Từ năm 1969, căn bệnh này đã là một trong những bệnh nguy hiểm tại Nhật Bản (Kusuda & Yamaoka, 1972) Từ năm 1990 nó trở thành mối đe dọa cho các trang trại cá Nam Châu Âu Gây ra thiệt hại về kinh

tế ở các nước châu Âu khác nhau trong đó có Pháp, Ý, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Bồ Đào Nha[28]

Bệnh lý bùng phát phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt

độ nước tăng lên trên 18-20°C Dưới nhiệt độ này, cá ở tình trạng ủ bệnh (Romalde, 2002) [36]

Vi khuẩn P.damselae có khả năng tuân thủ và xâm nhập vào tế bào biểu

mô cá Khả năng xâm nhập này đã được chứng minh trước đây bởi Magariños

et al (1996) và Yoshida et al (1997) Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên

của động học và độ đặc hiệu của quá trình này Hình ảnh bằng chứng của giai đoạn trong tế bào của P.damselae bên trong tế bào biểu mô cá được cung cấp bởi các quan sát bằng kính hiển vi điện tử và kỹ thuật huỳnh quang hiển vi ánh sáng Với đặc tính chọn lọc diệt vi khuẩn ngoại bào, kháng sinh Gentamycin được sử dụng trong các xét nghiệm Gentamycin để xác nhận sự xâm nhập vào biểu mô cá của P.damselae [23]

1.1.2 Lịch sử phát hiện bệnh ở Việt Nam

Ở Việt Nam, một số loài cá thuộc họ các mú, cá giò, cá vược cũng đã

phát hiện sự hiện diện của P.damselae Trong đó có các loài E.coioides,

E.fuscogutatus, E.tauvina, E.lanceolatus, E.malabaricus ở Khánh Hoà; loài E.coioides ở Cát Bà (Hải Phòng) và Cửa Hội (Nghệ An) Bệnh tụ huyết trùng trên cá biển tại Việt Nam được báo cáo lần đầu tiên vào năm 2002 trên cá mú

(Epinephelus spp) nuôi lồng trên vịnh Hạ Long Kết quả điều tra ở huyện Vân

Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh Bệnh xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10, nhiệt độ thích hợp bệnh phát triển 25-30oC

Kết quả điều tra sơ bộ của Khoa Nông Lâm Ngư – Trường đại học Vinh cho thấy cá nuôi tại vùng biển Nghệ An, Thanh Hóa thường gặp bệnh có dấu hiệu tương tự như bệnh tụ huyết trùng Tuy nhiên, cho tới nay ở Việt Nam vẫn chưa có một báo cáo khoa học cụ thể nào về tình hình dịch bệnh Biểu hiện bệnh lý bên ngoài cho thấy khi mắc bệnh, cá thường bỏ ăn, màu sậm đi, mang và nội tạng xuất huyết Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100%

1.2 Tổng quan về bệnh tụ huyết trùng ở cá biển

P.damselae đã được công nhận là một tác nhân gây bệnh của vi khuẩn

trong một loạt các động vật thủy sản như cá, động vật thân mềm và động vật giáp xác (Vera et al., 1991; Fouz et al., 1992; Company et al., 1999; Sung et al., 2001; Lozano-Leon et al., 2003; Labella et al., 2006; Wang & Cheng, 2006; Vaseeharan et al., 2007; Han et al 2009; Kanchanopas-Barnette et al.,

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 5

2009) Vi sinh vật này tồn tại sẵn trong các hệ sinh thái thủy sản, trong đó có thể tồn tại trong nước biển và trầm tích trong một thời gian dài, duy trì tính lây nhiễm và các đặc tính gây bệnh (Ghinsberg et al., 1995; Fouz et al., 1998;

2000) Ngoài ra, P.damselae có thể là tác nhân gây bệnh cho động vật có vú

kể cả con người (Morris et al., 1982; Clarridge & Zighelboim-Daum, 1985; Fujioka et al., 1988; Perez-Tirse et al., 1993; Yuen et al., 1993; Shin et al., 1996; Fraser et al., 1997; Tang & Wong, 1999; Goodell et al., 2004; Yamame

P.damselae được tìm thấy nhiều hơn trong các loài cá biển ở những

tháng thời tiết ấm áp Sự lây lan giữa cá bệnh sang cá khỏe xảy ra ngày càng

nhiều, vì có nhiều cá nhiễm P.damselae mà không có triệu chứng biểu hiện

bên ngoài nên người nuôi không biết để phòng trị

Sự bùng phát bệnh phụ thuộc vào nhiệt độ và thường xảy ra khi nhiệt

độ nước tăng lên trên 18oC, dưới nhiệt độ này cá ở tình trạng ủ bệnh[36].Dấu

hiệu điển hình của cá nhiễm P.damselae là xuất hiện vùng xuất huyết và tổn

thương loét trên bề mặt cơ thể Cá bệnh hầu hết có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài có thể quan sát được: xuất hiện vết loét trên da, xuất huyết ở vây đuôi, bong da, mòn vây, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da màu sẫm[34] Giải phẫu bên trong cơ thể cho thấy: thận bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô thận, gan tụy, mang và nội tạng xuất huyết, hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá nách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi [31] Bệnh cấp tính cá chết sau 3-5 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ 80-100%

Các báo cáo gần đây về sự phân lập của tác nhân gây bệnh từ cá biển

bị bệnh trên các loài nuôi mới, cho rằng P.damselae có thể được coi như là

một tác nhân gây bệnh mới nổi trong nuôi trồng thủy sản biển (Labella et al, 2011)

Để điều trị được bệnh tụ huyết trùng ở cá biển, một số nghiên cứu đã đề xuất biện pháp trị bệnh Pseudotuberculosis cho cá biển bằng cách cho ăn, tắm hoặc tiêm kháng sinh Biện pháp trộn kháng sinh vào thức ăn như trộn tetracyline 75-100 mg/kg cá, streptomycine 50-75 mg/kg cá, oxolinic acid 10 mg/kg cá và cho ăn liên tục trong 7 đến 10 ngày cũng cải thiện được tình

trạng nhiễm bệnh do vi khuẩn P.damselae Nhìn chung, kháng sinh là phương

pháp chọn lựa đầu tiên dùng trị bệnh do vi khuẩn Mặc dù kháng sinh đã đem lại hiệu quả điều trị nhất định trong một số trường hợp, nhưng việc lạm dụng kháng sinh đã tạo ra các chủng vi khuẩn kháng thuốc gây khó khăn cho quá trình điều trị

1.3 Tổng quan về Photobacterium damselae

1.3.1 Phân loại khoa học

Loài: Photobacterium damselae

Theo Love và các cộng sự, ban đầu Photobacterium damselae được mô

tả như một loài Vibrio gây bệnh mới, gây lở loét ở Chromis punctipinnis Kể

từ đó, các báo cáo về khả năng gây bệnh đối với nhiều loài cá khác nhau (cá bơn, cá hồi vân, cá tráp, cá vược, cá mập) và động vật có vú (cá heo, con

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202

người) đã tăng lên rất nhiều Ban đầu, P.damselae được mô tả như Vibrio damselae, sau đó chúng được phân loại lại là một thành viên trong chi Listonella Đến năm 1991, được chuyển giao cho các chi Photobacterium

Trong một nghiên cứu sau đó của Gauthier và các cộng sự (1995) về các tác nhân gây bệnh tụ huyết trùng ở một số loài cá đã xác định chủng vi khuẩn này

là một thành viên của Photobacterium damselae bằng phương pháp phân tích

loài theo các trình tự 16S rDNA và DNA [22]

1.3.2 Đặc điểm hình thái

Hình1.1 Hình thái vi khuẩn P.damselae dưới kính hiển vi điện tử

Photobacterium damselae là trực khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 - 0.8 µm x 0.7 - 2.6 µm, lưỡng cực [13]

1.3.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Về điều kiện nuôi cấy, vi khuẩn phát triển tốt nhất trên môi trường có nồng độ NaCl từ 1,0%- 2,5%, nhiệt độ nuôi cấy từ 15ºC- 32,5ºC Không phát triển trong môi trường có nồng độ NaCl 0%, 8%, 10%, 12% và không thể phát triển nếu thiếu Na+ Môi trường nuôi cấy cấp 1 tốt nhất là môi trường Brain Heart Infusion Agar (BHI agar), Thiosulfate Citrate Bile Salt

Sucrose(TCBS), Marine Agar hoặc môi trường thạch máu cừu (2% máu cừu) không bổ sung thêm muối Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết dạng β và quan sát được rõ ràng sau 48h ở nhiệt độ 28ºC [23,19]

Vi khuẩn bắt màu Gram âm, nhuộm lưỡng cực, khi nhuộm thường thấy

vi khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện tượng nguyên sinh chất bị dung giải về hai đầu của vi khuẩn Là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện;không có khả năng phát quang và không sinh bào tử Dương tính với các phản ứng oxidase, catalase, methyl red, khử nitrate, sinh acid từ glucose Âm tính với các phản ứng indol, citrate, phân giải gelatin, không sinh H2S (phản ứng KIA), không sử dụng sucrose (trong môi trường TCBS) [37]

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 9

Bảng 1.1 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn P.damselae[37]

Các phản ứng sinh lý, sinh hóa Photobacterium damselae

-

-

V

- +

- +

-

+

- +

- + +

-

V + (+) dương tính; (-) âm tính; (V) dương tính hoặc âm tính

1.3.4 Độc tố vi khuẩn và cơ chế gây bệnh

Photobacterium damselae, trước đây là Vibrio damselae, là một tác nhân

gây bệnh của một loạt các động vật biển như cá, động vật giáp xác, động vật

thân mềm và các loài thú biển Ở con người, nó có thể gây ra nhiễm trùng và

có thể phát triển thành hoại tử fasciitis gây tử vong Mặc dù các cơ sở di truyền về độc lực của vi khuẩn ở đây không phải là hoàn toàn sáng tỏ, nhưng những phát hiện gần đây chứng minh rằng phospholipase-D dly (damselysin)

và các chất độc tạo thành HlyApl và HlyAch đóng một vai trò chính trong độc lực cho homeotherms và poikilotherms Việc tìm ra các plasmid độc lực pPHDD1 mã hóa dly và HlyApl đã có khả năng tạo cơ sở chính cho sự phát triển của một dòng cao huyết tán trong phân loài Ngoài ra, trường hợp các chủng thiếu pPHDD1 cũng có khả năng gây bệnh mạnh mẽ cho nhiều loài cá cho thấy sự tồn tại của các yếu tố độc lực có khả năng gây bệnh rất lớn Phân

tích sâu hơn về trình tự bộ gen hoàn chỉnh của P.damselae chắc chắn sẽ cung

cấp một bức tranh rõ ràng hơn về các yếu tố độc lực của loại vi khuẩn này gây bệnh ở các phạm vi khác nhau [38]

Thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao gồm các protease, hemolysins (Norqvist et al., 1990; Toranzo & Barja, 1993) Những cơ chế này có thể gây phá hủy mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh trong cơ thể cá (Finkelstein et al., 1992; Silva et al., 2003) Tuy nhiên, Osorio và các cộng sự (2000) đã chứng minh rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn này Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng được coi là yếu tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh (Ishihara et al., 2002; Miyoshi et al., 2002; Farto et al., 2006)

Protrease hạn chế sự hoạt động của enzym đã được phát hiện ở P.damselae

bao gồm cả phosphatases, esteraza, amylase và glycosidases [38]

Rất ít thông tin về các yếu tố độc lực của P damselae gây nhiễm trùng

huyết ở động vật thủy sản và con người Một thông tin ban đầu đã được quan

sát thấy giữa khả năng gây bệnh của P.damselae ở chuột và cho sản lượng lớn một độc tố tiêu tế bào Chuẩn bị dly lấy từ phần tinh khiết trong môi trường

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 11

nuôi cấy cho thấy khả năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, và chuột là loài động vật nhạy cảm hơn Các nghiên cứu khác

đã báo cáo rằng các sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn này cũng có hoạt tính

gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn Một đặc tính sâu sắc hơn về dly cho

thấy nó có hoạt động D-phospholipase chống sphingomyelin,

phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine Các gen độc tố dly, được

nhân bản vô tính và trình tự của nó đã được xác định Tuy nhiên, bối cảnh của

bộ gen của gen dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng

cao huyết tán mang lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động tán huyết

khi đã bị mất gen dly [13]

Nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng, ảnh hưởng lớn nhất của khả

năng dung huyết của P.damselae gây nguy hiểm cho chuột Trên thực tế, các

nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng liều gây tử vong cho người, cá gần như giống nhau đến 50% liều gây tử vong cho chuột Các nghiên cứu khác đã báo

cáo rằng, các chủng thiếu gen dly vẫn cho thấy tính độc đối với chuột và cá,

điều này chỉ ra rằng dly không phải là một điều kiện tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [21, 27, 28] Ngoài ra, các sản phẩm ngoại bào của chủng độc lực

không có sự hiện diện của gen dly cũng gây chết cho cá và chuột, cũng như

gây độc cho người [21, 27] Điều này cho thấy các yếu tố độc lực khác không

phải là gen dly cũng có thể đóng một vai trò quan trọng trong yếu tố gây bệnh

của vi khuẩn này, nhưng bản chất của chúng vẫn chưa được biết

1.3.5 Nghiên cứu tạo Vac-xin vi khuẩn cho cá biển:

Theo nghiên cứu của Pasqualina Laganà và cộng sự (2011) [29], thử

nghiệm tính mẫn cảm của các chủng P.damselae phân lập ở một số trang trại nuôi trồng thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P.damselae phân lập có khả năng

kháng với một số loại kháng sinh bao gồm: ampicillin, carbenicillin, kanamycin, cefalothin; trong khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh gồm: chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin

Theo nghiên cứu của Toranzo et al (1991), Bakopoulos et al (1995)

và Sano (1998) các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị tụ huyết trùng bao gồm Amoxicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Florfenicol, Flumequine, axit oxolinic, oxytetracycline, nitrofurazone, trimethoprim sulfadiazine- và tetracycline [14]

Tuy nhiên, Thyssen và Ollevier (2001) đã nghiên cứu tính nhạy cảm

với một số kháng sinh của P.damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác

nhau Cho thấy, phần lớn các chủng (93%) kháng với Erythromycin và một tỷ

lệ thấp (dưới 10%) kháng với Amoxicillin, Ampicillin, Florfenicol và Trimethoprim-sulfamethoxazole Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy cảm với Kanamycin, Florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole[32]

Ngoài ra, tồn dư kháng sinh trong sản phẩm thủy sản còn ảnh hưởng đến an toàn vệ sinh thực phẩm và môi trường Vì vậy, việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh cho vật nuôi thủy sản vẫn không nên khuyến khích và cần cân nhắc thận trọng trong từng trường hợp Chính vì những mặt trái do sử dụng kháng sinh, việc phòng bệnh cho cá nuôi vẫn luôn được chú ý trong suốt quá trình nuôi Phương pháp phòng bệnh tổng hợp thường được các trại nuôi áp dụng như sát trùng bể, ao và dụng cụ trước mỗi đợt sản xuất, xử lý nguồn nước trước khi đưa vào sử dụng Thả cá nuôi với mật độ thích hợp, tránh làm

cá bị tổn thương trong quá trình vận chuyển, tắm định kỳ để phòng các loại bệnh ký sinh trùng và chú ý chất lượng thức ăn Tuy nhiên, đây chỉ là những biện pháp phòng bệnh đơn giản với mục đích giảm thiểu nguy cơ nhiễm bệnh, những thiệt hại do bệnh vẫn đang tiếp tục diễn ra và gây ảnh hưởng lớn cho nghề nuôi cá biển Hiện nay, giải pháp nâng cao sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách sử dụng các chất gây kích thích miễn dịch và vắc-xin phòng bệnh

là phương pháp phòng bệnh chủ động mang lại hiệu quả cao, đã và đang được tập trung nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới Song, để chế tạo ra các loại vắc-xin đặc hiệu hay chọn lựa được các hoạt chất kích thích miễn dịch

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 13

đem lại hiệu quả bảo hộ cao cho vật nuôi vẫn là một thử thách không nhỏ đối với khoa học hiện nay

1.4 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc

1.4.1 Tình hình nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn nhược độc

1.4.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Ở các nước có nghề nuôi cá biển phát triển như Na Uy, Mỹ, Nhật Bản, việc nghiên cứu và sử dụng vắc-xin cho cá được đầu tư nghiên cứu từ rất sớm và đạt được nhiều thành công Thử nghiệm vắc-xin vi khuẩn để phòng bệnh cho

cá được công bố đầu tiên bởi Duff (1942) [Duff D.C.B (1942), The oral

immunization of trout against Bacterium salmonicida, Joumal Immunology 44:88-94] Trong nghiên cứu này, cá hồi sau khi ăn vi khuẩn Aeromonas salmonicida bất hoạt bằng chloroform đã có khả năng kháng bệnh lở loét

Furunculosis Năm 1970, vắc-xin thương mại đầu tiên được sản xuất từ vi khuẩn Vibrio bất hoạt bằng formalin phòng bệnh lở miệng (ERM) và Vibriosis đã thành công tại Mỹ và đã làm giảm đáng kể lượng kháng sinh sử dụng cho nghề nuôi cá hồi tại đây Tiếp đó, nhằm nâng cao hiệu quả bảo hộ cho cá nuôi, vắc-xin tiêm có bổ sung chất bổ trợ (adjuvant) ra đời trong những năm đầu 1990 [33] Ngoài vai trò như một chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu, các chất bổ trợ còn giữ cho kháng nguyên được phóng thích từ từ trong cơ thể vật chủ, kéo dài thời gian tiếp xúc của vật chủ với kháng nguyên, xác lập tính nhớ và kích thích sinh kháng thể đặc hiệu trong thời gian dài Sau

đó, nhiều loại vắc-xin vi khuẩn cho cá với các phương thức chế tạo khác nhau

đã được nghiên cứu như vắc-xin bất hoạt kết hợp đa kháng nguyên, vắc-xin sống nhược độc, vắc-xin có bổ sung các loại chất bổ trợ khác nhau… Việc sử dụng vắc-xin phòng bệnh đã đem lại những thành công vượt bậc cho nghề nuôi cá ở nhiều nước

Trong vài năm trở lại đây, các nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh cho cá

mú bắt đầu được chú ý, tập trung tại các nước Châu Á như Hàn Quốc, Nhật

Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan Vắc-xin vi khuẩn V harveyi bất hoạt

đã làm giảm tỷ lệ chết ở nhóm cá mú E bruneus tiêm vắc-xin (35 %) so với

nhóm đối chứng (90 %) [24] Vắc-xin tổ hợp từ 2 loài vi khuẩn V harveyi

và V parahaemolyticus bất hoạt formalin đã được thử nghiệm trên cá mú

chấm cam tại Thái Lan, kết quả cho thấy hiệu quả bảo hộ đạt đến 77,6 % Tuy nhiên, vắc-xin từ vi khuẩn bất hoạt thường cho hiệu quả bảo hộ trong thời gian ngắn

Nhìn chung, trên thế giới, nhiều loại vắc-xin phòng bệnh cho cá nuôi

đã được nghiên cứu và sản xuất, từ loại vắc-xin đơn giản như vắc-xin bất hoạt (inactivated), đến vắc-xin có công nghệ sản xuất phức tạp như vắc-xin nhược độc (live attenuated), vắc-xin đa giá (multivalent), vắc-xin tiểu phần (sub-unit vắc-xin) Mỗi loại vắc-xin có qui trình sản xuất, cách sử dụng cũng như công hiệu khác nhau trên các loài cá Tuy nhiên, có rất ít những loại vắc-xin được thương mại hóa ra thị trường hiện nay

1.4.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu về miễn dịch và vắc-xin cho cá vẫn còn khá mới mẽ Vài công trình nghiên cứu miễn dịch trên cá chỉ mới bắt đầu thực hiện trong những năm gần đây, chủ yếu tập trung trên các đối tượng cá nước ngọt như cá trắm cỏ, cá tra…

Về bệnh tụ huyết trùng trên cá biển tại Việt Nam chỉ có báo cáo về việc

phát hiện bệnh lần đầu tiên năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng

trên vịnh Hạ Long Và kết quả điều tra sơ bộ của Khoa Nông Lâm Ngư – Trường đại học Vinh cho thấy cá nuôi tại vùng biển Nghệ An, Thanh Hóa thường gặp bệnh có dấu hiệu tương tự như bệnh tụ huyết trùng Tới nay ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này

Nhìn chung, gần đây những nghiên cứu miễn dịch cá và vắc-xin vi khuẩn phòng bệnh cho cá ở Việt Nam đã được quan tâm nhiều hơn Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu còn rất hạn chế, các nghiên cứu cơ bản

về miễn dịch trên các đối tượng cá biển có giá trị kinh tế vẫn chưa được thực

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 15

quan tâm đúng mức, có rất ít sản phẩm vắc-xin thương mại phòng bệnh cho

cá xuất hiện trên thị trường

1.4.2 Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn:

Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được làm giảm độc lực không còn khả năng gây bệnh nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh, thời gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài

- Giảm độc bằng nhiệt độ Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với

yếu tố nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên

Vắc-xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ 15-20 ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vắc-xin

Vắc-xin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt

đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp Virus có thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa

- Giảm độc bằng yếu tố hóa học

Vắc-xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò

Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường

có mật bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng để sản xuất vắc-xin BCG phòng bệnh lao cho con người

Vắc-xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách: Vi khuẩn nhiệt thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp mô Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ O2 thì

vi khuẩn lại hình thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả năng gây bệnh được sử dụng làm vắc-xin

- Giảm độc bằng phương pháp sinh vật học

Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc-xin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này Vi

sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm) Vi sinh vật không

đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi hệ gen để thích nghi với điều kiện sống mới, do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh

- Giảm độc bằng kỹ thuật gen

Tái tổ hợp hệ gen (genome)

Virus tái tổ hợp hệ genđược tạo ra bởi kỹ thuật gây nhiễm đồng thời hai chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành sẽ có

bộ gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ Ví dụ chủng Rotaviruses tái tổ hợp sử dụng làm vắc-xin tiêm phòng cho con người được tạo thành từ sự trao đổi gen của các chủng gây bệnh trên động vật, hoặc virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một chủng virus cúm cung cấp các gen mã hóa các glycoprotein bề mặt miễn dịch (hemagglutinin và neuraminidase) và một chủng nhược độc Tuy nhiên, vắc-xin Rotavirus tái tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với tỷ lệ cao (1/10.000) ở người được tiêm phòng, vì vậy, vắc-xin này đã bị ngừng cấp phép sản xuất Tác dụng không mong muốn này cho thấy an toàn là một thách thức lớn trong quy trình sản xuất vắc-xin sống

Xóa hoặc cắt gen độc

Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa bỏ các gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc Đây là giải pháp khắc phục được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng phương pháp truyền thống Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái tổ hợp phức tạp hơn so với virus do kích thước lớn hơn của hệ gen vi khuẩn

Tạo vector tái tổ hợp

Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus làm vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptid từ các tác nhân gây bệnh khác Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus và được

Đỗ Thị Tuyết Nhung - 1202 17

vận chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể dịch thể hoặc

bị phá vỡ thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào lympho T độc Mục đích của việc tạo ra vector là để trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây nhiễm với một vi sinh vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra đáp ứng mạnh hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào

Nguyên mẫu của vector virus là virus đậu bò, virus này được cắt các gen gây độc để không có khả năng gây bệnh cho người Hàng chục các kháng nguyên tái tổ hợp khác nhau được biểu hiện bằng virus này, ví dụ kháng

nguyên của vi khuẩn Brucella abortus, Listeria monocytogenes, thậm chí là

các kháng nguyên khối u Bên cạnh đó, một số loài virus khác cũng được sử

dụng để làm vector tái tổ hợp biểu hiện kháng nguyên như Adenovirus, Alphaviruses Adenovirus được sử dụng để thiết kế các vector tái tổ hợp phục

vụ sản xuất vắc-xin phòng các bệnh hô hấp cấp tính

Vi khuẩn gây bệnh cũng có thể được thiết kế thành vector sống tái tổ hợp để biểu hiện các kháng nguyên có bản chất polypeptid Các loài vi khuẩn được sử dụng làm vector là Salmonella typhimurium, V cholerae và S

flexneri chủ yếu để sản xuất các vắc-xin đường uống Vắc-xin tái tổ hợp nhược độc được sản xuất theo công nghệ này đòi hỏi phải có hai đặc tính: 1) giữ được khả năng lây nhiễm trong đường ruột và 2) biểu hiện ở mức thích hợp các polypeptid kháng nguyên để kích thích tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo

hộ vật chủ Bên cạnh đó, một số các loài vi khuẩn nội bào cũng đang được nghiên cứu để thiết kế thành vector tái tổ hợp, tạo đáp ứng miễn dịch tế bào

1.4.3 Các tác nhân tạo chủng nhược độc

1.4.3.1 Tác nhân vật lý

Tác nhân vật lý tia bức xạ không gây ion hóa Tia bức xạ ion hóa Tia có bản chất song điện từ với bước song cực ngắn Tia rơntgen (tia X) và tia gama

(γ) Tia có bản chất là các hạt gồm tia alpha(α), tia beta (β), và các proton, nơtron.,nhiệt độ[1]

Tia cực tím

Tia cực tím (hay tia tử ngoại, tia UV) Là sóng điện từ có bước

sóng ngắn hơn ánh sáng nhìn thấy nhưng dài hơn tia X Phổ tia cực tím có thể chia ra thành tử ngoại gần (có bước sóng từ 380 đến 200 nm) và tử ngoại xạ hay tử ngoại chân không (có bước sóng từ 200 đến 10 nm)[35]

Tia cực tím có thể khử khuẩn vì tác dụng rất mạnh trên Nucleo Protein của vi khuẩn, nó có thể làm biến dạng hoặc giết chết vi khuẩn Hiệu lực tiệt khuẩn của tia cực tím không những tuỳ thuộc mật độ, thời gian chiếu tia, điều kiện môi trường mà còn tùy thuộc vào sức chịu đựng của vi khuẩn Ngoài ra

do tác dụng của tia cực tím, không khí có thể sinh ra Ozon cũng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn

Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chứng minh ADN hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537Ǻ (~254nm), đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến[35]

Tia UV gây ra sự biến đổi quang oxy hóa các gốc purin và pirimidin Tác động của tia UV làm cho adenine (A) bị biến thành hypoxantin, dẫn đến những thay đổi hóa học của DNA Tia UV làm cho các base thymin gần nhau trên phân tử DNA liên kết với nhau tạo dimer thymin, gây méo mó phân tử DNA Nếu phân tử DNA có nhiều dimer thynin có thể làm mất khả năng tái bản của DNA [1]

thời gian ngắn trước khi c

Có thể khi hiện diện oxy, tia t

HHO2HOCác peroxit là nh

biến

Hiện tượng quang ph

Sau khi chiếu tia tử ngo

phần lớn được phục hồ

đứt các thymine dimer

- 1202

động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine.

ủa tia tử ngoại, cytosin gắn thêm phân tử

ch vòng (Hình 1.2) và thymine bị đứt liên kế

thành thymine dimer

ộng sự đã nhận thấy tần số đột biến t

Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong

c khi cấy vào Đây là tác động gián tiếp của tia t

xy, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxit:

H*+O2HO*

HO2 + H H2O2 2HO2* + H* H2O2 + O2 Các peroxit là những phân tử có phản ứng mạnh, chúng d

ng quang phục hồi là một đặc điểm trong tác động cngoại lên tế bào nếu để ngoài ánh sáng thì các sai h

ồi Ánh sáng có tác động hoạt hóa enzym s

Hình 1.3: Tác động tia UV làm cho DNA có m

) tia UV bị các tế bào che l

ngược lại dịch huyền phù quá loãng d

động gây chết tế bào và gây

trạng thái sinh lý của các t

ng tia UV làm cho DNA có một chỗ phình trong c

trúc

c tím gây hại cho DNA của sinh vật Một trong nh

ng liên kết bất thường giữa 2 đơn phân kế cận thay vì gisung trên 2 mạch đối nhau (tạo bậc thang) Kết qu

ấu trúc và nó không còn có thể thực hiệa[35]

bào sống một số enzyme có khả năng làm đ

a dimer thymin khôi phục chức năng của DNA Do đó khi tia UV tác

ết mà tạo nên các đột biến

a các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào li

ặc của dịch huyền phù được chiếu tia UV

n Dịch huyền phù quá đậm đặc ( lớn hơn 1.10bào che lấp lẫn nhau hiệu quả hấp thụ tia UV không cao,

n phù quá loãng dễ gây chết các tế bào khi chibào và gây đột biến của tia UV còn phụ thu

ác tế bào, tuổi giống, loài sinh vật…

phình trong cấu

t trong những cách phổ

n thay vì giữa các quả là DNA có