Nghiên cứu thu nhận b glucan từ nấm đầu khỉ và ứng dụng làm siro tăng cường miễn dịch

Nấm Đầu Khỉ chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao β- glucan, ergosterol, hericenone CH và erinacine AI… có tác dụng rất tốt trong việc hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-





 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

“ NGHIÊN CỨU THU NHẬN β-GLUCAN TỪ NẤM ĐẦU KHỈ VÀ

ỨNG DỤNG LÀM SIRO TĂNG CƯỜNG MIỄN DỊCH”

Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN ĐỨC TIẾNSinh viên thực hiện : NGUYỄN HỒNG VÂNLớp : CNTP 12-01

Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN

Có được kết quả nghiên cứu này tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu

sắc đến:

TS Nguyễn Đức Tiến – Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm nông nghiệp –

Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, người người đã trực

tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ, động viên, khuyến khích tôi rất tận tình và

chu đáo trong những lúc khó khăn, truyền cho tôi kiến thức và kinh nghiệm

quý báu để tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này

Đồng thời tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị tại bộ môn Nghiên

cứu phụ phẩm nông nghiệp và toàn bộ cán bộ làm việc tại Viện Cơ điện Nông

nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch đã hỗ trợ và chỉ bảo tôi trong suốt thời

gian thực hiện khoá luận

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Công nghệ sinh học

– Viện Đại học Mở Hà Nội đã dạy dỗ và dẫn dắt tôi trong suốt thời gian học

tập tại trường

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến bố mẹ, anh chị tôi đã

luôn ở bên động viên trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi, chia

sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành

đề tài tốt nghiệp

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu trên

Hà nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Hồng Vân

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về nấm Đầu Khỉ 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 3

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2.2 Phân bố 4

1.1.3 Thành phần dinh dưỡng và một số hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ 5

1.1.3.1 Thành phần dinh dưỡng 5

1.1.3.2 Các nhóm hoạt chất sinh học trong nấm Đầu Khỉ 5

1.1.4 Tác dụng của nấm Đầu Khỉ 8

1.1.5 Các sản phẩm chế biến từ nấm Đầu Khỉ 9

1.2 Hoạt chất của β-glucan 10

1.2.1 β-glucan trong nấm Đầu Khỉ 10

1.2.2 Cơ chế tác dụng 11

1.2.3 Một số ứng dụng của β-glucan 13

1.3 Thu nhận các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ 14

1.3.1 Cơ sở khoa học duy trì và thu nhận hợp chất β-glucan trong nấm Đầu Khỉ 14

1.3.2 Phương pháp trích ly 14

1.3.3 Một số nghiên cứu thu nhận β-glucan từ nấm Đầu Khỉ 15

1.4 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trong và ngoài nước 16

1.4.1 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới 16

1.4.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất trong nước 17

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 18

2.1.1 Đối tượng 18

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 18

2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hoá lý 18

2.3.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm 18

2.3.1.2 Phương pháp xác định phần trăm chất khô hòa tan 19

2.3.1.3 Định lượng β-glucan bằng phương pháp phenol-sulfuric theo phương pháp của Dubois và CS, 1956 19

2.3.1.4 Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH (test DPPH) theo phương pháp của Shimada và CS 22

2.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 23

2.4.1 Trích ly β-Glucan từ nấm Đầu Khỉ 23

2.4.2 Làm sạch dịch trích ly 23

2.4.3 Cô dịch trích ly 23

2.4.4 Ảnh hưởng của dung môi tủa đến khả năng thu nhận β-Glucan 24

2.4.5 Đề xuất công thức phối chế tạo siro nấm Đầu Khỉ tăng cường miễn dịch từ chế phẩm β-glucan 24

2.5 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 26

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Ảnh hưởng của phương pháp lọc đến khả năng thu nhận β-Glucan từ dịch chiết của nấm Đầu Khỉ 28

3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến chất lượng dịch trích ly β-Glucan từ H erinaceus 29

3.3 Ảnh hưởng của dung môi tủa đến khả năng thu nhận beta glucan từ cao trích ly H erinaceus 30

3.4 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến khả năng tủa thu nhận và làm sạch sơ bộ β-Glucan từ cao trích ly H erinaceus 32

3.5 Ảnh hưởng của thời gian tủa dịch trích ly bằng ethanol đến khả năng thu nhận

β-Glucan từ cao trích ly H erinaceus 33

3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không đến hàm lượng β-Glucan sau tủa 33

3.7 Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH 35

3.8 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm β-Glucan từ dịch trích ly nấm Đầu Khỉ 36

3.9 Ứng dụng chế phẩm β-Glucan từ Đầu Khỉ để tạo siro giúp tăng cường miễn dịch 38

3.9.1 Xác định tỷ lệ phối chế 38

3.9.2 Nghiên cứu xác định thời gian và điều kiện bảo quản sản phẩm Sỉro Nấm Đầu Khỉ 42

4.1 KẾT LUẬN 43

4.2 KIẾN NGHỊ 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 48

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Dự kiến một số thành phần phối chế tạo sản phẩm siro nấm Đầu Khỉ 25Bảng 3.1 Hoạt tính chống oxy hoá của chế phẩm nấm Đầu khỉ trích ly bằng sóng siêu âm 35Bảng 3.2 Kết quả tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm siro nấm Đầu Khỉ 38Bảng 3.3 Kết quả điểm đánh giá cảm quan cho các chỉ tiêu 39

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Nấm Đầu Khỉ 4

Hình 1.2 Nấm Đầu Khỉ kết hợp với các nấm khác dạng viên ………….9

Hình 1.3 Bột nấm Đầu Khỉ Fusi……… 9

Hình 1.4 Liên kết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit 10

Hình 2.1 Công thức DPPH 22

Hình 3.1 Ảnh hưởng của phương pháp lọc đến hàm lượng β-Glucan và chất khô hòa tan của dịch trích ly β-Glucan từ Hericium erinaceus sau lọc 29

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ cô đặc chân không đến hàm lượng β-glucan và độ ẩm còn lại trong cao chiết nấm Đầu khỉ 30

Hình 3.3 Ảnh hưởng của dung môi đến hàm lượng β-Glucan và chất khô hòa tan của phần kết tủa từ cao trích ly H erinaceus 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hàm lượng Glucan và % β-Glucan ở phần kết tủa từ cao trích ly H erinaceus 32

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian tủa đến khả năng thu nhận β-Glucan từ H erinaceus 33

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không đến hàm lượng β-Glucan sau tủa 34

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay, nhu cầu về thực phẩm không chỉ dừng lại ở những yêu cầu về số lượng, chất lượng mà hướng tới tính an toàn, khả năng phòng và chữa bệnh Vì thế xu hướng thực phẩm chức năng đang rất được quan tâm Thực phẩm chức năng là thực phẩm có thể cải thiện tình trạng sức khỏe và làm giảm nguy cơ mắc bệnh, do chứa những thành phần có hoạt tính sinh học cao Các hoạt chất sinh học này có thể được tách chiết từ các nguồn gốc khác nhau như động vật, thực vật, vi sinh vật Trong đó việc tách chiết các hoạt chất sinh học từ thực vật và đặc biệt là các loại nấm ăn hiện đang được chú ý

Từ nhiều thế kỷ qua nấm ăn được biết đến như một nguồn thực phẩm

bổ dưỡng có lợi cho sức khỏe Nấm ăn được gọi là loại thực phẩm vừa là rau vừa là thịt, nó có rất ít chất béo, cung cấp ít năng lượng nhưng lại rất giàu protein và acid amin Trong các loại nấm ăn hiện nay được quan tâm hơn cả

là nấm Đầu Khỉ (Hericium erinaceum) Từ lâu, tại Trung Quốc và Nhật Bản

nấm Đầu Khỉ đã được biết tới như là loại thực phẩm bổ dưỡng được nhiều người ưa chuộng Nấm Đầu Khỉ chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao (β-

glucan, ergosterol, hericenone CH và erinacine AI…) có tác dụng rất tốt trong

việc hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh viêm loét dạ dày, ung thư dạ dày, ung thư thực quản Nấm có tác dụng tốt lên hệ thần kinh, cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi, tăng cường hệ miễn dịch, nâng cao sức đề kháng với tình trạng thiếu oxy, chống mệt mỏi, lưu thông tuần hoàn máu…[4,2] Vì vậy xu hướng nghiên cứu của các nhà khoa học hiện nay xoay quoanh về các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ Đặc biệt là chất β-glucan với hoạt tính chống ung thư, miễn dịch có hoạt lực mạnh

Với lợi thế là một nước nông nghiệp có nguồn phụ phẩm giàu chất xơ (cellulose), chất gỗ (lignin) hết sức phong phú, đồng thời có nhiều vùng khí hậu nên có thể trồng nấm quanh năm với hàng chục loại nấm ăn và dược liệu,

thị trường tiêu thụ nấm rộng lớn Mặc dù vậy nấm Đầu Khỉ vẫn còn khá mới đối với người dân nước ta, nhất là những sản phẩm mang tính tiện lợi có bổ sung các hoạt chất sinh học từ nấm như: Sử dụng làm đồ uống có tính kích thích, chiết xuất thành dạng viên hỗ trợ miễn dịch, ứng dụng trong sản xuất trà túi lọc, trà hòa tan… Hiện nay trên thị trường Việt Nam những sản phẩm

từ nấm Đầu Khỉ chủ yếu dưới dạng bột từ quả thể nấm, vừa không tiện dụng lại hiệu quả kinh tế thấp

Để tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có và những tác dụng ưu việt của

nấm Đầu Khỉ chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thu nhận

β-glucan từ nấm Đầu Khỉ và ứng dụng làm Siro giúp tăng cường miễn dịch”

2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục đích

Nghiên cứu thu nhận hợp chất β-glucan có hoạt tính sinh học cao từ nấm Đầu Khỉ và ứng dụng xây dựng công thức làm Siro tăng cường miễn dịch

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về nấm Đầu Khỉ

1.1.1 Phân lo ại

Nấm Đầu Khỉ hay còn gọi Nấm Hầu Thủ, nấm lông nhím Tên tiếng Anh thông dụng là Monkey’s Head Theo phân loại thực vật, vị trí của nấm Đầu Khỉ trong giới nấm được phác họa như sau [4,5]:

Thuộc Giới (kingdom) : Mycota (Fungi)

Chi (Genus) : Hericium

Loài (Species) : Hericium erinaceum

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

Quả thể Nấm Đầu Khỉ thường hình cầu hoặc hình ellip, mọc riêng rẽ hoặc thành chùm, không phân nhánh có kích thước 5-20 cm Nấm có nhiều sợi dài dạng lông dày đặc, rũ xuống như đầu khỉ Các tua nấm chính là tổ

chức bào tầng (hymenium) Quả thể non tua ngắn, khi trưởng thành tua dài

0,5-3 cm , đường kính từ 1,8-3 mm Bào tử đảm sinh ra trên bề mặt các sợi tua Bào tử trắng, bên trong chứa dinh dưỡng và giọt dầu Đảm có dạng hình trụ hoặc hình chùy dài khoảng 26-36 µm Ngọn đảm hơi tù và có gai nhọn gọi

là tiểu đính mang bốn bào tử hình cầu, đường kính khoảng 5,5-7,8 µm [1,2] Quả thể khi non có màu trắng đến trắng ngà, thịt màu trắng, khi già ngả sang màu vàng đến vàng sậm Quả thể cắt dọc mô thịt có màu trắng kem, khi

để lâu ngoài không khí ngả sang màu nâu đến nâu vàng, có hương thơm dễ

chịu Nấm tạo quả thể (phần nhìn thấy được của nấm) từ cuối tháng tám đến tháng mười hai

Hình 1.1: N ấm Đầu Khỉ

1.1.2.2 Phân b ố

Nấm Đầu Khỉ là loại nấm ôn đới, nhiệt độ thích hợp nấm phát triển là 16-200°C và nhiệt độ cao nhất là 19-220°C Nấm Đầu Khỉ có mặt ở hầu hết các châu lục trên thế giới trừ châu Phi và Nam Mỹ Tại châu Âu theo ghi nhận nấm xuất hiện ở 23 quốc gia, trong đó có tới 13 quốc gia xếp nấm này vào danh sách đỏ Ngược lại, Trung quốc và Nhật bản lại khá phổ biến, sử dụng như một loại nấm ăn và dược liệu [8,17]

Tại Việt Nam nấm Đầu khỉ được trồng thử nghiệm ở nhiều nơi, chủ yếu

là vùng có khí hậu mát mẻ như Đà Lạt, Lâm Đồng Việc nuôi trồng ở những địa phương khác như, Hà Tĩnh, Hải Phòng, Hưng Yên, Hà Nội trong môi trường được kiểm soát chặt chẽ về các yếu tố

Nấm Đầu Khỉ là một loại nấm phá gỗ, hệ enzyme cellulase của nấm có hoạt tính phân giải rất mạnh Nấm đầu khỉ vừa sống hoại sinh, vừa sống ký sinh Nấm sống kí sinh trên cây hạt trần như cây sồi, các cây lá rộng hoặc trên

các cành cây lớn với đường kính lớn hơn 10cm, sống hoại sinh trên các loại

cơ chất: mạt cưa, bã mía, các loại cỏ, rơm rạ

1.1.3 Thành ph ần dinh dưỡng và một số hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ

1.1.3.1 Thành ph ần dinh dưỡng

Nấm Đầu Khỉ được biết đến cách đây hàng trăm năm trong truyền thống ẩm thực của Trung Quốc và Nhật Bản Nấm Đầu Khỉ được coi như một nguồn thực phẩm cung cấp dinh dưỡng khá toàn diện, chứa nhiều chất đạm, đường, khoáng và vitamin Đặc biệt có sự hiện diện đầy đủ của 7 loại acid

amin cần thiết cho con người

Nấm Đầu Khỉ khá phong phú nguồn khoáng chất, giàu vitamin

K, P, Mg…ngoài ra có cả Ge, một kim loại cực hiếm có hoạt tính chống ung thư Thành phần amino acid cũng có giá trị cân đối về dinh dưỡng, khoảng 18 loại acid amin tự do, đáng chú ý là hàm lượng glutamic và tryptophan rất cao Việc nuôi trồng, thu hái, chế biến, xử lý làm thay đổi thành phần các chất trong nấm Nó làm tăng các thành phần phân tử lượng thấp, tăng các hoạt chất sinh học, đồng thời làm tăng hương, tạo tính hấp dẫn hợp khẩu vị hơn

1.1.3.2 Các nhóm ho ạt chất sinh học trong nấm Đầu Khỉ

Từ đầu thế kỷ 20 các nghiên cứu về nấm Đầu Khỉ không còn chú trọng vào đặc điểm sinh dưỡng, nuôi trồng mà chuyển sang nghiên cứu về các thành phần hóa học, các hoạt tính sinh học của nấm và tác dụng

H erinaceum bao gồm nhiều thành phần trong đó có: Polysaccharides, protein, lectin, phenol, hericenones, erinacines, terpenoid và một số chất khác

có hoạt tính sinh hoc cao [17]

* Nhóm các acid béo không no

Năm 1994, Stadler và cộng sự ở đại học Kaiserslautern, cộng hòa liên bang Đức, đã phát hiện các acid béo có hoạt tính chống lại tuyến trùng caenorhabditis elegans Nhóm các chất acid béo có hoạt tính đặc biệt chủ yếu

là acid linoleic, acid oleic và acid palmitic Trong đó acid linoleic được biết

tới với vai trò phòng chống ung thư, kháng viêm, tác dụng tích cực đến sự phát triển của trẻ sơ sinh bị xơ nang [20]

* Cerebroside, Triterpen Ergosterol Peroxide, pyran

Từ cao chiết ethyl acetate và methanol đã cô lập được 4 chất từ quả thể nấm Đầu Khỉ: Một triterpen ergosterol peroxide; một pyran 5-(1-Hydroxy-ethyl)-2-hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2,4,5-triol; 2 chất thuộc cerebrosides là tricosanamide (2-Hydroxy-N-(1,3,4-trihydroxypentacosa-2yl); Cerebrocide B (1-O-β-D-glucopyranosyl-(2S,3R,4E,8E)-2-[(2R)-hydroxyhexadecanoylamion]-9-methyl-4,8-octadecadiene-1,3-diol)

Theo nghiên cứu của nhà khoa học Nhật Bản những chất này có tác

dụng ức chế miễn dịch, chống viêm, kháng viêm, ngăn ngừa sự phát triển của

ung thư [27]

* Ergosterol (pro-vitamin D 2 )

Trong nấm Đầu Khỉ khô có provitamin D, có khả năng chuyển hóa D2 (

là dẫn xuất của ergosterol và cholesterol) khi chiếu tia tử ngoại vào 2 chất trên

sẽ thu được các vitamin D2 và D3 giúp điều hòa trao đổi phospho-calcium, chống bệnh còi xương, loãng xương

* D-threitol, D-arabinitol và palmitic acid

Bing-Ji Ma và cộng sự (2005) khi nghiên cứu nhóm hoạt chất sinh học này có tác dụng hạ đường huyết, giảm nồng độ cholesterol xấu và giảm lượng đường trong máu, đồng thời cũng là tác nhân chống oxy hóa [26]

* Polysaccharides

Hàm lượng polysacchrides trong nấm Đầu Khỉ khá cao, theo phân tích tất cả bao gồm sáu loại monosacarit, cụ thể là glucose, galactose, mannose arabinose, xylose, rhamnose và fucose Glucose và galactose là monosacarit chiếm ưu thế

Trong nấm Đầu Khỉ, polysaccharides được chia ra làm hai loại là polysaccharides A (HPA) và polysaccharides B (HPB) với trọng lượng phân

tử tương ứng là 5 104c và 3 104c Các polysaccharides polysaccharides A của

bao gồm Glc, Gal và Fuc với các tỷ lệ 1:2,11:0,423, và polysaccharides B chứa các monosacarit Gal và Glc trong tỷ lệ mol của 1:11,529 Trong đó polysaccharides của nấm mang tính sinh học cao, hầu hết các trong đó bao gồm các β liên kết 1,3 và β liên kết 1,6 liên kết glucan hoặc β-1,6 liên kết glucan Các Polysaccharides này có tác dụng chống khối u và điều hòa miễn dịch [22]

Các Polysaccharides của nấm Đầu khỉ như xylan, glucoxylan, heteroxyglucan và phức hợp protein của chúng có các đặc tính cải thiện đáp ứng sinh học, có lợi cho khả năng miễn dịch và hệ tiêu hóa Trong nghiên cứu thực nghiệm kháng ung thư của Polysaccharides ở nấm Đầu Khỉ có 5 loại Polysaccharides được phân lập gồm Flo-a-α; Flo-a-β; Flo-b; FIIo-1 và FIII-2b

có hoạt tính kháng ung thư và tác dụng kéo dài thời gian sống Polysaccharides tạo thành chủ yếu bởi chitin trong thành tế bào nấm cũng có tính chất chống ung thư Ngoài ra với tính chất cơ lý có tác dụng thu hút, hấp phụ các chất độc có khả năng tạo ung thư hoặc thu hút cholesterol, cản trở sự hấp thu vào hệ tuần hoàn làm tăng tốc độ đào thải, do đó giúp cho việc phòng ngừa bệnh ung thư của cơ quan tiêu hoá [6]

* Diterpenoid

Trong nấm Đầu Khỉ có chứa 2 chất thuộc nhóm diterpenoid có hoạt tính sinh học cao: hericenone CH và erinacine AI có hoạt tính tổng hợp yếu tố tăng trưởng thần kinh và có tác dụng đối với bệnh mất trí nhớ [27]

Nhóm 14 các nhà khoa học Nhật bản đã chứng minh rằng trong nấm Đầu Khỉ có chứa hai diterpenoid đặc biệt đó chính là hericenone H và erinacine I từ hệ sợi nuôi cấy Trong đó Erinacines H có hoạt tính kích thích sinh tổng hợp yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) Yếu tố này đã được

GS Mizuno xác định và nêu lên khả năng của nấm Đầu Khỉ trong hỗ trợ điều trị bệnh Alzheimer ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các neuron thần kinh [7]

1.1.4 Tác d ụng của nấm Đầu Khỉ

Các thí nghiệm về độc tính nấm được nghiên cứu kỹ và cho thấy cả quả thể lẫn sợi nấm đều không có độc tính đối với người, không những vậy nấm còn thể hiện những tác dụng dược lý vượt trội so với một số loài nấm khác [2]

* Tác d ụng trên hệ thần kinh

Nấm Đầu Khỉ có tác dụng tốt trên bệnh Alzeimers, ngăn cản quá trình lão hóa và phục hồi các neuron thần kinh, có tác dụng tốt với những người bị bệnh teo cơ, thoái hóa thần kinh, trầm cảm, tâm thần phân liệt, tự kỷ, hội chứng Paret

* Tác d ụng hỗ trợ điều trị ung thư

Tăng cường hệ miễn dịch và chống lại ung thư phổi di căn

Polysaccharides chiết từ nấm đầu khỉ có hiệu quả trên ung thư ruột, dạ dày, thực quản và ung thư da Trong nấm Đầu khỉ có một số thành phần Diterpenoid có khả năng kháng các dòng tế bào ung thư nuôi cấy ở điều kiện

in vitro, trong đó có dòng tế bào HeLa

* Tác d ụng đối với hệ tiêu hóa

Trong lâm sàng, các bác sĩ Trung Quốc đã sử dụng rộng rãi nấm Đầu Khỉ để điều trị các bệnh viêm loét dạ dày, tá tràng, viêm loét ruột, co thắt

dạ dày và các bệnh đường tiêu hóa khác Nghiên cứu thực hiện trên 227 bệnh nhân, có bệnh từ 2 năm trở lên, có hiệu quả đạt tới tỷ lệ 85,2%-92,5% Đặc biệt ở Trung Quốc người ta đã dùng để điều trị ung thư dạ dày, kể cả trường hợp điều trị bằng hóa chất không hiệu quả [7]

sưng, làm tăng ngưỡng chịu đau, chống đột biến, làm giảm mỡ máu, xúc tiến việc tuần hoàn máu, chống lão hóa…

1.1.5 Các s ản phẩm chế biến từ nấm Đầu Khỉ

Theo các nhà khoa học trên thế giới nấm Đầu Khỉ chứa rất nhiều hoạt chất sinh học có có lợi cho sức khỏe con người Với phương pháp truyền thống, loại thảo dược này có trong các bài thuốc đông y được sắc lấy nước uống Với sự phát triển của công nghệ sinh học phát triển và đặc biệt là sự phát triển của các sản phẩm thực phẩm chức năng Các dạng thương phẩm của nấm Đầu Khỉ trên thi trường chủ yếu dưới hình thức bột nấm, nấm khô dạng lát, nấm quả thể, dạng lỏng hoặc kết hợp cùng các loại nấm khác tạo thành dạng viên nén…

Sản phẩm chế phẩm nấm Đầu khỉ trích ly trên thị trường hiện phổ biến

là các sản phẩm được sản xuất từ Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc… có hàm lượng Polysaccharides từ 20 đến 40%

Hình 1.2 N ấm Đầu Khỉ kết hợp Hình 1.3 Bột nấm Đầu

v ới các nấm khác dạng viên Kh ỉ Fusi

Hiện nay các sản phẩm trà và các dạng trà như trà túi lọc, trà hòa tan…Có bổ sung thêm các hoạt chất sinh học từ nấm như nấm linh chi, nấm

hương, nấm sò… Rất đa dạng và phổ biến trên thị trường Các sản phẩm trà

từ nấm Đầu Khỉ còn rất mới, trên thị trường chưa có một thương hiệu nào về sản phẩm này

1.2 Hoạt chất của β-glucan

1.2.1 β-glucan trong nấm Đầu Khỉ

β-glucan là một polysaccharide của D-glucose với các liên kết glicozit Tùy theo liên kết của các monosaccharides trong chuỗi mà hình thành nên những hợp chất với tên gọi khác nhau như là: Agar (β-1,3-1,4-glucan), fucoidan (β-1,3-glucan), laminarin (β-1,3-1,6-glucan), alginate (β-1,4-glucan), zymosan (β-1,3-glucan), chrysolaminarin (β-1,3-1,6-glucan), carrageenan (β-1,3-1,4-glucan)

Sự khác nhau giữa các mối liên kết và cấu trúc hóa học β-glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan, hoạt động và hoạt tính sinh học của chúng β-glucan càng phân nhánh mạnh hoạt tính sinh học càng cao [15]

Hình 1.4 Liên k ết β-1,3 glicozit và β-1,6 glicozit

β-Glucan tự nhiên chủ yếu có trong các loại đậu, rau, củ, trái cây và nấm Trong nấm Đầu Khỉ hàm lượng này thuộc loại khá cao chứa khoảng 2-2,6% trọng lượng khô, nhiều hơn so với một số nấm dược liệu khác nấm mỡ, nấm hương… hàm lượng này chỉ thuộc khoảng 0,22-0,42%

Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng glucan với liên kết β gọi là Glucan có hoạt tính sinh học cao so với các nhóm glucan khác Sự khác nhau giữa các mối liên kết và cấu trúc hóa học glucan sẽ ảnh hưởng đến tính hòa

β-tan, hoạt động và hoạt tính sinh học của chúng Glucan càng phân nhánh mạnh thì có hoạt tính sinh học càng cao [18] Dạng hợp chất liên kết (1,3/1,6) β-glucan có hoạt tính sinh học cao hơn dạng (1,3/1,4) β-glucan Theo những phân tích về thành phần của polysaccharides của nấm Đầu Khỉ cho thấy β-glucan chủ yếu là liên kết (1,3/1,6) β-glucan Nghiên cứu của Zhaojing Wang

và cộng sự năm (2004) cho thấy trong polysaccharides của nấm Đầu Khỉ có 6 chất chứa liên kết beta-glcuan: 2,3-methyl 2-Fuc liên kết (1,4-); 2,4,6-methyl 3-Glc liên kết (1,3-); 2,3,4-methyl 3-Glc liên kết (1,6-); 2,3,4-methyl 3-Gal liên kết (1,6-); 3,4-methyl 2-Gal liên kết (1,2,6-); 2,4-Me2-Glc liên kết (1,3,6-)[22]

β-glucan D trong nấm Đầu Khỉ đã được khẳng định chức năng hạn chế tăng trưởng của vi khuẩn hình xoắn ốc, đẩy nhanh cicatrisation áp xe β-glucan có nhiều công dụng trong việc hỗ trợ phòng trống khối u, làm giảm cholesterol và chất béo trung tính, điều hòa lượng đường trong máu chữa lành vết thương, giảm stress và căng thẳng kéo dài và làm trẻ hóa làn da…

vi khuẩn, các loại nấm và bệnh nhiễm ký sinh trùng

β-glucan kết hợp với các thụ thể bên ngoài màng của đại thực bào và những tế bào bạch cầu khác (bao gồm cả những tế bào thực bào tự nhiên và những tế bào tạo độc tố của cơ thể) Với sự kết hợp đặc hiệu giữa các thụ thể trên bề mặt đại thực bào với tác nhân lạ, β-glucan có tác dụng phát hiện sự xâm nhập hoặc bám vào cơ thể của các nhân tố bất lợi và cảnh báo cho cơ thể biết [26]… Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác còn cho thấy được hiệu quả tích cực của β-glucan trong việc điều trị các khối u ác tính, bệnh HIV, sự biến

chứng của các vết thương… β-glucan còn tăng cường tính đặc hiệu của các loại thuốc kháng sinh và virus

*) Ho ạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư gồm có các con đường cơ bản sau:

- Bảo vệ các tế bào khỏe mạnh khỏi ung thư

- Tăng cường khả năng hoạt động của hệ thống miễn dịch để tìm và tiêu diệt những tế bào ung thư

- Giúp kiểm soát lại quá trình phân chia và lõa hóa tế bào (apoptosis)

- Giúp ngăn cản sự di căn của tế bào ưng thư (metastasis)

β liên kết 1,3 ; 1,6-D glucan lắp ráp với các receptor trên bề mặt đại thực bào và kích hoạt chúng Một khi ở trạng thái kích hoạt, chúng nhận ra và tiêu diệt các tế bào đột biến có hoạt tính kháng ung thư [19]

Các nghiên cứu trên động vật cho thấy rằng β-glucan chiết xuất từ Maitake ngăn cản sự phát triển của ung thư ruột già, phổi, dạ dày, tuyến tiền liệt, cổ bang quang và não xũng như bệnh bạch cầu [21]

*) Gi ảm Cholesterol, giúp trái tim khỏe mạnh

Trong suốt hơn hai thập kỷ qua beta glucan được biết đến như một chất

có đặc tính làm giảm cholesterol và chất béo trung tính Một nghiên cứu khácbảy mươi mốt người đàn ông và phụ nữ mắc hiện tượng tăng cholesterol huyết được cung cấp các khẩu phần ăn ít chất béo có bổ sung β-glucan yến mạch Những người có khẩu phần ăn chứa glucan giảm cholesterol đến 17%, đồng thới tăng mật độ cholesterol có lợi [17]

Việc sử dụng β-glucan đã được chứng minh là an toàn, hiệu quả, mạnh

mẽ và rẻ tiền để giảm cholesterol và cải thiện lipid máu so với các loại thuốc đắt tiền nguy hiểm, với các tác dụng phụ nghiêm trọng

*) M ột số hoạt tính khác

β-glucan đã cho thấy tiềm năng để chữa lành các vết loét dạ dầy vì nó

có tác dụng mạnh lên hệ thống tiêu hóa nói chung Trong một số nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các thông số máu đã được cải thiện cùng với các lợi ích khác

Một số nghiên cứu cũng cho thấy β-glucan trong nấm men có tác dụng chống

lại bệnh lao Đây là đặc điểm kháng virus và kháng khuẩn

1.2.3 M ột số ứng dụng của β-glucan

*) Ứng dụng của β-glucan trong thực phẩm

β-glucan có rất nhiều tác dụng trong thực phẩm:

- Cung cấp nguồn xơ thực phẩm

- Cung cấp chất đóng cục phân

- Cung cấp nguồn acid béo chuỗi ngắn qua lên men vi khuẩn trong ruột già, cải thiện sự tiêu hóa, giúp ích cho các tế bào màng trong ruột kết và ruột nói chung

β-glucan trong tự nhiên rất sạch, có khả năng giữ nước cao, không tạo gel, không bị phân hủy bởi enzym tiêu hóa ở người, vì vậy chúng thích hợp như một nguồn xơ thực phẩm Khi β-glucan đi qua ruột già, nó bị phân hủy một phần bởi hệ vi khuẩn ruột mà không làm mất tính giữ nước quá trình này tạo nên các chuỗi acid béo ngắn có lợi cho ruột Vì vậy β-glucan được sử dụng làm phụ gia thực phẩm để tăng sự tiêu hóa và chữa rối loạn tiêu hóa [9] Đặc biệt với hoạt tính sinh học cao β-glucan đang được ứng dụng nhiều trong sản xuất thực phẩm chức năng

*) Ứng dụng của β-glucan trong y dược và mỹ phẩm

β-glucan có vai trò như một chất có hoạt tính sinh học nhằm điều chỉnh miễn dịch Đối với bệnh nhân ung thư phải điều trị bằng hóa chất hoặc chiếu

xạ β-glucan có khả năng tăng nhanh sự phục hồi máu khi chiếu xạ, kích thích

sự phục hồi tủy xương sau hóa trị liệu và ngăn cản biến chứng nhiễm bệnh trong quá trình điều trị Bên cạnh đó, β-glucan còn có hiệu quả kháng khối u, giảm kích cỡ khối u [9]

β-1,3-glucan còn có khả năng cảm ứng hoạt tính của tế bào Langerhans khi bôi lên da Tế bào Langerhans là một loại tế bào đại thực bào chuyên hóa nằm trên da hoạt động tương tự như đại thực bào β-1,3-glucan làm se lỗ chân lông, giảm số lượng, độ sâu, độ dài của nếp nhăn, cảm ứng tổng hợp collagen và

elastin, giảm màu đỏ, giảm kích thích và sự khô da, giảm số lượng và kích cỡ tổn thương trên da β-1,3-glucan có thể thêm vào kem bôi da, mỹ phẩm thuốc mỡ, kem cạo râu và nói chung là các sản phẩm tiếp xúc trực tiếp với da [20]

1.3 Thu nhận các hoạt chất sinh học của nấm Đầu Khỉ

1.3.1 C ơ sở khoa học duy trì và thu nhận hợp chất β-glucan trong nấm Đầu Khỉ

Theo các nghiên cứu thì nấm Đầu Khỉ có cấu tạo tương tự như một số loại nấm lớn khác như nấm Linh Chi, nấm Hương, nấm Sò Thành tế bào cấu tạo chủ yếu là các cellulose, độ nhớt vừa phải nên các chất trong nấm Đầu Khỉ dễ hòa tan khi được trích ly bằng nước, enzyme và ngâm trong cồn… mà không bị mất hoạt tính của các chất sinh học Ngoài ra, các hợp chất này rất bền đối với nhiệt

Polysaccharides trong nấm Đầu Khỉ chiếm tới chiếm tới 6,23 tới 8% khối lượng thô tùy thuộc vào vùng nguyên liệu lấy nấm Polysaccharides là nhóm chất hữu cơ phổ biến và khối lượng lớn trong nấm Đầu Khỉ, trong đó

có chứa một hàm lượng lớn β-glucan β-glucan không hòa tan hoặc hòa tan ít trong nước lạnh; tan một phần trong ethanol, aceton; hòa tan tốt trong NaOH

và (CH3)2SO Sự hòa tan này do sự giảm bậc trong cấu trúc hóa học dưới tác động của chất oxy hóa mạnh Trong một số nghiên cứu về cấu trúc của polysaccharide trong nấm Đầu Khỉ được thực hiện bởi các nhà khoa học Nhật Bản Polysaccharides được tách chiết từ nấm Đầu Khỉ khô thu được hoạt chất polysaccharides là cao nhất so với tươi và nấm đông khô Nấm được chiết với dung môi là nước trong 950C trong vòng 2 giờ [22, 23]

1.3.2 Phương pháp trích ly

Hiện nay có hai phương pháp trích ly chính là: Phương pháp trích ly lỏng - lỏng và phương pháp trích ly lỏng - rắn Trích ly rắn - lỏng là quá trình tách một hoặc một số chất tan trong chất rắn bằng một chất lỏng khác gọi là dung môi Vì mục đích của đề tài là trích ly β-glucan trong nấm Đầu khỉ và mối liên quan giữa β-glucan và polysacchrides tôi sẽ trình bày về phương pháp trích ly rắn - lỏng Đối với phương pháp này phải có các yêu cầu sau:

Yêu c ầu đối với dung môi: Dung môi phải có tính hoà tan chọn lọc,

không độc, không ăn mòn thiết bị, rẻ và rễ tìm

C ơ chế hoà tan: Dung môi thấm qua các mao quản vào các tế bào dược

liệu, thời gian thấm phụ thuộc vào đường kính, chiều dài mao quản, bản chất dung môi Quá trình hoà tan phụ thuộc vào bản chất hoá học của các chất tan

và dung môi Các chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH) dễ tan trong dung môi phân cực (nước, cồn, propyl ) Các chất có nhiều nhóm không phân cực (chất béo, CH3 - C2H5- và đồng đẳng) dễ tan trong dung môi không phân cực

Hiện nay có nhiều cách trích ly các hợp chất sinh học, dựa vào đặc tính vật lý và hóa học ta chọn phương pháp trích ly thích hợp mang lại hiệu quả

cao: Phương pháp ngâm, Phương pháp ngấm kiệt, Phương pháp trích ly bằng

thiết bị Soxhlet

1.3.3 M ột số nghiên cứu thu nhận β-glucan từ nấm Đầu Khỉ

Chai Junhong và cộng sự năm 2010 khi nghiên cứu công nghệ trích ly nấm Đầu khỉ bằng công nghệ sóng siêu âm Quy trình tiến hành 2 lần trong thời gian 45 phút, nhiệt độ 60°C, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi lỏng = 1/15 So với công nghệ truyền thống trích ly bằng nước ấm, trích ly sóng siêu âm giảm

tới 4/5 thời gian và lượng dịch chiết Polysaccharides tăng thêm 40% [27]

HU Bin-jie, SHI Zhao-zhong năm 2009 khi sử dụng phương pháp siêu

âm trong trích ly Polysaccarides từ nấm Đầu khỉ ở điều kiện cơ chất/dung môi nýớc = 1/15, 500C, 2 giờ trích ly Cho hiệu suât trích ly ðạt trên 40% (so với tổng số Polyasaccharides), thời gian trích ly ngắn hơn phương pháp trích

ly bằng nước nóng truyền thống là 4-5 lần [15]

Han Wei và cộng sự, năm (2009) đã đưa ra được quy trình trích ly nấm Đầu khỉ ở nhiệt độ 850C trong 4h với dung môi ethanol, thu hồi Polysaccharides bằng phương pháp tửa với ethanol 75%, lượng Polysaccharides này có vai trò quan trọng đối với hệ miễn dịch khi kích hoạt

tế bào LAK và IL-2 [25]

WU Zhi-ming và cộng sự năm (2011) đã nghiên cứu trắch ly Polysaccharides từ quả thể nấm Đầu khỉ cho thấy ảnh hưởng của các điều kiện trắch ly nhý: PH, tỷ lệ nguyên liệu và chất lỏng, nhiệt độ và thời gian trắch ly đến hiệu quả trắch ly Xác đinh được điều kiện tối ưu cho trắch ly: Nhiệt độ trắch ly 800C, tỉ lệ nguyên liệu/chất lỏng là 1 g/25 ml, giá trị pH dung môi là 5,5, thời gian trắch ly 3 giờ Cho hiệu quả trắch ly Polysaccharides đạt 4,5% [22]

1.4 Tình hình sản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình s ản xuất và nghiên cứu nấm Đầu Khỉ trên thế giới

Ngay từ đầu thế kỷ thứ 19 nấm Đầu Khỉ được biết đến như một loại

nấm ăn mang giá trị dinh dưỡng cao, đồng thời còn là nguồn dược liệu quý

Tới năm 1960 nấm Đầu Khỉ được nuôi trồng thành công, nhưng phải hơn 40

năm sau tức là gần 10 năm trở lại đây mới phát triển

Tắnh đến năm 1991, tổng sản lượng nuôi trồng nấm Đầu Khỉ trên thế

giới là 66.000 tấn nấm tươi, chỉ chiếm 1,2% so với tổng lượng nấm trên toàn thế giới, và còn rất thấp đối với nhu cầu của thị trường Nói chung Từ năm

1981 đến 1997 sản lượng trồng nấm Đầu Khỉ tăng lên ắt, trong những báo cáo

về tình hình nuôi trồng nấm trên thế giới sản lượng vẫn bị xếp chung vào cùng các loài nấm khác Nhận thấy tiềm năng về mặt sinh học của nấm Đầu Khỉ, là thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, được chiết xuất thành các chế phẩm y dược Một số nước châu Âu, châu Mỹ bắt đầu quan tâm đến

việc nuôi trồng loài nấm này Hoa Kỳ, PhápẦ Sản lượng nấm Đầu Khỉ trên

trên thế giới tăng một cách đáng kể trong năm 2003, đứng đầu về sản lượng nuôi trồng là Trung Quốc, tiếp theo là Nhật Bản

Nấm Đầu Khỉ tuy được trồng ở nhiều quốc gia song chất lượng và năng

quả vẫn còn hạn chế, tua nấm thường ngắn, quả thể mau già và hóa vàng

Tới giữa thế kỷ 19 có rất nghiều những nghiên cứu về chiết xuất các hoạt tắnh sinh học trong nấm, trong đó có polysaccharides Polysaccharides có thể không tan như cellulose nhưng có những loại có độ trương nở và hoà tan

tốt trong nước nóng và nước lạnh (tinh bột, guaran gum) Dung dịch polysaccharides có độ nhớt thấp ngay cả ở nồng độ cao hay có độ nhớt cao ngay cả ở nồng độ thấp Nhiều loại polysaccharides ở nồng độ thấp vẫn có thể tạo gel nhiệt thuận nghịch Khi nhiệt độ tăng, các gel này sẽ bị chảy ra, tuy nhiên một số dẫn xuất của cellulose lại tạo gel ở nhiệt độ cao

1.4.2 Tình hình nghiên c ứu và sản xuất trong nước

Với một nước khí hậu nhiệt đới như Việt Nam thì việc nuôi trồng nấm Đầu Khỉ có rất nhiều khó khăn Nhưng nhờ vào áp dụng khoa học kỹ thuật và nuôi trồng nấm trong một môi trường khắt khe lần đầu tiên vào năm 1998, viện nghiên cứu Đà Lạt đã thành công trong nuôi trồng loài nấm này, nhưng sản lượng nấm ít chỉ đáp ứng cho các đề tài nghiên cứu

Tổng sản lượng các loại nấm ăn và nấm dược liệu của Việt Nam hiện nay đạt trên 100.000 tấn/năm, kim ngạch xuất khẩu khoảng 40 triệu USD/năm, riêng nấm Đầu Khỉ đạt khoảng 6.000 tấn So nấm dược liệu như nấm hương, nấm linh chi con số này còn rất nhỏ Hiện nay tại nhiều nơi như Sõn La, Sapa, Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Ninh Bình, Hồ Chí Minh, Đà Lạt bắt đầu trồng thử nghiệm loại nấm này

Nấm Đầu Khỉ đang mở ra một hướng phát triển mới cho ngành trồng nấm.Việc xuất khẩu sẽ mang lại nguồn lợi rất lớn Tuy nhiên nấm vẫn còn khá xa lạ với người dân Việt Nam Việc nuôi trồng nấm vẫn chưa được quan tâm và phổ biến rộng rãi Nấm Đầu Khỉ còn khá mới đối vối Việt Nam nên những nghiên cứu về nấm chỉ hạn chế ở việc nuôi trồng nấm đạt năng quả chứ chưa chú trọng đến việc trích ly các hợp chất thành các sản phẩm chức năng

PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

Nguồn nấm Đầu Khỉ (Hericium erinaceus): Thu thập tại cơ sở trồng

nấm Hưng Yên – Hà Nội

Nấm Đầu Khỉ thu thập ở dạng nguyên liệu khô (độ ẩm để <13%) Sau

đó nấm được xử lý nghiền nhỏ rồi đem bảo quản kín trong túi bóng ở nơi thoáng mát để tránh ẩm mốc

2.1.2 Hoá ch ất và thiết bị

- Hoá chất: Cồn (960), nước cất, phenol, acid sunfuric (96%),

D-glucose tinh khiết

- Dụng cụ: Bình tam giác, bình định mức, pipet, đĩa péptri

-Thiết bị: Máy sấy (Grot DZ 47-63, Trung Quốc), Máy đo OD (Zuzi

4110ED SpeCTKrophotometer, Đức), Máy siêu âm (Ultrasonic LC30, Đức), Cân phân tích (Precisa XT 320M, Thụy Sỹ), hiết bị Soxhlet (TC 15, Trung Quốc), Cân kỹ thuật (Cent-0-Gram Balance, OHAUS, Mỹ), Tủ lạnh

(Samsung SR-15NFBA, Nhật bản), Máy xay (Điện cơ An Phát, Việt Nam)

2.2 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

Địa điểm: Bộ môn Nghiên cứu phụ phẩm và môi trường nông nghiệp -

Viện Cơ điện Nông nghiệp và CNSTH, 60 Trung Kính, Trung Hòa, Cầu

Giấy, Hà Nội

Th ời gian: Từ tháng 12/2015 đến tháng 5/2016

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Ph ương pháp xác định các chỉ tiêu hoá lý

2.3.1.1 Ph ương pháp xác định độ ẩm[10]

- Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách lượng nước tự do và nước liên kết bên trong sản phẩm Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân

khối lượng mẫu đến khi khối lượng lần trước và lần sau nó không thay đổi thì dừng sấy Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô

- Công thức tính: Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:

` Trong đó: G1: Khối lượng mẫu trước khi sấy (g)

G2: Khối lượng mẫu sau khi sấy (g)

2.3.1.2 Ph ương pháp xác định phần trăm chất khô hòa tan

Xác định phần trăm chất khô hòa tan trong mẫu dùng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi theo TCVN 5860 – 1994 [11]

Nguyên tắc: Sấy mẫu trong thời gian dài để tách hết lượng nước tự do

và nước liên kết bên trong sản phẩm Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết, phần còn lại là chất khô

Tiến hành: Giảm thể tích phần dịch chiết xuất bằng cô chân không tại

60ºC/-0,8 atm trong 3 giờ, sau đó tiếp tục sấy khô chân không tại 60ºC/-0,8 atm tới khối lượng không đổi, lấy mẫu ra làm nguội cân xác định hàm lượng chất khô hòa tan Tiến hành ba mẫu song song, lấy kết quả trung bình của các mẫu

Phần trăm chất khô hòa tan (C %) so với 100g nguyên liệu được xác định theo công thức sau:

C% = G1

4xG

Trong đó:

G: khối lượng nguyên liệu ban đầu (100g)

4: hệ số chuyển đổi từ 400g nguyên liệu ban đầu

G1: Khối lượng chất khô hòa tan sau khi sấy từ 400g nguyên liệu ban đầu (g)

2.3.1.3 Định lượng β-glucan bằng phương pháp phenol-sulfuric theo phương pháp

c ủa Dubois và CS, 1956 [28]

Nguyên tắc: Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan được tiến

hành dựa trên phương pháp phenol-sulfuric của Michel Dubois và cộng sự

(1956), sử dụng D-glucose làm chất chuẩn, phenol sẽ kết hợp với cacbohydrate tạo phức Phức chất này sẽ được hấp thụ tại bước sóng 490 nm Khi phức chất tạo ra càng nhiều, giá trị hấp thụ màu của phương pháp phenol-sulfuric ở bước sóng 490nm càng lớn Hàm lượng β-glucan được xác định dựa trên độ tăng khả năng hấp thụ màu của hỗn hợp Tùy từng điều kiện phương pháp phenol-sulfuric có độ chính xác đến ± 2%

Cân 1g β-glucan tổng, hòa tan trong 10ml nước cất được dung dịch đầu

có nồng độ 0,1 g/ml Pha loãng dung dịch đầu theo tỉ lệ xác định

- Lấy 0,5ml dịch mẫu pha loãng lắc đều với 0,5ml dung dịch phenol 5%, bổ sung 2,5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm

- Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng để hiện màu trong 30 phút

- Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490nm

- Mẫu đối chứng dùng 0,5ml nước cất thay mẫu

- Tất cả các thí nghiệm được lặp 3 lần rồi chọn giá trị trung bình

- Từ hiệu số giá trị OD giữa dịch mẫu và mẫu đối chứng sẽ tính được hàm lượng β-glucan có trong mẫu bằng cách so sánh với giá trị OD của D-glucose chất chuẩn

Xây dựng đường chuẩn:

Pha phenol 5%: Cân 5g phenol, hòa tan trong bình định mức 100 ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hòa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất, sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml

Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0, 25, 50,

75, 100, 125, 150 (µg/ml)

Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các ống nghiệm 5ml Thêm lần lượt vào tất cả các ống nghiệm chuẩn 0,5 ml dung dịch phenol 5%, bổ sung 2,5 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm

Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng để hiện màu trong 30 phút

Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 490nm

Kết quả xây dựng đường chuẩn:

Đường chuẩn β-glucan được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1 Với trục tung là mật độ quang và trục hoành

là nồng độ chất chuẩn Phương trình thể hiện mối tương quan giữa D-glucose

và OD 490nm là:

y = 0,006x + 0,0369

Trong đó, y: Giá trị mật độ quang ở 490nm (OD)

x: Hàm lượng β-glucan sau pha loãng (µg/ml)

a,b: Trị số của phương trình đường chuẩn

C

=

Trong đó, : X: Hàm lượng β-glucan (µg/g)

x.n: Hàm lượng β-glucan trong mẫu thí nghiệm (µg/ml)

x: Hàm lượng β-glucan xác định từ đường chuẩn (µg/ml) n: là hệ số pha loãng (lần)

m: Hàm lượng tủa β-glucan ban đầu (1 g) C: Nồng độ dung dịch mẫu ban đầu (0,1 g/ml)

2.3.1.4 Kh ảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH

(test DPPH) theo ph ương pháp của Shimada và CS[29]

- Nguyên tắc: Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại tại λ = 515 nm

Hình 2.1 Công th ức DPPH

*) Tiến hành

- Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol (MeOH)

- Các mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: