Nghiên cứu về đặc điểm sinh học và bước đầu nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng nấm thuộc chi cordyceps phân lập tại việt nam

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo, phần lớn thuộc chi Cordyceps đã được các nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh được giá trị của chúng trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con ng

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè

Tôi xin được gửi lời cảm ơn đặc biệt tới TS Phạm Thanh Huyền, phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã tạo điều kiện, hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cần có, những bước tiếp cận đầu tiên trong nghiên cứu khoa học, tận tâm và nhiệt tình, giúp tôi có thể hình thành nên các kỹ năng cần thiết trong suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Phí Quyết Tiến, trưởng phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã tạo điều kiện thuận lợi về phương tiện, hướng dẫn các quy tắc làm việc phòng thí nghiệm trong suốt thời gian làm luận văn

Và tôi xin được chân thành cảm ơn thầy cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học, bạn bè cũng như người thân đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Ngọc Trâm

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo 4

1.1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo 4

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái học của một số loài nấm thuộc chi Cordyceps 6

1.1.4 Quá trình xâm nhiễm nấm vào cơ thể côn trùng 9

1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo 11

1.2.1 Cordycepin 12

1.2.2 Adenosine 13

1.2.3 Polysaccharide 14

1.2.4 Các hợp chất khác 15

1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người 19

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong và ngoài nước 23

1.4.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới 23

1.4.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu 27

2.1.1 Chủng giống 27

2.1.2 Hóa chất 27

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị 27

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Phương pháo bảo quản giống 29

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học 29

2.2.3 Phân loại chủng nấm theo trình tự gen DNA 30

2.2.4 Lựa chọn môi trường lên men 31

chủng nấm 33

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Đặc điểm sinh học của chủng nấm 34

3.2 Kết quả phân loại của các chủng nấm 37

3.3 Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng nấm 37

3.4 Bước đầu nghiên cứu lên men chủng nấm C cicadae VTD4 42

3.4.1 Lựa chọn môi trường nhân giống thích hợp 42

3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng phát triển của chủng nấm 43

3.4.3 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp 47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Bảng 3.2 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 18S và 28S

rRNA của các chủng nấm với gen tương ứng đã được đăng ký trên GenBank

37

Bảng 3.3 Mô tả hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm C

militaris HTD3 trên một số môi trường nuôi cấy

38

Bảng 3.4 Mô tả hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm C

cicadae VTD4 trên một số môi trường nuôi cấy

40

Bảng 3.5 Khả năng phát triển của chủng nấm C cicadae VTD4

trên các môi trường nhân giống khác nhau

42

Bảng 3.6 Khả năng sinh trưởng của chủng nấm C

cicadaeVTD4 ở các nhiệt độ khác nhau

43

Bảng 3.7 Khả năng sinh trưởng của chủng nấm C cicadae

VTD4 tại các giá trị pH khác nhau

45

Bảng 3.8 Khả năng sinh trưởng của chủng nấm C cicadae

VTD4 với các độ thông khí khác nhau

46

Bảng 3.9 Khối lượng sinh khối khô thu được của chủng nấm C

cicadae VTD4 khi nuôi lắc ở 150rmp và nhiệt độ

25oC sau 7 ngày

47

Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng các chất có trong dịch

lên men và trong sinh khối lên men của chủng quả

thể tươi chủng nấm C cicadae VTD4

48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên 5 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm 34 Hình 3.2 Ảnh hiển vi điện tử của chủng C militaris HTD3 sau

10 ngày nuôi cấy

35

Hình 3.3 Ảnh hiển vi điện tử của chủng C cicadae VTD4 sau

10 ngày nuôi cấy

35

Hình 3.4 Hình ảnh dạng quả thể của chủng nấm HTD3 trên

môi trường lên men xốp và trên sâu sau 40 ngày nuôi cấy

36

Hình 3.5 Hình ảnh dạng quả thể của chủng nấm VTD4 trên

môi trường lên men xốp và trên sâu sau 40 ngày nuôi cấy

36

Hình 3.6 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm C militaris

HTD3 trên các môi trường khác nhau sau 15 ngày

39

Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc của chủng nấm C cicadae VTD4

trên các môi trường khác nhau sau 15 ngày

39

Hình 3.8 Kích thước khuẩn lạc của các chủng nấm trên các

môi trường sau 20 ngày

41

Hình 3.9 Kích thước khuẩn lạc của các chủng nấm trên các

môi trường sau 25 ngày

41

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng phát triển và

sinh tổng hợp chất của chủng VTD4

44

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng

nấm VTD4 trên đĩa petri sau 7 ngày

44

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng phát

triển của chủng C cicadae VTD4

45

Hình 3.13 Ảnh hưởng của độ thông khí đến khả năng sinh

trưởng và sinh tổng hợp các chất của chủng

46

Hình 3.14 Chủng C cicadae VTD4 sau 11 ngày lên men trong

môi trường MT1

48

Hình 3.15 Kết quả đo quang phổ xác định hàm lượng

cordycepin và adenosine của dịch lên men chủng nấm

C cicadae VTD4

49

Hình 3.16 Kết quả đo quang phổ xác định hàm lượng

cordycepin và adenosine trong sinh khối của chủng

nấm C cicadae VTD4

49

MỞ ĐẦU

Đông trùng hạ thảo được coi là một dược liệu quý hiếm có khả năng

chữa nhiều loại bệnh và đã được sử dụng từ xa xưa Nấm Đông trùng hạ thảo

là loại nấm ký sinh trên sâu non, nhộng, hoặc một số loại côn trùng Vào mùa

đông, một số loài côn trùng bị nấm ký sinh xâm nhiễm và sử dụng chất dinh

dưỡng trong cơ thể làm thức ăn, khiến côn trùng chết Đến mùa hè, khi gặp

điều kiện thuận lợi về độ ẩm và nhiệt độ, nấm chuyển sang giai đoạn hình

thành quả thể và nhú khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn dính liền vào thân côn

trùng Vì mùa đông nấm ký sinh trên côn trùng, mùa hạ mọc thành cây nên có

tên Đông Trùng Hạ Thảo Nấm ký sinh côn trùng để sản xuất dược liệu được

xác định khoảng hơn 400 loài khác nhau Nhưng cho đến nay, những nghiên

cứu và sản xuất đa phần tập trung vào nhóm Cordyceps sp do nhóm này có

chứa nhiều loại acid amin, vitamin, D-manitol, exopolysaccharide, adenosine,

ergosterol, cordycepin và các nguyên tố vi lượng… Các chất này có tác dụng

tăng cường sức khỏe, nâng cao hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, điều trị bệnh tim

mạch, kháng tế bào ung thư, kháng vi sinh vật.Theo các tài liệu ghi chép về

đông dược cổ, Đông trùng hạ thảo đã được sử dụng từ lâu và là một vị thuốc

bồi bổ hết sức quý giá cho sức khỏe con người

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo, phần lớn thuộc chi Cordyceps

đã được các nhà khoa học nghiên cứu và chứng minh được giá trị của chúng

trong chăm sóc và bảo vệ sức khỏe của con người Bằng các kỹ thuật công

nghệ sinh học tiên tiến, các phương tiện hiện đại, nhiều nước đã thành công

trong việc nuôi cấy nhân tạo các chủng nấm đông trùng hạ thảo trên quy mô

công nghiệp như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan

Việt Nam là nước có mật độ dân số cao nên việc cải thiện chất lượng

dân số, chăm sóc sức khỏe cho nhân dân được nhà nước đặc biệt quan tâm

Ngoài các thuốc chữa bệnh thiết yếu, thực phẩm dinh dưỡng và một số thực

phẩm chức năng từ đông trùng hạ thảo đã chứng minh được hiệu quả sử dụng

trong ph ng, chống bệnh được sử dụng rộng rãi Nắm bắt được tiềm năng, các

nước phát triển như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Đài Loan… đã có

nhiều năm nghiên cứu, xây dựng thành công quy trình, sản suất với quy mô

công nghiệp tạo ra rất nhiều sản phẩm trên thị trường Tuy nhiên, giá thành

sản phẩm quá cao Chính vì thế, việc nghiên cứu phát triển và ứng dụng các

loài nấm dược liệu như nấm đông trùng hạ thảo ở Việt Nam đang được đẩy

mạnh Hiện nay, phần lớn các chủng giống cho sản xuất nấm Đông trùng hạ

thảo vẫn phụ thuộc vào nguồn nhập khẩu từ các nước lân cận nên giá thành

còn cao Do vậy, việc nghiên cứu tạo các chủng nấm Đông trùng hạ thảo phân

lập tại Việt Nam nhưng vẫn đảm bảo chất lượng đang được quan tâm thúc đẩy

nhằm đáp ứng được nhu cầu cho xã hội Để góp phần vào nghiên cứu và phát

triển nâng cao thị trường sản xuất các sản phẩm từ nấm dược liệu Đông trùng

hạ thảo ở Việt Nam, chúng tôi đã thực hiện đề tài:“Nghiên cứu về đặc điểm

sinh học và bước đầu nghiên cứu điều kiện lên men của các chủng nấm

thuộc chi Cordyceps phân lập tại Việt Nam”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng nấm ký sinh côn trùng thuộc chi

Cordyceps với mục đích phân loại và tìm ra được điều kiện nuôi cấy phù hợp

cho sinh trưởng, phát triển của chủng nấm được phân lập từ Việt Nam Bên

cạnh đó, nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp với định hướng tăng khả

năng tạo ra các chất có giá trị dược liệu cao như cordycepin, adenosine… để

ứng dụng trong sản xuất thực phẩm chức năng

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu

Các chủng nấm Đông trùng hạ thảo thuộc chi Cordyceps ký hiệu HTD3

và VTD4 phân lập tại vườn Quốc Gia Tam Đảo trong bộ sưu tập giống của

phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng nấm đông trùng hạ

thảo Cordyceps sp HTD3 và Cordyceps sp VTD4

- Phân loại chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sp VTD4 theo

trình tự gen

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho nuôi cấy và bước đầu nghiên cứu

điều kiện lên men chủng nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps sp VTD4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về chủng nấm Đông trùng hạ thảo

1.1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo

Từ lâu, Đông trùng hạ thảo được coi là thần dược trong y học cổ truyền

của các nước phương Đông Trong lịch sử phát triển của Trung Quốc, Đông

trùng hạ thảo là một loại thuốc quý được sử dụng từ hàng ngàn năm trước và

chỉ dùng cho các bậc vua chúa Theo đông y Trung Quốc, loại nấm này có tác

dụng chữa nhiều bệnh như bệnh về phổi, về thận, đổ mồ hôi trộm, đau lưng,

yếu sinh lý… Vì vậy, nấm đông trùng hạ thảo được người Trung Quốc xem

như nhân sâm (Theo Sách y học cổ truyền Trung Quốc)

Nấm Đông trùng hạ thảo (còn gọi là Đông trùng thảo, Trùng thảo hay

Hạ thảo đông trùng) là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu

trưởng thành của một số loài côn trùng Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng

thành của một số loài nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn

trùng xâm nhiễm và sử dụng các chất trong cơ thể côn trùng làm thức ăn, làm

cho côn trùng chết Giai đoạn này nhiệt độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký

sinh ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ không khí cao, nấm

chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng gốc vẫn

dính liền vào thân sâu Vì mùa đông nấm ký sinh trên côn trùng, mùa hạ mọc

thành quả thể nấm nên có tên Đông Trùng Hạ Thảo Để thu hoạch nấm người

ta thường đào lấy cả xác sâu và nấm để làm thuốc (Trịnh Tam Kiệt et al.,

2001; Đái Duy Ban et al., 2009)

Từ đầu những năm 1990, các nước phương Tây bắt đầu quan tâm

nghiên cứu Đông trùng Hạ thảo để ứng dụng trong ngành y học hiện đại

Ngày này, hiệu quả sử dụng của các chất dinh dưỡng trong nấm đông trùng hạ

thảo đã được khoa học chứng minh Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã

nghiên cứu, điều tra và thu thập nấm Đông trùng hạ thảo ngoài tự nhiên để

làm nguyên liệu sản xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho con người

(Park et al., 2001; Kim et al., 2005; Shin et al., 2007; John & Matt, 2008; Đái

Duy Ban et al., 2009)

Hình 1.1 Nấm Đông trùng hạ thảo tự nhiên

1.1.2 Sự phân bố của nấm Đông trùng hạ thảo trong tự nhiên

Theo như công bố, các loài nấm ký sinh côn trùng chủ yếu thuộc thuộc

lớp nấm túi (Ascomycetes), bộ Clavicipitales, họ Cordycipitaceae Dựa trên

đặc điểm hình thái cũng như đặc điểm về thông tin di truyền, các loài nấm

thuộc họ này bao gồm các chi chủ yếu là: Cordyceps, Elaphocordyceps,

Metacordyceps và Ophiocordyceps (Sung et al., 2007) Nấm Đông trùng hạ

thảo để sản xuất dược liệu được xác định gồm hơn 680 loài khác nhau, chỉ

riêng Trung Quốc đã tìm thấy hơn 60 loài (Park et al., 2001) Nhưng cho đến

nay, những nghiên cứu và sản xuất đa phần tập trung vào nhóm Cordyceps sp

do nhóm này có chứa nhiều loại acid amin, vitamin (A, B12, B2, C, E, K),

D-manitol, exopolysaccharide, adenosine, ergosterol, cordycepin và các nguyên

tố vi lượng (Al, Si, K, Na)… có tác dụng tăng cường sức khỏe, nâng cao hệ

miễn dịch, chống ôxi hóa, điều trị bệnh tim mạch, kháng tế bào ung thư,

kháng vi sinh vật…(Kim et al., 2004; Shin et al., 2007; John & Matt, 2008)

Các chủng thuộc chi Cordyceps được thu mẫu ở các vùng khác nhau

trên toàn thế giới Đông trùng hạ thảo được tìm thấy vào mùa hè ở một số cao

nguyên cao hơn mặt biển từ 3500 đến 5000m thuộc các vùng Tây Tạng, Tứ

Xuyên, Thanh Hi, Cam Túc, Vân Nam … Mao và cộng sự (2000) đã mô tả

đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa cho 13 loài nấm thuộc chi

Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài: Cordyceps barnesii

Thwaites, C.capiata (Holmsk.:Fr.) Link., C crassispora Zang, C gunii

(Berk.) Berk., C.hawkesii Gray, C kyushuensis Kobayasi, C martialis Gray,

C militaris (L.:Fr.) Link., C nutans Pat., C ophioglossoides (Ehrenb.) Link.,

C sinensis (Berk.) Sacc., C sobolifera (Hill.) Berk Et Br., C tubeculata

(Leb.) Maire

Trong công bố của các nhà khoa học Hàn Quốc, 25 loài nấm thuộc chi

Cordyceps phân bố ở Hàn Quốcđã được mô tả đặc điểm hình thái và hình ảnh

bao gồm: C adaesanensis, C agriota Kawamura, C bifisispora, C

crassispora, C discoideocapiata, C formicarum, C gemiculata, C gracilis,

C heteropoda, C ishikariensis, C kyushuensis, C martialis, C militaris, C

nutans, C ochraceostromata, C ophioglossoides, C oxycephala, C

pentatoni, C pruinosa, C rosea, C scarabaeicola, C sinensis, C

sphecocephala, C tricentri, C yongmoonensis(Sung et al., 2000) Và theo

một số nghiên cứu cho thấy, các thành viên của chi nấm Cordyceps còn có thể

được tìm thấy ở Thái Lan, Nhật Bản và Việt Nam (John et al., 2005) Như

vậy, có thể thấy thành phần loài nấm Đông trùng hạ thảo khá phong phú ở

trên các vùng sinh thái khác nhau và nhiều loài có phạm vi phân bố rộng, các

loài có đặc điểm phân bố đặc hữu cho từng vùng

1.1.3 Đặc điểm hình thái học của một số loài nấm thuộc chi Cordyceps

Trong tự nhiên, nấm Cordyceps để hoàn thành chu kỳ sinh trưởng của

mình chúng phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển phức tạp, từ giai đoạn

sống trong đất tới sau khi lây nhiễm vào cơ thể ấu trùng, chúng chịu sự cạnh

tranh với các vi khuẩn khác, thậm chí cả sự tham gia nhiều loài khác của chi

nấm Cordyceps Ở giai đoạn đầu, bào tử nấm nhiễm vào cơ thể sâu non,

nhộng, sâu trưởng thành nằm dưới đất hoặc ở trên mặt đất Trong khi ấu trùng

ngủ đông, nấm ký sinh sẽ tấn công cơ thể của chúng, sử dụng chất dinh dưỡng

trên ấu trùng thức ăn Giai đoạn này nhiệt độ và độ ẩm không khí thấp nên

nấm ký sinh ở dạng hệ sợi, phát triển trên cơ thể vật chủ để hút chất dinh

dưỡng Đến mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm không khí cao, nấm chuyển sang giai

đoạn sinh sản hữu tính, hình thành thể quả (John et al., 2005)

Trong Bảng 1.1 và 1.2 là một số mô tả về hình dạng của vật chủ (ấu

trùng hoặc sâu non) và quả thể của các loài nấm thuộc chi Cordyceps

Bảng 1.1 Mô tả hình thái một số loài nấm thuộc chi Cordyceps

C sinensis Ấu trùng giống nhộng tằm, có

chiều dài từ 3-5cm, đường kính 3-8mm, màu vàng đậm tới màu

vàng nâu

Quả thể hình trụ mảnh, 4-7 cm chiều dài và khoảng 3mm đường

đỉnh

C barnesii Ấu trùng cong, ngắn, 1,5-2cm

chiều dài, đầu nhỏ, với một cặp

răng

Quả thể thanh mảnh và cong, 6cm chiều dài và khoảng 2mm

2-đường kính

C cicadae Âu trùng giống con tằm, dày,

chiều dài 3-6cm, đường kính 10mm; bề mặt bên ngoài màu

6-nâu đến màu 6-nâu sẫm

Quả thể phẳng, hơi cong, khoảng 5cm chiều dài, màu vàng đến màu vàng cam, trông giống quả

thể của loàiC militaris

C militaris Âu trùng giống con tằm, bề

mặt bên ngoài có màu nâu

Quả thể phẳng, hơi cong, khoảng 5cm chiều dài, màu vàng cam

đến màu đỏ da cam

(Hui-juan et al., 2011)

Bảng 1.2 Mô tả mặt cắt phần cơ thể ấu trùng bị xâm nhiễm và quả thể

của các loài thuộc chi Cordyceps

Chủng Mặt cắt phần cơ thể ấu trùng Mặt cắt phần quả thể

C sinensis Bề mặt trong của ấu trùng phủ lớp

sợi dày 20-40µm và dài 23-85µm

Cơ thể ấu trùng đầy sợi nấm màu trắng, hình chữ C, sọc hình chữ V

hay L ở trung tâm

Quả thể hình elip hoặc bầu dục bám với phần chất dinh dưỡng Phần trung tâm phủ đầy sợi nấm khí

sinh

C gunnii Phần ấu trùng bao phủ bởi sợi khí

sinh, hình V hoặc hình trụ thẳng ở trung tâm Các cạnh của cơ thể ấu

trùng cong

Quả thể hình bầu dục, bám với phần thân vật chủ, phần trung tâm phủ sợi khí

sinh

C barnesii Cạnh cơ thể ấu trùng cong, các sợi

khí sinh mọc trên ấu trùng, đường kính 9-25µm, có thể dài tới

100µm

Không có quả thể Vỏ ngoài màu nâu, chứa mô giả, lớp bên trong không màu, sợi nấm sắp xếp hình

lưới

C gracilis Bên trong có màu vàng nâu, bề

mặt trơn bóng Cạnh của cơ thể ấu

Phần cơ thể ấu trùng có sợi nấm

đan vào nhau, màu trắng ngà

Sợi nấm màu trắng, quả thể màu vàng cam, đầu hơi

tròn hình elip

(John et al., 2005)

Theo như nghiên cứu của nấm Đông trùng hạ thảo thuộc họ

Clavicipitaceae Trong đó, các loài nấm như C militaris, C sinensis, C

cicadae được nghiên cứu nhiều hơn cả

Loài Cordyceps militaris (L.) Link, Syn Clavaria militaris L., Sp hay

Sphaeria militaris (L.) Fr có quả thể đơn, đôi khi phân nhánh ở phía đỉnh,

màu vàng da cam, 2-5cm chiều cao Đỉnh hình chùy, 1-2cm chiều dài, 3-5mm

chiều dày, dạng củ hình thành từ thể quả đệm Quả thể hình nón, kích thước

400-570 x 250- 325µm Nang 150-300µm chiều dài, 4-5µm chiều rộng, bào

tử đường kính 1µm hay nhỏ hơn, thường gãy thành từng phần nhỏ, đạt từ

2-6µm chiều dài Gặp trên nhộng của côn trùng cánh vảy Lepidoptera tên đất

Phân bố: nhiều nơi ở Trung Quốc và Việt Nam (Trịnh Tam Kiệt, 2011)

Loài Cordyceps sinensis ( Berk.) được mô tả như sau: Mô tương đối

phát triển, mọc lên từ phía đầu của vật chủ, đôi khi tách ra làm 2-3 thùy ở

phía trên đỉnh, 4-11cm chiều dài, 1,5-4mm chiều rộng ở đáy; đỉnh gần hình

trụ, thót đầu lại, đầu tiên đặc sau trở nên rỗng, trên mặt tạo thành các quả thể,

kích thước 10-45 x 3-6 mm Quả thể đơn độc nằm sâu trong mô, hình elip

cầu, kích thước 400-560 x 150-250 µm Nang dài hình sợi, kích thước

240-485 x 12-16 µm, chứa hai bào tử Bào tử hình sợi, có nhiều vách ngăn, trong

suốt, khôn gãy thành từng đoạn, kích thước 160-470 x 5-6µm Thường kí

sinh trên sâu của côn trùng cánh vảy Lepidoptera Phân bố: Thanh Tạng, Vân

Nam, Quý Châu, Sâp- Lào Cai (Hoàng Liên Sơn cũ), Lai Châu Đây là loài

nấm dược liệu rất quý hiếm, hiện đang được nghiên cứu nuôi trống nhân tạo ở

Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản… (Trịnh Tam Kiệt, 2011)

Loài Cordyceps cicadae có đặc điểm hình dáng và màu sắc của quả thể

hơi giống với loài C militaris Màu sắc của loài này có khi có màu cam nhạt

ở ngoài, màu hơi trắng sữa ở xung quanh khi nuôi trên môi trường xốp Tuy

nhiên, với đặc điểm hình thái tương đối giống với loài của C militaris nên

trước đây đã phân loại là dưới loài của loài này Phân biệt 2 loài này người ta

dựa vào loại vật chủ ký sinh, loài C cicadae thường ký sinh vào ấu trùng của

ve sầu (Cicada) (Sung et al., 2007)

1.1.4 Quá trình xâm nhiễm nấm vào cơ thể côn trùng

Theo Bách khoa toàn thư thì loài nấm Cordyceps lây nhiễm vào cơ thể

sâu hại đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân Những con sâu này có thể đã ăn

phải bào tử nấm hoặc chúng mắc bệnh nấm ký sinh qua hô hấp Đến khi sợi

nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, sử dụng

hoàn toàn các chất dinh dưỡng trong cơ thể vật chủ Đến một giai đoạn nhất

định, nấm phát triển thành dạng quả thể (hình dạng giống thực vật) và phát

tán bào tử (Ohta Y Lee et al., 2007) Nấm Đông trùng hạ thảo khi còn sống,

người ta có thể trông rõ hình con sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá Khi

sấy khô nó có mùi tanh, đốt lên có mùi thơm Phần “lá”- quả thể nấm- hình

dạng giống ngón tay, dài khoảng 4-11cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu

sâu non mà thành Đầu sâu non giống như con tằm, dài chừng 3-5cm, đường

kính khoảng 0,3- 0,8cm Bên ngoài có màu vàng sẫm hoặc nâu vàng với

khoảng 20-30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ hơn Phần đầu có màu nâu đỏ,

đuôi giống như con tằm, có tất cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất

Chất đệm nấm hình que cong mọc ra từ mình sâu non, dài hơn sâu non một

chút Sâu non dễ bẻ gãy, ruột bên trong căng đầy, màu trắng hơi vàng, chất

đệm nấm khá dai và bên trong ruột hơi rỗng, có màu trắng ngà (Chenet al.,

2005)

Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:

(i) Giai đoạn xâm nhập

Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập

vào trong xoang cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh

mầm bệnh, nó giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành

phần chính của lớp vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ dày như

Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, N-

axetylglucosaminidase, cenlulase Các enzyme này được tạo ra một cách

nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và thậm chí

ngay trong một loài

Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia

phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là

protein) Lipase, cenlulase và các enzyme khác cũng là những enzyme có vai

trò không kém phần quan trọng Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân

hủy protein (protease) và enzyme phân hủy kitin (chitinase) của côn trùng

Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký

sinh côn trùng (Nguyễn Lân Dũng và cs., 2006)

(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng

chết

Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm Trong xoang cơ thể côn trùng

nấm tiếp tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợ nấm

được hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi theo dịch máu, phá hủy

các tế bào máu và làm giảm tốc độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phận nội

quan bị xâm nhập Nấm thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp

Hoạt động của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác

nhân kích thích bên ngoài Kết quả là vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt

động sống và dẫn đến chết (Minaet al., 2005)

(iii)Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết

Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh

chóng Một số loài nấm tiếp tục sinh trưởng ở dạng sợi nấm Hệ thống miễn

dịch của ký chủ côn trùng sử dụng cơ chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối

kháng (như quinine và melanine) Đầu tiên, cơ thể côn trùng phải xác định cơ

thể ngoại lai và tạo ra phản ứng miễn dịch Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng

phát triển rất nhanh thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp

đảo hệ thống miễn dịch của côn trùng Hơn thế nữa nấm còn tạo ra các dạng

độc tố và một số công cụ tấn công khác để giết chết côn trùng, chính những

độc tố và công cụ tấn công này đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ Hầu hết

các nấm bất toàn (inperfect fungi) thường tạo ra độc tố và giết chết côn trùng

trong một thời gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính Trong

giai đoạn đầu độc ký chủ, một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trước khi

gây hại toàn bộ cơ thể côn trùng và trên cơ thể côn trùng quan sát thấy rất ít

sợi nấm (Trần Ngọc Lân và cs., 2008)

1.2 Một số chất có hoạt tính sinh học từ nấm Đông trùng hạ thảo

Các thành phần hóa học chứa trong nấm Cordyceps, quan trọng nhất là

nhóm chất cordycepic acid, cordycepin và polysaccharide có tác dụng rất tốt

trong điều trị bệnh ung thư và các bệnh do virus Ngoài ba thành phần trên khi

phân tích nấm người ta còn phát hiện rất nhiều hợp chất có giá trị là

cordycepic acid, N-acetylgalactosamine, adenosine, ergosterol và ergosterol

esters, bioxanthracenes, hypoxanthine, polysaccharide và exopolysaccharide,

chitinase, cicadapeptins, và myriocin, các chất có hoạt tính sinh học là

saccharides (trehalose và polysaccharides), nucleosides (adenosine, inosine và

cordycepin), manitol và sterols (ergosterol)

1.2.1 Cordycepin

Cordycepin là một hợp chất quan trọng trong nấm đông trùng hạ thảo

(Mina Masuda et al., 2005) Cordycepin lần đầu tiên được chiết tách từ loài

C militaris năm 1950 do Cunningham và cộng sự thực hiện, sau đó chất này

cũng được tìm thấy ở loài C sinensis và C kyushuensis Mặc dù cordycepin

có thể được tổng hợp hóa học nhưng chỉ cho sản lượng thấp Cordyceps tự

nhiên chứa lượng cordycepin vào khoảng 0,006- 6.36 mg/g Trong sinh khối

sinh nấm nuôi và quả thể của Cordyceps, hàm lượng cordycepin ở giai đoạn

đầu sau khi được tách và nuôi thường thấp với hàm lượng từ 0,006-1,64 mg/g

Các nhà khoa học cho biết khi thu nhận trong tự nhiên, nồng độ cordycepin

trong quả thể C militaris cao hơn C sinensis với hàm lượng lần lượt là 2,65

và 1,64 mg/g, trong khi trong nuôi cấy trong các bình lên men hàm lượng chất

này thu được là 1,59 mg/g tương đượng với C sinensis trong tự nhiên (Lo et

al., 2013)

Cordycepin (3’-deoxyadenosine) là một dạng nucleotide có hoạt tính

sinh học phổ rộng, thường được chuyển đổi thành 5’-mono, di và

triphosphate, hợp chất này ức chế sự hoạt động của quá trình sinh tổng hợp

mới của các tế bào ung thư Những nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và

Mỹ tập trung chủ yếu vào tuyển chọn và nâng cao hàm lượng cordycepin

trong thể quả hoặc trong dịch nuôi cấy hệ sợi Khi nuôi cấy hệ sợi trên môi

trường lỏng, nấm đã sản sinh ra cordycepin, hàm lượng đạt 15-26,8 mg/lít

(Mao, Zhong, 2004)

Trọng lượng phân tử của cordycepin C10H13N5O3 là 251, có nhiệt độ

nóng chảy là 230-231°C, độ hấp thu cao nhất ở 259nm (Dong et al., 2012)

Cordycepin có thể tan trong saline, cồn ấm, hoặc methanol, nhưng không tan

trong benzene, ether hoặc chloroform, các nhà khoa học thường sử dụng

saline khử trùng và đệm phosphates để hòa tan cordycepin (Xuanwei et al.,

2009) Cordycepin có khả năng kháng nấm, kháng ung thư và kháng virus

Trong các nghiên cứu gần đây đã chứng minh cordycepin có khả năng điều

hòa sản phẩm của interleukins trong tế bào lympho T (Mina et al., 2005)

Cordycepin phát huy tác dụng gây độc tế bào thông qua methyl hóa acid

nucleic, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh Clostridium

paraputrificum và Clostridium perfringens, nhưng không có tác dụng gây hại

tới vi khuẩn có lợi như Bifidobacterium sp và Lactobacillus sp (Lu et al.,

2009)

1.2.2 Adenosine

Adenosine được phân phối rộng rãi trong Cordyceps spp Chất này có

hiệu quả làm tăng khả năng lưu thông mạch vành và não, điều khiển lưu

lượng máu (1), phòng chống các rối loạn nhịp tim (Hermann và Feigl, 1992;

Kodama et al, 2000) Adenosine xuất hiện khá nhiều trong quả thể và có mặt

ở trong hầu hết các loài Cordyceps với hàm lượng dao động từ 0,28 tới 14,15

mg/g Khi thu nhận nấm Cordyceps trong tự nhiên, nồng độ adenosine là 2,45

±0,03 mg/g trong quả thể và ở nấm C militaris cao hơn C sinensis Hàm

lượng adenosine là 1,592±0,03 mg/g ở C sinensis, trong khi đó, hàm lượng

adenosine trong sợi nấm C militaris khi lên men có thể đạt tới 1,643±0,03

mg/g gần bằng với trong loài C sinensis tự nhiên Adenosine được cho là có

tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ tim mạch, giúp cải thiện tuần hoàn ngoại

biên và tim mạch, cải thiện năng lực cho cơ bắp, giảm sinh trưởng của các tế

bào thoái hóa, tăng lượng oxy trong máu, đóng vai tr quan trọng trong quá

trình chuyển hóa năng lượng của cơ thể… (Shashidhara et al., 2013)

1.2.3 Polysaccharide

Thành phần polysaccharide trong nấm Cordyceps được đánh giá cao về

giá trị dinh dưỡng trong sản xuất thực phẩm chức năng và sản xuất thuốc

phòng, chữa bệnh cho người Polysaccharide có cấu trúc phức tạp gồm

cyclofuran (đường 5C, mạch vòng), beta-glucans; beta-mannan; và phức hợp

polysaccharide có cả đường 5C và 6C cùng tham gia vào các chuỗi nhánh,

dùng cả cầu nối alpha- và beta-) Polysaccharide bao gồm monosaccharide,

disaccharide, các oligosaccharide và các polysaccharide phức tạp như

cyclofuran, là đường có 5 carbon Các chất chưa rõ tác dụng như β -glucan, β

-mannan và polyme của β -mannan; các loại polysaccharide phức tạp bao

gồm cả 5 và 6 đường carbon liên kết với nhau trong chuỗi phân nhánh sử

dụng cả hai α và β- tất cả các dị chất của polysaccharide Các hợp chất này có

tác dụng miễn dịch cũng đã được tìm thấy trong loài sâu Isaria sinclairii, một

loài có quan hệ chặt chẽ với chi Cordyceps Các loại polysaccharide là các

chất có hoạt tính sinh học tốt nhất có trong chi Cordyceps Số lượng các

polysaccharide và các loại đường như cordycepic acid hay D-mannitol phụ

thuộc vào từng chủng loài khác nhau Nhiều nghiên cứu cho thấy các

polysaccharide thu được từ nấm Cordyceps có hiệu quả điều chỉnh đường

máu, chống khối u và chống di căn (Nakamura et al., 1999); trong khi

polysaccharide từ thực vật lại không có đặc điểm này (Hui et al., 2011)

Các polysaccharide có khả năng chống lại hoạt động của các tế bào ung

thư bao gồm homopolyme có cấu tạo từ đơn giản đến phức tạp bao gồm

glucose, galactose, mannose, xylose, arabinose, fucose, ribose và acid

glucuronic Trong một số loài nấm ĐTHT, polysaccharide liên kết với các

protein hoặc peptide tạo thành các hệ polysaccharide - protein hoặc

polysaccharide – peptide, các cấu trúc này có hoạt tính kháng u mạnh hơn

(Mao, Zhong, 2004) Cấu trúc 1/3 - β - glucan có khả năng kháng khối u được

biết nhiều nhất, theo các nghiên cứu cho thấy những glucan có được hoạt tính

sinh học này là trong cấu tạo các phân tử có dạng mạch thẳng hoặc phân

nhánh với cấu trúc chính là phân tử đường glucose liên kết với các đơn vị

trong chuỗi tại các vị trí khác nhau, với các chuỗi bên bao gồm các đơn vị như

acid glucuronic, xylose, galactose, mannose, arabinose hoặc ribose

Heteroglycan là một nhóm lớn polysaccharide lớn hoạt tính sinh học đa dạng

được phân loại là galactan, fucan, xylan, và mannan (John et al., 2008;

Hardeep et al., 2014)

1.2.4 Các hợp chất khác

Ngoài ra, thành phần dinh dưỡng của các chất trong nấm Cordyceps

spp có chứa tất cả các acid amin thiết yếu, các loại vitamin (A, E, K và nhóm

B1, B2, B12) và các nguyên tố vi lượng (K, Na, Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn , Pi,

Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V, Zr) có tác dụng tăng cường sức khỏe, nâng

cao hệ miễn dịch, chống ôxi hóa, điều trị bệnh tim mạch, kháng tế bào ung

thư, kháng vi sinh vật…(Kim et al., 2004; Shin et al., 2007; John & Matt,

2008)

Nucleotide

Các nucleoside đã được tìm thấy ở Cordyceps spp bao gồm uridine,

một số cấu trúc khác biệt của deoxyuridine, adenosine, 2'3'-dideoxyadenosine,

hydroxyethyladenosine, cordycepin [3'-deoxyadenosine], cordycepin

triphosphate, guanidin, deoxyguanidine và một số các nucleoside bị khử oxy

mà không có trong tự nhiên (Nakamura et al., 1999) Nhiều nghiên cứu chỉ ra

rằng, guanosine có hàm lượng cao nhất trong tất cả các mẫu tự nhiên, khi nuôi

cấy trong điều kiện nhân tạo, hàm lượng của nucleotide thường cao hơn

Cordycepsspp so với tự nhiên Các nucleotide trong Cordyceps tự nhiên bắt

nguồn từ sự phân rã của nucleoside trong suốt quy trình bảo quản, tiếp đó các

nhà nghiên cứu cũng tìm ra rằng độ ẩm có thể làm tăng đáng kể hàm lượng

nucleotide trong Cordyceps khi nuôi trên môi trường xốp (Xuanwei et

al.,2009)

Các hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa của nấm Cordyceps

Hoạt tính chống oxy hóa (AOA) là một hoạt tính sinh học quan trọng

xuất hiện trong các chủng thuộc ngành nấm Basidiomycetes Mặc dù có nhiều

nhà nghiên cứu đã khảo sát đặc tính chống oxy hóa phổ rộng của các quả thể

nấm, nhưng chỉ có số ít được chú ý và tiến hành thu nhận các chất chống oxy

hóa này nhờ lên men chìm Một trong số các nghiên cứu được thực hiện bởi

Badalyan khi lên men trên môi trường lỏng để thu nhận dịch sau lên men,

dịch chiết sinh khối nấm và sinh khối) của 14 chủng nấm ( Cordyceps

comatus, C disseminatus, C micaceus, Hypholoma fasciculare, Lentinus

edodes, Lepista personata, Marasmius oreades, Pholiota alnicola, Pleuronata

versicolor, Stropharia coronilla, Suillusltuteus, Schizophyllum commune,

Trimetes versicolor và Volvariella bombycina) đều cho thấy có chứa các chất

chống oxy hóa có khả năng ức chế gốc tự do trong phản ứng peroxide hóa

lipid khi thí nghiệm trên não chuột (Lu et al., 2012)

Hiệu quả loại bỏ gốc tự do thu nhận từ sinh khối các chủng nấm từ môi

trường nuôi cấy, các chất khô của dịch lọc sau lên men, các hợp chất chiết khi

sử dụng dung môi chiết khác nhau thu nhận nấm Antrodia camphorata trong

lên men chìm Kết quả thu được trong dịch chiết sinh khối có tác động tích

cực với khả năng loại bỏ gốc tự do, đặc biệt hơn khi chiết sinh khối nấm bằng

nước cũng cho thấy khả năng và hoạt tính chống oxy hóa Ngay cả dịch sau

lên men sau khi đã loại bỏ sinh khối cũng có hiệu quả loại bỏ gốc tự do nhưng

với hiệu quả thấp hơn Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được mối quan hệ

tuyến tính giữa sự ức chế quá trình peroxy hóa chất béo và hàm lượng

polyphenol tổng thu nhận được từ dịch lên men của các chủng nấm Antrodia

camphorata Hơn nữa, họ cũng tìm ra sự tương quan cao giữa sự ức chế quá

trình peroxy hóa chất béo và hàm lượng triterpenoids thô trong dịch chiết bởi

dung môi methanol, ethyl acetate (Lu et al., 2012; Shi et al., 2009)

Mặc dù các nghiên cứu đều đã chứng minh được rằng nấm Cordyceps

có hoạt tính chống oxy hóa, nhưng để chắc chắn hợp chất nào đảm nhiệm

công việc này lại chưa có một kết luận rõ rang Chưa thể kết luận được rằng

bất cứ thành phần nào như polysaccharides, mannitol và cordycepin ở nấm

Đông trùng hạ thảocó tác động chính là chống oxy hóa (Shashidhara et al.,

2013)

Sterol

Ergosterol là sterol duy nhất của nấm và là tiền chất thiết yếu của

vitamin D2, có giá trị dược liệu quan trọng Hàm lượng ergosterol trong quả

thể nhân tạo của Cordyceps rất cao (10,68 mg/g) cao hơn nhiều so với hệ sợi

nấm chỉ có 1,44 mg/g(Xuanwei et al., 2009) Ergosterol trong C sinensis có

thể được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High

Performace Liquid Chromatography) do Li và cộng sự thực hiện năm 1991,

được cho là chất ophiocordin, ở C pseudomilitaris là chất bioxanthracenes và

tập hợp bốn exopolysaccharide với các trọng lượng phân tử thay đổi từ 50

kDa tới 2260 kDa tìm thấy ở C.militaris (Lu et al., 2012; Seok et al., 2009)

Protein và các acidamin

Nấm Cordyceps có hàm lượng protein thô trong khoảng 29,1-33%

Protein này bao gồm 18 loại acid amin, gồm có aspartic, threonine, serine,

glutamate, proline, glycine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine,

phenylalanine, lysine, histidine, cystine, cysteine và tryptophan Hàm lượng

acid amin sau khi thủy phân hầu hết là 20-25%, lượng thấp nhất là 5,53%, cao

nhất là 39,22% Hàm lượng cao nhất là glutamate, arginine và acid aspartic,

các thành phần có tác dụng dược lý chính là arginine, glutamate, tryptophan

và tyrosine (Xuanwei et al., 2009) Các chủng Cordyceps spp cũng chứa các

loại protein, peptide, polyamine và tất cả các acid amin thiết yếu Thêm nữa,

trong các loài Cordycep spp cũng chứa các loại dipeptide vòng hiếm gặp có

vòng gồm có cyclo-[Gly-Pro], cyclo-[Leu-Pro], cyclo-[Val-Pro],

cyclo-[Ala-Leu], cyclo-[Ala-Val] và cyclo-[Thr-Leu] Một lượng nhỏ polyamine như

1,3-diamino propane, cadavarine, spermidine và putrescine cũng được tìm thấy

(John et al., 2008; Hui et al., 2011)

Acid béo và các nguyên tố kim loại

Acid béo bao gồm carbon, hydro và oxy và là thành phần chính của

lipid, phospholipid và glycolipid, chúng được phân loại thành acid béo no và

không no Ở Cordyceps, lượng acid béo no được tìm thấy là 57,84% gồm có

C16:1, C17:1, C18:1, C18:2 Acid linoleic chiếm hàm lượng cao nhất 38,44%, tiếp

đó là acid olein 17,94% Các acid béo no chiếm 42,16%, bao gồm C14, C15,

C16, C17, C18, C20, và C22 Acid palmitic và acid octadecanoic chiếm hàm

lượng cao nhất lần lượt là 21,86% và 15,78% Các acid béo không no có chức

năng giảm lipid máu và bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chứa một loạt các

hợp chất dinh dưỡng như các acid amin thiết yếu, vitamin E và K, các vitamin

tan trong nước B1, B2, và B12 và các nguyên tố đa lượng và vi lượng (K, Na,

Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ti, Cr, Ga, V ) (John et al., 2005)

Acid cordycepic

Theo dược điển của Trung Quốc, acid cordycepic hay D-manitol, một

đồng phân của acid quinic với cấu trúc polyol chiếm khoảng 9% trong nấm

Cordyceps, đây là thành phần được sinh ra trong hoạt động sinh tổng hợp và

được sử dụng như một dấu hiệu trong kiểm soát chất lượng nuôi cấy nấm C

sinesis Mannitol là sản phẩm sinh học chính với hoạt tính sinh học quan

trọng, tồn tại trong tự nhiên ở rễ cây, mầm và lá của thực vật, trong khi đó

cũng có nhiều mannitol được phát hiện ở các loài nấm ăn được, cà rốt và địa

y Thông thường, hàm lượng acid cordycepic trong Cordyceps spp là 7-29%,

thành phần này khác nhau trong từng giai đoạn phát triển của quả thể Về mặt

hóa học, mannitol là một rượu và một đường hoặc là một polyol; nó tương tự

như xylitol và sorbitol Tuy nhiên, mannitol có xu hướng mất một ion hydro

trong dung dịch, điều này gây đến dung dịch có tính acid Công thức hóa học

của mannitol là C6H14O6, trọng lượng phân tử là 182, có điểm nóng chảy là

166oC, điểm sôi là 290-295oC Mannitol được sử dụng rộng rãi trong y dược

và công nghiệp thực phẩm

Thông thường, hàm lượng mannitol có trong quả thể Cordyceps sp là

29-85 mg/, lượng mannitol chứa trong hệ sợi nấm của Cordyceps thì cao hơn

trong quả thể (Xuanwei et al., 2009) Trong nuôi cấy invivo, hàm lượng acid

cordycepic tạo ra bởi C sinensis là khá cao và hầu như giống với các mẫu

trong tự nhiên Hơn nữa, khi nuôi C sinensis cho hàm lượng D-mannitol cao

hơn trong quả thể của C militaris

Các thành phần hóa học tự nhiên của Cordyceps bao gồm cả acid

cordycepic, đã được Dong và cộng sự mô tả, cho thấy hoạt động chống oxy

hóa và hàm lượng cordycepic acid trong quả thể của C militaris phụ thuộc

vào nồng độ khoáng chất selenite natri trong môi trường (Zong et al., 2009)

Và họ cũng công bố rằng, C sinensis chứa nhiều thành phần có hoạt tính sinh

học hơn như 3’ –deoxyadenosine, acid cordycepic và polysaccharide (Jian et

al., 2009) Acid cordycepic được tách ra từ C sinensis từ những năm 1957, đã

được chúng minh có tác dụng lợi tiểu và phòng ngừa biến chứng sau phẫu

thuật cắt tận, làm giảm ho và hen suyễn Đặc biệt acid cordycepic có thể cung

cấp sự bảo vệ hiệu quả trong điều trị các bệnh nhân sau nhồi máu não và chấn

thương, chẳng hạn như cải thiện vi tuần hoàn não và lưu lượng máu não, thúc

đẩy phục hồi thần kinh và bảo tồn các khu vực thiếu máu cục bộ, giảm điều

tiết áp lực nội sọ và giảm sự hình thành hàm lượng nước trong não và các mô

não (John et al., 2008)

1.3 Giá trị dược liệu của các hoạt chất sinh học tới sức khỏe con người

Nấm Đông trùng hạ thảo hay Cordyceps sp có các chất dược liệu quý

chủ yếu là cordycepin và adenosine, ngoài ra còn có nhiều chất khác cũng có

tác dụng tốt cho con người như: protein, amin acid, vitamin, lipit,

polysaccharide,và các khoáng chất,… Quan trọng hơn là trong sinh khối

Đông trùng hạ thảo có nhiều chấtcó hoạt tính sinh học quý mà các nhà khoa

học đã phát hiện ra nhờ các tiến bộ của ngành hóa học các hợp chất tự nhiên

Trong đó phải kể đến chất cordiceptic acid, cordycepin, adenosine,

hydroxyethyl-adenosine Đáng chú ý hơn cả là nhóm hoạt chất HEAA

(Hydroxy- Ethyl-Adenosine- Analogs) Ngoài ra còn có chứa nhiều loại

Vitamin (trong 100g nấm Cordyceps có 0,12g vitamin B12; 29,19 mg vitamin

A; 116,03mg vitamin C; ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E,

vitamin K… (Shrestha et al., 2010; Zhoua et al., 2009)

Khả năng kháng tế bào ung thư

Các tác động được cho là của nấm Cordyceps là chống ung thư, chống

di căn, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa, chống viêm, diệt khuẩn, hạ đường

huyết, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh và bảo vệ thận Cụ thể,

polysaccharides đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống ung thư,

chống di căn khối u, điều hòa miễn dịch, hypoglycaemic, steroidogenic và

hypolipidaenic Cordycepin đảm nhiệm chống ung thư, trừ sâu, chống nhiễm

khuẩn Ergosterol ức chế ung thư, và điều hòa miễn dịch (Shashidhara et al.,

2013)

Theo như nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh nấm Cordyceps

spp có tác dụng chống tế bào ung thư, điều hòa miễn dịch, chống oxy hóa,

chống viêm, diệt khuẩn, chống lão hóa, bảo vệ thần kinh, thận… Những tác

dụng tuyệt vời của Cordyceps sp do những dược chất trong thành phần nấm

mang lại như polysaccharide đảm nhiệm chống viêm, chống oxy hóa, chống

ung thư hypoglycaemic, steroidogenic và hypolipidaemic Cordycepin có khả

năng chống ung thư, tăng cường hệ thống miễn dịch, chống nhiễm khuẩn

Ngoài ra, ergosterol sinh tổng hợp bởi Cordyceps spp ức chế sự phát triển tế

bào ung thư và điều hòa miễn dịch (Shashihara et al., 2013)

Hiệu quả chống ung thư khả năng ức chế sự phát triển của các khối u

được phát hiện ở nhiều chi của loài Cordyceps Tác dụng chống ung thư được

đề cập đến trong nhiều công trình nghiên cứu của các tác giả ở nhiều quốc gia

trên thế giới Dịch chiết từ thể quả Cordyceps militaris có tác dụng chống ung

thư, hiệu quả đối với hai loại tế bào màng trong tĩnh mạch rốn là HT1080 và

B16-F10 do có khả năng chống lại sự tạo thành các mạch máu mới bằng cách

giảm sự biểu hiện của bFGF, một trong những nhân tố kích thích quá trình

này Do có vai trò kìm hãm quá trình tạo thành các mạch máu mà có thể

ngăn chặn được quá trình di căn và sự phát triển của tế bào ung thư (Yoo et

al., 2004) Dịch chiết nấm ĐTHT có tác dụng kìm hãm sự phát triển của tế

bào ung thư vú, ung thư phổi (Ahn et al., 2001) Dịch chiết bằng nước ấm từ

nấm C militaris có tác dụng kìm hãm sự phát triển của dòng tế bào ung thư

máu ở người bằng cách gây ra hiện tượng tự chết của các tế bào thông qua sự

hoạt hóa enzyme caspase-3 (Lee et al., 2006) Thí nghiệm của Kim et al

(2006) cũng cho kết quả tương tự với khả năng điều trị ung thư máu của dịch

chiết từ nấm C militaris Các nhà khoa học cũng đã sử dụng dịch chiết từ loài

nấm này để thử nghiệm trên các dòng tế bào bình thường và các dòng tế bào

ung thư Kết quả cho thấy hai dòng tế bào K562 (tế bào ung thư

máu-leukemia) và Du145 (tế bào ung thư tuyến tiền liệt-prostate carcinoma) bị ức

chế mạnh với dịch chiết bằng dung môi butanol

Các thành phần hoạt tính sinh học có tác động chống ung thư chủ yếu

là polysaccharide, sterols và adenosine Trong đó, sterols và adenosine được

nghiên cứu nhiều nhất về khả năng chống ung thư Cho tới nay, các nhà khoa

học vẫn chưa thể biết chính xác cơ chế ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

của Cordyceps spp., cơ chế này có thể là: (i) tăng cường chức năng của hệ

thống miễn dịch và miễn dịch tự nhiên; (ii) ức chế có chọn lọc tổng hợp RNA,

từ đó ảnh hưởng tới tổng hợp protein; (iii) hoạt động chống oxy hóa và chống

các gốc tự do; (iv) chống đột biến; (v) làm nhiễu quá trình sao chép của virus

cảm ứng khối u; (vi) cảm ứng methyl hóa acid nucleic (Xuanwei et al., 2009)

Khả năng tăng cường miễn dịch, điều hòa cơ thể, chống lão hóa, oxy hóa

Tác động chính của dịch chiết Cordyceps lên hệ thống miễn dịch vào

các tế bào như đáp ứng tăng sinh lympho, tế bào giết tự nhiên; kích thích tạo

interleukin-2 (IL-2) và tác nhân gây hoại tử tế bào ung thư (TNF- α) trên các

tế bào người Các tác động dược liệu của nấm như ngăn chặn bệnh tự miễn, dị

ứng cũng có liên quan đến tác động điều hòa miễn dịch (Xuanwei et al.,

2009) Các thử nghiệm trên động vật cho thấy, Cordyceps có tác dụng bảo vệ

gan của bệnh nhân, chống nhiễm virus A, viêm gan B mãn tính, viêm gan C,

xơ gan Các hoạt chất của nấm hỗ trợ tăng các tế bào có chức năng điều hòa,

đưa trạng thái HBeAg-dương tính về HBeAg-âm tính, tăng cường chức năng

gan và ức chế xơ gan (Xuanwei et al., 2009) Ngoài ra, C sinensis có nhiều

ảnh hưởng đến hệ thống tim mạch, chẳng hạn như tần số âm tính, cơ tim giảm

tiêu thụ ôxy, cải thiện cơ tim thiếu máu cục bộ, chống đông tụ tiểu cầu, loạn

nhịp Dịch chiết và tế bào nấm C sinensis cũng cho thấy tác động lên hệ thần

kinh như giảm đau, chống co giật và thanh nhiệt Trên hệ thống hô hấp, dịch

chiết từ C sinensis có tác dụng làm giãn cuống phổi nhờ quá trình tăng cường

tiết adrenaline từ tuyến thượng thận và co khí quản nhờ histamine Đồng thời,

tác dụng tới hormone, corticosterone trong hệ nội tiết của người (Klaunig,

2004)

Chống lão hoá, chống các chứng viêm tấy được thể hiện trong công

trình nghiên cứu của Won & Park (2005) Ahn et al (2000) nhận định nấm

ĐTHT có tác dụng chống viêm nhiễm kìm hãm sự phát triển của một số virut,

vi khuẩn và nấm Ngoài ra, nấm ĐTHT C militaris còn có tác dụng kìm hãm

sự oxy hoá lipit, lipoprotein và lipoprotein tỷ trọng thấp (Klaunig, 2004)

Trong những năm gần đây, Cordyceps trở thành nguồn nguyên liệu rất

quan trọng cho làm thuốc và thực phẩm chức năng Giá cả của chúng tăng lên

rất nhanh, có rất nhiều người đã canh tác chúng Hiện tại, sự phát triển của

Cordyceps và các chế phẩm của chúng chủ yếu tập trung vào ba hướng

Thuốc ăn kiêng Thực phẩm chức năng Phát triển tính thuốc Hầu hết các

hoạt chất sinh học chiết xuất từ Cordyceps như cordycepin, cordycepic acid,

và polysaccharide đều là các chất chống lão hóa và tác động tới điều hòa giấc

ngủ cũng đã được cấp phép như một nguồn thuốc mới bởi SFDA của Trung

Quốc Vì vậy, sử dụng Cordyceps và cả dịch chiết, chúng ta có thể phát triển

rất nhiều sản phẩm nhờ công nghệ hiện đại, các sản phẩm này có rất nhiều

chức năng chủ yếu tập trung vào các phương diện: tăng cường thể chất, chống

lão hóa, bảo vệ tim mạch, cải thiện giấc ngủ, tăng ngon miện, tăng cường

miễn dịch (Zhenghua Gonga et al., 2009)

1.4 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trong và ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo trên thế giới

Trên thế giới, nấm Đông trùng hạ thảo đã được các nhà khoa học

nghiên cứu và thu được rất nhiều thành tựu có giá trị cao Từ năm 1998, ở

Trung Quốc đã có những nghiên cứu đi sâu vào các hoạt chất sinh học có

trong Cordyceps trong đó chủ yếu tập trung vào các hợp chất polysaccharide,

adenosine, cordycepin, cordycepic acid Các nước khác như Nhật Bản, Hàn

Quốc, Đài Loan… cũng nghiên cứu, ứng dụng và sản xuất các sản phẩm từ

các chủng nấm thuộc chi Cordyceps và thu lại hiệu quả kinh tế cao Nhiều

công trình nghiên cứu đã khẳng định sinh khối nấm Cordyceps spp có chứa

nhiều hợp chất có giá trị như: 14-19 acid amin khác nhau, 11 loại

bioxanthracen, beauvericin, chất béo, cordycedipeptide, cordyceamide,

adenosine, cordycepin, exopolysaccharide… Một trong những chất có hoạt

tính sinh học cao đang được quan tâm là expolysaccharide, được chứng minh

có khả năng tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol, chống hạ

đường huyết, chống ôxi hóa và kháng tế bào ung thư (Xiao et al., 2004; Yang

et al., 2013)

Với công nghệ sinh học tiên tiến, nhiều nước đã thành công trong việc

nuôi cấy Cordyceps trong phòng thí nghiệm và phát triển nền công nghiệp sản

xuất các sản phẩm từ nấm Cordyceps.Ví dụ, Công ty Biofact life (Malaysia)

đã kết hợp công nghệ tiên tiến của Nhật và các nước khác nuôi cấy thành

công nấm Cordyceps trên môi trường nhân tạo để tạo ra hai hoạt chất chính là

cordycepin và adenosine được tạo ra từ hệ sợi nấm với giá trị cao Các nước

như Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, Nhật Bản, Malaysia đã sản xuất được nấm

Đông trùng hạ thảo trên quy mô công nghiệp từ những năm 1995, thế kỷXX

và bán trên thị trường với giá khá cao, ước tính lợi nhuận lên tới hàng tỷ đô la

(nguồn trên internet)

1.4.2 Tình hình nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo ở Việt Nam

Hiện nay, các nghiên cứu trong nước đã có các công trình công bố về

phát hiện loài nấm dược liệu ký sinh côn trùng, nuôi cấy nấm ký sinh côn

trùng làm thuốc chữa bệnh hoặc thực phẩm chức năng Nhìn chung, các

nghiên cứu dừng lại ở mức độ phát hiện, đánh giá, thăm d hoặc sản xuất

thành công nấm ký sinh côn trùng ở quy mô nhỏ lẻ

Năm 2009, Viện Khoa Học Lâm nghiệp Việt Nam và trường Đại học

Lâm Nghiệp đã tiến hành điều tra thu mẫu nấm Đông trùng hạ thảo

(Cordyceps nutans) tại khu bảo tồn Tây Yên Tử- Sơn Động- Bắc Giang Tác

giả Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện được loài nấm Đông trùng hạ

thảo và được giám định là loài Cordycep nutans Đây là loài nấm đầu tiên

được mô tả và ghi nhận có phân bố tại Việt Nam Tại vườn Quốc gia Tam

Đảo, Vĩnh Phúc, Phạm Quang Thu đã phát hiện nấm Đông trùng hạ thảo

Cordyceps gunnii(2009)

Năm 2009, Phạm Quang Thu đã thông báo phát hiện loài nấm

C.nutans, C militaristại khu bảo tồn Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang và

vườn Quốc gia Hoàng Liên, Lào Cai (Phạm Quang Thu, 2009; Phạm Quang

Thu, Lê Thị Xuân, 2009) Lê Tuấn Hưng và cs đã thu thập 259 mẫu nhằm

đánh giá đa dạng nấm ký sinh côn trùng tại vườn Quốc gia Cát Tiên Kết quả

thu nhận 41 loài được ghi nhận thuộc 17 chi bao gồm Akanthomyces,

Aschersonia, Beauveria, Conoideocrella, Cordyceps, Gibellula, Hirsutella,

Hymenostilbe, Hypocrella, Isaria, Metarhizium, Moelleriella, Nomuraea,

OphioCordyceps, Paecilomyces, Torrubiella và Verticillium Có đến 85% số

mẫu được thu trên lá cây trong khi chỉ có 15% mẫu thu được dưới mặt đất

Đái Duy Ban vàcs nghiên cứu phân lập và nuôi cấy nấm Isaria

cerambycidae trên giá thể ấu trùng xén tóc Ngoài ra, đã xác định các thành

phần dược chất tổng hợp bởi nấm (Đái Duy Ban et al., 2009) Nguyễn Mậu

Tuấn tại Trung tâm nghiên cứu thực nghiệm Lâm Đồng đã nghiên cứu sản

xuất sinh khối nấm Paecilomyces tenuipes trên giá thể nhộng tằm (Bombyx

mori) Các nghiên cứu được kế thừa và phát triển sau khi TS Nguyễn Mậu

Tuấn thực hiện luận văn tiến sỹ về đặc điểm di truyền và khả năng nuôi cấy

của chủng nấm nói trên tại Đại học quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc (Nguyễn

Mậu Tuấn et al., 2009) Hiện tại, nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc

nhân sinh khối nấm ở quy mô Phòng thí nghiệm và đang phát triển ở quy mô

lớn hơn tại Lâm Đồng Trịnh Tam Kiệt và cs đã công bố phát hiện nấm

ĐTHT thuộc 03 loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm C militaris, C sinensis,

C sabrolifera (Trịnh Tam Kiệt et al., 2001) Tổng hợp các nghiên cứu cho

thấy, tiềm năng khai thác nấm ĐTHT ở Việt Nam dựa trên nuôi cấy nấm ký

sinh côn trùng Tuy nhiên, việc nghiên cứu mới chỉ bắt đầu cho nên còn gặp

nhiều khó khăn về kiến thức, cơ sở vật chất cho nên chưa có nhiều công trình

công bố nghiên cứu thành công lên men chìm các chủng Cordyceps sp

Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên

cứu nấm Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu

rừng nhiệt đới thường xanh, có độ cao từ 800m đến 2000m

Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung

Quốc cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps

militaris của PGS.TS Phạm Thị Thùy, Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài

phát triển nấm Đông trùng hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho

người Kết quả đã nghiên cứu xác định được 3 loài nấm Đông trùng hạ thảo

đó là: Cordyceps nutans ở Cúc Phương, Ninh Bình và Tam Đảo, Vĩnh Phúc;

Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh; Cordyceps spp ở Sơn Động, Bắc

Giang Tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của nấm Đông

trùng hạ thảo Cordyceps militaris gồm chất Cordycepin, HEAA, một số

vitamin và một số nguyên tố vi lượng

Hiện tại, Việt Nam chưa có nhiều công trình công bố nghiên cứu cũng

như ứng dụng lên thiết bị hiện đại nhằm sản xuất sinh khối nấm Cordyceps

hiệu quả trên quy mô lớn Các quy trình lên men chủ yếu sử dụng giá thể

trong bình kín được khử trùng dẫn tới một số thời điểm chất lượng không

đồng đều, phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh, chiếm nhiều diện tích, thời

gian nuôi cấy dao động từ 45-60 ngày Tuy nhiên, hướng nghiên cứu lên men

nấm Cordyceps trong bình lên men với thời gian thu hồi ngắn từ 5-8 ngày, dễ

dàng thu hồi và tinh sạch sản phẩm đích bằng cách thiết lập các thông số

trong quá trình lên men vẫn chưa được triển khai nhiều Đây cũng là hướng

nghiên cứu mới mở ra hướng ứng dụng tạo sản phẩm có giá trị cao, phục vụ

sức khỏe cộng đồng ở Việt Nam và nhằm làm giảm giá thành của sản phẩm

Như vậy nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris ở

Việt Nam là hoàn toàn cần thiết, đáp ứng nhu cầu đ i hỏi đó là bảo vệ sức

khỏe con người ở Việt Nam