Tách dòng và biểu hiện gen mã hoá endoglucanase từ hệ vi sinh vật ruột mối coptotermes gestroi trong tế bào escherichiacolibl21(DE3)

Vì vậy, trong những năm qua trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu khai thác tìm ra enzyme cellulase có hoạt tính mạnh, tốc độ chuyển hóa nhanh cellulose thành đường đơn dùng c

Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENDOGLUCANASE TỪ HỆ VI SINH VẬT RUỘT

MỐICOPTOTERMES GESTROI TRONG TẾ BÀO

Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thành Duy

Hà Nội - 2016

L ỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS Trương Nam Hảivà TS Đỗ Thị Huyền Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâmKhoa học và Công nghệ Việt Nam đã thu nhận và hướng dẫn, quan tâm nhiệt tình tạo mọi điều kiện cho em nghiên cứu cũng như trang thiết bị máy móc để em có thể hoàn thành luận văn này

Luận văn được thực hiện tại phòng Kỹ Thuật Di truyền, phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự giúp đỡ của NCS ThS Nguyễn Thị Thảo cùng các Anh (Chị) trong phòng Kỹ thuật di truyền

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô bộ môn trong khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội đã giảng dạy và chỉ bảo cho em những kiến thức chuyên môn và kỹ năng cần thiết

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn

bè đã tạo điều kiện và luôn ủng hộ em trong suốt thời gian học tập

Hà nội, ngày tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thành Duy

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE 3

1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase 3

1.1.2.Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-beta-1,4-glucanase 4

1.1.3.Ứng dụng của endoglucanase 7

1.2 BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E COLI 9

1.2.1 Hệ biểu hiện E coli 9

1.2.2 Chủng biểu hiện E.coli BL21 10

1.3.3 Vector biểu hiện pET22b(+) 10

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

2 1 NGUYÊN LIỆU 13

2.1.1 Chủng vi sinh vật và plasmid 13

2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị 13

2.1.3 Dung dịch và môi trường nuôi cấy 14

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 16

2.2.2 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel Extration kit 18

2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose 18

2.2.4 Biến nạp gen vào tế bào E coli DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt 19

2.2.5 Tách chiết ADN plasmid từ tế bào E coli 21

2.2.6 Xử lý ADN bằng enzyme hạn chế 22

2.2.7 Phản ứng ghép nối gen 22

2.2.9 Điện di protein trên gel polyacrylamide-SDS 23

2.2.10 Điện di protein trên gel polyacrylamide không SDS dùng xác định hoạt tính

bằng zymography 24

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET22-egc 26

3.1.1 Khuếch đại gen egc 27

3.1.2 Cắt sản phẩm PCR gen egc và pET22b(+) bằng NcoI+XhoI 28

3.1.3 Nối ghép gen egc vào vector biêu hiện pET22b+ 29

3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-egc tế bào E coli DH10b 29

3.1.5 Kiểm tra sự có mặt của gen egc trong vector tái tổ hợp pET22-egc 30

3.2 Biểu hiện gen egc trong chủng E coli BL21 (DE3 ) 32

3.3.1 Nhiệt độ……… 34

3.3.2 Nồng độ chất cảm ứng IPTG……….37

3.4 KIỂM TRA HOẠT TÍNH CỦA ENDOGLUCANASE 41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

Tài liệu tham khảo 43

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên tiếng việt

CMC Cacboxymethylcellulose Cơ chất cacboxymethyl cellulose

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Axit ethylene diamine tetraacetic

E coli Escherichia coli Escherichia coli

Egc Endoglucanase gene Gen mã hóa endoglucanase trong

ruột mốiCoptotermes gestroi

IPTG Isopropy beta - D-1

thiogalactopyranoside

Chất cảm ứng Isopropy beta -

D-1 thiogalactopyranoside

LBA Luria-bertani ampicilin Môi trường LB có bổ sung

ampicillin

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi

rRNA Ribosome ribonucleic acid Axit ribonucleic mã hóa

ribosome

SDS Sodium dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE SDS - Polyacrylamide Gel

Electrophoresis

Điện di trên gel polyacrylamide

TAE Tris – acetat – EDTA Tris – acetat – EDTA

TEDMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1 Cấu trúc không gian của Cel5 (Endoglucanase Z)

Hình 1 2 Cấu trúc và mô hình xúc tác của cellulase nói chung và endoglucanase nói riêng 22. 6

Hình 1 3 Vector pET22b(+) 28 12

Hình 3 1 Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen egc 26

Hình 3 2 Điện di đồ sản phẩm PCR gen egc trên gel agarose 0,8% 27

Hình 3 3 Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sản phẩm PCR và vector pET22b(+) cắt bằng NcoI+XhoI trước khi lai thành vector pET22-egc 28

Hình 3 4 Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET22-egc 30

Hình 3 5 Điện di đồ sản phẩm cắt 4 dòng pET22-egc tái tổ hợp bằng cặp enzyme hạn chế NcoI và XhoI trên gel agarose 0,8% 31

Hình 3 6 Điện di đồ protein tổng số của các thể biến nạp E coli BL21(DE3) mang gen egc trên gel polyacrylamide 12,6% 33

Hình 3 7 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra protein pha tan (T), pha không tan (KT) và protein tổng số (TS) được biểu hiện trong chủng E coli BL1(DE3) mang gen egc 34

Hình 3 8 Điện di đồ SDS-PGE kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) và protein tổng số (TS) được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong chủng E coli BL21(DE3) khi tế bào được phá bằng hạt thủy tinh 36

Hình 3 9 Điện di đồ kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) và protein tổng số (TS) được biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau trong chủng E coli BL21(DE3) khi phá tế bào bằng siêu âm 37

Hình 3 10 Đồ thị thể hiện giá trị OD 600 tại thời điểm thu mẫu của tế bào được cảm ứng ở các nồng độ IPTG khác nhau………38

Hình 3 11 Điện di đồ protein tổng số biểu hiện trong tế bào E coli BL21(DE3) mang gen egc ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 39

Hình 3 12 Điện di đồ kiểm tra protein pha tan biểu hiện trong tế bào E coli BL21(DE3) ở các nồng độ IPTG khác nhau trên gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 40

Hình 3 13 Điện di đồ kiểm tra hoạt tính protein tan (T), pha không tan (KT) và protein tổng số (TS) trên gel polyacrylamide 9 % không biến tính kết hợp đệm biến tính các mẫu nhuộm coomassie 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần điện di protein 16

Bảng 2 Thành phần PCR 17

Bảng 3 Thành phần cắt DNA plasmid bằng enzyme hạn chế 22

Bảng 4 Thành phần phản ứng nối ghép gen 23

MỞ ĐẦU

Endoglucanase là một trong ba loại enzyme quan trọng phân hủy cellulose Chúng phân cắt các liên kết β-1,4-glycoside ở bên trong chuỗi polysaccharide dài của các vùng cellulose tinh thể và vô định hình để tạo thành các đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có các đầu tự do mới Các đoạn oligosaccharide ngắn này là cơ chất cho các cellulase khác như exoglucanase, beta glucosidase phân cắt tạo đường glucose dùng cho lên men sản xuất các sản phẩm có giá trị, điển hình là cồn sinh học

Việt Nam là nước nông nghiệp mỗi năm lượng phế thải lignocellulose như rơm rạ, bã mía được tạo ra với hàm lượng rất lớn (khoảng 40-50 tấn/năm) Ước tính cứ một tấn lúa sẽ có 1 – 1,2 tấn rơm rạ1 Lượng phế thải này thường được đốt hoặc bỏ đi gây ô nhiễm không khí và ảnh hưởng nghiêm trọng đến tầng ozon gây hiệu ứng nhà kính Thay vì đốt hay bỏ đi thì đây là nguồn nguyên liệu phong phú cho quá trình lên men sinh khối cellulose tạo thành ethanol Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol từ sinh khối này còn gặp nhiều khó khăn do giá thành các enzyme chuyển hóa lignocellulose còn cao nên cồn sinh học chưa cạnh tranh được trên thị trường Đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng nhiên liệu sinh học hiện nay chưa được phổ biến

Một trong những chiến lược quan trọng để giảm giá thành nhiên liệu sinh học để đưa vào thực tiễn đó là làm giảm giá thành enzyme thủy phân lignocellulose Vì vậy, trong những năm qua trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu khai thác tìm ra enzyme cellulase có hoạt tính mạnh, tốc độ chuyển hóa nhanh cellulose thành đường đơn dùng cho lên men tạo ethanol

và các sản phẩm có giá trị Các hướng nghiên cứu đó bao gồm tìm kiếm các enzyme mới, gây đột biến định hướng làm tăng hoạt tính của enzyme

Ngày nay, dựa trên thành tựu về giải trình tự gen nên DNA đa hệ gen

của quần thể vi sinh vật của môi trường sinh thái được giải trình tự dễ dàng để khai thác gen từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy được mà vi sinh vật này chiếm hàm lượng rất lớn (99-99,9%) tùy theo môi trường sinh thái Từ năm 2013, Phòng Kỹ thuật di truyền đã giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong ruột mối và khai thác được 316 gen mã hóa enzyme cellulase, trong đó có 31 ORF mã hóa endo glucanase Bằng các phần mềm tin sinh ước đoán tính chất

enzyme, trình tự gen egc mã số GL0130684 mã hóa endo glucanase đã được

phân lập

Trong công trình nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành: “Tách dòng và

bi ểu hiện gen mã hóa endoglucanase từ hệ vi sinh vật ruột mối

Coptotermes gestroi trong t ế bào Escherichia coli”nhằm tiến tới tinh chế và

nghiên cứu tính chất của enzyme

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng phân cắt mối liên kết beta-1,4-O-glucoside trong phân tử của cellulose, oligosaccharide, disacharide

và một số cơ chất tương tự khác Cellulase được chia làm ba dạng: (1) beta-1,4-glucanase (được gọi tắt là endoglucanase) thủy phân liên kết ở bên trong phân tử; (2) exo-beta-1,4-glucanase thủy phân các liên kết đầu khử và đầu không khử của phân tử cellulose; (3) beta-1,4-glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose thành glucose Enzyme này được tổng hợp chủ yếu từ các vi sinh vật như nấm2, vi khuẩn sống trên môi trường có cellulose

endo-Endoglucanasecó tên gọi kháclà1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase hoặc carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4) là enzyme thủy phân có khả năng phân cắt mối liên kết beta-1,4-O-glucoside bên trong chuỗi polysaccharide dài của các vùng cellulose tinh thể và vô định hình dẫn đến tạo thành các đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có đầu tự do mới hay nói cách khác tạo ra các đoạn cellulose dextrin, một ít cellobiose (cắt 2 đơn vị)

1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase

Endo-beta-1,4-glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp endo-beta-1,4-glucanase Ngoài ra, chúng còn

khuẩn trong ruột mối Coptotermes9

Nấm mốc cũng là một trong những đối tương nghiên cứu sự sinh tổng

hợp endo-beta-1,4-glucanase Nhiều loài thuộc chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerrochaete cũng khả năng tổng hợp nhiều endo-beta-1,4- glucanase như: Aspergillus niger10, A flavus11, A fumigates12, Trichoderma reesei13, Penicillium persicium, P.brasiliamum14, Penicillium sp15, Phanerochaete chrysosporium16

Nhiều xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces và Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-beta-1,4-glucanase như: Actinomyces griseus17, Streptomyces reticuli18.

Trong số các nguồn enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn cung cấp enzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất vượt trội so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật như: chu kỳ sinh trưởng ngắn(từ

16 đến 18 giờ), khối lượng nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên được ứng dụng quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme19

1.1.2.Cấu trúc và cơ chế xúc tác của endo-beta-1,4-glucanase

Erwinia chrysanthem có nhiều trung tâm xúc tác (CD), một vùng liên kết và

một vùng liên kết với cellulose (CBD) Cấu trúc không gian 3 chiều của CBDCel5 được phát hiện bằng phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân với ba

axit amin (Trp18, Trp43 và Tyr44) có vai trò xúc tác phản ứng Asp17 có vai trò quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của Cel5 Loại bỏ axit amin Asp17 đến Pro23 để làm cho cấu trúc cellulose sẽ nới lỏng20

Hình 1 1Cấu trúc không gian của Cel5 (Endoglucanase Z)

a Cấu trúc không gian ba chiều của CBD Cel5 phần đột biến được in đậm

b Cấu trúc không gian ba chiều của CBD Cel5 khi loại bỏ phần đột biến

1.1.2.2 Cơ chế xúc tác của endoglucanase

Mỗi loại enzyme trong nhóm cellulase tham gia thủy phân từ cơ chất theo một cơ chế riêng Tuy nhiên, những enzyme này thường phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm đơn giản nhất là glucose

Hình 1 2Cấu trúc và mô hình xúc tác của cellulase nói chung và

Enzyme cellulase nói chung và endoglucanase nói riêng có cấu trúc gồm 3 vùng chính: vùng liên kết là vùng bám với cellulose còn được gọi là vùng CBM (Cellulose binding module), vùng xúc tác hay còn gọi là vùng CD (Catalytic domain) và đoạn peptide nối (linker peptide)- đoạn nối giữa CBM và CD

Để phân cắt hết cellulose thì cấu trúc cellulase thường có 3 vùng: vùng xúc tác (CD), một hoặc nhiều vùng liên kết với cellulose (CBD) và đoạn nối peptide giữa CD và CBD

CD có chức năng phân cắt liên kết beta-1,4-glucoside Trong mỗi enzyme, CD chiếm hơn 70% trình tự axitamin Vị trí hoạt động của CD có hai cách sắp xếp khác nhau: (1) tạo thành dạng khe hầm (đối với cellulase phân hủy bên ngoài), (2) dạng khe rãnh (đối với cellulase phân hủy bên trong)

Đoạn peptide nối có khoảng 6 đến 59 axitamin và hoạt động như một bản lề linh hoạt cho phép mỗi vùng thực hiện chức năng độc lập nhau Trình

tự của đoạn nối rất khác nhau ở các enzyme khác nhau, tuy nhiên trong thành phần của chúng giàu proline, threonine và serine Nếu đoạn nối không có hoặc ngắn thì cả hai vùng CBM và CD sẽ cản trở lẫn nhau

CBD có kích thước khoảng 30 đến 300 axit amin, mỗi protein chứa 1 hay 2 hay 3 CBM độc lập với nhau CBM có chức năng mang enzyme lại gần

Vùng xúc tác Đoạn nối

hơn và tương tác lâu hơn với cơ chất, qua đó làm tăng tốc độ phản ứng Để phân hủy cellulose, CBM liên kết với sợi cellulose, nhận dạng đầu khử của chuỗi rồi đưa chuỗi vào khe xúc tác của CD và thủy phân cellulose Sản phẩm thủy phân sẽ được giải phóng ra khỏi khe xúc tác và cellulase sẻ thủy phân sợi cellulose khác

1.1.3.Ứng dụng của endoglucanase

1.1.3.1Trong công nghiệp sản xuất cồn sinh học

Nhiên liệu sinh học thứ hai ra đời đã tận dụng được nguồn sinh khối cellulose có nguồn gốc từ chất thải nông nghiệp, chất thải rừng, chất thải rắn

đô thị hoặc các loại phế phẩm như rơm, rạ, bã mía, vỏ trấu, cỏ… qua nghiền sấy rồi lên men thành nhiên liệu sinh học

Người ta nghĩ đến việc sử dụng sản phẩm phân hủy của cellulose để làm nhiên liệu đốt cháy, đó là nhờ vi sinh vật sử dụng sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose để chuyển hóa thành enthanol Với nhiều nghiên cứu hiện nay đã ứng dụng thành công bổ sung thêm enthanol vào xăng để làm giảm ô nhiễm môi trường như ở Brazil đã sử dụng E85(nghĩa là 85% là enthanol còn 15% là xăng) còn ở Việt Nam mới bắt đầu sử dụng E5(nghĩa là

% là ethanol còn lại là xăng) vào 2011 và đang trên đà phát triển

1.1.3.2 Trong công nghiệp thực phẩm

Trong quá trình sản xuất nước quả và nước uống không cồn,dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào quả và các chất xơ có bản chất là polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và đục Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm

độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscoenzyme được ứng dụng chủ yếu trong phá vỡ màng tế bào đậu tương21 Trong công nghiệp sản xuất bia, ngoài các thành phần đường, protein, dịch lên men còn có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như

cellulose và beta-glucan làm ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm Người

ta thường sử dụng beta-glucanase để loại bỏ những thành phần này Các chế

phẩm cellulase từ A niger, beta-glucanase từ Bacillus subtilis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng trong sản xuất bia22

Ngoài ra, endoglucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất

bánh mỳ, bánh quy và thực phẩm chức năng Glucanase từ Humicola insolens được ứng dụng trong sản xuất bánh mỳ, glucanase từ Trichoderma reesei, A niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosachcaride Đây là một trong

số các oligosaccharide chức năng(probiotic) được sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn Probiotic có nhiều lợi ích tốt đến sức khỏe như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng gan, làm giảm cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, ức chế sự phát triển của các vi sinh vật trong miệng23

1.1.3.3Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc

Chăn nuôi là một phần quan trọng của ngành nông nghiệp nói chung Thu nhập hàng năm từ chăn nuôi đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành nông nghiệp Chăn nuôi cung cấp các loại thực phẩm như thịt, trứng, sữa hay phân bón cho ngành trồng trọt Để nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn bảo đảm an toàn cho môi trường xung quanh, đặc biệt là sức khỏe cho con người, nhiều nghiên cứu về thức ăn cho gia súc có bổ sung thêm các chế phẩm enzyme để tăng khả năng tiêu hóa, hấp thụ chất dinh dưỡng, năng cao chất lượng vật nuôi Thức ăn gia súc chủ yếu từ các loại ngũ cốc, thóc, bã mía… có chứa nhiều cellulose và glucan, chất này làm hạn chế sự hấp thụ chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật Bổ sung thêm beta-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng nhóm glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn và nhiều nghiên cứu cho thấy khi bổ sung beta-glucanase hoặc kết hợp với các enzyme khác làm tăng tốc độ sing

trưởng và giảm bênh tật cho vật nuôi24

1.1.3.4Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền cơ học và xử lý bằng phương pháp hóa học nhưng tốn kém và gây ô nhiễm môi trường nên thay vì xử lý bằng phương pháp hóa học người ta bổ sung glucanase vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi cấu hình của sợi cellulose25, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học, đồng thời phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin Trong công nghiệp tái chế glucanase được sử dụng để tẩy vết mực trên giấy

1.2.BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E COLI

1.2.1Hệ biểu hiệnE coli

Hiện nay có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện gen như:

E coli, B sutilis, nấm men (S cerevisiae), tế bào động vật và tế bào thực vật

Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì việc chọn

lựa hệ biểu hiện và vector biểu hiện phù hợp là quan trọng và cần thiết.E coli

vẫn là một trong những đối tượng sử dụng rộng rãi hiện nay

E coli là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que và được sử dụng phổ biến trong các protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm sau: có khả năng sinh trưởng, phát triển nhanh trên môi trường nuôi cấy đơn giản của vi khuẩn như

LB (cứ 30 phút vi khuẩn E coli lại sinh sản bằng hình thức phân đôi một lần),

chúng có khả năng thu nhận rất nhiều yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như plasmid, phage…Các yếu tố di truyền này có thể tồn tại và tái bản

nhiều lần trong E coli ở nhiệt độ 37oC E coli đã được nghiên cứu khá lâu

nên đã biết được cấu trúc di truyền và cách thức hoạt động của chúng cũng như các quá trình phiên mã, dịch mã và quá trình sinh protein nội bào

Bên cạnh đó, việc sử dụng vi khuẩn E coli trong biểu hiện cũng có một

số hạn chế sau: các gen mã hóa protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, protein giàu cystein hoặc những sản phẩm protein có liên kết disunfua (S – S) rất khó

biểu hiện trong tế bào E coli,biểu hiện các loại protein không biến đổi cấu trúc phân tử sau dịch mã và một số chủng E coli có thể gây bệnh hoặc tạo

độc tố khi biểu hiện gen26

1.2.2 Chủng biểu hiện E.coli BL21

Trong quá trình biểu hiện, protein ngoại lai mới sinh có thể bị phân giải

bởi các protease củaE coli Để giải quyết vấn đề này, người ta sử dụng biện

pháp đó là tạo chủng biểu hiện mang gen đột biến làm mất khả năng tổng hợp

protease Với chủng biển hiện E coli BL21 chứa đột biếnlonprotease (một protease nội bào),opmTprotease (một protease ngoại bào) bị đột biến nênlàm

giảm khả năng thủy phân protein đáng kể

Ngoài ra, DNA của hệ gen E coli BL21 còn chứa gen mã hóa cho

T7-RNA polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa

vào hệ gen của E coli BL21 dưới sự điều khiển của promoter lac cảm ứng IPTG Chính nhờ những cải biến này mà E coli BL21 đã trờ thành vật chủ

hiện hữu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt la những gen được đưa vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase)

1.3.3Vector biểu hiện pET22b(+)

Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mARN của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai Vector có thể là ADN plasmid, phage hoặc cosmid Đây là những phân tử có khả năng phân đôi , phiên mã, dịch mã độc lập với vật chủ Ngoài ra, vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng làm dấu hiệu chọn lọc Gen thường sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh Gen này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế bào mang ADN plasmid

Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở

hệ điều khiển promotor T7 mạnh có nguồn gốc từ bacteriophage T7, cho phép

biểu hiện gen tách dòng ở các tế bào chủ là vi khuẩn (E coli, bacillus…) khi

- Trình tự khởi đầu sai chép (ori) là vị trí gắn của ADN polymerase,

quyết định số lượng bản sao trong vật chủ

- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (AmpR) để đảm bảo sự suy trì tồn tại của vector trong tế bào vi khuẩn đồng thời giúp chọn lọc các tế bào mang plasmid

- Vùng đa nối (multiple cloning site) có chứa điểm cắt của một số

enzyme hạn chế (Hind III, EcoR I, BamH I… ) để thuận tiện cho việc

đưa gen ngoại lai vào vector

- Promoter T7 kiểm soát phiên mã để nhận biết tín hiệu khởi đầu phiên

mã, từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được nhân dòng sau khi được cảm ứng.Khi trong môi trường không có chất

cảm ứng, gen lacI nằm trên hệ gen vi khuẩn được phiên mã sinh tổng hợp protein LacI LacI là chất ức chế, chúng có ái lực cao với lac operon và bám chặt vào operator làm cho lac promoter điều khiển

phiên mã gen T7 RNA polymerase trong hệ gen chủng chủ và T7 promoter điều khiển phiên mã gen ngoại lai trên plasmid không hoạt động Khi được cảm ứng với IPTG, IPTG bám vào LacI làm thay đổi

hình dạng LacI không còn ái lực với lac operator nữa và rời khỏi phức

hợp với operator trên DNA hệ gen chủng chủ và plasmid Kết quả là T7 ARN polymerase được tổng hợp từ hệ gen chủng chủ gắn với vùng

trình tự -35 và -10 của lacpromoter trên vector để khởi động phiên mã

gen ngoai lai

- Các trình tự kiểm soát dịch mã như điểm bám của ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu ATG

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3)(Invitrogen) kiểu gen: F–

ompT gal dcm lon hsdS B (r B

–

m B

–) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene

1 ind1 sam7 nin5]) được sử dụng trong thí nghiệm để biểu hiện gen

Plasmid :

- Plasmid pJET1.2/blunt của hãng Fementas (Mỹ) mang toàn bộ gen mã

hóa endoglucanase (có vùng mã hóa tín hiệu tiết) có tên là pJET-wegc

do phòng Kỹ thuật di truyền thiết kế được sử dụng làm khuôn để

khuếch đại gen egc (không chứa trình tự mã hóa peptide tín hiệu) cho

biểu hiện gen

- Plasmid pET22b(+) được sử dụng làm vector biểu hiện (Novagen) Mồi dùng cho khuếch đại gen:

Mồi xuôi: 5'-accatggatgcctgtcgctggccagcatgggatc-3'

Mồi ngược: 5'-actcgagctgtgaacttgcgcattcctgg-3'

Mồi xuôi có thêm trình tự của enzyme hạn chế NcoI (CCATGG), mồi ngược có thêm trình tự của enzyme hạn chế XhoI (CTCGAG)

2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc và thiết bị

Hóa ch ất:

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều được đặt mua từ các công ty đạt tiêu chuẩn quốc tế như Bio-rad (Mỹ), Fementas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức) gồm có: SDS, Tris-HCl, EDTA, cao nấm men, bactor pepton, d-NTPs,

phenol, methanol, isoamylalcohol, chloroform, ampicillin, ethidium bromide, bis-acrylamide, TEMED, APS, sodium chloride, potassium acetate, agar, dNTP, agarose, glycerol

2.1.3.Dung dịch và môi trường nuôi cấy

2.1.3.1 Môi trường và dung dịch sử dụng để biến nạp và biểu hiện

Dung d ịch: CaCl20,1 M vô trùng, giữ ở 4oC

2.1.3.2 Dung dịch được sử dụng để tách chiết ADN plasmid từ tế bào E coli

- Dung dịch I (Sol I): 50 mM glucose; 25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 10 mM EDTA, pH 8,0

- Dung dịch II (Sol II): 0,2 N sodium hydroxide; 1% SDS

- Dung dịch III (Sol III): 3 M potassium acetate; 11,5% acetic acid

- Dung dịch I và III được giữ ở 4oC; dung dịch II được chuẩn bị trước khi sử dụng

- TE: 1 M Tris-HCl, pH 8,0; 0,5 M EDTA, pH 8

- Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcohol: 50 phenol: 49 chloroform: 1 isoamylalcohol

- Gel agarose 0,8%: 0,8 g bột agarose pha trong 100 ml TAE 1 lần

2.1.3.3 Dung dịch được sử dụng trong điện di ADN trên gel agarose

- Dung dịch đệm TAE 50 lần (100 ml): 24,2 g Tris-base; 5,71 ml glacial acetic acid; 10 ml EDTA 0,5 M, pH 8,0

- Đệm tra mẫu (6 lần) (loading dye): 0,25% bromophenol blue; 0,25% xylen cyanol FF; 30% glycerol

- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml

2.1.3.4 Dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE

- Bis-acrylamide 30%: 30 g acrylamide và 0,8 g bis- acrylamide hòa tan trong 100 ml nước cất vô trùng, bảo quản ở 4oC

- Đệm Tris 1,5 M pH 8,8: Tris 0,75 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh đến pH 8,8

- Đệm Tris 0,5 M pH 6,8: Tris 0,25 M; 0,2% SDS và dùng HCl để chỉnh đến pH 6,8

- SDS 10% (100 ml): 10 g SDS và bổ sung nước cất cho đến thể tích

100 ml

- Đệm chạy điện di: 0,05 M Tris; 0,192 M glycine; 0,1% SDS

- APS 10%: 10 mg ammonium persulfate bổ sung nước cất cho đến 100

ml

- TEMED: Sử dụng dung dịch đậm đặc mua từ công ty hóa chất

- Đệm xử lý mẫu 6X: 7 ml Tris-HCl 1 M, pH, 6,8; 3 ml glycerol 100%;

1 g SDS; 0,6 ml 2-mercapto-ethanol; 1,2 mg bromophenol

- Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining) (100 ml): 0,025 g Coomassie brilliant blue; 40 ml ethanol; 10ml axit axetic và bổ sung nước đến 100 ml

- Dung dịch tẩy gel (Destaining): 30% methanol và 10% axit axetic

- Sau khi đã chuẩn bị gel điện di protein, bắt đầu tiến hành đổ lần lượt gel tách trước, khi đổ tránh sao không để tạo bọt khí, sau đó bổ sung nước lên trên bề mặt gel để tránh hiện tượng gel bị oxi hóa và giúp cho

bề mặt gel được phẳng Sau khoảng 30 phút gel đông, đổ hết nước trên

bề mặt gel và gài lược để tiếp tục đổ gel cô

Bảng 1 Thành phần điện di protein

Thành phần Gel tách

biến tính 12,5%

Gel cô biến tính 5% không biến Gel tách

tính 9%

Gel cô không biến tính 5%

dd H2O

Tris-HCl pH

6,8

0,55 ml-

0,45 ml0,2 ml

1,125 ml-

0,454 ml0,2 ml

Tris-HCl pH

6,8

Glycerol 50%

1,125 ml0m9 ml

-

-1,125 ml0,9 ml

-

Tổng

3 µl4.543 ml

1 µl0,803 ml

3 µl5,245 ml

1 µl0,803 ml

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

Cơ sở lý thuyết của phương pháp

PCR là một phương pháp hiệu quả để tạo ra số lượng lớn trình tự DNA đặc hiệu in vitro Sự nhân bội này, có thể lên tới một triệu lần, được tạo bởi

một quá trình có chu kỳ gồm ba bước Các thành phần cần thiết cho phản ứng nhân bội PCR là (1) hai mồi oligonucleitide tổng hợp (~20 nucleotide mỗi mồi) bổ sung với các vùng trên các sợi đối nhau, các vùng này nằm ở hai đầu của trình tự DNA đích và sau khi ủ ghép với DNA khuôn; (2) một trình tự đích trong mẫu DNA nằm giữa cặp mồi và có thể dài từ 100 đến 3500 bp; (3) một DNA polymerase bền nhiệt, có thể chịu được nhiệt độ từ 95oC trở lên; và (4) bốn deoxyribonuclotide29,26

Các bước PCR được thực hiện theo sơ đồ sau:

Mồi xuôi 10 pmol 10

Mồi ngược 10 pmol 10

Plasmid (0,2 ng) 5

Vent (10 u/ul) 2

2.2.2 Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose bằng QIAquick Gel

2 Bổ sung đệm gắn – QG vào gel sao cho cứ 100 mg agarose bổ sung

300µl, sau đó ủ hỗn hợp ở 50oC cho đến khi tan hết

3 Dùng pipet hút hỗn hợp cho lên cột, ly tâm 13000 vòng/phút trong

1 phút

4 Bổ sung 700 µl dịch rửa lên cột và ủ 30 giây ở nhiệt độ phòng, sau

đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại hoàn toàn ethanol ra khỏi cột

5 Sau đó chuyển cột sang ống eppendorf 2 ml mới , bổ sung ít nhất 30

µl nước khử trùng ion vô trùng, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1phút và thu dịch DNA

6 Sản phẩm tinh sạch được điện di kiểm tran trên gel agarose

2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose

Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Trong môi trường có pH trung tính, ADN mang điện tích âm Do đó, khi được đặt trong một điện trường đều, ADN sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Trên môi trường chất giá agarose, các đoạn ADN có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (đoạn ADN có kích thước lớn hơn sẽ

di chuyển chậm hơn) và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy

Quy trình

Chuẩn bị gel agarose

- Cân bột agarose rồi hoà tan vào đệm TAE 1X sao cho được nồng độ 0,8%

- Đun sôi dịch agarose cho đến khi tan hết và để dịch nguội đến khoảng

50oC thì đổ vào khuôn có cài sẵn răng lược

- Gel sẽ đông và ổn định hoàn toàn trong khoảng 30 phút

- Rút lược nhẹ nhàng ra khỏi khuôn, đặt gel vào bể điện di, đổ đệm TAE tới khi ngập mặt gel

Tra mẫu ADN vào giếng

- Tùy thuộc vào mục đích điện di khác nhau mà ta có thể sử dụng nồng

độ ADN cao hoặc thấp

- Tra mẫu sau khi đã đổ đệm TAE vào khuôn điện di cho ngập gel Mẫu được trộn với loading dye 6X với tỷ lệ mẫu: loading dye là 5:1 và được đưa vào giếng Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với hiệu điện thế 100 V trong khoảng 30 phút

- Trong quá trình chạy, cần quan sát sự di chuyển của bromophenol để biết lúc nào cần dừng điện di

Nhuộm ADN bằng ethidium bromide: Quá trình điện di kết thúc khi băng màu bromopenol chạy được 2/3 bản gel agarose, bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch ethidium bromide nồng độ 0,5 µg/ml trong khoảng 15 phút rồi rửa lại bằng nước

Quan sát và chụp ảnh: Bản gel sau khi nhuộm ethidium bromide được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại với bước sóng λ = 302 nm

2.2.4 Biến nạp gen vào tế bào E coli DH10b bằng phương pháp sốc

nhiệt

Cơ sở lý thuyết của phương pháp

Sốc nhiệt là phương pháp thường dùng để biến nạp ADN plasmid vào tế

bào E coli Trong quá trình sinh trưởng, màng tế bào của vi khuẩn E coli có

hàng trăm lỗ gọi là lỗ dính bám Màng tế bào vi khuẩn được tạo thành bởi các phân tử phospholipid có các gốc phosphate tích điện âm Mặc dù, bình thường các lỗ dính bám đủ lớn để ADN có thể đi qua, nhưng các gốc phosphate tích điện âm trên phân tử ADN và các gốc phosphate của màng tế bào vi khuẩn cùng tích điện tích âm đẩy nhau ra nên phân tử ADN xoắn kép không thể đến gần màng tế bào vi khuẩn Theo lý thuyết, các ion Ca2+ từ CaCl2 có thể tương tác với các điện tích âm, dẫn đến các lỗ dính bám trở nên tích điện Khi ở điều

kiện nhiệt độ thấp, màng lipid sẽ bị đóng băng Khi nhiệt độ tăng nhanh hoặc sốc nhiệt sẽ làm mất cân bằng nhiệt ở 2 bên màng vi khuẩn và tạo thành một đường đi và ADN có thể di chuyển nhanh qua lỗ dính bám

Quy trình

Tạo tế bào khả biến

1 Cấy chuyển một khuẩn lạcE coli trong 5 ml môi trường LB lỏng,

lắc 200 vòng/phút ở 37oC qua đêm

2 Chuyển 0,5 ml dịch nuôi cấy sang 50 ml LB lỏng, tiếp tục nuôi cấy

ở điều kiện như trên tới khi nồng độ tế bào OD600 đạt 0,4 đến 0,6 (khoảng 2 giờ) Sau đó, dịch tế bào được chia ra mỗi ống falcon 40

ml và đặt trên đá khoảng 1 giờ

3 Từ bước này trở đi mẫu luôn được tiến hành ở 4oC Ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

4 Thu tủa trong box cấy

5 Gom tủa vào một ống, hòa tủa trong 40 ml CaCl2 0,1 M (vô trùng,

đã được làm lạnh) và ủ 30 phút trên đá

6 Ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút

7 Thu tủa trong box, tế bào tiếp tục hòa vào 35 ml CaCl2 0,1 M và ủ

10 phút trên đá

8 Tiếp tục ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút

9 Thu tủa trong box, hòa tủa bằng 1 -2 ml CaCl2 0,1 M có bổ sung thêm 15% glycerol

10 Cuối cùng chia vào mỗi ống eppendorf 40 µl dịch tế bào để bảo quản ở -80oC

4 Mẫu được lấy ra khỏi bể ổn nhiệt rồi đặt trên đá trong 2 phút

5 Bổ sung vào dịch mẫu khoảng 500 đến 600 µl LB lỏng, lắc ở 37oC