Tách dòng và thiết kế vector biển hiện nhóm gene doxa và dnrv tham gia điều hoà sinh tổng hợp doxorubicin trong xạ khuẩn streptomyces lividans TK24

Khi đó người ta đã định nghĩa :" Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra vi khuẩn, vi nấm, có tác dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn l

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -





 -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI :

TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN NHÓM GENE

doxA VÀ dnrV THAM GIA ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP

DOXORUBICIN TRONG XẠ KHUẨNSTREPTOMYCES LIVIDANS

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn các thầy, các cô giáo công tác tại khoa Công Nghệ Sinh Học – Viện Đại Học Mở Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho chúng em được học tập trong một môi trường khoa học và hoàn thiện nhất

Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến thầy cô giáo TS Tạ Thị Thu Thủy và ThS Nguyễn Thành Chung- người đã dành rất nhiều thời gian

và tâm huyết đinh hướng nghiên cứu, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện bài khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn chị Nguyễn Thị Phương Thảo - Kỹ sư công

nghệ sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực tập

và hoàn thành đề tài nghiên cứu của mình

Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân, và toàn thể các bạn trong phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu đề tài, mặc dù bản thân em đã có nhiều cố gắng,nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót, hạn chế nên em rất mong nhận được những góp ý của quý thầy – cô để bài khóa luận của em được đầy

đủ và hoàn chỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Mai Thị Lan Anh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về kháng sinh 3

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 3

1.1.2 Lịch sử kháng sinh 3

1.1.3 Phân loại kháng sinh 5

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 6

1.2 Đại cương về xạ khuẩn 10

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn 10

1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn 10

1.3 Vật chủ biểu hiện xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24 12

1.4 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin 12

1.4.1 Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin 12

1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin 13

1.4.3 Cấu trúc của Doxorubicin 14

1.4.4 Con đường sinh tổng hợp Doxorubicin 15

1.4.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin 16

1.4.6 Ứng dụng và thành tựu đạt được về nghiên cứu kháng sinh DXR 18

1.5 Giới thiệu chung về gen doxA , dnrV 21

1.5.1 Giới thiệu chung về gen doxA 21

1.5.2 Giới thiệu chung về gen dnrV 23

1.5.3 Vai trò liên kết hỗ trợ của doxA và dnrV 23

1.6 Vector biểu hiện pIBR25trong hệ xạ khuẩn 24

1.7 Mục tiêu và nội dung đề tài 24

1.7.1 Mục tiêu đề tài 25

1.7.2 Nội dung đề tài 25

1.7.3Sơ đồ tiến trình thí nghiệm 26

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27

2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị 27

2.1.1 Vật liệu 27

2.1.2 Môi trường 29

2.1.3 Hóa chất 31

2.1.4 Thiết bị 33

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Phương pháp thiết kế mồi 33

2.2.2 Phương pháp PCR 34

2.2.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số của xạ khuẩn 37

2.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 39

2.2.5 Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose 40

2.2.6 Phương pháp tách ADN plasmid từ tế bào vi khuẩn 41

2.2.7 Phương pháp nối ADN 42

2.2.8 Phương pháp cắt ADN bằng enzyme giới hạn 43

2.2.9 Phương pháp chuyển gen bằng sốc nhiệt 43

2.2.10 Phương pháp chuyển gen vào Streptomyces lividansTK24 45

PHẦN 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 Thiết kế mồi 47

3.2 Tách dòng gen doxA và dnrV 47

3.2.1 Tách chiết ADN tổng số xạ khuẩn S.peucetius ATCC27952 47

3.2.2 Nhân gen doxA , dnrV bằng phản ứng PCR 48

3.2.3 Tạo vector tái tổ hợp pGEM-T.doxAV 51

3.3 Giải trình tự và dự đoán chức năng gen qua genbank 54

3.3.1 Giải trình tự gen và dự đoán chức năng doxA 54

3.3.2 Giải trình tự gen và dự đoán chức năng dnrV 56

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

3.4 Thiết kế vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 58

PHẦN 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62

4.1 Kết luận 62

4.2 Đề xuất 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Chú thích Amp

bp

C DMSO ADN dNTPs ARN HTKS

kb PCR SDS IPTG SDS-PAGE DTT

Da

Ampicillin Base paire Carbon Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotides Ribonucleic Acid Hoạt tính kháng sinh Kilobase

Polymerase Chain Reaction Sodium dodecyl sulfate Isopropyl-thio-β-galactoside Sodium Dodecyl Sulfate Dithinotheitol

Dalton

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Hóa chất sử dụng 31 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng 33

Bảng 3.1 So sánh gen doxA được giải trình tự với gen doxA được công bố trên

Genbank qua phần mềm Blast 53

Bảng 3.2 So sánh gen dnrV được giải trình tự với gen dnrV được công bố trên

Genbank qua phần mềm Blast 55

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.2 Cấu trúc không gian của kháng sinh DXR 15

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của DNR và DXR 15

Hình 1.4 Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp DXR 16

Hình 1.5 Tóm tắt các phản ứng xúc tác bởi gen doxA 22

Hình 2.1 Cấu trúc pGEM T Easy vector dùng trong tách dòng gen 28

Hình 2.2 Cấu trúc pIBR25 dùng trong biểu hiện gen doxAV 29

Hình 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ chủng xạ khuẩn

S.peucetiusATCC27952

48

Hình 3.2 Điện di kết quả PCR nhân gen doxAV 50

Hình 3.3 Tinh sạch gen doxAV từ gel agarose 50

Hình 3.4 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV 51

Hình 3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp pGEM T.doxAV vào vi

Hình 3.8 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV 58

Hình 3.9 Cắt plasmid pGEM T.doxAV và vector pIBR25 bằng

enzyme XbaI và EcoRI

59

Hình 3.11 Kiểm tra cáckhuẩn lạc đã được chuyển gen vector

pIBR25 và được cắt bằng enzyme EcoRI và XbaI

61

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MỞ ĐẦU

Bệnh ung thư được coi là một trong những bệnh nan y nguy hiểm được phát hiện với số ca mắc bệnh ngày càng gia tăng trên thế giới Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) năm 2014 cho thấy tới năm 2035 số lượng bệnh nhân mới mắc bệnh ung thư đạt 24 triệu người tăng 70% so với năm 2012 là 14,1 triệu người Nhưng ở một số nước phát triển như Hoa kỳ, theo thống kê của tổ chức ung thư Hoa Kỳ cho thấy tỷ lệ ca tử vong vì bệnh ung thư trong hai thập kỷ qua

có xu hướng giảm từ đỉnh điểm 215/100.000 người năm 1991 xuống còn 175/100.000 người năm 2010 Điều đó đã chứng tỏ vai trò vô cùng quan trọng của các chất kháng sinh tham gia vào quá trình điều trị ung thư.Tuy nhiên , hiện nay kho tàng thuốc kháng sinh ngày càng trở nên hạn hẹp và khan hiếm Tốc độ phát triển của các loại kháng sinh kháng các loài vi sinh vật gây bệnh mới cũng không thể bắt kịp sức tăng trưởng và biến đổi của các mầm bệnh kháng thuốc Hiện tượng kháng kháng sinh đã trở thành vấn đề mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát triển Với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí có liên quan trong việc chữa trị đã trở thành gánh nặng lớn với các bệnh nhân Chính vì vậy, song song với việc sử dụng thuốc kháng sinh một cách hợp lí của người bệnh thì việc nghiên cứu, phát triển và ứng dụng sản xuất các loại kháng sinh mới đang là nghĩa vụ và trách nhiệm của các nhà khoa học trên toàn thế giới

Doxorubicin (DXR) là kháng sinh thuộc nhóm anthacycline, được sử dụng trong điều trị các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ lympho như ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu Hiện nay, kháng sinh này được biết đến bởi các đặc điểm vượt trội của nó như có phổ tác dụng mạnh và tác động mạnh mẽ, trực tiếp vào quá trình sinh tổng hợp tế bào ung thư mới

Doxorubicin là một loại kháng sinh có giá thành rất đắt và hiện nay ở Việt Nam chưa sản xuất được Trong con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng xạ

khuẩn Strepyomyces peucetius thì hàm lượng Daunorubicin (DNR) được tạo ra

với hàm lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR Một trong những biện pháp tăng sản lượng kháng sinh DXR đó là thực hiện phản ứng chuyển hóa invitro nhằm DNR thành DXN Việc chuyển hóa DNR thành DXR dựa trên sự hoạt động của enzyme Cytochrome P450 Hydroxylase, enzyme Putative Ketoreductase Vì vậy

em thực hiện nghiên cứu đề tài: “Tách dòng và thiết kế vector biểu hiện nhóm

gen doxA và dnrV tham gia điều hòa sinh tổng hợp DXR trong Streptomyces

lividansTK24 ” nhằm tạo enzymeCytochrome P450 Hydroxylase, enzyme Putative Ketoreductase tái tổ hợp để thực hiện phản ứng chuyển hóa DNR thành

DXR

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về kháng sinh

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Thời kì vàng son của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941) Khi đó người ta đã định nghĩa :" Kháng sinh là những sản phẩm trao đổi chất tự nhiên được các vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có tác

dụng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật khác",

Để biểu thị độ lớn giá trị hoạt tính sinh học của kháng sinh trong 1 ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1 mg chế phẩm (đơn vị/mg), thường dùng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hoà tan trong một thể tích môi trường xác định, có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định trong thời gian xác định[3] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6 µg, còn 1 UI streptomycin = 1,0µg (Hopwood, 2007)

1.1.2 Lịch sử kháng sinh

Kháng sinh được phát hiện và ứng dụng sớm nhất là penicilin cách đây hơn

70 năm.Nhưng thực tế, từ lâu con người đã biết dùng các chất có tác dụng chữa trị các bệnh mà sau này được gọi là các chất kháng sinh

Giữa thế kỷ 17, một thầy thuốc hoàng gia Anh đã chữa bệnh bằng cách dùng rêu đắp lên vết thương

Cuối thế kỷ 19 tại Anh, các mẫu bánh mì mốc được dùng để chữa vết thương Theo quan điểm khoa học hiện nay thì thì mốc meo trên bánh mỳ thực tế

có chứa chất kháng sinh, chỉ có điều người xưa chưa biết vi khuẩn và lại càng không biết chất kháng sinh là gì

Năm 1928, nhà sinh vật học người Anh Alexander Fleming trong khi nghiên cứu tụ cầu ông nhận thấy xung quanh khuẩn lạc mốc xanh nhiễm vào hộp petri nuôi tụ cầu tạo thành vòng vô khuẩn Hiện tượng kì lạ này đã được Fleming

nghiên cứu, phân lập thuần khiết và xác định được mốc xanh đó là Penicillium

notatum – một chủng tạo penicillin [1][2]

Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được xác định hầu hết từ xạ khuẩn, và đó trở thành thời kỳ vàng son của hóa liệu pháp kháng sinh

Năm 1944, streptomycin được phát hiện từ xạ khuẩn đất Streptomyces

griseus. Sau đó đến chloramphenicol, tetracycline, các kháng sinh thuộc nhóm macrolide và glycopeptide(tức vancomycin) được phát hiện Các kháng sinh tổng hợp như nalidixic acid, thuốc chống vi sinh vật có bản chất quinolone đã được tạo ra vào năm 1962

Đặc biệt ở hai thập kỷ cuối của thế kỷ XX, khi công nghệ sinh học và hóa dược phát triển mạnh, người ta đã tìm ra được rất nhiều loại kháng sinh mới Việc phát hiện, phát triển và sử dụng các kháng sinh trong điều trị ở thế kỷ XX

đã làm giảm đáng kể tỷ lệ chết do nhiễm khuẩn Tuy nhiên từ 1980 số kháng sinh mới được đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí cho việc phát triển và thử nghiệm thuốc mới ngày càng lớn Bên cạnh đó, một hiện trạng đáng báo động là ngày càng tăng các vi sinh vật gây bệnh kháng với các kháng sinh hiện có Hiện nay, việc kháng của vi khuẩn phải được khắc phục bằng việc phát hiện ra các

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

thuốc mới Tuy nhiên vi sinh vật càng ngày càng nhanh kháng thuốc và tốc độ kháng thuốc nhanh hơn cả tốc độ tạo được thuốc mới của con người [1]

1.1.3 Phân loại kháng sinh

Việc phân loại kháng sinh nhằm khái quát một cách có hệ thống danh mục các kháng sinh do việc tìm ra các kháng sinh ngày càng nhiều Nhờ đó tiết kiệm thời gian khi nghiên cứu các kháng sinh mới về cấu trúc hoá học, cơ chế tác dụng và khả năng ứng dụng trong công tác chữa bệnh [1]

Có thể phân loại kháng sinh dựa trên nhiều phương diện như phổ tác dụng,

cơ chế tác dụng, nguồn gốc, con đường sinh tổng hợp hay cấu trúc hóa học Tuy nhiên, phân loại theo cấu trúc hóa học là phương pháp khoa học nhất, đưa ra một cái nhìn tổng quát nhất đối với các nhóm kháng sinh [1]

1.1.3.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Theo cấu trúc hóa học, kháng sinh được phân thành 9 nhóm chính [1]:

• Nhóm 1: Các kháng sinh cacbonhydrate

• Nhóm 2: Các lactone macrolide

• Nhóm 3: Các kháng sinh quinolone và dẫn xuất

• Nhóm 4: Các kháng sinh peptide và amino acid

• Nhóm 5: Các kháng sinh dị vòng chứa nitơ

• Nhóm 6: Các kháng sinh dị vòng chứa oxy

• Nhóm 7: Các kháng sinh mạch vòng no

• Nhóm 8: Các kháng sinh chứa nhân thơm

• Nhóm 9: Các kháng sinh mạch thẳng

1.1.3.2 Phân loại kháng sinh theo cơ chế tác dụng

Dựa vào cơ chế tác dụng, kháng sinh được chia thành 6 nhóm chính như sau:

• Nhóm 1: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của thành tế bào

• Nhóm 2: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của màng tế bào

• Nhóm 3: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp của Protein của vi khuẩn

• Nhóm 4: Kháng sinh ức chế sự tổng hợp ADN của vi khuẩn

• Nhóm 5: Kháng sinh ức chế sự sinh tổng hợp axit Folic

• Nhóm 6: Kháng sinh ức chế một số quá trình tổng hợp khác

1.1.3.3 Phân loại kháng sinh dựa vào mức độ tác dụng

Dựa vào mức độ tác dụng, kháng sinh được chia thành 2 nhóm sau:

• Nhóm 1: Kháng sinh diệt khuẩn bao gồm những kháng sinh tác dụng đến khả năng tạo vách tế bào, sinh tổng hợp ADN và ARN …

• Nhóm 2: Kháng sinh kìm khuẩn gồm các chất ức chế sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách gắn vào các enzyme hay các ribosome 30S, 50S

và 70S

1.1.3.4 Phân loại kháng sinh dựa vào phổ tác dụng

Dựa vào phổ tác dụng kháng sinh được phân thành 5 nhóm sau:

• Nhóm1: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng hẹp, chỉ tác dụng lên một loại hay một nhóm vi khuẩn nào đó

• Nhóm 2: Nhóm kháng sinh có phổ tác dụng rộng

• Nhóm 3: Nhóm kháng sinh dùng ngoài

• Nhóm 4: Nhóm kháng sinh chống lao

• Nhóm 5: Nhóm kháng sinh chống nấm

1.1.4 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

Các kháng sinh tác dụng cơ bản qua việc ức chế các phản ứng tổng hợp rất khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật mà tạo ra các phản ứng trao đổi chất làm ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ

Các đích tác dụng

nhiều trường hợp ngườ

khác nhau đối với tế bào vi khu

lên màng nguyên sinh ch

trong đường trong đường

khuẩn hoặc hoạt động m

Dưới sự tác động c

nguyên liệu thành tế

peptidoglucan, nên chỉ

sinh sản, các tế bào ngh

đối với các tế bào động th

HÀ NỘI KHOA CÔNG NGH

ng đặc trưng cho từng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong

ời ta vẫn chưa biết được chính xác hết Có 6 mbào vi khuẩn hoặc nấm: tác dụng lên thành tlên màng nguyên sinh chất, tác dụng lên quá trình tổng hợp ADN, tác d

p protein, tác dụng lên sự trao đổi chất hô hấp và cu

i chất trung gian [3]

Hình 1.1.Cơ chế tác dụng của kháng sinh [3].

ng hợp thành tế bào

c đã làm thay đổi các β-lactam để tạo ra các d

t này bền hơn trong môi trường axit của dạ dày, d

ng ruột, ít mẫn cảm hơn so với sự bất ho

ng mạnh hơn chống lại nhiều vi khuẩn

ng của các kháng sinh sẽ ngăn cản vi khu

ế bào, song không gây tác động lên thành t

ỉ có hiệu quả đối với các tế bào trưởng thành hobào nghỉ không bị ảnh hưởng Tất nhiên, chúng s

ng thực vật vì chúng không có thành tế bào peptidoglucan

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ng nhóm kháng sinh, tuy nhiên trong

Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin, Rostocetin, Vancomycin [3]

1.1.4.2.Sự tổn thương màng tế bào

Một số kháng sinh gây tổn thương cho thành thành tế bào bằng cách phá vỡ màng tế bào chất của tế bào đích bằng cách gắn vào màng và làm hư hỏng tính toàn vẹn của nó

Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như: Amphotericin B, Colistin, Imidazole, Nystatin, Polymycins [3]

1.1.4.3 Sự ức chế tổng hợp Protein

Quá trình này xảy ra thông qua việc chuyển giao thông tin di truyền đã được mã hóa trên mARN.Qúa trình tổng hợp protein diễn ra qua ba giai đoạn là gai đoạn khởi đầu, giai đoạn kéo dài, giai đoạn kết thúc.Các loại kháng sinh khác nhau sẽ tác động vào quá trình này ở những giai đoạn khác nhau Một số kháng sinh tác động theo cơ chế này như:

 Tác động vào giai đoạn khởi đầu:

- Nhóm aminoglycoside gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome, ngăn cản phức hợp khởi đầu hoạt động bình thường, can thiệp tiếp cận tRNA làm cho quá trình dịch mã không chính xác

- Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide mới thành lập

- Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản sự thành lập phức hợp đầu tiên để tổng hợp chuỗi polypeptide

 Tác động vào giai đoạn kéo dài:

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- Tetracyclin ảnh hưởng tới sự gắn tARN mang amino acid vào ribosome ở tiểu phần 30S của ribosome do đó ngăn cản sự bổ sung amino acid vào chuỗi polypeptide đang tổng hợp

1.1.4.4 Sự ức chế tổng hợp acid nucleic

Các hợp chất có khả năng hoạt động như các tác nhân kháng vi sinh vật bằng cách can thiệp vào chức năng của các acid nucleic được gọi là các chất tương tự như acid nucleic Do có sự giống nhau về mặt cấu trúc của các hợp chất này với các acid nucleic thông thường cho phép chúng gắn được vào các phân tử ADN hoặc ARN của các tác nhân gây bệnh, sau đó, chúng sẽ làm biến dạng các phân tử axit nucleic và ngăn ngừa sự sao chép, phiên mã và dịch mã xảy ra sau

đó Đặc biệt, các chất có cấu tạo tương tự như acid nucleic cũng có tác dụng lên các tế bào ung thư trong giai đoạn phân chia nhánh [3]

1.1.4.5.Sự ức chế tổng hợp acid folic

Acid folic là cơ sở cho sự tổng hợp methionine, purine và pyrimidine, từ đó tổng nên protein và các acid nucleic của vi khuẩn Sulfamides và trimethoprim là những chất tương tự về mặt cấu trúc và hóa học với các acid p-aminobenzoic (PABA) và acid folic Sulfamides đối kháng cạnh tranh với PABA - một tiền chất để tổng hợp acid folic PABA kết hợp với acid pteroic hoặc axit glutamic để tạo PGA, chất này giống như một coenzym trong sự tổng hợp purin và timin Do

đó khi thiếu PABA sẽ gây thiếu purin, acid nucleic Trimethoprim ức chế dihydrofolate reductase ngăn quá trình chuyển hóa dihydrofolate thành tetrahydrofolate (dạng hoạt động của acid folic), làm cho sự hoạt động của tế bào

bị rối loạn [3]

1.2 Đại cương về xạ khuẩn

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật rất đa dạng trong đó đa số sinh trưởng hiếu khí và tạo khuẩn ty phân nhánh tương tự như nấm

Tên xạ khuẩn là actinomycete, bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “actys” (tia) và

“mykes” (nấm) Ban đầu xạ khuẩn được coi là nấm nhỏ vì chúng sinh trưởng giống với nấm

Theo hệ thống phân loại hiện nay, xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes (gồm

vi khuẩn Gram (+) và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật và vi khuẩn nhân sơ

Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, phân lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài trong đó có

478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các chi còn lại được xếp

vào nhóm xạ khuẩn hiếm [5]

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau Phần lớn xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25–30 0C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường chỉ nằm trong khoảng 18–280C Độ ẩm thích hợp đối với

xạ khuẩn dao động trong khoảng 40 - 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5

Xạ khuẩn không có giới tính [28].Xạ khuẩn có khả năng hình thành enzym và các chất kháng sinh nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống

1.2.2 Sự hình thành chất kháng sinh trong xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh.Trong số 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới có

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [5].Một trong những tính chất của các chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc Mỗi chất kháng sinh chỉ có tác dụng với một nhóm vi sinh vật nhất định Hầu hết chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng.Khả năng kháng khuẩn của các chất kháng sinh là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh, nhưng có hai giả thuyết được ủng hộ hơn cả là:

• Việc tổng hợp chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được

sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ

đó

• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao của chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là các loài có bào tử Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc khác nhau và vi sinh vật sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một

số con đường nhất định

Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp duy nhất như Chloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhóm nucleoside.Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau như lincomycin, novobiocin Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất trao đổi bậc một, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều chất kháng sinh có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor[6]

1.3 Vật chủ biểu hiện xạ khuẩn Streptomyces lividansTK24

 Cấu trúc và vai trò của Streptomyces lividansTK24

Streptomyces lividansTK24 là một vi khuẩn đất gram dương, cấu trúc dạng sợi Với hàm lượng G - C cao nên bộ gen của chúng rất bền.Do môi trường sống tự nhiên của chúng, cùng với các tác nhân không gây bệnh của các loài trong chi

này, S lividansTK24 được sử dụng như máy chủ để tổng hợp và tiết ra protein

tương đồng và dị hợp [10]

 Ứng dụng công nghệ sinh học

Streptomyces lividans TK24 sản xuất một số lượng lớn các protein, nó đã được

sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất và bài tiết của các protein trong công

nghiệp Các chi Streptomyces là vi khuẩn dạng sợi sống trong đất, và môi trường

sống tự nhiên của nó đã cho phép họ sản xuất hầu hết các loại kháng sinh được biết đến từ tự nhiên, cũng như nhiều chất chuyển hóa thứ cấp khác và các enzym quan trọng để sử dụng trong kinh tế và công nghiệp

1.4 Tổng quan về kháng sinh Doxorubicin

1.4.1 Giới thiệu chung về kháng sinh Doxorubicin

Doxorubicin hay còn được gọi là Hydroxydaunorubicin, là một trong những kháng sinh quan trọng thuộc nhóm Anthracycline được tạo ra bởi con đường

sinh tổng hợp sản phẩm bậc hai của chủng xạ khuẩn Streptomyces

peucetiusATCC27952 Dẫn xuất được sử dụng trong điều trị bệnh u bướu và ung thư bằng phương pháp hóa trị liệu

Doxorubicin là kháng sinh có khả năng điều trị các loại bệnh về khối u cứng, ung thư hệ tạo máu, và khối u hệ Lympho như ung thư bàng quang, ung thư vú, ung thư cổ tử cung , ung thư máu

Doxorubicin là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng xạ khuẩn

Streptomyces peucetius ATCC27952 đươc phân lập từ tự nhiên.DXR được tạo ra

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

bằng cách thêm vào cấu trúc của DNR (sản phẩm trao đổi chất bậc một của

chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952, tiền thân của

Doxorubicin) vị trí C14 một nhóm OH.Vì vậy mà DXR còn được gọi là C14 - Hydroxydaunorubicin

Cũng giống như các kháng sinh khác thuộc nhóm kháng sinh Anthracycline, DXR hoạt động bằng cách liên kết với phân tử ADN, ức chế quá trình sinh tổng hơp acid nucleic và sự phân chia của tế bào ung thư nhưng nó lại

có một tác dụng phụ lớn nhất là gây tổn thương cho tim và đe dọa tính mạng của người sử dụng nếu có tiền sử về bệnh tim [16]

1.4.2 Lịch sử nghiên cứu Doxorubicin

Trong những năm 1960, một công ty nghiên cứu ở Italia - Farmitalia Research Laboratories, tổ chức này đã thực hiện tìm kiếm các hợp chất chống ung thư từ vi khuẩn đất trên quy mô phòng thí nghiệm Họ đã tiến hành phân lập

từ các mẫu đất xung quanh lâu đài Castel Del Monte bằng sự lỗ lực cố gắng họ

đã phát hiện ra một chủng xạ khuẩn.Chủng xạ khuẩn này đã tạo ra một hợp chất

có sắc tố đỏ và có hoạt tính chống lại các khối u ở chuột rất tốt.Chủng xạ khuẩn

này chính là Streptomyces peucetius [15]

Cùng thời gian đó, một nhóm nghiên cứu ở pháp đã phát hiện ra một hợp chất tương tự cũng có màu sắc đỏ và sau này khi kháng sinh được tách chiết thì đặt tên cho chất màu đỏ này là Daunorubicin " Daunorubicin " là tên hợp nhất của hai từ Dauni và Rubis (Rubi), Dauni là tên của bộ lạc trước thời kỳ La Mã sinh sống và chiếm đóng vùng đất đã phân lập được chủng xạ khuẩn sản xuất được chất kháng sinh này, còn Rubis là tiếng Pháp mô tả màu sắc [15]

Những năm 1960, bắt đầu thử nghiệm lâm sàng loại kháng sinh này và đã thành công trong việc điều trị bệnh bạch cầu cấp tính và ung thư hạch

Tuy nhiên, năm 1967 Daunorubicin được công nhận có tác dụng phụ lớn nhất là gây ra độc tính trên tim và gây tử vong cho con người [16]

Năm 1969, Arcamone F cùng với các cộng sự đã tiến hành biến đổi một

chủng xạ khuẩn có nguồn gốc từ chủng Streptomyces peucetius bằng cách sử

dụng N - nitroso - N- methyl urethane, kết quả là tạo ra một chủng đột biến mới

và đặt tên là Streptomyces peucetius phân loài Casius ATCC27952 có khả năng

sản xuất ra một kháng sinh cũng có màu đỏ như DNR và họ đặt tên chất này là Adrimycin , sau đó được thay đổi tên thành DXR để phù hợp với quy ước đặt tên của quốc tế [17] [18]

Trong bài báo cáo khoa học lần thứ 53 của Di Manrco A, Gactani M, Scarpinato B năm 1969 đã chỉ ra rằng DXR có tác dụng chống lại các khối u chuột đặc biệt là u cứng tốt hơn hẳn so với DNR và có chỉ số điều trị cao hơn nhưng tác động phụ tới tim vẫn còn tồn tại [19]

Năm 1996, nhóm Strohl đã phát hiện ra gene DoxA - gen mã hóa các enzyme có thể chuyển đổi DNR thành DXR [20]

Năm 1999, nhóm Strohl sản xuất tái tổ hợp được gen DoxA là một oxydaza Cytochrome P- 450, gen này tham gia xúc tác nhiều bước trong quá trình sinh tổng hợp DXR bao gồm cả các bước sản xuất DNR [21] Bằng đột biến ba gen với sự có mặt của DoxA đã làm tăng từ 36%-86% năng suất sinh tổng hợp Doxorubicin [18]

1.4.3 Cấu trúc của Doxorubicin

• Công thức phân tử: C27H29NO11

• Tên khác: C-14 hydroxydaunorubicin

• Tên thương mại: Doxil, Adriamycin

• Tên khoa học: pyran-2-yloxy)-6,7,8,11-trihydroxy-8-2-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-

(8S,10S)-10-(4-amino-5-hydroxy-6-methylt-etrahydro-2H-7,8,9,10-tetrahydrotetracene-5,12-dione

• Kích thước: 1.583 × 1.212 (4 KB)

phân lập trong tự nhiên là

sản phẩm đầu tiên là DNR.Khi có m

DNR thì hình thành sản ph

Hình 1.3: C

HÀ NỘI KHOA CÔNG NGH

ng phân tử: 543.526 đơn vị Cacbon nóng chảy: 205oC

Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nư

Hình 1.2: Cấu trúc không gian hóa học của Doxorubicin

ng sinh tổng hợp Doxorubicin

ản phẩm trao đổi chất bậc hai của chủng x

nhiên là Strepyomyces peucetius.Chủng xạ khu

u tiên là DNR.Khi có một nhóm OH được gắn vào v

n phẩm bậc hai, đó chính là Doxorubicin

: Cấu trúc không gian của Daunorubicin và Doxorubicin

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tính tan: Tan trong MeOH, Cloroform, không tan trong nước và hexan

a Doxorubicin

ng xạ khuẩn được khuẩn này tạo ra

n vào vị trí C-14 của

a Daunorubicin và Doxorubicin

Theo nhiều chứng minh cho thấy rằng, DXR có hoạt tính mạnh hơn và ưu việt hơn so với DNR nhưng nếu tuân theo con đường sinh tổng hợp tự nhiên của chủng xạ khuẩn trên thì hàm lượng DNR được tạo ra với hàm lượng lớn hơn rất nhiều so với DXR

deoxysugar (dnm) regulatory resistance (drr)

glycosyltransferase oxidation

unspecified function cyclase

dxr modifying reduction dps (PKS)

dnmL dnmM N O dnrF drrA drrB drrD X dpsY dnmZ dnmU dnmVdnmJ I

doxA V U G H dnmT dnrH dnrE F E dnrG A B C D C D dnrK dnrP Q S drrC

SN Gene Proposed function

1 dnmL glucose-1-phosphate thymidylyltransferase

2 dnmM TDP-glucose-4,6-dehydratase

3 dnrN pseudo response regulator gene

4 dnrO repressor gene

5 dnrF aklavinone C-11 hydroxylase

6 drrA resistance gene

7 drrB resistance gene

8 drrD resistance gene

9 dnrX putative doxorubicin modifying enzyme

10 dpsY polyketide cyclase (3rd cyclase)

11 dnmZ putative flavoprotein

12 dnmU 3,5-epimerase

13 dnmV 4-ketoreductase

14 dnmJ C-3 aminotransferase

15 dnrI regulatory gene

16 doxA daunorubicin C-14 hydroxylase

17 dnrV putative ketoreductase

18 dnrU daunorubicin C-13 ketoreductae

SN Gene Proposed function

19 dpsG ACP for minPKS

20 dpsH daunorubicin biosynthesis enzyme

21 dnmT putative 2,3-dehydratase

22 dnrH putative baumycin biosynthesis enzyme

23 dnrE aklaviketone reductase

24 dpsF polyketide cyclase (1st cyclase)

Hình 1.4 Các gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR [32]

1.4.5 Cơ chế hoạt động và hoạt tính sinh học của Doxorubicin

Doxorubicin tác động vào tế bào ung thư bằng cách tương tác với ADN, ức chế sự tổng hợp axit nucleic (ARN - quá trình phiên mã) và sự phân chia của tế bào ung thư [21] [22]

Các enzyme ADN Topoisomerase chính là các mục tiêu tác động của DXR trong sự tiêu diệt tế bào ung thư DXR thực hiện quá trình ức chế trực tiếp lên sự hoạt động của các enzyme này, làm gián đoạn chức năng đồng thời thay đổi chức năng tự nhiên của nó tạo ra sự đứt đoạn trong phân tử ADN cuối cùng dẫn đến các tế bào ung thư bị chết [25]

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1.4.5.1 Enzyme ADN Topoisomarse

Lịch sử: Enzyme ADN Topoisomerase do James C Wang là nhà sinh học người Mĩ gốc Trung Quốc phát hiện ra và đề xuất cơ chế hoạt động của chúng

 Enzyme ADN Topoisomerase loại I

Enzyme ADN Topoisomerase loại I có cấu trúc như là một monomer gồm bốn tiểu phần riêng biệt Các thành phần chính gắn với nhau bằng đầu Cacbon và đầu Nito Hai đầu này gắn với các rãnh lớn và nhỏ tương ứng

Là enzyme nuclease đặc biệt có vai trò trong quá trình bẻ gãy liên kết photphodiester giữa các bazơ trên một mạch đơn tạo ra vết đứt giải phóng hai đầu và dạng sợi tự do Các đầu tự do này sẽ quay để giúp cho quá trình mở xoắn sợi ADN giúp cho quá trình sao chép, tái bản Do phân tử ADN có cấu trúc xoắn kép nên trong quá trình nhân đôi tại chạc sao chép được mở ra và chạc này chuyển động theo sợi khuôn sẽ khiến sợi này xoắn lại rất chắc Enzyme ADN Topoisomerase I đóng vai trò mở xoắn để khắc phục sự xoắn cho quá trình sao chép,sau đó liên kết photphodiester lại được phục hồi và enzyme tách khỏi ADN



 Enzyme ADN Topoisomerase loại II

Enzyme ADN Topoisomerase loại II có khả năng cắt đứt cả hai mạch trên sợi ADN và sau đó xúc tác cho quá trình phục hồi gắn lại hai sợi ADN Vì vậy

mà enzyme này vừa có chức năng tháo gỡ siêu xoắn trong quá trình tái bản ADN vừa có chức năng tạo ra trạng thái siêu xoắn trở lại của sợi ADN bằng cách đảo mạch hai sợi xoắn kép hoặc gắn hai đầu xoắn của sợi xoắn kép sau đó lồng vào với nhau để tạo siêu xoắn và co ngắn sợi ADN [26]

1.4.5.2 Cơ chế hoạt động của kháng sinh Doxorubicin

Trong tế bào ung thư, enzyme ADN Topoisomarase được sinh tổng hợp và biểu hiện với tấc độ rất cao Sau đó, enzyme này xúc tác cho quá trình sao chép ADN hay quá trình phân chia tế bào ung thư diến ra rất nhanh chóng Kết quả là

số lượng tế bào ung thư sẽ được nhân lên với một số lượng lớn Do đó, enyme ADN Topoisomarase là mục tiêu của rất nhiều loại thuốc kháng sinh chống và điều trị ung thư trong đó có cả kháng sinh DXR

Khi xảy ra sự tương tác với tế bào ung thư, DXR sẽ gây ức chế quá trình sinh tổng hợp ADN hay quá trình phân chia tế bào ung thư bằng cách phân tử DXR hình thành mối tương tác xen kẽ giữa các cặp bazơ trong chuỗi ADN ở trạng thái xoắn kép từ đó ức chế hoạt tính của enzyme ADN Topoisomarse II dẫn đến ức chế quá trình tháo xoắn và mở xoắn của ADN Ngoài ra, DXR còn giúp cho quá trình cố định lại phức hệ Topoisomarase II với ADN và sau khi tháo xoắn kép cho quá trình sinh tổng hợp phân tử ADN đó không có khả năng đóng xoắn lại hay ghép lại mạch bởi cầu nối photphodieste

1.4.6 Ứng dụng và thành tựu đạt được về nghiên cứu kháng sinh DXR

1.4.6.1 Ứng dụng cuả Doxorubicin

Kháng sinh DXR và những chế phẩm của nó đã được áp dụng thử nghiệm lâm sàng vào những năm của thập niên 1960 Qua các nghiên cứu thực tiễn đã chỉ ra rằng kháng sinh này có khả năng ức chế sự hoạt động của tế bào Hiện nay DXR đã được nhiều công ty dược lớn trên thế giới nghiên cứu sản xuất và bào chế thành nhiều dạng thuốc lưu hành trên thị trường với một số tên gọi khác như Adriamycin CS, Adrim, Doxorubicin hidrocloride

DXR được dùng để điều trị về các bệnh khối u cứng, ung thư hệ tạo máu,

và khối u hệ lympho gồm các bệnh như:

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

• Điều trị ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing, u

mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgin và không Hodgin, ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinom tuyến giáp)

• Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thưtinh hoàn Khối u đặc biệt của trẻ em như: Sarcom cơ vân (Rhabdomyosarcom), u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp, ung thư cổ tử cung, ung thư âm đạo, ung thư đầu cổ, ung thư dạ dày

• Thuốc có tác dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như: đau tủy xương, u màng hoạt dịch, u quái và u nguyên bào võng mạc

1.4.6.2 Thành tựu nghiên cứu

Hiện nay với nền khoa học hiện đại nghiên cứu tạo ra thuốc chống ung thư

đã áp dụng các phương pháp sinh tổng hợp, hóa tổng hợp hoặc kết hợp bán tổng hợp tạo ra thư viện dự trữ, tổ hợp lại các hợp chất có hoạt tính chống ung thư Kết hợp với việc áp dụng công nghệ enzyme, kết hợp các enzyme để sinh tổng hợp kháng sinh tạo ra nhiều dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao hơn, tạo ra thế hệ kháng sinh lai , kháng sinh thế hệ mới bằng phương pháp in vitro và in vivo Áp dụng các công cụ và các phương pháp nghiên cứu hiện đại như sinh học phân tử, nghiên cứu cấu trúc gene, nghiên cứu tối ưu hóa trong quá trình lên men sản xuất kháng sinh trên quy mô công nghiệp

nghiêm ngặt bởi cơ chế điều hòa của nhóm gen dnrV, dnrI, afsR và metK1-sp từ

Streptomyces peucetius ATCC27952 Với nghiên cứu này nhóm gen điều hòa

được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh ( ermE*), sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu

Trong nhóm gen sinh tổng hợp kháng sinh DXR có chứa gen vận chuyển

(glycosyltranferase - dnrS/dnrQ) gắn nhóm đường vào gốc rhonohodine D Khi

hai gen này được chuyển vào vector có chứa promoter mạnh (ermE*) đồng thời chuyển nhóm gen sinh tổng hợp đường khử trong vector này Các tế bào có chứa vector tái tổ hợp này hay chủng tái tổ hợp đã có khả năng tăng tổng hợp mạnh DXR hơn Theo số liệu đã được công bố và phân tích thì lượng DXR được tạo ra cao gấp 5,6 lần so với lượng kháng sinh được tạo ra từ chủng tự nhiên

 Nghiên cứu tạo thế hệ kháng sinh mới từ DXR

Nhóm Miyamoto Y (Nhật Bản năm 2000) đã tạo ra kháng sinh lai thế hệ

mới thuộc nhóm anthracyline bằng phương pháp tạo chủng Streptomyces

Violaceus tái tổ hợp Gene dnrK mã hóa cho carminomycin metyltransferase Chủng thuộc nhóm gen sinh tổng hợp DXR được chuyển vào

4-O-chủng xạ khuẩn Streptomyces Violaceus Chủng này đã tạo ra kháng sinh

anthracyline mới là dẫn xuất của DNR và DXR (4-O-methylepelmycin D)

Cho tới năm 1991 đã có tới 553 dẫn xuất đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng tại NCI [27] Theo thống kê của Viện Nghiên Cứu Ung Thư của Mỹ (National Cancer Institute - NCI), đã có hơn 2000 dẫn xuất,các hợp chất sinh học thuộc nhóm anthracyline có cấu trúc đồng dạng với kháng sinh trên được tạo ra

 Các nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện trong lên men sinh tổng hợpDXR

Các nghiên cứu của Hutchinson và cộng sự đã chỉ ra rằng Streptomyces

peucetius tổng hợp và tiết DXR ngoại bào ra môi trường nuôi cấy bằng phương pháp lên men chìm đạt hiệu quả cao khi sử dụng nguồn dinh dưỡng với tỷ lệ thích hợp Tỷ lệ này đã được tối ưu hóa với (gram/lit) nguồn Cacbon là Glucose (60), Sacarose (1000), bột malt (20), nguồn Nito với Cao nấm men (8), nguồn

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

khoáng: NaCl (2), MOPS (15), MgSO4 (0,1), FeSO4.7H2O (0,01), ZnSO4.7H2O (0,01) Với nhiệt độ thích hợp là 28-30oC và thời gian lên men là 4-5 ngày Với điều kiện trên hiệu xuất thu được là 1,5 miligram/lit dịch lên men thực hiện với chủng tự nhiên

Theo nghiên cứu của nhóm Sohng (2009), áp dụng phương pháp tái tổ hợp

về di truyền, công nghệ chuyển gene và nghiên cứu vai trò của các gene có khả năng nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh để tạo ra chủng tái tổ hợp và kết hợp với các điều kiện lên men tối ưu đã được công bố bởi nhóm Hutchinson như nguồn Cacbon, nguồn khoáng, nguồn Nito, chế độ lên men như PH, tấc dộ lắc, thời gian nuôi cấy đã giúp tăng hiệu xuất tổng hợp kháng sinh lên tới 11,5mg/lít

1.5 Giới thiệu chung về gen doxA , dnrV

1.5.1 Giới thiệu chung về gen doxA

1.5.1.1 Cấu trúc của gen doxA

Gen doxA là một Cytochrome P-450 hydroxylase (hay còn gọi là daunomycin

c-14 hydroxylase) thuộc nhóm gồm 37 gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp

kháng sinh DXR từ chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952 Trong đó, gen doxA được xác định có kích thước là 1263bp tương ứng với 420

axitamin được đăng ký bản quyền trên Genbank với mã số AF 403708 Chức

năng của gen doxA là mã hóa, tổng hợp Cytochrome P-450hydroxylase, xúc tác

cho phản ứng oxyl hóa và hydroxylation tại vị trí C14 trong cấu trúc kháng sinh DNR để chuyển đổi thành DXR [1]

1.5.1.2 Vai trò của gen doxA trong con đường sinh tổng hợp Doxorubicin

 Một số nghiên cứu về gen doxA trên thế giới như:

• Theo Dicken và các cộng sự năm 1997 đã cho thấy trong in vitro và in

vivo, enzyme DoxA Cytochrome P450 xúc tác cho quá trình oxyl hóa của 13-

quá trình oxyl hóa đ

• Quá trình oxyl hóa c

tới 13-hydro carminomycin và 13

• Quá trình oxyl hóa c

P G và C R Hutchinson năm 1991 cho thấy khi gen

ng tạo ra một vector tái tổ hợp có khả năng chuy

Natalie Lomovskaya và các cộng sự năm 1999 đã chỉ ra r

ột biến Doxa :: aphII dẫn đến sự tích tụ

ng DXR Ngược lại, biểu hiện của doxA trong đ

n ba dnrX dnrU dnrH tăng gấp hiệu quả tổ

Theo các nghiên cứu trước đấy đã chỉ ra rằng, gen doxA tham

y khi gen doxA và

ăng chuyển đổi 80%

ra rằng nếu chỉ biểu của DNR thay vì đột biến đôi dnrX

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

DOX:doxorubicin DauK:anthracycline 4 - O –

methyltransferase

1.5.2Giới thiệu chung về gen dnrV

1.5.2.1 Cấu trúc của gen dnrV

Gen dnrV có một codon khởi đầu có thể xảy ra (GTG) tại vị trí 2175và một codon TAG kết thúc ở vị trí 1348, chỉ ra rằng dnrVsẽ mã hóa một polypeptide

gồm 274 amino acid [33]

1.5.2.2 Vai trò của gen dnrV trong con đường sinh tổng hợp Doxorubicin

Gen dnrV có chức năng hỗ trợ ( hay còn được gọi là gen điều hòa ) cùng gen

doxA trong quá trình sinh tổng hợp DXR từ DNR

Theo nghiên cứu của Sailesh Malla và các cộng sự năm 2010, DXR là nhóm kháng sinh rất độc nên số lượng sinh ra trong tế bào rất ít nếu được tổng hợp theo con đường tự nhiên Vì vậy quá trình tổng hợp DXR được điều hòa rất

nghiêm ngặt bởi cơ chế điều hòa của nhóm gen dnrV, dnrI, afsR và metK1-sp từ

Streptomyces peucetius ATCC27952 Với nghiên cứu này nhóm gen điều hòa được chuyển vào vector có chứa promotor mạnh ( ermE*), sau đó chuyển vào tế bào vật chủ để tạo ra chủng tái tổ hợp đã tăng khả năng sinh tổng hợp Doxorubicin cao hơn gấp 3-4,3 lần so với tế bào ban đầu

1.5.3 Vai trò liên kết hỗ trợ của doxA và dnrV

Lý do mồi ngược của gen dnrV lại giống mồi ngược của gen doxA là do gen doxA là gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng sinh DXR từ chủng

xạ khuẩnStreptomyces peucetius ATCC27952 Gen dnrV là gen điều hòa luôn đi cùng với gen doxA để hỗ trợ cho quá trình sinh tổng hợp chuyển hóa DNR thành

DXR đạt hiệu suất cao hơn

1.6 Vector biểu hiện pIBR25 trong hệ xạ khuẩn

Biểu hiện gen của các chủng vi sinh vật thuộc nhóm xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật gram dương vô cùng phức tạp và khó khăn bởi cấu trúc genome của xạ khuẩn có tỷ lệ GC khoảng 70% trở lên Việc tạo ra một loại vector đặc biệt để chuyển vào tế bào xạ khuẩn đã và đang nghiên cứu bởi rất nhiều nhóm nghiên cứu về xạ khuẩn Tuy nhiên cho tới nay chưa có bất kỳ một loại vector biểu hiện đặc biệt nào dùng cho tế bào xạ khuẩn được thương mại hóa Vì vậy khi thực hiên các nghiên cứu về biểu hiện gen của xạ khuẩn thường phải tự thiết kế vector phù hợp để sử dụng cho nghiên cứu của mình

Nhóm nghiên cứu của Sohng và cộng sự đã sử dụng vector pGEM 7+ và pGEM 3+ làm gốc đồng thời sử dụng trình tự ermE* là một promotor mạnh để

thiết kế vector trong các nghiên cứu về genome của các chủng Streptomyces với

hy vọng vector này có thể biểu hiện các gen mong muốn ở mức độ cao

1.7Mục tiêu và nội dung đề tài

Doxorubicin là kháng sinh có hoạt tính tiêu diệt tế bào ung thư rất mạnh, mạnh hơn nhiều so với DNR nhưng trong quá trình sinh tổng hợp DXR thì tạo ra lượng tiền chất DNR rất nhiều Hơn nữa, kháng sinh này có phổ tác dụng rộng Đặc biệt với sự có mặt của gen doxA và gen dnrV sẽ thúc đẩy quá trình chuyển đổi Daunorubcin thành Doxorubcin làm tăng năng xuất sinh tổng hợp kháng sinh này

Xuất phát từ mong muốn trên, cùng với sự hướng dẫn, giúp đỡ của cô giáo

TS.Tạ Thị Thu Thủy và các thầy cô cùng toàn thể bạn bè trong phòng thí

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

nghiệm sinh học phân tử em đã thực hiện đề tài nghiên cứu mang tên : “Tách

dòng và thiết kế vector biểu hiện nhóm gen doxA và dnrV tham gia điều hòa sinh tổng hợp DXR trong Streptomyces lividansTK24”

1.7.1 Mục tiêu đề tài

• Tách dòng thành công gen doxA.dnrV bằng pGEMT – easy vector

• Thiết kế vector biểu hiện pIBR25.doxAV mang 2 gen doxAvàdnrV dùng

biểu hiện các gene trong hệ xạ khuẩn làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Doxorubicin

1.7.2 Nội dung đề tài

- Thiết kế mồi cho quá trình tạo vector biểu hiện dòng gen doxA và dnrV

- Tách dòng gen doxA , dnrV trong pGEMT – easy vector

- Giải trình tự gen doxA , dnrV và so sánh với trình tự gen doxA , dnrVđược công bố trên ngân hàng Genbank

- Thiết kế vector biểu hiện pIBR25.doxAV

1.7.3 Sơ đồ tiến trình thí nghiệm

Plasmid pGEM T.doxAV Vector pIBR25

Tạo vector tái tổ hợp pIBR25.doxAV Cắt bằng XbaIvà EcoRI Cắt bằng XbaIvà EcoRI

Biến nạp vào E coli JM109

Nuôi cấy Streptomyces

peucetius ATCC27952

Plasmid pIBR25.doxAV

Biến nạp vào Streptomyces

lividansTK24

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu, hóa chất, môi trường và thiết bị

2.1.1 Vật liệu

2.1.1.1 Chủng vi sinh vật

 Xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952

Chủng xạ khuẩn Streptomyces peucetius ATCC27952từ phòng thí nghiệm

sinh học phân tử khoa CNSH Viện Đại học Mở Hà Nội Đây là chủng xạ khuẩn

tự nhiên sản sinh ra kháng sinh DXR được dùng để tách chiết ADN tổng số phục

vụ việc tách dòng gen doxA , dnrV bằng pGEM-T Easy vector

 Xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24

Chủng xạ khuẩn Streptomyces lividans TK24sử dụng làm vật chủ biểu hiện gen doxA và dnrV Khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh do có chứa promoter

biểu hiện mạnh

 Vi khuẩn E.coli

Là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy tiện và không sinh bào tử Tế bào E coli

có khả năng sinh sản với tốc độ nhanh trên môi trường nuôi cấy tối thiểu Trung

bình khoảng 20 phút chúng lại phân chia một lần Chủng vi khuẩn E coli được

sử dụng trong đề tài đó là:

- Chủng E.coliJM109 dễ dàng tiếp nhận và nhân lên một cách nhanh chóng về

số lượng các plasmid tái tổ hợp chứa gen ngoại lai Chủng này sống trong môi trường LB và được sử dụng làm vật chủ trong tách dòng gen

2.1.1.2 Vector và plasmid sử dụng trong đề tài

Vector là một hay nhiều đoạn ADN có kích thước nhỏ cho phép gắn các đoạn ADN cần thiết, có khả năng tái bản, không phụ thuộc vào sự phân chia của

tế bào, tồn tại độc lập trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và không gây biến đổi bộ gen của tế bào chủ

 Vector tách dòng pGEM-T Easy

Vector pGEM-T Easy (3015bp) là vectơ tách dòng được thiết kế với nhiều đặc điểm của một vectơ đa chức năng, có khả năng ứng dụng cao trong lĩnh vực công nghệ gen Đây là vector đã được mở vòng, tại mỗi đầu mút của vòng mở có một base Timin (ddT) tự do Sản phẩm PCR cuối cùng được tạo thành luôn có gắn với base Adenin (A) nên vector này có khả năng gắn trực tiếp vào với sản phẩm PCR mà không cần có xúc tác của enzyme nối pGEM-T Easy có chứa sẵn các gene: lacZ, ori, f1-origin, AmpR Trong đó ori là những gen có chức năng tái bản trong tế bào vi khuẩn, lacZ dùng để nhận biết tế bào đã được chuyển gen hay gọi là gen chỉ thị, AmpR có vai trò là gen kháng kháng sinh có tác dụng lựa chọn các tế bào vi sinh vật có mang vector [1] pGEM –T vector là vector có khả năng tái bản rất nhanh vì vậy vector này đang là sản phẩm thương mại được sử dụng

rất rộng rãi và hầu hết trong các nghiên cứu về sinh học phân tử

Hình 2.1: Cấu trúc pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen

 Vector biểu hiện pIBR25

• Vector pIBR25 được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Sohng JK và cộng sự (Đại học Sunmoon Hàn Quốc)

• Vector pIBR25 thường được sử dụng với mục đích chính là biểu hiện gen trong hệ xạ khuẩn