Phân lập và thiết kế vector mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây arabidopsis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hùng Mạnh PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI Ở CÂY ARABIDOPSIS LUẬN VĂ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hùng Mạnh

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI

Ở CÂY ARABIDOPSIS

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Hùng Mạnh

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR MANG PROMOTER LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN PHÔI

Ở CÂY ARABIDOPSIS

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Lê Hồng Điệp

Hà Nội - 2015

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Lê Hồng Điệp đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội và các thầy cô giáo trong trường đã giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo phòng thí nghiệm Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thầy cô giáo và các anh chị trong bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, các thầy cô giáo trong khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền dạy kiến thức và kĩ năng cho tôi trong suốt quá trình học tập dưới mái trường Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể thực hiện tốt đề tài nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp cùng tập thể lớp Sinh học thực nghiệm khóa 2012 - 2014, nhóm sinh viên trong phòng thí nghiệm, những người đã luôn sát cánh bên tôi, giúp đỡ, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 24 tháng 11 năm 2015

Học viên

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khoa học kĩ thuật phát triển vượt bậc gắn liền với đời sống con người, hiện diện trong mọi lĩnh vực với mục đích nâng cao chất lượng cuộc sống Công nghệ sinh học ra đời đánh dấu bước tiến mới nhất trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên của con người, đặc biệt là sự phát triển của công nghệ sinh học hiện đại trong nhiều năm gần đây Sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp, các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra những cây trồng vật nuôi có năng suất và chất lượng cao, những thực phẩm, dược phẩm phục vụ chữa bệnh cho con người Hiện nay, công nghệ tế bào và kĩ thuật chuyển gen đang rất phát triển ở Việt Nam Việt Nam là một nước nông nghiệp truyền thống, vì vậy việc phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học được tập trung chủ yếu vào nông - lâm - ngư nghiệp, với mục đích đưa nền nông nghiệp nước ta trở thành nền nông nghiệp hiện đại, ứng dụng khoa học kĩ thuật vào sản xuất để tăng chất lượng, năng suất sản phẩm, đồng thời giảm thiểu sức lao động của con người

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, mưa nhiều, khá thuận lợi để nhiều loài động, thực vật tồn tại và phát triển Theo các nhà khoa học thì Việt Nam là quốc gia đứng thứ 16 trên thế giới về đa dạng sinh học, riêng ngành thực vật bậc cao đã có khoảng 12000 loài thuộc hơn 2500 chi và 300 họ [12] Trong đó có rất nhiều loài có giá trị, đáp ứng được các nhu cầu khác nhau của con người như lương thực thực phẩm, làm thuốc, cây cảnh,…

Trong công nghệ chuyển gen thực vật, việc thiết kế vector biểu hiện là một khâu quan trọng và đóng góp rất lớn cho sự thành công của công nghệ này Vì vậy việc tìm kiếm, phân lập các promoter và các gen có giá trị có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong công tác nghiên cứu và chọn lọc giống Để đạt được hiệu quả cao trong công tác này người ta thường nghiên cứu trên những sinh vật mô hình, trong đó có

Arabidopsis

Arabidopsis (Arabidopsis thaliana L.) mặc dù không có ý nghĩa gì về mặt

nông nghiệp, nhưng trong nghiên cứu nó đóng một vai trò rất quan trọng

Arabidopsis đã được chọn như là một cây mô hình trong nghiên cứu thực vật và đã

được các nhà khoa học trên thế giới sử dụng từ lâu

2

Arabidopsis có bộ gen nhỏ chỉ khoảng 125 Mb, đã hoàn toàn được giải trình

tự và công bố năm 2000 Chu kỳ sinh trưởng của Arabidopsis ngắn (khoảng 6-8

tuần), cho nhiều hạt và dễ dàng nuôi trồng trong một không gian hẹp và rất hiệu quả

trong việc sử dụng phương pháp chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium

Sự hình thành và phát triển của hạt do nhiều yếu tố quy định trong đó có các hormone thực vật như ABA, GA… những hormone này đều tham gia hoạt hóa nhiều gen liên quan đến sự phát triển của hạt

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và thiết

kế vecter mang promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi ở cây

Arabidopsis”, với các mục tiêu cụ thể như sau:

1 Thiết lập được nguồn mẫu cây Arabidopsis in vitro

2 Nhân dòng được trình tự promoter liên quan đến quá trình phát triển phôi

hạt của cây Arabidopsis

3 Đã thiết kế được vector tái tổ hợp pBI121-ET có mang trình tự promoter

ET và tiến hành đưa vào cây Arabidopsis giống Columbia

4 Bước đầu phân tích trình tự của promoter ET

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về cây Arabidopsis

1.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Arabidopsis (tên Latin Arabidopsis thaliana) là một loài thực vật có hoa nhỏ

thuộc họ Cải (Brassicaceae), bộ Brassicales [38]

Arabidopsis có nguồn gốc từ Châu Âu, Châu Á và Tây Bắc Châu Phi Arabidopsis lần đầu tiên được phát hiện năm 1577 ở dãy núi Harz bởi một bác sỹ

người Đức Johannes Thal (1542-1583) và đã được gọi là Pilosella siliquosa Đến năm 1841, danh pháp đã được đổi thành Arabidopsis thaliana bởi một nhà thực vật học người Đức Gustav Heynhold để vinh danh Thal Các loài Arabidopsis có thể được tìm thấy trong tự nhiên hầu như ở khắp mọi nơi ở Bắc bán cầu Arabidopsis đã

được tìm thấy ở mọi độ cao từ mực nước biển cho đến dãy núi cao Himalayas, từ phía bắc Scandinavia đến Bắc Phi, bao gồm cả Cape Verde Islands tại vĩ độ 16 Nó cũng được tìm thấy ở Bắc Mỹ, có thể là bắt nguồn từ Châu Âu [38]

1.1.2 Sinh trưởng và phát triển

Arabidopsis có chu kì sống tương đối ngắn khi so sánh với các loài thực vật

khác Toàn bộ chu trình sống bao gồm sự nảy mầm của hạt, tạo thành cây hình hoa thị, mọc thân chính, ra hoa và thời sinh trưởng đến khi hình thành hạt là khoảng 6 đến 8 tuần

Arabidopsis có kích thước rất nhỏ, cây phát triển thành cụm hình hoa thị

đường kính 2-10 cm, hoa dài 2 mm, hạt khi trưởng thành đạt kích thước 0.5 mm về chiều dài Lá được bao phủ bởi lông đơn bào nhỏ gọi là trichomes thuận tiện cho nghiên cứu hình thái và sự khác biệt của tế bào Lá thật thứ nhất có trichomes chỉ ở

bề mặt trên của lá, trong khi các lá còn lại thì có ở cả mặt dưới Số lượng lá hình hoa thị được hình thành phụ thuộc vào kiểu gen và điều kiện môi trường cùng với

sự tương quan mạnh với thời gian từ lúc nảy mầm đến lúc bắt đầu ra hoa [38]

Hạt giống Arabidopsis nhỏ, có hình bầu dục Hạt giống có thể nảy mầm một

cách dễ dàng, mặc dù hạt sau thu hoạch thì cần được xử lý lạnh một vài ngày và lưu trữ bảo quản một thời gian để hạt có sức nảy mầm tốt nhất Hạt thường yêu cầu ánh sáng để nảy mầm

4

Hạt cây Arabidopsis được gieo trên đĩa petri hoặc trong chậu đặt trong nhà

kính hoặc dưới ánh đèn huỳnh quang trong phòng thí nghiệm Khoảng 3 tuần sau khi gieo hạt, thân chính sẽ bắt đầu phát triển, tạo ra cụm hoa và sau đó là quả Hoa cấu tạo phía ngoài là bốn đài hoa, vòng xoắn bên trong có bốn cánh hoa màu trắng, sáu nhị hoa mang phấn hoa và một nhụy trung tâm có hai lá noãn hình thành nên

quả Arabidopsis là loài thực vật tự thụ phấn, cây trưởng thành đạt chiều cao 15-20

cm Rễ có cấu trúc đơn giản, không cộng sinh với các vi khuẩn cố định đạm, tạo điều kiện dễ dàng cho việc nghiên cứu môi trường tối ưu cho sinh trưởng [38,47]

1.1.3 Đặc điểm về di truyền

Arabidopsis là loài thực vật đầu tiên, và là sinh vật đa bào thứ ba sau Caenorhabditis elegans và Drosophila melanogaster hoàn toàn được giải trình tự

gen [15,55,56]

Hệ gen của Arabidopsis có kích thước 125 Mb mã hóa cho khoảng 26000

gen trên 5 nhiễm sắc thể [2] Theo một báo cáo khác của Hall và cộng sự [31] hệ

gen của Arabidopsis có kích thước khoảng 146 Mb mã hóa cho khoảng 25000 gen

Kể từ khi hệ thống giải trình tự gen Arabidopsis được hoàn thành và công bố năm

2000 thì trình tự các gen ngày càng được nghiên cứu mở rộng, được bổ sung và hoàn thiện Các vùng gen của hệ gen đã được giải trình tự và phân tích khoảng 119

Mb Trình tự hệ gen được phân tích bởi TIGR (The Institute for Genome Research) v5 analysis (http:// www.tigr Org/tdb/e2k1/ath1/ath1.shtml) [19,30].

Arabidopsis là loài thực vật có bộ gen nhỏ nhất, với ít trình tự lặp lại nhất so

với bất kỳ loài thực vật bậc cao nào được biết đến, tạo điều kiện cho rất nhiều

nghiên cứu phân tử dựa trên bản đồ tách dòng Ngoài ra, Arabidopsis có thể dễ dàng được chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, đó là điều kiện tiên quyết cho nhiều thí nghiệm di truyền phân tử [51] Arabidopsis được đề xuất làm

thực vật mô hình lần đầu tiên bởi Friedrich Laibach năm 1943 Mặc dù thực tế

Arabidopsis có rất nhiều đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền học nhưng đã

không lập tức được sử dụng phổ biến

1.1.4 Giá trị của cây Arabidopsis

Arabidopsis là thực vật mô hình rất hữu ích cho nghiên cứu di truyền học và

sinh học phân tử thực vật, bao gồm nghiên cứu bệnh lý học và sinh lý học, với nhiều hiểu biết từ đó có thể áp dụng trực tiếp cho cây trồng

Trong tất cả các loài thực vật có hoa, cây Arabidopsis được sử dụng nhiều

nhất làm đối tượng cho các nghiên cứu, hơn hẳn tất cả các loài khác từng được coi

là ứng cử viên đầy hứa hẹn để định hướng nghiên cứu thực vật trong tương lai Chỉ

riêng năm 2008, đã có hơn 3500 tài liệu có liên quan đến Arabidopsis được thêm vào cơ sở dữ liệu Pubmed So với năm 1979, chỉ có 7 công bố về Arabidopsis và 65

công bố cho tất cả các năm trước cộng lại Sự phát triển của việc nghiên cứu

Arabidopsis trong vòng 30 năm qua rất đáng chú ý, bổ ích, có tác dụng tạo nên một

bước tiến mới trong công nghệ sinh học thực vật [37] Việc nâng cao vai trò của di truyền học trong thời kỳ hội nhập cùng với sự sẵn có của các công cụ sinh học phân tử

đã dẫn đến việc các nhà thực vật học tập trung vào một sinh vật để phân tích chi tiết

Arabidopsis mã hóa cho các gen cùng nguồn gốc của hầu hết các protein

được các sinh vật nhân thật sử dụng để duy trì tính toàn vẹn của bộ gen [55]. Sự lựa

chọn nghiên cứu Arabidopsis đã mang lại và hứa hẹn sẽ mang đến những hiểu biết

mới thú vị

Arabidopsis có một số lượng đáng kể các đột biến đặc trưng, tuy nhiên việc

nghiên cứu tìm kiếm các đột biến mới cũng rất quan trọng Hạt giống Arabidopsis

rất nhỏ là tương đối nhạy cảm với các chất gây đột biến hóa học, do đó, việc tìm kiếm các đột biến thường xuyên được bắt đầu bằng cách gieo hàng ngàn hạt giống

xử lý với ethyl methane sulfonate (EMS) Đối với nhiều mục đích khác, hạt giống đơn giản là có thể trồng trên đất, 16 hạt với mỗi chậu 9 cm, hoặc 250 với mỗi mặt phẳng 25 cm x 50 cm, làm giảm nhu cầu về phương tiện vô trùng Để lựa chọn giống kháng thuốc hoặc thuốc diệt cỏ, hoặc để tạo thuận lợi cho sự hấp thu các hợp chất hóa sinh, hạt giống được trồng trên môi trường thạch vô trùng trong đĩa petri hoặc trong hộp nhựa cho phép sự phát triển nhiều hơn Lá mầm xuất hiện sau 3 ngày, và lá thật đầu tiên sau 6 ngày Tại thời điểm này, cây giống kháng thuốc cao 5mm, mọc lên từ khoảng 2000 hạt giống gieo trên mỗi đĩa 10 cm, có thể được xác

6

định và chuyển vào đất, hoặc tiếp tục xử lý với ánh sáng UV hoặc các tác nhân gây độc khác Tiếp tục phát triển thêm nhiều lá hơn, phát triển lá hiện có, ADN trong lá

sẽ tăng tuyến tính cho đến khoảng 20-25 ngày sau khi nảy mầm [24], và lúc đó mỗi cây sẽ nhanh chóng phát triển một thân chính, chiều cao lên đến 20cm, mà hoa và cuối cùng là vỏ hạt sẽ xuất hiện vào khoảng 28 ngày Sự tự thụ phấn là tự động, nhưng cũng có thể dễ dàng thực hiện nhờ tác nhân bên ngoài bằng cách chuyển phấn hoa cho nhụy hoa đã được loại bỏ bao phấn Thông thường, việc lai cận huyết

tự động lặp đi lặp lại sẽ làm cho mỗi dòng Arabidopsis hoàn toàn đồng hợp tử Chỉ

sau 6 tuần, có đến 5000 hạt giống được thu hoạch từ mỗi cây, và chu kì mới có thể được bắt đầu Sản lượng hạt giống cao làm cho nó có thể dùng để nhân dòng trong

lý thuyết mà khả năng sinh sản 99%, hầu như không giới hạn, hạt nhỏ có thể được lưu trữ trong các bình hút ẩm ở nhiệt độ lạnh nếu cần thiết Các đột biến ở thế hệ đầu tiên phát sinh từ hạt M1 hoặc từ đoạn chèn T-ADN (T1) là gen lặn và không có kiểu hình Lai Menden các đột biến có thể được quan sát thấy ở các thế hệ con cháu (M2 hoặc T2) Như vậy chỉ 8 tuần sau khi đột biến, một phần tư các thế hệ con cháu M2 phát sinh từ một hạt giống sản xuất đột biến mang tính chất đồng hợp tử về kiểu hình [32]

Arabidopsis có chu kì sống ngắn, kích thước cây nhỏ do đó hạn chế được

mức thấp nhất các yêu cầu về cơ sở vật chất và điều kiện sinh trưởng Ngoài ra cây

Arabidopsis còn có khả năng sản sinh nhiều hạt trong mỗi thế hệ Vì các tính năng

này mà ngay từ ban đầu Arabidopsis được xem là một sinh vật mô hình vì tính hữu

dụng của nó cho các thí nghiệm di truyền

Friedrich Laibach là một trong những người tiên phong nghiên cứu về

Arabidopsis, ông đã mô tả chính xác số lượng nhiễm sắc thể trong nghiên cứu tiến

sĩ của ông Năm 1943, trong một bài báo chuyên đề, Laibach đã cho thấy sự phù

hợp của Arabidopsis cho nghiên cứu di truyền học Ông và học trò cũng nhấn mạnh

việc sử dụng các đột biến tự nhiên để phân tích sinh lý của cây như thời gian ra hoa

và sự ngủ của hạt, ông cũng bắt đầu thí nghiệm xử lý Arabidopsis với X-rays

Arabidopsis đã được chọn làm thực vật mô hình đại diện cho khoảng

300.000 loài Các sinh vật đa bào lớn mà chúng ta thấy xung quanh rất phong phú

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1 Nguyễn Thị Lý Anh, Hồ Thị Thu Thanh, Nguyễn Thị Thanh Phương, Nguyễn

Tấn Hưng (2009), “Nghiên cứu nuôi cấy in-vitro cây hoa đào Nhật Tân (Prunus

persica L.)”, Tạp chí Khoa học và Phát triển, 7(4), tr.387-393

2 Lê Hồng Điệp, Ngô Thị Trang (2012), “Arabidopsis - thực vật mô hình cho các thực vật bậc cao”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công

nghệ, 28, tr.19-27

3 Phạm Thu Hằng, Nguyễn Duy Phương, Trần Lan Đài, Phan Tuấn Nghĩa, Phạm

Xuân Hội (2014), “Thiết kế vector biểu hiện mang gen OsNAC1 được điều khiển bởi promoter cảm ứng điều kiện bất lợi RD29A”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN:

Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 30, Số 4, tr.1-10

4 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter và

ứng dụng trong công nghệ gen thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5(1),

tr.1-18

5 Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010), “Tách dòng và đánh giá hoạt động của promoter cảm ứng

khô hạn RD29A từ Arabidopsis thaliana”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(4),

tr.1809-1814

6 Võ Thị Thương Lan (2011), Giáo trình Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo Dục Việt Nam

7 Trần Thị Lệ (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro hoa mắt mèo (Torenia

fournieri L.)”, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, số 57

8 Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, NXB Giáo Dục Việt Nam

9 Nguyễn Đình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Thị Vân Thùy, Huỳnh Hữu Đức (2008), “Nghiên cứu phương pháp khử trùng mầm chồi từ cây trưởng thành của

một số giống điều (Anacardium occidentale L.) cao sản”, Science & Technology

Development, 11(07)