Nghiên cứu định lượng paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= VŨ ANH PHƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO C

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS TẠ THỊ THẢO

2 TS HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và

TS Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2015

Học viên

Vũ Anh Phương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Tổng quan về paraquat Error! Bookmark not defined 1.1.1 Công thức paraquat Error! Bookmark not defined 1.1.2 Tính chất lý, hóa học của paraquat Error! Bookmark not defined 1.1.3 Cơ chế gây độc của paraquat Error! Bookmark not defined 1.1.4 Dược động học paraquat Error! Bookmark not defined 1.1.4.1 Hấp thu Error! Bookmark not defined 1.1.4.2 Phân bố Error! Bookmark not defined 1.1.4.3 Chuyển hoá, thải trừ Error! Bookmark not defined.

1.1.5 Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương

Error! Bookmark not defined 1.2 Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tươngError! Bookmark not defined.

1.2.1 Phương pháp quang phổ Error! Bookmark not defined 1.2.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ Error! Bookmark not defined 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Error! Bookmark not defined 1.2.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Error! Bookmark not defined 1.3 Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat Error! Bookmark not defined.

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined.

2.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2.1 Chất chuẩn Error! Bookmark not defined 2.2.2 Hoá chất Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ Error! Bookmark not defined.

2.3 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat.Error! Bookmark

not defined.

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu chuẩn Error! Bookmark not defined 2.3.1.2 Phương pháp tách PQ từ huyết tương Error! Bookmark not defined.

2.3.1.3 Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết

tương Error! Bookmark not defined 2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tươngError! Bookmark

not defined.

2.3.2.1 Tính chọn lọc Error! Bookmark not defined 2.3.2.2 Khoảng nồng độ tuyến tính Error! Bookmark not defined 2.3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượngError! Bookmark not defined.

2.3.2.4 Đánh giá độ đúng (độ thu hồi) và độ chụm (độ lặp lại) Error! Bookmark not defined.

2.3.2.5 Độ ổn định Error! Bookmark not defined.

2.3.3 Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên

lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ Error! Bookmark not defined.

2.3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.3.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc lý lỏng hiệu năng caoError! Bookmark not defined.

3.1.1 Xác định bước sóng phát hiện chất phân tích với detector DAD Error!

Bookmark not defined.

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thể tích mẫu tiêm vào cộtError! Bookmark not

defined.

3.1.3 Khảo sát lựa chọn loại pha động Error! Bookmark not defined 3.1.4 Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined.

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu Error!

Bookmark not defined.

3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng pH của pha động Error! Bookmark not defined.

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu Error!

Bookmark not defined.

3.1.6 Khảo sát thành phần dung dịch đệm Error! Bookmark not defined 3.1.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natriheptanesulfonate Error! Bookmark not defined.

3.1.6.2 Ảnh hưởng của nồng độ KCl Error! Bookmark not defined 3.1.6.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ PEGError! Bookmark not defined.

“-” là không xuất hiện pic PQ trên sắc đồ, chỉ chứa pic nền mẫu Error!

Bookmark not defined.

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng Error! Bookmark not defined.

3.1.8 Đường chuẩn, giớ i ha ̣n phát hiê ̣n và giới ha ̣n đi ̣nh lươ ̣ng Error!

Bookmark not defined.

3.1.8.1 Xây dựng đường chuẩn Error! Bookmark not defined 3.1.8.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượngError! Bookmark not defined.

3.1.8.3 Đánh giá phương trình đường chuẩn Error! Bookmark not defined 3.2 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch TCA Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát thời gian lắc xoáy Error! Bookmark not defined 3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích Error! Bookmark not defined 3.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp Error! Bookmark not defined.

3.3.1 Đánh giá đô ̣ cho ̣n lo ̣c Error! Bookmark not defined 3.3.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp Error! Bookmark not defined 3.3.2.1 Đánh giá độ thu hồi của phương phápError! Bookmark not defined.

3.3.2.2 Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tíchError! Bookmark not defined.

3.3.2 Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại Error! Bookmark not defined 3.3.2.1 Đánh giá độ lặp lại của thiết bị Error! Bookmark not defined.

3.3.2.2 Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phương

pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.3 Độ ổn định Error! Bookmark not defined.

Độ ổn định trong thời gian phân tích Error! Bookmark not defined.

3.4 Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng

bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụError! Bookmark not defined.

3.4.1 Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: Error! Bookmark not defined.

3.4.2 Nồng độ Paraquat huyết tương trong tiên lượng bệnh nhân và đánh giá

hiệu quả lọc máu hấp phụ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của tỉ lê ̣ pha đô ̣ng t ới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối

xứng pic Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3: Ảnh hưở ng của pH tới thời gian lưu, hệ số đối xứng pic Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ natriheptanesulfonate đ ến thời gian lưu, hệ số đối

xứng pic Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đ ến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ PEG đ ến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đ ến thời gian lưu và hệ số đối xứng pic

Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: Nồng độ và diện tích pic trung bình của PQError! Bookmark not defined.

Bảng 3.9: Giớ i ha ̣n phát hiê ̣n và giới ha ̣n đi ̣nh lương của PQError! Bookmark not defined.

Bảng 3.10: Kết quả so sánh giữa giá trị a với giá trị 0 của phương trình đường chuẩn PQ

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.11: Kết quả so sánh giữa b và b′ trong phương trình đường chuẩn của PQ

Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tương

Error! Bookmark not defined Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiếtError! Bookmark not defined.

Bảng 3.14: Kết quả xác định độ ổn định khác ngày Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.15: Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp phân tích PQ

Error! Bookmark not defined Bảng 3.16: Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyết tương thêm chuẩn Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.17: Các đại lượng thống kê Error! Bookmark not defined Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chấtError! Bookmark not defined.

Bảng 3.19: Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn của

3 kỹ thuật viên khác nhau Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.20: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến

hành bởi ba KTV khác nhau Error! Bookmark not defined Bảng 3.21: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.22: Kết quả xác đi ̣nh đô ̣ ổn đi ̣nh trong ngày Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.23: Thờ i gian từ lúc uống đến khi lấy mẫu xét nghiệmError! Bookmark not defined.

Bảng 3.24: Kết quả định lượng PQ trên 31 bệnh nhânError! Bookmark not defined.

Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tương sau lọc máu hấp phụ Error! Bookmark not defined.

DANH SÁCH HÌNH

Chương 1

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat Error! Bookmark not defined Hình 1.2 Cơ chế gây độc của paraquat [15] Error! Bookmark not defined.

Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tương (µg/ml), thời gian

sau uống, và khả năng sống Error! Bookmark not defined Chương 3

Hình 3.1: Phổ hấp thụ UV của PQ Error! Bookmark not defined.

Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ vớ i hê ̣ dung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trong

nước và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ vớ i hê ̣ dung môi B Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ vớ i hê ̣ dung môi C Error! Bookmark not defined.

Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lê ̣ pha đô ̣ng ACN : Đê ̣m %v/vError! Bookmark not defined.

Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của pH Error! Bookmark not defined.

Hình 3.8: Sắc đồ khảo sát nồng đô ̣ của natriheptanesulfonate trong đê ̣m pH 2,5

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.9: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của KCl trong pha động Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10: Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của PEG trong pha động Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Sắc đồ khảo sát tốc đô ̣ dòng Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Sắc ký đồ các nồng đô ̣ PQ khác nhau từ 0,02 – 10,00 µg/ml Error! Bookmark not defined.

Hình 3.13: Đường chuẩn PQ theo diện tích pic Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tươngError! Bookmark not defined.

Hình 3.15: Sắc ký đồ PQ trong huyết tương chuẩn áp du ̣ng quy trình xử lý mẫu

hình 3.14 Error! Bookmark not defined Hình 3.16: Độ chọn lọc PQ của phương pháp Error! Bookmark not defined Hình 3.17: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổiError! Bookmark not defined.

Hình 3.18: Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nghề nghiệpError! Bookmark not defined.

Hình 3.19: Kết quả bệnh nhân ngộ độc Paraquat Error! Bookmark not defined.

Hình 3.20: Kết quả định lượng nồng độ PQ khi vào viện ở bệnh nhân sống và tử vong

Error! Bookmark not defined Hình 3.21: Giá trị điểm SIPP ở bệnh nhân sống và tử vong.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.22: Thang điểm SIPP tiên lượng tử vong Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt

% RSD % Relative standard deviation % Độ lệch chuẩn tương đối

% RSDR % Reproducibility standard

deviation

% Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối

ACN Acetonitrile Acetonitril

AS Asymmetry factor Hệ số đối xứng pic

ATP Adenosin Triphophate Adenosin Triphophat

DAD diode-array detector detector mảng diode

EPQ Ethylparaquat Ethylparaquat

GC - MS Gas chromatography - Mass

spectroscopy Sắc ký khí khối phổ

HP Hemoperfusion Lọc máu hấp phụ

HPLC High performance liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC - MS Liquid Chromatography - Mass

Spectroscopy Sắc ký lỏng khối phổ LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

ppm Parts per million Phần triệu

R Relative coefficient Hệ số tương quan

ROC Receiver operating characteristics Đường cong ROC

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

Tên viết tắt Tên tiếng anh Tên Tiếng việt

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

SIPP Severity Index of Paraquat

Poisoning

Chỉ số độ nặng của ngộ độc Paraquat

TCA Trichloroacetic acid Acid Tricloacetic

tR Retention time Thời gian lưu

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Viê ̣t:

1 Nguyễn Thi ̣ Phương Khắc (2008), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của ngộ độc paraquat tại Trung tâm Chống độc , Bê ̣nh viê ̣n Bạch Mai ,

Luận án tốt nghiệp bác sĩ chuyên khoa 2 hồi sức cấp cứu Trường Đại học Y

Hà Nội

2 Vũ Mai Liên, Hà Trần Hưng (2011), Nhận xét tỉ lệ tử vong do ngộ độc paraquat và một số yếu tố liên quan tại Trung Tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai năm 2010-2011, Khóa luận tốt nghiệp bác sỹ đa khoa Trường Đại học Y

Hà Nội

3 Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, Bài giảng Đại học Khoa học

Tự Nhiên – ĐHQGHN

4 Đặng Thị Xuân , Nguyễn Thi ̣ Du ̣ (2007), Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng , cận lâm sàng và điều trị của ngộ độc paraquat , Kỷ yếu Hô ̣i thảo hồi sức cấp cứu

và chống độc toàn quốc năm, tr 128-133

Tiếng Anh:

5 Almeida RM, Yonamine M (2003), “Gas chromatographic-mass spectrometric method for the determination of the herbicides paraquat and diquat in plasma

and urine samples”, Journal of Chromatography 853, pp 260-264

6 Alvin CB, “Herbicide”, Medical Toxicology 239 (4), pp 1515-1527

7 Arys K, Van Bocxlaer J, Clauwaer K, et al (2000), “Quantitative determination of Paraquat in a fatal intoxication by HPLC-DAD following

chemical reduction with Sodium borohydride”, Jounal of Analytical Toxicology 24, pp 116-121

8 Baselt RC (2004), Disposition of toxic drugs and chemicals in man, 7th

edition Biomedical Publication, pp 844-846

9 Brunetto MR, Morales AR, Gallignani M et al (2003), “Determination of paraquat in human blood plasma using reversed-phase ion-pair

high-performance liquid chromatography with direct sample injection”, Talanta 59,

pp 913-921