Thực hành vi sinh vật nguyễn minh trí, nguyễn thị thanh hải

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Thực hành Vi sinh vật đại cương nhằm trang bị cho các bạn về một số kỹ năng cơ bản, giúp bước đầu tìm hiểu về thế giới vi sinh vật rộng lớn.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CHẾ BIẾN

BIÊN SOẠN

TS Nguyễn Minh Trí ThS Nguyễn Thị Thanh Hải

THỰC HÀNH

VI SINH VẬT THỰC PHẨM

Họ và tên SV:

MSSV:

Lớp:

Nhóm:

NHA TRANG 2010

MỤC LỤC

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 3

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT 5

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 10

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT 11

Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU 15

Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (TPC – Total Plate count) 17

Bài 7: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM, FECAL COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI .19

Bài 8: KIỂM TRA SALMONELLA TRONG MẪU THỰC PHẨM 21

Bài 9: KIỂM TRA VIBRIO TRONG MẪU THỰC PHẨM 23

Bài 10: KIỂM TRA STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM 25

Bài 11: KIỂM TRA LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM 27

Bài 12: PHÂN LẬP NẤM MỐC 28

Bài 13: PHÂN LẬP LACTOBACILLUS TRONG MẪU THỰC PHẨM 29

Bài 14: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP 30

PHỤ LỤC 32

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Thực hành Vi sinh vật đại cương nhằm trang bị cho các bạn về một số kỹ năng cơ bản, giúp bước đầu tìm hiểu về thế giới vi sinh vật rộng lớn Phần trình bày ở đây liên quan đến vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Chúng ta sẽ tìm hiểu về cả hai nhóm vi sinh vật có lợi và có hại

Để bắt tay vào nghiên cứu vi sinh cần phải học thao tác cấy đúng kỹ thuật để không gây tạp nhiễm ảnh hưởng đến thí nghiệm hay không gây phân tán vi sinh vật ra môi truờng xung quanh Việc này liên quan đến việc học các kỹ thuật vô trùng và thực hành phương tiện an toàn phòng thí nghiệm Bạn phải biết và thực hiện đúng các quy định trong phòng thí nghiệm

Lịch thí nghiệm:

Trước khi đến phòng thí nghiệm, bạn phải biết bài thí nghiệm sắp làm, phải chuẩn bị hiểu bài trước khi đến phòng thí nghiệm

Mỗi buổi thí nghiệm đều bắt đầu bằng phần trình bày và thảo luận các ý chính Do vậy,

điều quan trọng là không đến lớp trễ

THUẬT NGỮ

Một số thuật ngữ cần phân biệt:

Vô trùng là 1 quá trình mà tất cả các vi sinh vật sống bị phá huỷ Các vi sinh vật này bị

giết bởi hơi nóng áp lực hay ở nhiệt độ cao trong điều kiện khô, hay đốt thành tro Nếu chúng ta nói một vật vô trùng, chúng ta hiểu rằng vật đó hoàn toàn không có các vi sinh vật sống Nói chung khi nói đến sự vô trùng, ý nói đến sự an toàn phòng thí nghiệm, chủ yếu chúng ta nói đến

vô trùng bởi hơi nóng áp lực bằng autoclave Phương pháp khử trùng cơ bản là đốt cháy các tác nhân khử trùng hoặc đốt thành tro Tất cả các chất thải sinh học phải được đốt cháy kỹ trước khi thải bỏ

Khử trùng là quá trình trong đó các sinh vật không sinh bào tử, sinh dưỡng bị phá huỷ

Các tác nhân gây được quá trình này gọi là chất khử trùng hay chất giết khuẩn Các tác nhân như vậy chỉ được sử dụng cho các vật dụng do chúng độc với mô người và động vật

Nhiễm trùng được xác định khi có sự phát triển (nhân lên) của các vi sinh vật trong mô

của cơ thể Thuật ngữ vô trùng dùng để chỉ bất cứ quá trình nào mà ngăn cản sự xâm nhập của các tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, do vậy ngăn ngừa sự nhiễm trùng Các kỹ thuật vô

trùng chỉ những thao tác mà các nhà vi sinh vật học dùng để loại tất cả các vi sinh vật khỏi môi

trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc Các chất kháng khuẩn là các hoá chất (thường là các chất

khử khuẩn hoà tan) có thể sử dụng an toàn cho bên ngoài cơ thể nhằm phá huỷ hay ức chế các vi khuẩn sinh dưỡng

sát khuẩn Lau khô bằng giấy lau Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm, chúng ta phải rửa tay bằng xà phòng

- Khử trùng mặt bàn làm việc

Bắt đầu buổi làm việc phải lau bàn bằng chất diệt khuẩn quá trình này nhằm loại bụi bẩn

có trên mặt bàn, làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn các canh cấy mà chúng ta làm việc Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm, chúng ta phải tiến hành khử trùng lại để bảo vệ cho nhóm thực tập tiếp theo

- Sử dụng đèn cồn (đèn gas)

Trong phòng thí nghiệm vi sinh thường sử dụng đèn cồn để khử trùng vòng cấy của que cấy, miệng bình, miệng ống nghiệm Để khử trùng vòng cấy cần đốt cho đến khi nóng đỏ Để không giết chết vi sinh vật mà chúng ta muốn cấy chuyền, trước khi đưa vào canh cấy, cần để cho vòng cấy nguội xuống bằng cách giữ vòng cấy ở vùng vô trùng xung quanh ngọn lửa một thời gian

Để an toàn khi sử dụng đèn cồn, cần lưu ý không di chuyển đèn cồn khi đang cháy Không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, muốn tắt thì phải dùng nắp chụp đậy lại Không mồi lửa cho đèn cồn từ một đèn cồn đang cháy

- Pipette

Để chuyển canh cấy bằng pipette phải sử dụng thiết bị hút cơ học, Không sử dụng miệng

để hút

- Thải bỏ canh cấy

Các bình, ống nghiệm, hộp lồng nuôi cấy vi sinh vật trước khi thải bỏ, phải được hấp khử trùng (autoclave) để giết chết vi sinh vật

XỬ LÝ KHI LÀM ĐỔ CANH CẤY

Tất cả các trường hợp sự cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn Mặc dù đa số các vi sinh vật sử dụng trong các bài thực hành là không gây bệnh, nhưng có một số ít gây bệnh Do vậy, chúng ta phải xử lý tất cả các trường hợp sự cố làm đổ dịch cấy, phòng khi có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh Biện pháp xử lý:

- Tất cả áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải được đem autoclave

- Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ

- Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan ra xung quanh và không khí

- Dùng kẹp (loại có thể hấp tiệt trùng được) gắp giấy, vải lau bỏ vào dụng cụ chứa đựng đem autoclave (autoclave cả kẹp gắp)

(Tương tự, đối với hoá chất gây nguy hiểm đến người như gây kích ứng cơ thể, gây tổn thương da hay gây ung thư phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn để có biện pháp xử lý thích hợp)

MỘT SỐ QUY ĐỊNH QUAN TRỌNG KHÁC

1 Không được đem canh cấy vi sinh, hoá chất, dụng cụ ra khỏi phòng thí nghiệm trừ khi bạn được phép của giáo viên hướng dẫn

2 Không hút thuốc, ăn uống trong phòng thí nghiệm

3 Không đưa tay lên sờ miệng

4 Dọn dẹp, lau chùi sau khi làm việc Lam kính, lá kính sau nhuộm soi cần rửa, làm khô và

để đúng nơi quy định

5 Các dụng cụ, lọ hoá chất sau khi dùng xong phải để đúng nơi quy định

6 Khi làm việc với các dụng cụ cần cẩn thận, nhất là đối với kính hiển vi Khi không hiểu vận hành như thế nào, bạn phải hỏi người phụ trách

7 Hợp tác, làm việc cùng sinh viên khác trong nhóm, nhưng phải tự mình phân tích kết quả thí nghiệm

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT

1 KÍNH HIỂN VI:

Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi, một số loại được dùng phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh vật: kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, và huỳnh quang; trong bài này chỉ trình bày kính hiển vi trường sáng Nếu trước đây bạn đã tìm hiểu về kính hiển

vi, thì bài này sẽ không có nhiều thông tin cung cấp cho bạn; tuy nhiên nếu đây là lần đầu tiên tìm hiểu về vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng đúng kính hiển vi

Kính hiển vi là dụng cụ cần được chăm sóc đặc biệt để tránh hư hỏng hệ thống quang học

và cơ học Thực tế kính hiển vi được nhiều người sử dụng và di chuyển nhiều dẫn đến dễ hư hỏng kính so với chỉ do 1 người sử dụng Bạn cần thực hiện đúng các chỉ dẫn khi sử dụng kính

2 PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN:

b/ Phương pháp làm tiêu bản cố định

Hình 1: Phương pháp làm tiêu bản giọt treo

Hình 2: Phương pháp làm tiêu bản cố định

Hình 3: Làm tiêu bản cố định từ môi trường lỏng và môi trường rắn

Nhuộm đơn:

Nhuộm Gram

Hình 4: Phương pháp nhuộm đơn

Hình 5: Phương pháp nhuộm Gram

BÁO CÁO KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

1 Vẽ hình dạng tế bào nấm men đã quan sát được

2 Nêu thao tác chăm sóc kính hiển vi?

3 Lý do dùng dầu soi kính?

Hình 6: Một số hình ảnh các kiểu nhuộm quan sát tế bào vi khuẩn

4 Vẽ hình dạng một số vi khuẩn lactic quan sát được: : 5 Vi khuẩn Gram dương có màu gì nếu bước nhuộm iodine bị bỏ quên trong thao tác nhuộm Gram?

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

CHUẨN BỊ DỤNG CỤ:

1 Bao gói dụng cụ

a/ Nguyên tắc

- Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo sạch và khô

- Bao gói phải kín và cẩn thận để sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng của dụng cụ trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng

b/ Phương pháp bao gói dụng cụ: Hướng dẫn cụ thể

2 Các phương pháp vô trùng dụng cụ

a/ Nguyên tắc

- Sau khi vô trùng cần đảm bảo:

+ Sự vô trùng tuyệt đối cho dụng cụ và vật phẩm + Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật

- Bảo đảm an toàn tuyệt đối cho con người

Khi khử trùng bằng nhiệt, các tế bào sinh dưỡng của VSV bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào

tử vẫn còn tồn tại ở ngay nhiệt độ đó

Khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào:

- Tính chất môi trường

- Số lượng tế bào

- Độ pH của vật cần khử trùng

Do vậy để khử trùng bằng nhiệt hiệu quả cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ VSV và bào tử của chúng có trong dụng cụ cần khử trùng

b/ Phương pháp vô trùng dụng cụ: Hướng dẫn cụ thể

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Hầu hết các thí nghiệm vi sinh đều cần sử dụng các môi trường cho qua trình nuôi cấy vi khuẩn Thông thường các thí nghiệm sử dụng môi trường khô đã được chuẩn bị sẵn Tuy nhiên,

có thể trong một số trường hợp bạn cần một vài môi trường đặc biệt mà đã không được chuẩn bị sẵn, các bạn trong nhóm phải cùng nhau chuẩn bị

BÁO CÁO KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

1 Tại sao phải sấy dụng cụ và hấp thanh trùng môi trường? Kiểm tra kết quả khử trùng bằng cách

để môi trường vào tủ ấm 37oC từ 24-48h để xác định có khuẩn lạc mọc không? Nếu có, hãy giải thích nguyên nhân của hiện tượng này

2 Trình bày các nguyên tắc cơ bản của việc pha môi trường dinh dưỡng? Các bước pha môi trường dinh dưỡng?

.

3 Đưa ra 2 lý do giải thích tại sao agar là thành phần tốt để tạo đông cho môi trường rắn?

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT

1 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG:

Các thủ tục hướng dẫn chi tiết đảm bảo việc duy trì một môi trường vô trùng khi thao tác cấy vi sinh vật Cấy chuyển vô trùng từ canh cấy này sang canh cấy khác thành công khi không lây nhiễm vi sinh vật trong quá trình Quá trình cấy chuyển có thể từ khuẩn lạc trên hộp lồng sang ống nghiệm chứa canh trường hoặc cấy chuyển từ canh trường nuôi cấy sang nhiều loại môi trường (rắn hoặc lỏng) cho nhiều loại xét nghiệm

Trang thiết bị:

Thao tác chung:

Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:

Hình 7: Các bước thực hiện lấy vi sinh vật từ ống canh thang

Hình 8: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ đĩa thạch

Hình 9: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ ống thạch nghiêng

2 PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG MẪU

Hình 21: Cách pha loãng mẫu

Hình 10: Phương pháp pha loãng mẫu

Hình 11: Các cách cấy phân lập khác nhau trên đĩa thạch

Hình 12: Phương pháp phân lập vi khuẩn bằng que cấy vòng

BÁO CÁO KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT

1 Một đĩa cấy trang/ cấy trộn/ cấy ria như thế nào là đạt yêu cầu?

2 Mục đích của phương pháp cấy trang, cấy trộn và cấy ria?

3 Ưu nhược điểm của phương pháp cấy trộn và cấy trang?

4 Dạng vi sinh vật nào bị tiêu diệt khi bàn làm việc được khử trùng bởi chất diệt khuẩn?

5 Tại sao phải hơ nóng miệng ống nghiệm trước và sau khi thực hiện thao tác cấy?

6 Những chú ý khi thực hiện thao tác pha loãng mẫu?

Bài 5: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU

Lượng mẫu và điều kiện lấy mẫu đem kiểm tra đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá các chỉ tiêu vi sinh của một lô thực phẩm Nếu mẫu lấy không thích hợp và xử lý không đúng hoặc không đại diện cho lô thực phẩm, kết quả thí nghiệm sẽ trở nên vô nghĩa Do một lô hàng thực phẩm lớn đem phân phối dựa trên kết quả thí nghiệm trên một mẫu tương đối nhỏ so với cả

lô, nên cần phải dựa vào các thủ tục lấy mẫu theo quy định Cần có một mẫu đại diện do tác nhân gây bệnh hoặc độc tố phân bố rải rác trong thực phẩm hoặc tuỳ theo sự sắp xếp thực phẩm khi vận chuyển theo đường biển phụ thuộc vào lượng VK có trong TP so với tiêu chuẩn cho phép Một số điểm cần lưu ý:

1 Lấy mẫu:

- Số lượng mẫu lấy đại diện cho lô hàng thực phẩm cần kiểm tra Nếu có thể thu nhận tối thiểu 100g cho mỗi đơn vị mẫu

- Mẫu gởi đến PTN cần giữ nguyên trạng thái ban đầu, không mở bao bì đóng gói

- Các dụng cụ lấy mẫu cần được vô trùng trong nồi hấp hoặc tủ sấy Không nên sử dụng cồn đốt có thể gây nguy hiểm và không đủ để vô trùng dụng cụ

- Thùng chứa mẫu phải khô sạch, không rò rỉ Cần dán nhãn mẫu rõ ràng, chính xác

- Chuyển mẫu tới PTN ngay và duy trì các điều kiện bảo quản gần giống mẫu ban đầu Ghi lại thời gian lấy mẫu và nhận mẫu tại PTN Đối với mẫu đông lạnh cần làm lạnh trước thùng đựng mẫu Các mẫu đông cần giữ trong trạng thái đông cứng liên tục Các mẫu bảo quản lạnh cần giữ trong đá ở 0 – 40C cho đến khi về đến PTN

- Cần phân tích mẫu bảo quản lạnh trước 36h kể từ khi lấy mẫu Đối với động vật thân mềm và giáp xác cần phân tích mẫu trong vòng 6h kể từ khi lấy mẫu, không được quá 24h

2 Nhận mẫu:

Mẫu chính thức được người kiểm tra nhận Mẫu nếu không được phân tích ngay thì cần được bảo quản như sau:

- Kiểm tra kỹ bao bì mẫu xem có bị rách hay rạn vỡ gây nhiễm chéo không, nếu có không

sử dụng mẫu này cho việc kiểm tra

- Dán nhãn và ghi chép: Ghi số mẫu, tên mẫu, ngày lấy mẫu

- Bảo quản mẫu: Nên kiểm tra mẫu ngay sau khi nhận mẫu Tuy nhiên nếu không phân tích ngay, phải bảo quản đông lạnh mẫu ở -200C cho tho tới khi kiểm tra Làm lạnh không đông các mẫu dễ hư hỏng ở 0 – 40C không quá 36 giờ Bảo quản các thực phẩm khó hư hỏng, thực phẩm đóng hộp hoặc có độ ẩm thấp ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích

- Nếu các mẫu thực phẩm không đủ tiêu chuẩn thông báo cho nơi lấy mẫu để lấy mẫu khác đúng quy định, tránh lặp lại sai sót

3 Tan giá mẫu: Trước khi xử lý hoặc phân tích mẫu, cần làm sạch vùng làm việc bằng kỹ

thuật vô trùng Tan giá được thực hiện ngay trong túi chứa đựng ban đầu, tránh di chuyển mẫu sang túi chứa đựng thứ hai Thông thường tan giá ở nhiệt độ 2–50C trong 18 giờ Nếu muốn tan giá nhanh có thể tan giá ở nhiệt độ dưới 450C không quá 15 phút Khi tan giá ở nhiệt độ cao cần lắc mẫu liên tục để kiểm soát nhiệt độ

4 Đồng nhất mẫu: Mẫu cần đồng nhất để vi sinh vật phân bố đều trong mẫu Lắc kỹ mẫu

lỏng, trộn mẫu khô bằng muỗng vô trùng Nếu thực phẩm đem đóng gói không đồng đều (ví dụ:

một bữa ăn đông lạnh), tùy mục đích kiểm tra, phân tích riêng từng loại thực phẩm khác nhau

5 Cân: Cân vô trùng chính xác (±0,1g) lượng mẫu chưa rã đông Nếu lượng mẫu nhỏ hơn

so với yêu cầu, lấy phần khối lượng tương đương nửa mẫu và điều chỉnh lượng dịch pha loãng cho phù hợp Xác định TPC hoặc coliform dùng 50g mẫu Nên dùng cỡ đơn vị phân tích và dung tích phù hợp theo quy trình sẽ nêu

6 Xay và pha loãng mẫu dùng để đếm ví sinh vật: Thêm 450ml dung dịch đệm

phosphate vào 50g mẫu và đồng nhất trong 2 phút Kết quả được độ pha loãng 10-1 Tiếp tục pha loãng với các pipet thích hợp Tiếp tục pha loãng đến các độ pha loãng khác nhau Thời gian pha loãng mẫu không quá 15 phút

Bài 6: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ

(TPC – Total Plate count)

Quy trình tóm tắt định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí

Chuẩn bị mẫu: Cân 50g mẫu + 450ml dung dịch đệm phosphate

Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2 ,10-3 , 10-4…

Chọn 3 nồng độ pha loãng phù hợp liên tiếp nhau

Chuyển 1ml mẫu vào đĩa Petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội 45 -500C Lắc cho mẫu phân tán đều trong môi trường

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 -250 khuẩn lạc/ đĩa

Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4…

Chọn 3 nồng độ pha loãng phù hợp liên tiếp nhau

Chuyển 1ml mẫu vào đĩa Petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa)

Rót vào đĩa môi trường PCA đã được làm nguội 45 - 500C

Lắc cho mẫu phân tán đều trong môi trường

Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25 -250 khuẩn lạc/ đĩa

để đếm

Ủ ở 350C / 24 -48 giờ

Tính kết quả tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu

(CFU/ g; CFU/ ml)