GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Lê Quốc Thịnh*, Trương Hữu Khanh*, TÓM TẮT Mục tiêu:
Trang 1GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT
TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG
Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Lê Quốc Thịnh*, Trương Hữu Khanh*,
TÓM TẮT
Mục tiêu: 1) So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước
(PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT); 2) Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM; 3) Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng
Phương pháp: Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR và Real-time RT-PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh
phẩm như phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy ở bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bệnh tay chân miệng, theo qui trình chuẩn và đoạn mồi do Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Đài Loan – Trung Quốc cung cấp
Kết quả: Phản ứng có độ lập lại tốt và độ chính xác cao Mật độ vi rút trong bệnh phẩm có tương quan
tuyến tính nằm trong giới hạn từ 10 2 -10 5 copies/ml Trong các loại bệnh phẩm, mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất (84,5%), kế đến là phết trực tràng (55,2%) và dịch não tủy (40,2%) Phân tích giá trị trung bình của mật độ vi rút trong các mẫu phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 nhóm có và không có biến chứng Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo các mốc thời gian trong năm có liên quan không
rõ với cao điểm của BTCM trong năm và không tương quan với tỉ lệ biến chứng
Kết luận: Qui trình chẩn đoán EV71 3 bước đã thiết lập có khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ
tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh phẩm phết họng Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có thể áp dụng thường qui trên lâm sàng Chưa thấy mối tương quan rõ giữa NĐVR với khả năng gây biến chứng của EV71 và chưa xác định được sự tương quan giữa sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV với những cao điểm của BTCM
Từ khóa: enterovirus 71, bệnh tay chân miệng, Real-time RT-PCR
ABSTRACT
THE VALUE OF SPECIMENS AND VIRAL LOAD IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF
HAND-FOOT-MOUTH DISEASE
Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Le Quoc Thinh, Truong Huu Khanh,
Do Van Niem, Le Anh Tuan, Nguyen Thi Ngoc Dung, Nguyen Ngoc Hanh
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 3 - 2011: 94 - 101
Study objectives: 1) Determine EV and EV71- positive rates in various specimens: pharyngeal swab,
vesicle swab, rectal swab abd cerebrospinal fluid; 2) Determine the correlation between EV71 infection and HFMD outbreak based on the the increased proportion of EV71 infections among all EV infections; 3) Analyze the correlation between virus load and the occurance of complications
Method: Detection EV71-RNA directed from clinical samples as pharyngeal swab, rectal swab and CSF in
patients with HFMD by RT-PCR and Real-time RT-PCR, following standard protocol and primer of Taiwan National Health Research Institute
* Bệnh viện Nhi Đồng 1
Trang 2Results: the test has been proved with good iterativeness and high accuracy Virus load has linear correlation
in range 10 2 -10 5 copies/ml The means of virus load in pharyngeal swab, rectal swab and CSF are not statistically different between non-complication and complicated group The increase of EV71 infection proportion among all
EV infections by time is unclearly related with HFMD outbreaks annually and not related with the occurance of complications
Conclusions: the three-step diagnosis process for EV71 has been proved valid to detect EV and EV71
infections with the positive rate of 84.5% and 36.7% respectively in pharyngeal swab Pharyngeal swab is the specimen with highest positive rate and easy to take so it is applicable routinely in clinical setting The correlation between virus load and EV71-induced complications is not clear and it is the same with the correlation between the increase of EV71 infections among all EV infections with the outbreak of HFMD
Key words: enterovirus 71, hand-foot-mouth disease, Real-time RT-PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Enteroviruses (EVs) là một giống thuộc họ
Picornaviridae Đây là những vi rút có một
chuỗi đơn RNA chia thành 68 týp huyết thanh,
gồm các nhóm echoviruses, coxsackie virus,
polioviruses, và các enterovirus (EV) từ týp
huyết thanh 68 đến 71(3) Trong đó coxackie A16
(CA16) và enterovirus 71 (EV71) là hai tác nhân
chính gây bệnh tay chân miệng (BTCM) ở trẻ
em(5,7)
BTCM do EV71 có thể gây biến chứng nguy
hiểm như viêm thân não, viêm cơ tim, phù phổi
cấp; diễn tiến bệnh nặng rất nhanh và tử vong
cao Từ năm 2002 – 2003, tại Bệnh Viện Nhi
Đồng 1 (BVNĐ1) đã phát hiện nhiều ca viêm
não tối cấp, gây tử vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn
3 tuổi có liên quan đến BTCM(13,4).Qua nghiên
cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur TP
Hồ Chí Minh (TP.HCM), lần đầu tiên đã phân
lập được EV71 trong phân trẻ BTCM có biến
chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng
8 năm 2003(4) Số ca mắc BTCM gia tăng hàng
năm, với trên vài nghìn trường hợp nhập viện
mỗi năm Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối
hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP.HCM năm
2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định
được 2 tác nhân chính là CA16 và EV71, trong
đó EV71 chiếm tỉ lệ 46%(9)
Phương pháp nuôi cấy vi rút cần 1-2 tuần để
thực hiện, với chi phí cao nên chỉ thực hiện
trong nghiên cứu và ít có giá trị ứng dụng trên
lâm sàng, khả năng dự báo dịch chậm Những
nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chẩn
đoán với độ chính xác cao của phương pháp khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reation: PCR) trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm khi
so sánh với phương pháp nuôi cấy(1,8,10,11,12) Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chẩn đoán của phương pháp PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đoán nhanh góp phần dự báo dịch và xác định mối tương quan giữa nồng độ vi rút với biến chứng
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT)
Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM
Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bệnh phẩm
Các mẫu bệnh phẩm DNT, phết họng, PTT lấy ở ngày thứ 2-4 của bệnh, được tách chiết theo qui trình, lưu giữ ở nhiệt độ âm 70OC cho tới khi thực hiện phản ứng
Hệ thống chuẩn và chứng dương
Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan-Trung Quốc (National Health Research Institute: NHRI) cung cấp dưới dạng dung dịch có nồng
Trang 3độ 1010 copies/ml Dùng chuẩn này pha loãng
thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng
EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng
Revere transcriptase PCR (RT-PCR) định tính
Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có
phản ứng PCR dương tính mạnh với EV (băng
điện di sáng và rõ nét) trộn lẫn với nhau
(khoảng 5ml) và bảo quản ở -70oC Sau đó ly
trích RNA-EV trong bệnh phẩm theo phương
pháp Boom (QIAmpMinElute Virus Kit), phân
chia RNA đã ly trích được thành nhiều tube 30
l, lưu giữ ở -70oC Lấy một tube chạy
RealTime-PCR với chứng gốc pha loãng và tìm được nồng
độ của mẫu chuẩn Pha loãng các mẫu chuẩn và
chọn các độ pha loãng có nồng độ tương ứng từ
102 đến 107 copies/ml làm các nồng độ chuẩn để
thực hiện gam chuẩn và chứng dương cho phản
ứng Realtime-PCR
Ly trích EVs-RNA
Dựa trên nguyên tắc trong điều kiện biến
tính cao khi nhiệt độ được nâng lên, dưới tác
động của QIAGEN Protease và dung dịch đệm
AL cùng với sự bất hoạt của men RNAse sẽ làm
màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích
RNA Các RNA sẽ gắn kết tối đa vào màng silica
khi cho thêm ethanol vào phản ứng Các protein
và các chất khác (làm ức chế các phản ứng men
trong chuỗi phản ứng PCR) không bám được
trên màng silica và sẽ bị loại bỏ sau khi rửa và ly
tâm hai lần Cuối cùng RNA tinh sạch sẽ được
thu giữ bằng dung dịch đệm thích hợp
Cách thực hiện
Cho vào 1 tube Eppendorf nắp khóa 1,5ml:
200 l bệnh phẩm, 25 l Protease, 200 l dung
dịch đệm AL (chứa RNA carrier) Vortex kỹ
trong 15 giây, sau đó ủ ở 56OC trong 15 phút Ly
tâm nhẹ, cho thêm vào 250 l ethanol nồng độ
từ 96-100% Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở
nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút Ly tâm
nhẹ, chuyển tất cả dung dịch vào MinElute
Column (QIAgen), ly tâm 8.000 rpm trong 1
phút Chuyển qua tube thứ 2, cho thêm vào 500
l AW1, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút Chuyển
qua tube thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm
8.000 rpm trong 1 phút Chuyển qua tube thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%), ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút Chuyển qua tube thứ 5,
ly tâm 14.000 rpm trong 3 phút Sau đó chuyển MinElute Column qua một tube Eppendorf 1.5ml mới, mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút Thêm 30 l AE (nước cất không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút Sau đó ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào tube Eppendorf 1.5ml mới Dùng 10 l dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR
Chứng âm
Sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng
âm ly trích và dung dịch TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR
Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng
kỹ thuật RT-PCR
Hai cặp mồi đặc hiệu cho EV (EV-F và EV-R)
và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu cụ thể như sau:
EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3' EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3'
5'-GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3'
5'-GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3'
Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc thử One-Step RT-PCT (Qiagen, USA) Phương pháp khuếch đại định tính EV được thực hiện trong những tube PCR 0.2ml với thể tích dung dịch 25µl chứa 5µl MgCl2, 1µl EV-R, 1µl EV-F, 1µl enzymes, 5µl RNA ly trích Phản ứng RT-PCR sẽ được thực hiện trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như sau
50oC/30 giây trong một chu kỳ, 95oC/5 phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với
Trang 494oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/01 phút; và cuối
cùng là 72oC/10 phút trong một chu kỳ Sản
phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới
ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5%
được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE Các
mẫu dương tính sẽ được thực hiện tiếp phản
ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 và
R-primer 2036 trên máy luân nhiệt Genius (Techne,
England) với trình tự các bước như sau 50oC/30
giây trong một chu kỳ, 95oC/5phút trong một
chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với 94oC/30 giây,
50oC/30 giây, 72oC/01 phút; và cuối cùng là
72oC/10 phút trong một chu kỳ Tương tự như
trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan
sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch
1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X
TBE Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều
chạy kèm theo một chứng dương và hai chứng
âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm
phản ứng PCR)
Định lượng EV71-RNA bằng kỹ thuật
REAL-TIME PCR với đoạn dò TAQMAN
Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích
trên máy LightCyler (Roche Diagnostics) Bộ
thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit
Hybprobe (Roche Diagnostics) đã được sử dụng
trong phản ứng này Đây là bộ thuốc thử cho
phép sử dụng một bước Realtime-PCR trên ống
mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl2, 0.5µl EV-F,
0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl
enzymes, 2 µl RNA ly trích Phản ứng
Realtime-PCR được thực hiện với các bước sau: 55oC/20
phút trong một chu kỳ, 95oC/30 giây trong một
chu kỳ; tiếp theo là 45 chu kỳ với 95oC/5 giây,
57oC/15 giây, 72oC/6 giây; và cuối cùng là
40oC/30 giây trong một chu kỳ Để tiêu chuẩn
hóa phản ứng, mỗi lần thực hiện Realtime-PCR
EV71 đều kèm theo bốn nồng độ chuẩn có nồng
độ từ 102 đến 105 cùng một chứng âm là TE1X
Phân tích dữ liệu nhờ vào phần mềm của hệ
thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics)
Dữ liệu được thu nhận ở giai đoạn bắt cặp và
kéo dài (57oC) của mỗi chu kỳ; và chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) của các mẫu thử được xác định tại điểm mà ánh sáng huỳnh quang phát ra vượt quá giới hạn nền Đường cong chuẩn được vẽ tự động dựa vào các giá trị Ct của mỗi một nồng độ chuẩn đã biết Hệ số tương quan của mỗi lần chạy Realtime-PCR phải đạt trên 0.98 và hiệu suất PCR từ 90 đến 100% Số bản copies của RNA trong mẫu thử được tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chuẩn hóa qui trình xét nghiệm Real-time RT-PCR
Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản ứng Real-time PCR đã được nghiên cứu chứng minh về
độ nhạy cảm và độ đặc hiệu Chúng tôi chỉ áp dụng qui trình được chuyển giao từ NHRI nên không cần thiết lập lại các bước xác định độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của phản ứng, mà chỉ thực hiện chuẩn hóa xét nghiệm trong điều kiện
cụ thể của phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc xác định độ lập lại của kết quả xét nghiệm
và mức độ biến thiên
Với hệ thống mẫu chuẩn được thiết kế dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thực hiện phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ EV-RNA từ 102
copies cho tới 105 copies/phản ứng
Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha
loãng có nồng độ từ 10 2 copies cho tới 10 5 copies/phản
Trang 5ứng trong phản ứng Realtime-PCR với Taqman
probes trong định lượng EV-RNA
Hình 2: Đường cong chuẩn của Real-Time PCR với
Taqman Probes định lượng EV-RNA
Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa
trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường cong
chuẩn cho phản ứng Kết quả (hình 2) cho thấy
đường cong chuẩn của phản ứng có tương quan
tuyến tính khi nồng độ EV-RNA của mẫu chuẩn
nằm trong giới hạn từ 102 đến 105 copies/ml
Bảng 1: Độ lập lại của Ct ứng với các nồng độ chuẩn
trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng
Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71
Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn với
FAM-490 (Ct)
Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng
Real-time PCR thực hiện tại phòng thí nghiệm
BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của
kết quả phản ứng cho một mẫu chuẩn được
thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác
nhau trong cùng một lần chạy phản ứng, cũng
như những lần thực hiện phản ứng khác nhau
Bảng 1 và 2 trình bày độ lập lại của kết quả
xét nghiệm trên gam chuẩn có nồng độ vi rút thay đổi từ 102 đến 105 copies/ml
Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau
Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản ứng của
phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71
Mẫu
số
EV71-RNA (Copies/ml)
(%)
Lần 1: 2,4 x 10 5 Lần 2: 2,4 x 10 5 Lần 3: 2,6 x 10 5
1
Lần 4: 2,3 x 10 5
2,42 x 10 5 0,11 4,5
Lân1: 8,9 x 10 3 Lần 2: 8,9 x 10 3 Lần 3: 8,9 x 10 3
2
Lần 4: 8,4 x 10 3
8,77 x 10 3 0,22 2,5
Lần 1: 7,4 x 10 7 Lần 2: 7,9 x 10 7 Lần 3: 7,4 x 10 7
3
Lần 4: 8,4 x 10 7
7,77 x 10 7 0,41 5,2
Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác nhau của
phản ứng Real-Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71
(copies/ml)/ngày
(%)
N1: 2,42 x 10 5 N2: 2,7 x 10 5
1
N3: 2,8 x 10 5
2,64 x 10 5 0,16 6,1
N1: 8,77 x 10 3 N2: 8,3 x 10 3
2
N3: 8, 1 x 10 3
8,39 x 10 3 0,28 3,34
N1: 7,77 x 10 7 N2: 8,1 x 10 7
3
N3: 7,5 x 10 7
7,79 x 10 7 0,25 3,1
Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu lập lại 4 lần trong cùng một lần chạy phản ứng real-time PCR, và chạy như vậy trong 3 lần khác nhau Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng
Trang 6độ của mẫu mỗi lần lập lại trong một lần phản
ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau
Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của cùng một mẫu
trong cùng một plate
Hình 4:Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong
các mẫu thử khi thực hiện Realtime-PCR Taqman
Probes
Phản ứng Real-time RT-PCR được xem là
chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của
phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71 Phản
ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có
độ chính xác tốt bắt buộc phải dương tính nếu
phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương
tính với EV71 và ngược lại Để nghiên cứu độ
chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman
Probes phát hiện EV71, chúng tôi thực hiện
phản ứng định lượng này trên 100 mẫu bệnh
phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính và 10
mẫu âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp
RT-PCR Có 10 mẫu lập lại với 5 mẫu dương và
5 mẫu âm tính Kết quả của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng RT-PCR Các mẫu dương lặp lại đều có chu kỳ ngưỡng gần giống nhau với hệ số biến thiên < 5% và mẫu âm thì đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện
Kết quả của các mẫu lâm sàng cũng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5)
Hình 5: Đường cong chuẩn của Realtime-PCR
Taqman Probe định lượng EV71-RNA
Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với ưu điểm
sử dụng các mồi đặc hiệu và đoạn dò đặc hiệu giúp tạo ra các sản phẩm đặc hiệu sẽ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng Chu kỳ ngưỡng được ghi nhận khi mà tín hiệu huỳnh quang của mẫu phát ra cao hơn tín hiệu nền Dựa trên chu
kỳ ngưỡng của các chất chuẩn và số bản sao của các chuẩn đã biết mà từ đó người ta có thể định lượng được số bản sao RNA có trong mẫu bệnh phẩm(6,8,12)
Hệ thống mẫu chuẩn được chúng tôi sử dụng dựa trên chuẩn gốc do NHRI cung cấp, từ
đó chúng tôi có gam chuẩn với nồng độ từ 102
copies cho tới 107 copies/phản ứng Khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tôi có kết quả phản ứng với hệ số tương quan là 1, độ cong là -3,478, hiệu suất PCR là 93,9 và phương trình Y= -3,478X + 44,151 Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct của các chuẩn này ổn định trong các lần chạy định lượng khác nhau (CV< 10%) (bảng
Trang 71), cho thấy mức độ ổn định của định lượng
EV71 bằng Taqman Probes Ngoài ra với 4 nồng
độ này cách nhau 10 độ pha loãng thì chu kỳ
ngưỡng của chúng đi từ chuẩn có nồng độ cao
nhất cho đến nồng độ kế tiếp cách nhau 3, 3 cho
đến 3,7 Điều này nói lên tính chất tuyến tính
của phản ứng
Về độ lập lại của phản ứng Realtime-PCR
Taqman Probes, kết quả các số liệu trong bảng 2
cho thấy các giá trị số lượng bản sao của các
mẫu mỗi lần lặp lại trong một lần phản ứng và
trong các lần chạy phản ứng khác nhau có hệ số
biến thiên CV<10%, chứng tỏ không có sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê trong một lần chạy và
giữa các lần chạy khác nhau, điều đó cho thấy
phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định
lượng EV71-RNA có tính đồng nhất, không thay
đổi trong các tube phản ứng khác nhau có cùng
nồng độ mẫu thử
Về độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR
Taqman Probes, khi tiến hành thử nghiệm trên
90 mẫu phết họng dương tính và 10 mẫu phết
họng âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp
RT-PCR, chúng tôi thu được các kết quả của
những lần chạy Realtime-PCR này với hệ số
tương quan và hiệu quả cũng như các Ct của các
nồng độ chuẩn tương đối ổn định so với nghiên
cứu ban đầu Các mẫu phết họng dương tính có
Ct chạy từ 20 đến 40, với các mẫu có Ct xuất
hiện sớm (trước chu kỳ 15), chúng tôi sẽ tiến
hành pha loãng mẫu EV-RNA đã được ly trích,
sau đó kết quả sẽ nhân với hệ số pha loãng Các
chứng âm và mẫu âm có đường biểu diễn nằm
dưới ngưỡng phát hiện phù hợp với kết quả âm
tính với EV bằng phương pháp RT-PCR
Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu
bệnh phẩm
Sau 12 tháng chúng tôi đã chọn được 449
bệnh nhân vào khảo sát Tất cả các bệnh nhân
được lấy ít nhất 1 mẫu bệnh phẩm bao gồm phết
họng, PBN, PTT, và DNT khi có biến chứng thần
kinh Tỉ lệ dương tính của các mẫu bệnh phẩm
đối với EV và EV71 trình bày trong bảng 5
Mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất
với EV cao nhất khi so sánh với mẫu phết trực tràng và dịch não tủy
Bảng 5: Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu
bệnh phẩm
Dương tính EV Dương tính EV71
Phết trực tràng 415 229/415 55,2 69/229 30,1
Những mẫu có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 sẽ được thử nghiệm Real-time RT-PCR để xác định NĐVR Phân tích trị số trung bình của NĐVR giữa hai nhóm có và không có biến chứng bằng phép kiểm T dành cho 2 mẫu độc lập Trong phân tích định chuẩn xét nghiệm ban đầu, tương quan tuyến tính chỉ xuất hiện khi NĐVR từ 102 đến 105 copies/ml Do NĐVR tính toán khi thực hiện xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm căn cứ vào quan hệ tuyến tính trên nên chúng tôi chỉ phân tích các trường hợp NĐVR trong ngưỡng nhằm đánh giá mối tương quan giữa NĐVR và biến chứng
Kết quả phân tích giá trị trung bình của NĐVR các trường hợp có kết quả nằm trong ngưỡng có tương quan tuyến tính từ 102-105
copies/ml cho thấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê về giá trị trung bình giữa hai nhóm (bảng 6)
Bảng 6: So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến
chứng và không biến chứng
Nhóm không biến chứng
Nhóm có biến chứng Loại
bệnh
Trung bình (copies/ml)
P
Phết họng
30 4.960 ± 12.701 40 4.852 ± 11.171 0,97 Phết trực
tràng
22 18.314 ± 22.419 31 11.159 ± 13.971 0,159 Dịch não
tủy
3 4.083 ± 6.261 5 3.512 ± 4.705 0,887
Khi phân tích tương quan giữa NĐVR và các biến chứng nặng, giá trị trung bình của NĐVR trong mẫu phết họng ở nhóm không có biến chứng nặng là 4.892 ± 12.005 copies/ml (n=60) so với nhóm có biến chứng nặng là 4.957 ± 10.766
Trang 8copies/ml (n=10), không khác biệt về mặt thống
kê với p = 0,991
Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biế n chứng
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
04/07 05/07 06/07 07/07 08/07 09/07 10/07 11/07 12/07 01/08 02/08 03/08
0 175 350 525 700
T ỉ lệ biến chứng Tỉ lệ biến chứng nặng
Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biến
chứng
Tương tự như vậy, NĐVR trong mẫu PTT ở
nhóm không biến chứng nặng là 13.616 ± 18.449
copies/ml (n=47) thấp hơn so với nhóm có biến
chứng nặng là 18,147 ± 16,138 copies/ml (n=6),
nhưng sự khác biệt này không ý nghĩa thống kê
với p = 0,569
Như vậy, NĐVR trong mẫu phết họng và
PTT không có tương quan với cả biến chứng
chung và các biến chứng nặng là viêm não, phù
phổi, viêm cơ tim và sốc
Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ bệnh
nhân dương tính với EV71 trên tổng số được xác
định dương tính theo tháng và tỉ lệ bệnh nhân
có biến chứng cũng như có biến chứng nặng cho
thấy không có tương quan thuận rõ ràng (hình
6) Tuy nhiên, những thời điểm có tỉ lệ EV71 cao
thường trùng lặp với các đợt cao điểm của bệnh
trong năm
KẾT LUẬN
Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương
pháp Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ
mẫu bệnh phẩm có độ lập lại tốt và tính ổn định
cao Qui trình chẩn đoán 3 bước đã thiết lập có
khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ
tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh
phẩm phết họng Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ
dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có
thể áp dụng thường qui trên lâm sàng
NĐVR trong mẫu bệnh phẩm phết họng, PTT, DNT được lấy ở từ ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng của EV71 Cần nghiên cứu thêm
về sự thay đổi của NĐVR theo thời gian của bệnh để có đánh giá chính xác hơn
Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Brown BA, Kilpatrick DR, Oberste MS, Pallansch MA (2000) Serotype-specific identification of enterovirus 71 by PCR J Clin Virol.; 16: 107–12
2 Brown BA, Oberste MS, Alexander JP, Kennett ML, Pallansch
MA (1999) Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998 J Virol.; 73: 9969–75
3 Cardosa MJ, Krishnan S, Tio PH, Perara D, Wong SC (1997) Isolation of subgenus B adenovirus during fatal outbreak of enterovirus 71-associated hand, foot and mouth disease in sicu, sarawak The Lancet; 354:987–91
4 Đỗ Văn Niệm và cộng sự (2005) Giám sát bệnh tay chân miệng dựa vào bệnh viện: phương pháp dự báo dịch viêm não do enterovirus 71 Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 66-71
5 Hand AK (2000), foot and mouth disease outbreak reported in Singapore The Lancet; 356: 1338
6 Mckay IM, Arden KE, Nitsche A (2002) Real-time PCR in virology Nucleic Acids Res.;30: 1292–305
7 McMinn PC (2002) An overview of the evolution of enterovirus
71 and its clinical and public health significance FEMS Microbiol Rev.; 26: 91–107
8 Nijhuis M, van Maarseveen N, Schuurman R, Verkuijlen S, de Vos M, Hendriksen K, et al (2002) Rapid and sensitive routine detection of all members of the genus enterovirus in different clinical specimens by real-time PCR J Clin Microbiol;40: 3666–70
9 Phan Van Tu, et al (2007) Epidemiologic and Virologic Investigation of Hand, Foot, and Mouth Disease, Southern Vietnam, 2005; Emerging Infectious Diseases; 13 (11): 1733-41
10 Read SJ, Mitchell JL, Fink CG (2001) LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system J Clin Microbiol; 39: 3056–9
11 Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH (1974) An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of central nervous system J Infect Dis.;129: 304–9
12 Singh S, Chow VTK, Phoon MC, Chan KP, Poh CL (2002) Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71-specific primers J Clin Microbiol; 40: 2823–7
13 Trương Hữu Khanh (2005) Những kinh nghiệm bước đầu trong chẩn đoán và xử trí nhiễm enterovirus 71 ở trẻ em Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 58-66
Trang 9CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG
DO ENTEROVIRUS
Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Đỗ Văn Niệm*, Trương Hữu Khanh*, Bạch Văn Cam*, Nguyễn Thị Bạch Huệ*, Lê Anh Tuấn*, Lê Phan Kim Thoa*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định yếu tố lâm sàng và cận lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong Phương pháp: Nghiên cứu 419 trường hợp BTCM có xét nghiệm khẳng định PCR dương tính với
Enterovirus(EV) từ tháng 4/2007 đến tháng 3/2008 Các bệnh nhân vào lô nghiên cứu sẽ được theo dõi diễn tiến lâm sàng ít nhất 7 ngày trong bệnh viện Đối tượng nghiên cứu sẽ được lấy mẫu phết họng, phết bóng nước (nếu có thể), dịch não tủy khi có biến chứng để thực hiện chẩn đoán nguyên nhân bằng qui trình chẩn đoán 3 bước cho EV71
Kết quả: Tỷ lệ biến chứng 47,7 %, biến chứng nặng (viêm não, phù phổi, viêm cơ tim) chiếm tỉ lệ 10% Tử
vong chiếm 1,4% tổng số bệnh nhân trong nhóm nghiên cứu; 3% ở nhóm có biến chứng và 10,9 % ở nhóm có biến chứng nặng Các yếu tố sốt, sốt ≥ 38 o 5C, phát ban ít, giật mình, nôn ói, thở nhanh, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, bạch cầu trong máu tăng > 13.000/mm 3 , neutrophile tăng trên 7.000/mm 3 có giá trị tiên lượng biến chứng Các yếu tố phát ban ít, sốt ≥ 38 o 5C, nhịp tim nhanh > 150 lần/phút, thở nhanh theo tuổi, bạch cầu máu tăng trên 16.000/mm 3 có giá trị trong tiên lượng biến chứng nặng (viêm não, phù phổi cấp, viêm cơ tim) Các yếu tố nhịp tim nhanh, hôn mê, sốc, phù phổi hoặc biến chứng viêm não, lactate DNT > 2,5 mmol/L có giá trị tiên lượng tử vong
Kết luận: BTCM thường gặp ở trẻ dưới 36 tháng Đây là một bệnh cấp tính, tỉ lệ biến chứng cao đến
47,7% Biến chứng nặng như viêm não, phù phổi, viêm cơ tim chiếm 10% Tử vong chiếm 10,9% tổng số các trường hợp biến chứng nặng
Từ khóa: bệnh tay chân miệng, enterovirus, yếu tố tiên lượng, RT-PCR
ABSTRACT
PROGNOSTIC FACTORS IN HAND-FOOT-MOUTH DISEASE DUE TO ENTEROVIRUS
Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Do Van Niem, Truong Huu Khanh, Bach Van Cam, Nguyen Thi Bach Hue, Le Anh Tuan, Le Phan Kim Thoa
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 3 - 2011: 102 - 109
Objetives: Determine clinical and lab factors in relation with complications, severe complications and
hospital death prognosis
Method: study 419 EV-induced HFMD confirmed by PCR from April 2007 to Mar 2008 4/2007 All
enrollments will be followed up in at least 7 hospitalized days Pharyngeal swab, vesicle swab (if possible) and cerebrospinal fluid (in severe cases) will be collected for etilology identification by three-step diagnosis process for EV71
Results: The prevalence of overall complications and severe complications such as encephalitis,
pulmonary edema and myocarditis is 47.7 % and 10% respectively; The overall mortality rate is 1.4% in total, 3% among the cases with complications and 10.9 % among the cases with severe complications
* Bv Nhi Đồng 1
Trang 10Factors such as fever, fever ≥ 38 o 5C, a few rashes, myoclonic jerks, vomiting, tachypnea, heart beat over 150 times per minute, while blood count above 13,000/mm 3 , neutrophile count above 7,000/mm 3 are significantly associated with the presence of complications Factors such as fever ≥ 38 o 5C, a few rashes, tachypnea, tachycardia, while blood count above 16,000/mm 3 among the cases with severe complications such as encephalitis, pulmonary edema and myocarditis While factors including coma, shock, encephalitis and CSF-lactate > 2.5 mmol/L are significantly associated with death
Conclusion: HFMD commonly occurs in children less than 36 months of age It is an acute disease with the
complication rate of 47.7% Common severe complications are encephalitis, pulmonary edema, myocarditis with the total rate of 10% Mortatily rate among the cases with severe complication is 10.9%
Key words: Hand-foot-mouth disease, enterovirus, prognostic factors, RT-PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tay chân miệng (BTCM) hiện đã trở
thành một bệnh lưu hành ở khu vực phía Nam
Thống kê hằng năm tại Bệnh viện Nhi đồng 1
(BVNĐ1), tổng số lượt khám và nhập viện do
BTCM tương đương với sốt xuất huyết Dengue
BTCM do vi rút đường ruột gây ra, lây lan
nhanh qua đường tiêu hóa, nguy cơ phát triển
thành dịch, đặc biệt trong môi trường chăm sóc
trẻ tập trung như nhà trẻ, mẫu giáo Biểu hiện
lâm sàng bằng vết loét ở miệng, nổi bóng nước
vùng lòng bàn tay, bàn chân, mông, gối Hai tác
nhân quan trọng là Coxaskie A 16 và
Enterovirus 71 (EV71) BTCM do EV71 có thể
gây biến chứng nguy hiểm như viêm thân não,
viêm cơ tim, phù phổi cấp; diễn tiến bệnh nặng
rất nhanh và tử vong cao Trên thế giới từ năm
1974(6), BTCM do EV71 đã xuất hiện ở hầu hết
các nước và gây ra khoảng 13 trận dịch lớn nhỏ
như năm 1973 và 1978 tại Nhật Bản; tại Bungary
và Hungary vào những năm cuối của thập kỷ 70
đã có 4 trận dịch và gây nhiều ca tử vong do
biến chứng viêm thân não; tại Mã Lai và Trung
quốc - Đài Loan năm 1997 – 1998(7), Singapore(1)
Trong thời gian xảy ra dịch tại Trung quốc - Đài
Loan năm 1998 đã có trên 100.000 ca mắc bệnh
và 78 ca tử vong
Từ năm 2002 – 2003, tại BVNĐ1 đã xuất hiện
nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử vong rất
nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi(9,5) Trong đó, một số
trẻ có biểu hiện lâm sàng điển hình của BTCM
Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện
Pasteur TP Hồ Chí Minh, lần đầu tiên đã phân
lập được EV71 trong phân trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng
8 năm 2003(5) Từ đó đến nay, số ca mắc BTCM gia tăng nhanh hàng năm Năm 2006 đã có trên
2000 trường hợp mắc mới được chẩn đoán với trên 400 ca có biến chứng thần kinh, trong đó 63% trẻ bệnh thuộc địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định được 2 tác nhân chính là Coxsaskie A 16 và EV71, trong đó EV71 chiếm tỉ lệ 46%(8)
Nhằm xác định các yếu tố tiên lượng bệnh nặng, giúp cho việc theo dõi và can thiệp sớm, góp phần giảm tỉ lệ tử vong nên chúng tôi tiến hành nghiên cứu này
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định yếu tố lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong
Xác định yếu tố cận lâm sàng tiên lượng biến chứng, biến chứng nặng và tử vong
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tiêu chuẩn chọn bệnh
Bệnh nhân được chọn vào nghiên cứu khi có
2 tiêu chuẩn sau:
(a) Có chẩn đoán lâm sàng là BTCM: khi có một trong các dấu hiệu sau: (1) có sang thương điển hình ở miệng: vết loét đỏ hay bóng nước đường kính 2-3 mm ở vòm khẩu cái, niêm mạc
má, nướu, lưỡi; (2) bóng nước có kích thước 2-10
mm ở lòng bàn tay, bàn chân, gối, mông có tính chất: hình bầu dục, nổi cộm hay ẩn dưới da, trên
