Phân lập, tuyển chọn và khảo sát các điều kiện nuôi cấy của chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng trong xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong

Miến dong là một loại sản phẩm trong số đó,miến dong được sản xuất từ dong riềng và được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡngcũng như mùi vị của nó.. Tuy nhiên, phương pháp sinh học vẫn chiế

DANH MỤC BẢNG BIỂU 4

DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ 5

LỜI CẢM ƠN 7

TÓM TẮT 8

LỜI MỞ ĐẦU 9

PHẦN I: TỔNG QUAN 10

1.1 Tình hình sử dụng dong riềng tại Việt Nam: 10

1.2 Quy trình sản xuất miến dong: 12

1.3 Hiện trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong 15

1.3.1 Môi trường nước tại các làng nghề sản xuất miến dong 15

1.3.2 Môi trường không khí tại các làng nghề sản xuất miến dong 15

1.3.3 Hiện trạng chất thải rắn tại các làng nghề sản xuất miến dong 16

1.4 Thành phần bã thải rắn tại làng nghề sản xuất miến dong 18

1.4.1 Cellulose và cấu trúc : 18

1.4.2 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 20

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh cellulase của vi sinh vật 24

1.5.1 Nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật 24

1.5.2 Các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tạo cellulase của vi sinh vật 25

1.6 Các phương pháp sinh học xử lý bã thải rắn để làm tăng giá trị nguyên liệu 26

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31

2.1 Vật liệu 31

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.2 Dụng cụ 31

2.1.3 Hóa chất 32

2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 32

2.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose 32

2.2.2 Môi trường thử hoạt tính enzym cellulase 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase 33

2.3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao 33

2.4 Khảo sát một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng 35

2.4.1 Phương pháp nhuộm Gram 35

2.4.2 Phương pháp xác định sự hình thành bào tử 36

2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 36

2.5 Định tên theo phương pháp sinh học phân tử 37

2.5.1 Phản ứng PCR nhân gen 16S rRNA 37

2.5.3 Phương pháp điện di gel agarose 38

2.5.4.Giải trình tự 39

2.5.5 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 39

2.6 Khảo sát một số ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng tuyển chọn 39

2.6.1 Ảnh hưởng của yếu tố pH 39

2.6.2 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ 39

2.6.3 Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ cơ chất CMC 39

2.6.4 Tỷ lệ cấp giống 40

2.6.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 40

2.7 Xây dựng đường cong sinh trưởng: 40

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase 41

3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao 42

3.2.1 Phương pháp chấm điểm 42

3.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch 43

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme cellulase 44

3.3 Khảo sát một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của chủng BD5 45

3.3.1 Phương pháp nhuộm Gram 45

3.3.2 Phương pháp xác định sự hình thành bào từ 45

3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính catalase 46

3.4 Định tên chủng BD5 theo phương pháp sinh học phân tử 47

3.4.1 Kết quả PCR 47

3.4.2 Kết quả giải trình tự DNA 48

3.4.3 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 49

3.5 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển chủng BD5 50

3.5.1 Ảnh hưởng của yếu tố pH 50

3.5.2 Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ 51

3.5.3 Tỷ lệ cấp giống 52

3.5.4 Nồng độ CMC 53

3.5.5 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 54

3.6 Đường cong sinh trưởng của chủng BD5 theo các điều kiện đã tối ưu 55

KẾT LUẬN 56

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

PHỤ LỤC 61

DANH MỤC BẢN

Bảng 1.1: Đặc trưng nước thải tại một số làng nghề sản xuất tinh bột 17

Bảng 1.2: Chất lượng môi trường không khí tại một số làng nghề 18

Bảng 1.3: Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu 19

Bảng 1.4: Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu 19

Bảng 1.5: Thành phần của bã dong 20

Bảng 1.6: Thành phần dinh dưỡng của một số loại nấm 31

Bảng 2.1 Tên thiết bị 33

Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập 43

Bảng 3.2: Tỷ lệ đường kính vòng phân giải và kích thước lỗ thạch 46

Bảng 3.3: Hoạt độ enzym sinh ra theo thời gian, (đơn vị U/ml) 47

Bảng 3.4: Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng BD5 phân lập được 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Quy trình công nghệ sản xuất tinh bột dong 16

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của phân tử cellulose 22

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử cellulose 22

Hình 1.4: Mô hình enzymecellulase 24

Hình 1.5 Ba loại phản ứng xúc tác cellulase 25

Hình 1.6: Quy trình sản xuất nấm 33

Hình 3.1: Hoạt tính cellulase của các chủng theo phương pháp cấy chấm điểm 46

Hình 3.2: : Hoạt tính cellulase của các chủng theo phương pháp đục lỗ thạch 47

Hình 3.3: Ảnh nhuộm Gram của chủng BD5 48

Hình 3.4: Hình dạng bào từ của chủng BD5 49

Hình 3.5: Thử hoạt tính Catalasa 50

Hình 3.6: Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% 50

Hình 3.7: Trình tự DNA của chủng BD5 52

Hình 3.8: Các chủng có độ tương đồng cao với chủng BD5 52

Hình 3.9: Phân loại chủng vi khuẩn Bacillus subtilis strain BD5 dựa trên phân tích trình tự đa gen 53

Hình 3 10: Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của chủng BD5 54

Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của chủng BD5 55

Hình 3 12: Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống đến sự phát triển của chủng BD5 56

Hình 3.13: Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến sự phát triển của chủng BD5 57

Hình 3 14: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến sự phát triển của chủng BD5 58

Hình 3 15: Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng của vi khuẩn BD5 theo thời gian 59

DANH MỤC VIẾT TẮT

CMC : Cacboxyl methyl cellulose

BHM : Bushnell Haas medium

BOD : Biochemical Oxygen Demand

COD : Chemical Oxygen Demand

SS : Suspended Solids

DNS : 3,5-dinitrosalicylic

QCVN : Quy chuẩn Việt Nam

QHTN : Quy hoạch thực nghiệm

TCCP : Tiêu chuẩn cho phép

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Liên Hà - Giảngviên bộmôn Vi Sinh - Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử, Viện Công nghệ Sinh học vàCông nghệThực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình hướng dẫntrong suốt quá trình em thực hiện đề tài và hoàn thành khoá luận

Em xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Viện CôngNghệSinh Học - Công nghệThực phẩm - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đãdạydỗvà tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian học tập tại trường

Em cũng xin cảm ơn gia đình, các anh chị, bạn bè làm việc tại phòng thí nghiệmcủa bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử C4 - 401 và tập thể lớp Kỹ thuậtSinh học - K56 đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện

đề tài

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tốt nghiệp do thời gian và kiếnthức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được

sự đóng góp ý kiến và chỉ bảo tận tình của quý thầy cô để khóa luận hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 26 tháng 4 năm 2016

Sinh viên

Phạm Thị Hằng Nga

TÓM TẮT

Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ quá trình quang hợp ởthực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuấtnông nghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may Cellulose không tantrong nước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phânbởi các enzyme cellulase Hiện nay, lượng phế phụ phẩm nông nghiệp cũng nhưchất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường Ngoài ra,Việt Nam là một nước nông nghiệp, hàng năm lượng phụ phẩm nông nghiệp tạo ra

từ ngành chế biến nông sản là vô cùng lớn và đa dạng, phong phú như: rơm, rạ, câyngô, bã mía, bã dong riềng, bã sắn Miến dong là một loại sản phẩm trong số đó,miến dong được sản xuất từ dong riềng và được ưa chuộng bởi giá trị dinh dưỡngcũng như mùi vị của nó Quá trình chế biến tinh bột dong từ củ dong riềng tạo ramột lượng chất thải lớn là bã dong Lượng bã này tại một số làng nghề sản xuấtđược tận thu và tái sử dụng rất ít còn lại xả thẳng ra môi trường mà không qua xử lýgây ô nhiễm nguồn nước mặt, nước ngầm, ô nhiễm đất cũng như bầu không khí tạilàng nghề Tuy nhiên với thành phần chủ yếu là cellulose, bã dong có thể tận dụnglàm nguồn nguyên liệu để tạo ra các sản phẩm có giá trị kinh tế đồng thời giúp giảmthiểu ô nhiễm môi trường

Để giải quyết vấn đề trên, việc phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạttính phân huỷ cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm

vi sinh vật để xử lý ô nhiễm môi trường Hiện nay có rất nhiều phương pháp đượcđưa ra và áp dụng để xử lý nước thải như: vật lý, hóa học, sinh học, kết hợp cácphương pháp Tuy nhiên, phương pháp sinh học vẫn chiếm được nhiều sự quan tâm

bởi những ưu điểm về mặt kinh tế cũng như xã hội.Vì vậy em chọn đề tài “Phân

lập, tuyển chọn và khảo sát các điều kiện nuôi cấy của chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng trong xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong”.

Từ các mẫu phân vi sinh, mẫu đất, rơm rạ mủn, bã dong của huyện Dương Liễu,

Hà Nội Ta tiến hành phân lập, tuyển chọn và định tên được chủng Bacillus subtilis

strain BD5có khả năng phân hủy cellulose cao Từ chủng trên tiến hành khảo sát các

điều kiện nuôi cấy của chủng, nhận thấy chủng phát triển tốt ở pH = 6, nồng độCMC là 1% và tỷ lệ cấp giống 5%, nguồn nitơ, cacbon là pepton và cao thịt

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay, ngành chế biến nông sản thực phẩm nước ta được chú trọng bởi lợi thếnguyên liệu là một nước nông nghiệp mang lại.Tuy nhiên qua quá trình chế biếnluôn tạo ra một lượng chất thải Việc không tận thu, tái sử dụng cũng như không xử

lý nguồn thải này gây lãng phí và gây ô nhiễm môi trường từ đó đòi hỏi một khoảntiền lớn để giải quyết triệt để

Miến dong là một sản phẩm dạng sợi được sản xuất từ tinh bột dong riềng và nổitiếng với nhiều làng nghề ở Bắc Kạn, Tuyên Quang, Hưng Yên, Hà Nội,… Việc sảnxuất tinh bột dong tạo ra lượng bã thải bằng khoảng 80% so với lượng nguyên liệu[10].Thành phần bã thải này chủ yếu là cellulose – một dạng hợp chất hữu cơ cấutrúc phức tạp, trong tự nhiên phân hủy với tốc độ chậm và không hoàn toàn nên nên

về lâu dài thì đây là nguồn thải có nguy cơ gây ô nhiễm môi trườngnghiêm trọng

Một trong những giải pháp hiệu quảvà kinh tế nhất nhằm chuyển hóa được nguồn

cơ chất cellulose này thành các sản phẩm có giá trị là sử dụng enzyme cellulase loại enzyme có khả năng phân cắt cellulose

-Từ những lý do trên, em lựa chọn đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và khảo sát các

điều kiện nuôi cấy của chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase để ứng dụng trong xử lý chất thải làng nghề sản xuất miến dong”

Đề tài trên em tiến hành nghiên cứu với mục đích:

- Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulasecao

- Khảo sát, tối ưu điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp cellulasecủa chủ

PHẦN I: TỔNG QUAN1.1 Tình hình sử dụng dong riềng tại Việt Nam:

Xu hướng trồng cây lương thực ngoài cây lúa, ngô và mì nhằm mục đích đảmbảo an ninh lương thực đang được quan tâm không chỉ ở Việt Nam, mà rất nhiềunước trên thế giới Trong hàng loạt cây lương thực, những cây có tiềm năng pháttriển như cây lương thực dạng củ chứa nhiều bột còn rất lớn Có mấy chục loài vớihàng trăm giống khác nhau đang được trồng Cây có củ thích hợp trồng trên đất tốt,xấu; đất pha cát, thịt; khí hậu nóng, lạnh; ở vùng sườn núi, đồi; vùng trung du, đồngbằng; nơi hạn, úng; ở vùng chuyên canh, ở những mảnh đất "đầu thừa đuôi thẹo"; ởven bờ rào, dưới bóng râm… Việc phát triển cây ăn củ đạt được năng suất cao vàchất lượng tốt sẽ làm giảm lượng gạo tiêu dùng trong nước để dành cho xuất khẩu.Trong tập đoàn cây có củ Dong riềng là cây cho năng suất cao và phù hợp tại nhiềuvùng sinh thái, cây dễ trồng có hàm lượng tinh bột cao, có thể chế biến được nhiềumặt hàng lương thực và thực phẩm có giá trị kinh tế cao được người tiêu dùng trong

và ngoài nước ưu thích Dong riềng có tên khoa học là Canna edulis Ker Gawl,thuộc họ Chuối hoa - Cannaceae Cây cao 1,2-1,5m, có thể tới 2m Thân rễ phình tothành củ, chứa nhiều tinh bột Lá có phiến thuôn dài, thường có màu tía, bẹ tía, gângiữa to, gân phụ song song Hoa xếp thành cụm ở ngọn thân; đài 3, cánh hoa 3; nhịlép màu đỏ son, rộng 1cm; nhị vàng, môi vàng Ra hoa quả quanh năm Củ dongriềng chứa nhiều tinh bột, có vị ngọt, nhạt, tính mát; có tác dụng thanh nhiệt, lợithấp, an thần, giáng áp Củ luộc ăn ngon và chế bột làm miến tại nhiều vùng ở nướcta[32]

Tại xã Lực Hành (Yên Sơn), nhiều năm nay cây dong riềng được coi là cây thếmạnh, được người dân trồng từ những năm 70 của thế kỷ trước Xã cũng coi câydong riềng là cây xóa đói giảm nghèo.Cây dong riềng được trồng trên khắp vườn đồi

ở cả 12 thôn Bên cạnh việc thu mua dong riềng củ tại xã, nhiều hộ nông dân xã LựcHành còn tổ chức thu mua dong riềng ở các xã lân cận về để sản xuất, chế biếnthành bột dong riềng cung cấp cho thị trường Theo thống kê từ Trung tâm khuyếnnông tỉnh, toàn tỉnh có trên 600 ha dong riềng; diện tích dong riềng phân bố tậptrung chủ yếu ở các huyện: Yên Sơn 300 ha, Chiêm Hóa 160 ha, huyện Lâm Bình

40 ha; năng suất bình quân đạt 80 tấn/ha; sản lượng trên dưới 48.000 tấn củtươi/năm[33]

Và theo thống kê của sở Công thương, diện tích trồng dong riềng tại Bắc Kạn

đã tăng đột biến lên tới khoảng 2.900ha (tăng 56,97% so với năm 2012 và đạt138,14% kế hoạch năm) Với dự ước năng suất thu hoạch đạt từ 50-70 tấn củ/ha thìtổng sản lượng củ dong riềng thu hoạch năm 2013 trên địa bàn tỉnh sẽ ước đạt182.166 tấn Sau khi để giống cho vụ trồng dong năm 2014 khoảng 3.400 tấn tươngđương 1.700ha (theo kế hoạch trồng dong riềng năm 2014 trên địa bàn tỉnh do SởNông nghiệp và Phát triển nông thông xây dựng) thì sản lượng củ dong riềng đưavào chế biến tiêu thụ năm 2013 trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn ước khoảng 178.766 tấn Hiện nay trên địa bàn tỉnh Bắc Kạn có 112 cơ sở, hộ gia đình hoạt động chếbiến dong riềng (bao gồm cả các cơ sở, hộ gia đình đầu tư mới, nâng công suất trongnăm 2013) Trong đó, 24 cơ sở, hộ gia đình vừa chế biến tinh bột, vừa sản xuấtmiến; 14 cơ sở, hộ gia đình chuyên sản xuất miến; 74 cơ sở, hộ gia đình chuyên chếbiến tinh bột Đối với 98 cơ sở, hộ gia đình (vừa sản xuất bột, miến và chuyên sảnxuất bột cộng lại) có tổng công suất chế biến tinh bột dong riềng trên địa bàn tỉnhkhoảng 1.170 tấn củ/ngày tương đương sản lượng củ dong riềng được chế biếnkhoảng 117.000 tấn (tính trong thời gian 100 ngày), đáp ứng 65,5% sản lượng củdong riềng của năm 2013 Với tỷ lệ thu hồi tinh bột là 18% thì sẽ thu được khoảng21.000 tấn tinh bột thương phẩm, còn lại sản lượng củ dong riềng xuất bán ra ngoàitỉnh khoảng 61.760 tấn [32]

Mỗi năm tỉnh Bắc Kạn đã sản xuất được khoảng 180.000 tấn củ dong riềng, sốnày hầu hết được đưa vào để chế biến miến dong và tinh bột dong tại các làng nghềcủa tỉnh, số củ dong nguyên liệu thô bán cho nhu cầu sản xuất miến dong của vùngkhác rất ít Tại làng nghề Minh Hồng, Minh Quang, Ba Vì, Hà Nội với lợi thế diệntích đất đồi rộng lớn, gần chân núi Ba Vì nên cây dong riềng ở Minh Hồng rất pháttriển, tổng diện tích dong riềng ở đây là250ha, sản lượng bột thu được hàng nămkhoảng 20.000 tấn [29], một phần bột này sử dụng làm nguyên liệu sản xuất miếndong tại làng nghề Bên cạnh các làng nghề sản xuất miến dong đi từ nguyên liệu là

củ dong, một số làng nghề sản xuất miến dong như Cát Quế, Minh Khai (Hoài Đức,

Hà Nội), Cự Đà (Thanh Oai, Hà Nội) chủ yếu mua tinh bột dong từ các làng nghềkhác và tiến hành chế biến

Từ việc sử dụng dong riềng số lượng lớn trải rộng khắp nhiều tỉnh thành trong cảnước Đặt ra vấn đề nếu lượng nước thải và bã thải rắn dư thừa không được xử lý

kịp thời rất có thể sẽ gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí… Và gây hại chosức khỏe của người dân.

1.2 Quy trình sản xuất miến dong:

Từ củ dong riềng, thông qua quá trình chế biến, thu được tinh bột dong riềng Cóhai loại tinh bột dong riềng là tinh bột khô và tinh bột ướt Hiện nay, miến được sảnxuất chủ yếu từ tinh bột dong riềng ướt.Thông thường, tinh bột dong riềng ướt đượcsản xuất ở các vùng người dân làm nghề sản xuất miến và vùng nguyên liệu trồng củdong Tinh bột dong riềng ướt được bảo quản kín trong bao hoặc trong hầm kín và

sử dụng để làm miến cả năm Tính trung bình, 1000 kg củ dong riềng sau khi chếbiến thu được 250- 300 kg tinh bột ướt Từ tinh bột ướt, đem phơi nắng hoặc sấykhô sẽ thu được tinh bột dong riềng khô, có thể bảo quản được trong thời gian dài

 Quy trình chế biến tinh bột dong:

Công nghệ chế biến các loại củ, đặc biệt là củ dong riềng có tính chất truyềnthống và tương đối phổ biến, làm tăng giá trị sử dụng của cây dong riềng đồng thờigóp phần làm tăng thu nhập cho bà con nông dân Sản phẩm chính thu được là tinhbột dong riềng

Hình 1.1: Quy trình công nghệ sản xuất tinh bột dong [8]

Củ dongNước

Làm sạch củ dong riềng

Nghiền củ dong riềng

Nước

Lọc dịch tinh bột dong riềng

Lắng, rửa tinh bột dong riềng

Tinh bột dong riềng ướt

Làm khô tinh bột dong riềng

Tinh bột dong riềng khô

Bước 1: Làm sạch củ dong:

Củ dong được đưa vào hệ thống máy rửa củ.Mục đích của công đoạn rửa củ làloại bỏ ra khỏi củ dong riềng các loại đất, đá, tạp chất bẩn và một phần vỏ củ, rễ

Bước 2: Nghiền củ dong:

Củ dong sau khi rửa được đưa tới hệ thống máy nghiền, xát.Trong công đoạn này

củ dong được nghiền, xát dưới tác động của mâm (hoặc lô) nghiền, xát quay ở tốc

độ cao, tạo thành hỗn hợp lỏng gồm bã, nước tinh bột

Bước 3: Lọc tinh bột dong riềng

+ Đối với phương pháp nghiền lọc không liên hoàn:

Quá trình nghiền và tách lọc tinh bột, bã được thực hiện trên 02 máy móc thiết bịkhác nhau Hỗn hợp bã, tinh bột, nước sau nghiền được đưa tới hệ thống bể chứa,sau đó được bơm sang các máy tách bã (hình trụ tròn, có mô tơ, cánh khuấy, mànglọc), hoà thêm nước, dưới tác động quay của cánh khuấy tinh bột sẽ được tách raqua màng lọc xuống bể chứa và lắng tinh bột Quá trình đánh lọc được tiến hành liêntục cho đến khi lượng tinh bột được tách ra hoàn toàn, xơ bã sẽ được xả ra khu bểchứa tập trung để xử lý

+ Đối với phương pháp nghiền lọc liên hoàn:

Quá trình nghiền và tách tinh bột, bã sẽ được thực hiện đồng thời trên cùng mộtmáy nghiền lọc liên hoàn.Trong quá trình nghiền, hỗn hợp tinh bột, nước được tách

ra khỏi xơ bã và qua màng lọc vào bể lắng tinh bột

Bước 4: Lắng, rửa tinh bột dong riềng Sau công đoạn tách bã, tinh bột được đểlắng, tách nước, tách bột non, tiếp đó sẽ được đánh, lọc, lắng, nhằm rửa sạch phầnnhựa của củ dong và loại bỏ tạp chất làm cho tinh bột trắng sạch Công đoạn đánhlọc, lắng tinh bột này được tiến hành cho đến khi nước không còn vẩn đục Kết thúcgiai đoạn lắng, sau khi gạn hết nước và phần cặn bã phía trên, sẽ thu được tinh bộtướt, có độ ẩm từ 38- 40% có thể sử dụng ngay làm nguyên liệu sản xuất miến hoặcbảo quản kín hàng năm trong bao nilon chôn dưới đất 15 (hoặc trong bể xi măng)hay phơi nắng để có tinh bột khô tùy theo mục đích sử dụng

Bước 5: Làm khô tinh bột :

Tinh bột sạch sau khi lắng lọc, tách nước thường được làm khô theo phương phápphơi nắng Dùng nong, nia hoặc bạt để phơi tinh bột[8].

1.3 Hiện trạng môi trường tại các làng nghề sản xuất miến dong.

1.3.1 Môi trường nước tại các làng nghề sản xuất miến dong

Làng nghề sản xuất miến dong cũng như các làng nghề sản xuất tinh bột khác,hằng năm thải ra một lượng nước thải lớn giàu chất hữu cơ Với việc không đầu tưnhiều cho vấn đề môi trường, nước thải được xả trực tiếp ra các kênh mương màkhông qua xử lý nên gây ô nhiễm nghiêm trọng và ảnh hưởng đến sức khỏe của dân

Tân Hòa(Hà Nội)

Bình Minh(Đồng Nai)

Cát Quế(Hà Nội)

1.3.2 Môi trường không khí tại các làng nghề sản xuất miến dong

Đối với không khí tại các làng nghề chế biến nông sản thực phẩm nói chung vàcác làng nghề sản xuất miến dong nói riêng, nguồn gây ô nhiễm điển hình nhất là từcác chất hữu cơ dạng rắn và chất hữu cơ tồn đọng trong nước thải bị phân hủy yếm

khí tạo ra các mùi hôi nồng nặc, khó chịu Các chất khí ô nhiễm chủ yếu gồm H2S,NH3 ảnh hưởng tới sức khỏe người dân trong khu vực và vùng lân cận.

Bảng 1.2: Chất lượng môi trường không khí tại một số làng nghề [1].

K1: Môi trường làng nghề Dương Liễu (khảo sát tháng 10/2002)

K2: Môi trường làng nghề Tân Hòa (khảo sát tháng 10/2002)

K3: Môi trường làng nghề miến Yên Ninh (khảo sát tháng 10/2002)

Hầu hết các chỉ tiêu chất lượng môi trường không khí còn ở mức cho phép Tuynhiên, hàm lượng H2S vượt quá TCCP từ 30 – 42 lần

1.3.3 Hiện trạng chất thải rắn tại các làng nghề sản xuất miến dong

Với nguyên liệu là từ sắn củ và dong củ, qua sơ chế, nghiền nhỏ, ngâm ủ, lọc táchrồi lấy bột sắn và bột dong cung cấp cho cơ sở sản xuất chế biến nông sản thựcphẩm trong làng nghề và các vùng khác Quá trình này thải ra một lượng lớn chấtthải rắn là vỏ, bã, đất cát, Hiện nay bã thải được người dân tận dụng làm thức ăncho cá và nuôi lợn, phơi khô làm nhiên liệu Còn lại đổ ra đường, đổ xuống cốngrãnh gây tắc nghẽn, khi bị phân hủy gây mùi hôi thối khó chịu Nguồn thải này gópphần chính gây ô nhiễm môi trường đất và trực tiếp gây ô nhiễm môi trường khôngkhí cũng như ảnh hưởng đến chất lượng nước mặt và nước ngầm ở làng nghề

Bảng 1.3: Nguyên liệu đầu vào và bã thải rắn của làng nghề Dương Liễu [24]

150.00

47.000

48.000

16.000

216.00

57.000

64.000

73.00

Tại làng nghề Dương Liễu, mùa sản xuất chính kéo dài từ tháng 10 năm trước đếntháng 4 năm sau Nguyên liệu để sản xuất tinh bột là củ sắn và củ dong Lượngnguyên liệu đưa vào sản xuất tăng 5 – 10% theo từng năm

Người ta sử dụng chất thải phát sinh từ chế biến tinh bột cho các mục đích khácnhau Các khảo sát cho thấy chất thải từ củ sắn được tái sử dụng làm thức ăn gia súc,gia cầm hoặc làm phân bón Tại làng nghề Dương Liễu, bã thải từ dong một phầnngười dân sử dụng ở dạng khô làm nhiên liệu còn lại là thải ra ngoài môi trườngkhông qua xử lý

Bảng 1.4: Khả năng tái sử dụng bã thải rắn tại làng nghề Dương Liễu [24]

Bã thải rắn

Bã thải rắn sử dụng (%)

Bã thải rắn không sửdụng (%)

Thức ănchăn nuôi

Nhiênliệu

Phânbón

Tại làng nghề Dương Liễu bã thải từ sắn hầu như được sử dụng lại, trong khi bãthải từ dong riềng không được tái sử dụng Để quản lý và xử lý lượng bã thải nàysao cho tạo ra lợi ích kinh tế và giảm tác động của nó với môi trường xung quanh làmột thách thức lớn đối với địa phương

1.4 Thành phần bã thải rắn tại làng nghề sản xuất miến dong

Ở nước ta, cây dong riềng được trồng ở hầu hết các tỉnh thuộc đồng bằng, trung

du và miền núi phía Bắc Các tỉnh có diện tích và sản lượng dong riềng lớn phải kểđến là: Bắc Kạn, Sơn la, Cao Bằng, Hòa Bình, Thanh Hóa, Quảng Ninh…[6]

Theo thống kê, riêng mỗi tỉnh Bắc Kạn năm 2011 đã thu hoạch được 180.000 tấn

củ dong riềng, lượng tinh bột sản xuất được là 25.000 tấn/năm [10] Tuy nhiên theoHoàng Toàn Thắng và cộng sự từ 5486,29 tấn củ ước tính lượng bã thải ra là 4115tấn [10], có nghĩa là khoảng 80% bã bị loại ra Từ đó ta có thể thấy hằng năm lượng

1.4.1 Cellulose và cấu trúc :

Cellulose là thành phần chủ yếu của tổ chức thực vật (chiếm khoảng 35-50%trọng lượng khô của xác thực vật) và đặc biệt là ở rễ Ở tế bào thực vật và một số tếbào vi sinh vật, chúng tồn tại ở dạng sợi Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biếnnhất trong tự nhiên Hằng năm một lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn)được tạo thành chủ yếu từ quá trình quang hợp [19]

Hình 1.2: Cấu trúc không gian của phân tử cellulose

Cellulose là 1 polysaccharide gồm nhiều polymer được cấu thành từ các tiểu đơn

vị monosaccharide glucose Cellulose là hợp chất cao phân tử cấu tạo từ các liên kếtmắt xích β – D – Glucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]ntrong đó n có thể nằm trong khoảng 5000 – 14000 Đây là thành phần chủ yếu tạonên vách tế bào thực vật, chúng liên kết chặt chẽ với các thành phần khác nhưhemicellulose, lignin tạo nên các phức hệ bền vững

Cellulose không có trong tế bào động vật Chúng là một homopolimer mạchthẳng, được cấu tạo bởi các β–D–glucose–pyranose Các gốc glucose trong cellulosethường lệch nhau một góc 180o và có dạng như một chiếc ghế bành Cellulosethường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như hình 1.6

Hình 1.3: Cấu trúc phân tử cellulose

Về cấu trúc phân tử cellulose có hai phân vùng, phân vùng tinh thể và phân vùngkhông định hình Trong phân vùng tinh thể có liên kết hydro rất bền vững giữa cácchuỗi polymer trong khi ở phân vùng không định hình thì liên kết này lỏng lẻo hơnnhiều

Cellulose là chất màu trắng, không mùi, không vị, không tan trong nước và cácdung môi thông thường Tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh như HCl,HNO3, và bị thủy phân bởi enzyme cellulase [9] Cellulose cấu tạo dạng sợi, cócấu trúc phân tử là một polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharide gọi là

cellubiose, cellubiose được cấu trúc từ hai phân tử D - glucose Cellulose có cấu trúcbâc 2 và bậc 3 rất phức tạp, tạo thành cấu trúc dạng lớp gắn với nhau bằng lực liênkết Hydro trùng hợp nhiều lần nên rất bền vững, ngoài ra còn có lực Vander Walltạo ta mạng lưới gồm các sợi song song hoặc đan chéo nhau có độ bền cao.

Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy Người và hầu hết động vật không cókhả năng phân hủy cellulose Do đó, khi thực vật chết hoặc con người thải các sảnphẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thảihữu cơ Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn cókhả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ enzyme cellulase[11]

1.4.2 Enzyme cellulase và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

1.4.2.1 Enzyme cellulase :

Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiềuenzyme khác nhau Cellulase là các enzyme thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D– glucoside) tạo ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides

Có 3 loại enzyme cellulase chính:

- Endoglucanases (1,4- β – D – glucan – 4 - glucanohydrolases) có khối lượngphân tử trong khoảng 42 – 49 kDa Chúng hoạt động ở nhiệt độ khá cao vàtham gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và β– D -glucan Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, vàglucose

- Exoglucanases, gồm 2 loại là 1,4 –β-D-glucan glucanohydrolases

(cellodextrinases) và 1,4 –β–D –glucan-cellobiohydrolases

(cellobiohydrolases) Exoglucanases có hoạt tính thủy phân trên cả 2 đầu khử

và không khử của mỗi đoạn cellodextrin Trong đó cellodextrinases tạo ra sảnphẩm là glucose và cellobiohydrolases tạo ra sản phẩm chính là cellobiose

- β-glucosidases (β-glucoside glucohydrolases) có khả năng hoạt động ở pH rấtrộng (pH 4,4 – 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4

và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao β-glucosidase tham gia phân hủycellobiose, tạo thành glucose

Enzyme thủy phân cellulose ở các sinh vật khác thì khác nhau, có thể có các loạienzyme khác nhau, bao gồm một hoặc nhiều enzyme CBH, enzyme EG và có thể có

β-glucosidase Hệ thống hoàn chỉnh bao gồm CBH celulase, EG và BG phối hợp đểchuyển đổi cellulose thành glucose Các enzyme exo-cellobiohydrolases vàendocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các đoạn ngắnoligosaccharides Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được thủyphân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase [14]

Hình 1.4: Mô hình enzymecellulase

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị là axit amin, cácaxitamin được nối với nhau bởi liên kết peptid –CO-NH- Ngoài ra, trong cấu trúccòn có những phần phụ khác, cấu trúc hoàn chỉnh của các loại enzyme nhóm EG vàCBH giống nhau trong hệ cellulase của nấm sợi, gồm một trung tâm xúc tác và mộtđuôi tận cùng, phần đuôi này xuất phát từ trung tâm xác tác và được gắn thêm vùngglycosil hóa, cuối đuôi là vùng gắn kết với cellulose (CBD: cellulose bindingdomain) Vùng này có vai trò tạo liên kết với cellulose tinh thể

Hình 1.5 Ba loại phản ứng xúc tác cellulase

Thủy phân cellulose phải có sự tham gia của cả ba loại enzyme cellulase nhưendoglucanase, exoglucanase và β-glucosidase Thiếu một trong ba loại enzyme trênthì không thể thủy phân phân tử cellulose đến cùng

Từ những nghiên cứu riêng rẽ đối với từng loại enzyme đến nghiên cứu tác độngtổng hợp của cả ba loại enzyme cellulase, nhiều nhà khoa học đều đưa ra kết luậnchung là các loại enzyme cellulase sẽ thay phiên nhau phân hủy cellulose để tạothành sản phẩm cuối cùng là glucose Có nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chếtác động của cellulase, cụ thể cơ chế tác động hiệp đồng của 3 loại cellulase nhưsau: đầu tiên EG tác động vào vùng vô định hình trên bề mặt cellulose, cắt liên kếtβ-1,4-glucosid và tạo ra các đầu mạch tự do Tiếp đó CBH tấn công cắt ra từng đoạncellobiose từ đầu mạch được tạo thành Kết quả tác động của EG và CBH tạo ra cáccelloligosaccharit mạch ngắn, cellobiose, glucose BG thủy phân tiếp và tạo thànhglucose

2 1

3

Các loài vi sinh 3vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase trong điều kiện tự nhiênthường bị ảnh hưởng bởi tác động nhiều mặt của các yếu tố ngoại cảnh nên có loàiphát triển rất mạnh, có loài lại phát triển yếu Chính vì thế, việc phân hủy cellulosetrong tự nhiên được tiến hành không đồng bộ, xảy ra rất chậm

Trong điều kiện phòng thí nghiệm hay điều kiện công nghiệp, việc phân hủycellulose bằng enzyme, ngoài các yếu tố kỹ thuật như nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất,lượng enzyme…, một yếu tố hết sức quan trọng là tính đồng bộ của hệ enzymecellulase từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau Quá trình thủy phân cellulose chỉ cóthể được tiến hành đến sản phẩm cuối cùng khi sử dụng đồng bộ ba loại enzymecellulase

Cellulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên, trong

đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một sốloại nấm men Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinhenzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme.Enzyme cellulase đã được nghiên cứu từ rất lâu trên thế giới Đây là enzyme đượcứng dụng rất rộng rãi, chỉ đứng sau protease và amylase

1.4.2.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase

Vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp cellulase chủ yếu là phân giải carbohydratethường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng[22] Môi trường được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase cóchứa các nguồn cellulose khác nhau[15,16] Trong số các vi sinh vật sinh tổng hợp

cellulase đáng chú ý nhất là vi khuẩn, Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn) Hầu hết

các loại nấm có thể sử dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose [25], trong khi

ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có sự lựa chọn về nguồn carbohydrate,cellulose Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại nấm, đặcđiểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn Nấm

Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào Hầu

hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose tập trung vào các loài nấm

(Trichoderma,Humicola, Penicilium, Aspergillus, Actinomucor), vi khuẩn

Pseudomonas, Cellulomonas, Actinomycetes và Streptomyces).

Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng enzyme cellulase – một hệ enzyme phức tạp được sinh ra bởi nhiều vi sinh vật, phổ biến là nấm và vi khuẩn [18] Mặc dù những

-loài nấm sợi thì tỏ ra phân hủy rất tốt các cellulose tự nhiên, thế nhưng vi khuẩn lại

có tốc độ sinh trưởng cao hơn so với nấm nên có tiềm năng lớn để được dùng trongviệc sản xuất cellulase Tuy nhiên, việc nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulasecủa các dòng vi khuẩn nhìn chung vẫn còn khiêm tốn so với nghiên cứu trên nấm

Dù vậy, đặc điểm phân giải cellulose của vài giống vi khuẩn như Cellulomonas,

Cellovibrio, Pseudomonas, Sporosphytophaga, Bacillus và Micrococcus đã được

nghiên cứu và báo cáo trên thế giới [18]

Bacillus là một trong những vi sinh vật đầu tiên được phát hiện và mô tả trong

giai đoạn đầu của tiến trình phát triển ngành vi sinh vật học ở cuối thế kỷ 19 Đây làmột chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que, có khả năng sinh nội bào

tử để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường sống Bacillus phân bốrộng rãi trong các hệ sinh thái tự nhiên: từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đếnnước mặn và từ vùng ven bờ đến đáy các Đại Dương [4] Bên cạnh các loài vi khuẩn

gây bệnh cho con người như B anthracis và B cereus, nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là nhóm B subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng

dụng trong y học, trong nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm

Theo hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA

bắt đầu từ những năm 1990 [4], một số loài có quan hệ gần gũi với B subtilis như B

amyloliquefaciens, B licheniformis, B megaterium, B coagulans, B anthracis, B cereus và B Thuringensis, Enzyme từ Bacillus như amylase, cellulose, protease

và lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng từ 5

-9 và bền nhiệt Do đó, enzyme từ Bacillus đã được ứng dụng nhiều trong công

nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệpsản xuất chất tẩy rửa [4]

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh

cellulase của vi sinh vật

1.5.1 Nguồn dinh dưỡng của vi sinh vật

Các yếu tố trong thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sống

và sự tạo thành enzyme của vi sinh vật Trong môi trường nuôi cấy của vi sinh vậtcần phải đảm bảo đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỷ lệ các chất dinh dưỡnghợp lý, phù hợp với nhu cầu của từng vi sinh vật cụ thể

 Nguồn Carbon:

Carbon có trong thành tế bào, tế bào chất, trong tất cả các phân tử enzyme, axitnucleic và các sản phẩm trao đổi chất Chính vì vậy những hợp chứa carbon có ýnghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase đòi hỏi nguồn carbon khác nhau

Nguyễn Đức Lượng và cộng sự khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces

griseus với nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cưa [7] Đối với nấm

sợi Aspergillus fumigutus và các loại nấm mốc ưu nhiêt, nguồn carbon thích hợp

nhất là rơm nghiền và bột giấy lọc Môi trường cám và bã củ cải đường là môi

trường thích hợp nhất đối với Trichoderma reesei [6].

 Nguồn nitơ:

Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu thành nên các protein cấu trúccũng như các enzyme Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật cóthể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ

Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase Điềunày phụ thuộc điều kiện sinh lý của từng chủng giống Theo Tăng Thị Chính vàcộng sự một số chủng vi khuẩn ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải có khả năng sinhtổng hợp cellulase sinh trưởng phát triển trong môi trường với nguồn nitrogen làpepton và cao nấm men [2]

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với vi sinh vật sinh cellulase là nguồnnitrat Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạothành cellulase

Ngoài nitơ và carbon thì các nguyên tố khoáng (Fe, Mg, Zn, Mo, Cu…) có ảnhhưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellualase của chủng vi sinh vật Các nguyên tố

Zn, Mg, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng

1.5.2 Các điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng tạo cellulase của vi sinh vật.

 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ là một trong số các yếu tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, pháttriển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của chủng vi sinh vật

Với một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải khả năng chịu đượcnhiệt độ 80˚C, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45˚C đến 55˚C [2] Năm 2012, một vài

nghiên cứu về khả năng sinh enzyme cellulase của chủng Bacillus đã chỉ ra nhiệt độ tối

ưa cho chủng là từ khoảng 35-45˚C [26]

 Ảnh hưởng của pH:

Có thể nói, pH là một trong những yếu tố có tác động rất mạnh đến hoạt động của

vi sinh vật nói chung và vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase nói riêng Đặc biệt là hệenzyme của chúng, mỗi enzyme đều có một vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực củaenzyme là cao nhất

Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn được hai chủng nấm sợi

có khả năng phân giải cellulose caovới pH tối ưu 4 – 7 [3] Theo Nguyễn Đức

Lượng và cộng sự khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus tối ưu

với điều kiện pH ban đầu là 6;7 [7] pH tối ưu cho khả năng sinh enzyme cellulase của

chủng Bacillus khoảng 6,5-7,5 [26].

 Ảnh hưởng của nồng độ oxy:

Các loài vi sinh vật khác nhau có phản ứng khác nhau với nồng độ oxy của môitrường Vi sinh vật sinh tổng hợp celluase có thể là các loài hiếu khí, hiếu khí tùytiện và yếm khí do đó nồng độ oxy ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển cũngnhư khả năng tổng hợp cellulase của chủng

1.6 Các phương pháp sinh học xử lý bã thải rắn để làm tăng giá trị nguyên liệu

Phương pháp xử lý bã dong hiệu quả nhất là tận dụng bã để sản xuất ra các sảnphẩm có giá trị, vì như thế có thể tiết kiệm được toàn bộ hoặc đáng kể chi phí xử lý

bã, mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn cho cơ sở sản xuất

 Làm thức ăn chăn nuôi:

Tận dụng các thành phần dinh dưỡng trong bã dong để làm thức ăn cho chăn nuôiđang là vấn đề được quan tâm trong ngành nông nghiệp hiện nay Bởi vì lượng chấtdinh dưỡng trong bã dong cao, nguồn nguyên liệu dồi dào Hiện nay có 2 phươngpháp xử lý bã dong làm thức ăn gia súc

- Bã dong được phơi nắng hoặc sấy khô rồi có thể cho gia súc ăn trực tiếp hoặctrộn lẫn với các chất dinh dưỡng khác Hiện nay người dân ở làng nghề đã dùng

phương pháp này để xử lý một phần bã thải thành thức ăn cho gia súc Tuy nhiênviệc phơi bã dong phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, gây mùi hôi thối và ở chừngmực nào đó có thể hư hỏng Với các cơ sở sản xuất lớn thì không thể áp dụng được

vì lượng bã thải ra một ngày quá nhiều

- Sử dụng công nghệ vi sinh làm thức ăn chăn nuôi:

Bã dong loại ra được ủ với chế phẩm sinh học trong đó bao gồm các loại vi sinhvật có khả năng sinh amylase, cellulase, protease, … bên cạnh đó bổ sung các loài vikhuẩn lactic, trong điều kiện yếm khí lên men tạo ra acid lactic làm pH giảm xuống

4 – 4,5, ức chế toàn bộ sự phát triển của nấm men và nấm mốc Phương pháp nàyngoài ưu điểm là tận dụng được lượng bã dư thừa, giảm chi phí thức ăn chăn nuôithì nó giúp bảo quản và chủ động lượng thức ăn trong mùa mưa lạnh, không đủ điềukiện phơi sấy rất nhanh bị mốc thối Thức ăn ủ chua thế này không bị tổn thất dinhdưỡng lại được bổ sung các vi sinh vật có lợi cho đường tiêu hóa, giúp gia súc ít bịbệnh hơn

Đã có một số nghiên cứu và đưa vào thử nghiệm thành công sử dụng bã dong làmthức ăn chăn nuôi Đề tài nghiên cứu cấp bộ: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềnglàm thức ăn chăn nuôi trâu, bò tại các làng nghề vùng núi Đông Bắc Việt Nam”, đãđưa ra được công thức ủ bã dong bằng men vi sinh để bảo quản dự trữ bã dong làmthức ăn chăn nuôi trâu, bò và đưa ra khuyến cáo thử nghiệm ở địa bàn thí nghiệmchuồng trại và áp dụng trong chăn nuôi trâu bò [10]

Dự án “Xây dựng mô hình xử lý chất thải từ quá trình chế biến tinh bột dongriềng làm thức ăn gia súc và phân bón hữu cơ tại tỉnh Bắc Kạn” của Viện Môitrường Nông Nghiệp đã xây dựng quy trình chế biến thức ăn chăn nuôi từ bã dongriềng theo 2 phương pháp là ủ chua và lên men vi sinh Đưa ra mô hình chế biến bãdong riềng làm thức ăn bổ sung cho lợn với quy mô 2 tấn/năm Qua đánh giá ảnhhưởng của thức ăn chăn nuôi đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của đàn lợncho thấy sử dụng thức ăn chăn nuôi từ bã dong riềng đã giảm bớt 10 - 20% lượngthức ăn và cho hiệu quả kinh tế cao hơn[27]

 Làm phân bón:

Đây là phương pháp được ứng dụng rỗng rãi trong việc tận dụng phế thải nôngnghiệp làm nguồn nguyên liệu cho sản xuất phân bón phục vụ lại cho ngành sản xuấtnông nghiệp

Bã dong được bổ sung thêm dinh dưỡng để tạo điều kiện cho vi sinh vật pháttriển, đồng thời bổ sung chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật phân giải cellulose

để đẩy nhanh quá trình mùn hóa tạo thành phân Sau khi nguyên liệu mùn hóa hếttạo thành phân thì có thể phối trộn thêm NPK và các chủng vi sinh vật đặc hiệu đểtạo thành phân hữu cơ vi sinh với chất lượng cao

Quá trình sản xuất phân bón từ nguyên liệu hữu cơ ảnh hưởng bởi các yếu tố, tỷ

lệ C/N đầu vào, nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ O2, … Do đó, trong quá trình làmphân bón phải đảm bảo các điều kiện trên để phân bón thu được đảm bảo chấtlượng Ưu điểm của phương pháp xử lý này là bảo vệ môi trường, tận dụng phế liệu,tiết kiệm và thu lợi nhuận từ phế liệu

Với dự án “Xây dựng mô hình xử lý chất thải từ quá trình chế biến tinh bột dongriềng làm thức ăn gia súc và phân bón hữu cơ tại tỉnh Bắc Kạn” của Viện Môitrường Nông Nghiệp đã xây dựng thành công mô hình sản xuất bã dong làm phânbón hữu cơ sinh học với quy mô 15 tấn bã thải/ngày Dự án đã hoàn thành quy trìnhsản xuất phân bón hữu cơ từ bã thải dong riềng tại xã Côn Minh với chất lượng phânbón đạt tiêu chuẩn cho phép Qua kết quả sản xuất thực tế cho thấy: Cây lúa đượcbón phân hữu cơ sinh học sản xuất từ bã dong riềng có thân cao hơn, số hạt chắctrên bông cao hơn so với lúa không bón phân hữu cơ Khi bón phân hữu cơ từ bãthải dong riềng kết hợp với bón phân khoáng đã cho năng suất lúa xuân tăng từ 7,6 -10,9% và năng suất lúa mùa tăng từ 15,6 - 21,8% so với canh tác truyền thống củanhân dân [27]

 Làm nguyên liệu trồng nấm:

Nấm được trồng ở hơn 100 quốc gia và việc sản xuất nấm hàng năm trên thế giớiđạt 5 triệu tấn và dự kiến đến năm 2016 đạt 7 triệu tấn [28] Tại Việt Nam nấm đượcxem là ngành hàng mang lại hiệu quả kinh tế cao thu hút sự tham gia của nhiều bàcon nông dân Các loại nấm chính trồng ở Việt Nam là nấm sò, nấm rơm, nấmhương, nấm tai mèo và nấm linh chi

Bảng 1.6: Thành phần dinh dưỡng của một số loại nấm [28]

Các loại

nấm

Độ ẩm(%)

Protein(%)

Lipid(%)

Cacbonhydrate(%)

Tro(%)

Nănglượng(Calo)

về đạm thì nấm góp phần bồi dưỡng cơ thể nhờ sự dồi dào về khoáng và vitamin.Đặc biệt nấm linh chi được xem là loại nấm dược liệu, có tác dụng làm phươngthuốc phòng và chữa nhiều loại bệnh tật cũng như để tăng cường bồi bổ sứckhỏe.Quy trình trồng nấm ăn và nấm dược liệu trên các loại nguyên liệu truyềnthống như mùn cưa, rơm rạ được miêu tả tóm tắt theo hình 1.6:

Hình 1.6: Quy trình sản xuất nấm [28]

Từ trước đến nay, nấm được biết đến trồng trên các nguồn cơ chất như mùn cưa,ngày nay, nguồn cơ chất đã được đa dạng hóa như bã sắn, bã mía, bã rơm rạ, … Đâyđều là nguồn phế thải từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp và có hàm lượngcellulose tương đối cao Với thành phần chính là cellulose, bã dong cũng thể xem làmột nguồn cơ chất tận dụng để trồng nấm cần được nghiên cứu và phát triển

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Từ 5 mẫu nghiên cứu: Rơm rạ mủn lấy từ huyện Yết Kiêu - Hải Dương, nướcthải lấy từ nhà máy giấy tại Bắc Ninh, phân vi sinh BioGro PB2, đất trồng cây tại HàĐông, bã dong của huyện Dương Liễu - Hà Nội

2.1.2 Dụng cụ

Các dụng cụ, thiết bị của phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh – Hóa sinh – Sinhhọc phân tử, khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường đại họcBách Khoa Hà Nội Thiết bị bao gồm:

Bảng 2.1 Tên thiết bị

Biotech

11 Máy ly tâm lạnh 13.000 vòng/phút Hettich Đức

13 Cân phân tích độ chính xác 0,1mg Mettler Toledo Thụy Sỹ

2.1.3 Hóa chất

Pepton, CMC (Nhật Bản), NaCl, NaOH, HCl (Trung Quốc), Agar (ViệtNam), lugol (Việt Nam), axit citric (Trung Quốc), DNS (Trung Quốc), cao thịt( Nhật Bản), cao men (Nhật Bản), MgSO4.7H2O , (NH4 )2SO4 ,

2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

2.2.1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải cellulose

- Thanh trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase

Các bước tiến hành: