Bài 1. KYÕ THUAÄT ÑÒNH NHOÙM MAÙU HEÄ ABO Bài 2. NHÖÕNG KHOÙ KHAÊN VAØ CAÙCH GIẢÛI QUYEÁT Bài 3. KỸ THUẬT CHỨNG NGHIỆM PHÙ HỢP Bài 4. KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN VÀ NHUỘM Bài 5. KỸ THUẬT LẤY MÁU MAO MẠCH Bài 6. KỸ THUẬT LẤY MÁU TĨNH MẠCH Bài 7. PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH NHUỘM Bài 8. PHA CHẾ DUNG DỊCH CHỐNG ĐÔNG Bài 9. PHA CHẾ DUNG DỊCH DÙNG TRONG XÉT NGHIỆM ĐÔNG MÁU Bài 10. PHA CHẾ DUNG DỊCH ĐẾM TẾ BÀO Bài 11. QUAN SÁT TẾ BÀO NGOẠI VI BÌNH THƯỜNG
Trang 1Bài 1
KỸ THUẬT ĐỊNH NHÓM MÁU HỆ ABO NHỮNG KHÓ KHĂN VÀ CÁCH GIẢÛI QUYẾT
I.Đặt vấn đề:
Hệ ABO là hệ thống nhóm máu được phát hiện sớm nhất doLandsteiner (1900) Đây là nhóm máu cực kỳ quan trọng vì là nguyênnhân chính yếu của các tai biến truyền máu Do đó việc xác địnhchính xác nhóm máu hệ ABO là rất cần thiết
II.Kháng nguyên – kháng thể hệ ABO:
1.Kháng nguyên ABO
Bắt đầu xuất hiện ở bào thai 37 ngày tuổi
Phát triển hoàn toàn lúc 3 tuổi
Kháng nguyên có cấu trúc gồm 2 phần:
+ Một phần có bản chất Protein có khả năng sinh kháng thể.+ Một phần có bản chất Gluxit hoặc Lipit ( còn gọi là
Hapten ),có khả năng kết hợp kháng thể
Tồn tại ở hầu hết các tế bào của cơ thể ( ngoại trừ các tế bào thần kinh, tế bào gan, tế bào Malpighi và mô liên kết )
Kháng nguyên thường tồn tại suốt cuộc sống nhưng có thể suy giảm, yếu đi khi về già hoặc trong 1 số trường hợp bệnh lý
Kháng nguyên hệ ABO cũng tuân theo định luật di truyền
Mendel
2) Kháng thể ABO:
- Bản chất là kháng thể tự nhiên
- Thông thường là IgM, 1 số rất ít trường hợp là IgM + IgA hay IgM + IgG
- Hoạt động tốt ở nhiệt độ từ 40C đến 200C trong môi trường NaCl 0,9%
- Nồng độ thay đổi từ người này sang người khác
Trang 23) Các hệ thống nhóm máu ABO:
Dựa vào các kháng nguyên trên màng hồng cầu và kháng thể trong huyết thanh ta có các nhóm máu:
Ngoài ra ta còn có các nhóm máu phụ khác như A1, A2, Ax, B3,
Bm, A1B, A2B……
III.Kỹ thuật định nhóm máu hệ ABO 1.Nguyên lý:
Dựa trên nguyên lý của phản ứng ngưng kết
Được xác định nhờ kháng nguyên trên màng hồng cầu và kháng thể trong huyết thanh
Có 2 phương pháp : hồng cầu mẫu và huyết thanh mẫu
2.Dụng cụ và thuốc thử:
Máy ly tâm ống thẳng
Pipette các loại
Ống nghiệm thuỷ tinh
Lam kiếng
Bút dạ quang hay bút chì kính
Tủ lạnh bảo quản thuốc
Huyết thanh mẫu: chống A, chống B, chống AB
Hồng cầu mẫu: A, B, O
Nước muối 0,9%
Huyết thanh máu AB
3.Tiến hành kỹ thuật
3.1) Định nhóm trên lam kính:
3.1.1) Phương pháp huyết thanh mẫu:
Trang 3Trên 1 lam kính: nhỏ 3 giọt huyết thanh mẫu chống A, chống B, chống AB vào 3 vị trí khác nhau.
Thêm 1 giọt hồng cầu cần định nhóm 10 – 20% (được pha với NaCl 0,9%)
Trộn đều bằng que thủy tinh thành 1 vòng tròn có đường kính 2 – 3cm Lắc nhẹ liên tục trong vòng 2 phút rồi đọc kết quả
3.1.2) Phương pháp hồng cầu mẫu:
Trên 1 lam kính: nhỏ 2 giọt huyết thanh cần định nhóm vào 2 vị trí khác nhau
Thêm 1 giọt hồng cầu mẫu A, 1 giọt hồng cầu mẫu B vào 2 vị trí trên (hồng cầu mẫu đã được pha 10 – 20% trong NaCl 0,9% )
Trộn đều và lắc nhẹ liên tục trong vòng 2 phút rồi đọc kết quả
3.2) Định nhóm trong ống nghiệm
3.2.1) Phương pháp huyết thanh mẫu:
- Nhỏ vào 3 ống nghiệm mỗi ống 1 giọt huyết thanh mẫu chống A,chống B, chống AB
- Thêm 1 giọt hồng cầu cần định nhóm 2 – 5% ( pha trong NaCl 0,9% ) vào mỗi ống nghiệm trên
- Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút
- Nghiêng nhẹ thành ống nghiệm, đọc kết quả bằng mắt thường vàkính hiển vi
3.2.2) Phương pháp hồng cầu mẫu:
- Nhỏ 1 giọt huyết thanh cần định nhóm vào 2 ống nghiệm
- Thêm 1 giọt hồng cầu mẫu A, 1 giọt hồng cầu mẫu B 2 – 5% vàomỗi ống nghiệm trên
- Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút
- Nghiêng nhẹ thành ống nghiệm, đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi
- Nhỏ 1 giọt hồng cầu cần định nhóm ( đã pha loãng thành 1% trong dung dịch Diluent có LISS ) vào các giếng Anti A, Anti B, Anti
AB, Ctl
Trang 4- Nhỏ 1 giọt huyết thanh cần định nhóm vào các giếng Ctl, HC A,
HC B
- Quay ly tâm Card trong 10 phút
- Đọc kết quả bằng mắt thường và bằng máy đọc
3.3) Những nguyên nhân gây sai lầm trong định nhóm máu hệ ABO:
- Tỷ lệ giữa huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu không tương ứng
- Đọc kết quả quá nhanh hoặc để quá lâu mới đọc kết quả
- Mẫu máu định nhóm lấy không đúng quy cách, hoặc bị nhiễm trùng
- Thuốc thử bị hư, nhiễm trùng hay quá hạn
- Tay nghề và trình độ của người làm kỹ thuật
IV.Cách giải quyết những khó khăn
- Việc xác định nhóm máu hệ ABO dựa vào kháng nguyên trên màng hồng cầu và kháng thể trong huyết thanh
- Hai phương pháp huyết thanh mẫu và hồng cầu mẫu phải được tiến hành đồng thời và phải luôn cho kết quả phù hợp
- Tất cả những khó khăn xảy ra khi không có sự phù hợp giữa 2 phương pháp
Để giải quyết ta tiến hành các bước sau:
+ Rửa hồng cầu cần định nhóm và hồng cầu O ( có đầy đủ kháng nguyên hệ hồng cầu ) bằng NaCl 0,9% 3 lần Pha thành hồng cầu 5%.Chứng tự thân:
Nhỏ vào ống nghiệm 2 giọt huyết thanh và 1 giọt hồng cầu cần định nhóm
Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút
Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi
Trang 5Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
Lưu ý: phản ứng âm tính thì phương pháp định nhóm bằng huyếtthanh mẫu được bảo đảm
+ Chứng đồng loài:
Nhỏ vào ống nghiệm 2 giọt huyết thanh cần định nhóm và 1 giọthồng cầu O
Lắc đều, quay ly tâm 1000 vòng/ phút/ 1 phút
Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi
Lưu ý: phản ứng âm tính thì phương pháp định nhóm bằng hồng cầu mẫu được bảo đảm
Dựa vào kết quả 3 chứng, ta có thể chia những trường hợp khó khăn thành 2 nhóm chính như sau:
1/Khi cả 3 chứng nói trên đều âm tính
2/Khi 1 hay cả 3 chứng nói trên đều dương tính
Khi cả 3 chứng nói trên đều âm tính
1.1) Trường hợp có kháng – kháng thể:
Nhận xét:
- Có thể có kháng – kháng thể chống A
- Kháng – kháng thể chỉ xảy ra khi có bổ thể
- Giải quyết bằng cách khử bổ thể trong huyết thanh cần định nhóm ở 560C/ 30 phút
- Định nhóm lại, nếu có kháng – kháng thể thì sau khi khử bổ thể phản ứng sẽ trở về bình thường như sau:
1.2)Trường hợp chia thành 2 quần thể hồng cầu:
Nhận xét:
- Nhóm máu có thể là A
- Nhưng hồng cầu cần định nhóm ngưng kết với huyết thanh mẫu chống A, chống AB không hoàn toàn, còn nhiều hồng cầu tự do
- Gặp trong các trường hợp đã được truyền máu, hoặc có các nhómmáu yếu, hay có các bệnh lý như Leucemie, Đa u tuỷ xương…
Trang 6- Giải quyết bằng cách hỏi lại các triệu chứng lâm sàng và tiền sử truyền máu.
1.3)Trường hợp kháng thể yếu
Nhận xét:
- Nhóm máu có thể là A
- Gặp ở trẻ nhỏ do kháng thể chưa hình thành đủ, hoặc người già >
70 tuổi
- Các trường hợp thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh hay mắc phải
- Giải quyết bằng cách định lại nhóm máu sau 1 thời gian, hay điềutrị các nguyên nhân gây thiếu hụt miễn dịch
2.Khi 1 hay cả 3 chứng nói trên đều dương tính
2.1) Trường hợp có kháng thể lạnh
Nhận xét:
- Có thể có kháng thể lạnh
- Khi để hồng cầu cần định nhóm ủ ở 370C thì hiện tượng ngưng kết mất dần
- Giải quyết bằng cách rửa hồng cầu cần định nhóm bằng NaCl 0,9% ấm 370C và định nhóm trong ống nghiệm ở 370C
2.2) Trường hợp có kháng thể tự miễn:
Nhận xét:
- Có thể có kháng thể tự miễn
- Các kháng thể này thường đã cố định trên bề mặt hồng cầu
- Giải quyết bằng cách xem lại chẩn đoán lâm sàng, rửa hồng cầu cần định nhóm bằng NaCl 0,9% ấm 370Cvà định lại
- Nếu cần thiết phải tiến hành các kỹ thuật sâu hơn
2.3) Trường hợp hồng cầu chuỗi tiền
Nhận xét:
- Có sự tăng bất thường Protein trong huyết thanh
- Có sự ngưng kết tầng nhanh và nó sẽ được phân tán rất nhanh khi ta nhỏ vào hồng cầu cần định nhóm 1 giọt NaCl 0,9%
Trang 7- Giải quyết bằng cách rửa hồng cầu cần định nhóm bằng NaCl 0,9%; định lại phương pháp huyết thanh mẫu.
- Phương pháp hồng cầu mẫu thì pha loãng huyết thanh cần định nhóm trong NaCl 0,9% cho đến khi nồng độ Protein trong huyết thanh không đủ để kết tầng thành hình chuỗi tiền thì định lại
V.Kết luận
- Xác định nhóm máu hệ ABO là 1 khâu cực kỳ quan trọng
- Phải kiểm tra đầy đủ các thủ tục hành chánh
- Định nhóm 2 lần bằng 2 phương pháp
- Đối chiếu kết quả:
+ Nếu kết quả phù hợp trả kết quả nhóm máu
+ Nếu kết quả không phù hợp, kiểm tra lại toàn bộ các bước, giải quyết các khó khăn ( nếu có ) và làm lại
Bài 3
KỸ THUẬT CHỨNG NGHIỆM PHÙ HỢP Nguyên tắc căn bản
Lựa chọn được túi máu phù hợp
Bảo đảm an toàn truyền máu
Nền tảng là phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể
Phản ứng thuận hợp ( phản ứng chéo ) chỉ là 1 trong các xét nghiệm
để tìm được túi máu phù hợp cho bệnh nhân
Các kỹ thuật trước truyền máu
Kiểm tra tiền sử truyền máu của bệnh nhân
Xác định nhĩm máu ABO, Rh của bệnh nhân và túi máu
Sàng lọc kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân và túi máu
Định danh kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân ( nếu cĩ )
Phản ứng chéo.
Các loại phản ứng chéo
Phản ứng chéo điện tử:
Trang 8+ Sử dụng máy vi tính để phân tích các dữ liệu của túi máu và bệnhnhân:
Nhóm máu ABO, Rh của túi máu và bệnh nhân
Phản ứng chéo trong huyết thanh học:
+ Trước truyền máu, hồng cầu túi máu được kiểm tra với huyết thanhbệnh nhân
+ Nếu trong huyết thanh bệnh nhân có kháng thể chống lại các khángnguyên tương ứng trên hồng cầu túi máu thì sự ngưng kết sẽ xuất hiện.+ Điều đó thể hiện sự không thuận hợp ở bệnh nhân này đối với túimáu
+ Nếu không có sự ngưng kết xảy ra, túi máu được xem như thuậnhợp hay an tòan để truyền cho bệnh nhân
Mục đích phản ứng chéo
Đây là bước kiểm tra cuối cùng sự thuận hợp của nhóm máu ABO Cóthể phát hiện được sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh bệnhnhân trong 1 số trường hợp
Quy trình phản ứng chéo
Gồm các bước:
Kiểm tra thông tin bệnh nhân:
+ Họ tên bệnh nhân phải đầy đủ, rõ ràng
+ Cần có mã số hồ sơ bệnh án, hay số nhập viện
+ Tiền sử truyền máu và các phản ứng truyền máu trước đó ( nếu có ).2) Kiểm tra mẫu máu bệnh nhân:
+ Phải đầy đủ họ tên, mã số bệnh nhân trên mẫu máu và khớp vớiphiếu yêu cầu
+ Mẫu máu được lấy tối đa trong vòng 3 ngày
+ Kiểm tra hiện tượng tán huyết, các cục fibrin trong mẫu máu
3) Xác định lại nhóm máu ABO, Rh:
+ Định lại nhóm máu ABO bằng cả 2 phương pháp
Trang 9+ Định lại nhĩm máu Rh bằng huyết thanh mẫu D.
+ Để xác định nhĩm máu cĩ thể dùng lam kính hoặc ống nghiệm.4) Tiến hành phản ứng chéo
Trang thiết bị
+ Nước muối sinh lý 0,9%
+ Lam kính thủy tinh
+ Ống nghiệm thủy tinh 10x75mm
+ Ống nghiệm nhựa 12x75mm
+ Chai nhựa đựng nước muối dùng để rửa
+ Pipette cĩ chia độ
+ Thuốc thử: hồng cầu mẫu, AHG, LISS, hồng cầu cảm ứng
+ Card gel, dung dịch đệm ( có LISS )
+ Máy quay ly tâm ống nghiệm, máy quay ly tâm Card gel
+ Máy rửa tự động ( nếu cĩ )
+ Máy ủ Card gel, ống nghiệm
+ Kính hiển vi
Kỹ thuật
Phản ứng chéo sử dụng kỹ thuật trong ống nghiệm
Phản ứng chéo sử dụng kỹ thuật Card gel
Kỹ thuật trong ống nghiệm
Pha lỗng hồng cầu túi máu từ 2 – 4% bằng nước muối sinh lý 0,9%( thường là 3% )
Cho 50L hồng cầu đã pha lỗng vào ống nghiệm
Cho thêm 100µL huyết thanh bệnh nhân vào cùng ống nghiệm trên.Trộn kỹ, quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vịng/phút trong 15giây
Lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả dưới kính hiển vi ( giai đoạn 1 )
Trang 10Thêm 100L LISS vào trong cùng ống nghiệm.
Trộn kỹ, ủ dung dịch ở 370C trong 15 phút
Sau ủ, quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000 vòng/phút trong
15 giây, lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả ( nếu cần thiết )
Rửa dung dịch 03 - 04 lần bằng nước muối sinh lý 0,9% và đổ bỏhoàn toàn nước rửa cuối cùng
Thêm 100µL AHG, trộn kỹ và quay ly tâm dung dịch ở tốc độ 3000vịng/phút trong 15 giây
Lắc nhẹ nhàng và đọc kết quả dưới kính hiển vi ( giai đoạn 2 )
Nếu kết quả (-) cho thêm 50L hồng cầu cảm ứng, trộn kỹ và quay lytâm dung dịch ở tốc độ 3000 vịng/phút trong 15 giây
Lắc nhẹ nhàng và kiểm tra kết quả lại dưới kính hiển vi
Kỹ thuật Card gel
Pha lỗng hồng cầu túi máu 1% bằng dung dịch đệm
Cho 50L hồng cầu 1% vào lỗ Card gel
Thêm 25µL huyết thanh bệnh nhân vào cùng lỗ Card gel trên
Ủ Card gel ở 370C trong 15 phút
Sau ủ, quay ly tâm Card gel trong 10 phút
Đọc và ghi nhận kết quả
Lưu ý: các bước kỹ thuật cần được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sảnxuất
Kỹ thuật tự chứng
Cần tiến hành khi phản ứng chéo (+)
Pha lỗng hồng cầu bệnh nhân bằng nước muối sinh lý 0,9%
Tiến hành các bước kỹ thuật giống như phản ứng chéo
Đọc và so sánh kết quả của ống tự chứng với phản ứng chéo
Lưu ý: nồng độ, tỷ lệ của hồng cầu và huyết thanh cần tuân theo kỹ thuật
sử dụng
Các nguyên nhân (+) trong phản ứng chéo
Khơng đúng nhĩm máu ABO
Kháng thể miễn dịch trong huyết thanh bệnh nhân
Kháng thể tự sinh trong huyết thanh bệnh nhân
Hồng cầu túi máu tự ngưng kết
Trang 11Các bất thường trong huyết thanh bệnh nhân.
Nhiễm trùng
Sàng lọc kháng thể (-), phản ứng chéo giai đoạn 1 (+):
Không đúng nhóm máu ABO của túi máu và bệnh nhân
Hồng cầu túi máu tự ngưng kết
Kháng thể chống A1 ở bệnh nhân A2 hoặc A2B
Các kháng thể miễn dịch hoạt động ở nhiệt độ phòng
Các kháng thể tự sinh loại lạnh
2) Sàng lọc kháng thể (-), phản ứng chéo giai đoạn 2 (+):
Hồng cầu túi máu ngưng kết
Kháng thể trong huyết thanh phản ứng với các kháng nguyên trongtúi máu
Các kháng thể do truyền tiểu cầu không phù hợp nhóm máu ABO( thường là kháng thể chống A hoặc B )
Các vấn đề liên quan đến thuốc thử
Các bước giải quyết trường hợp (+)
Kiểm tra nhóm máu ABO, Rh túi máu và bệnh nhân
Trang 12Kỹ thuật trong trường hợp khẩn cấp,Cố gắng xác định nhóm máuABO, Rh của bệnh nhân.
Nếu không xác định được, sử dụng túi máu O-
Ngay khi bệnh nhân đã được truyền máu, vẫn phải tiếp tục tiến hành
kỹ thuật phản ứng chéo
Tài liệu tham khảo
Technical manual, 15th edition
Modern blood Banking and Transfusion Practices, 4th edition.HealthAtoZ.com
Đặt lam kéo ngay phía trước giọt máu
Lùi lam kéo đến chạm giọt máu, để máu tràn hết chiều ngang của cạnh lam kéo
Để lam kéo 1 góc khoảng 30-450 so với lam kính nằm ngang
Từ từ đẩy ngược cho đều tay về phía trước
*Chú ý: đẩy nhanh tiêu bản sẽ dầy,đẩy chậm tiêu bản sẽ mỏng quá hoặc thành từng lớp sóng rất khó xem
I KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN (TT)
Kết quả:
Máu tràn đều càng về đuôi càng mỏng
Lam có màu hồng tươi, nhìn xuyên qua lam đọc được chữ
Đuôi có hình lưỡi bò hoặc răng cưa
Để khô tự nhiên
Trang 13Cho 2 giọt máu lên 2 đầu lam kính
Dùng que thủy tinh hoặc 1 góc của lam kính khác ngoáy nhẹ lêngiọt máu theo vòng tròn rộng ra đến khi giọt máu có đường kínhkhoảng 1-1,5cm
Lắc khô hoặc để khô tự nhiên
Không cần cố định mà nhuộm ngay
Ngoài ra còn làm tiêu bản: soi tươi, tiêu bản tủy đồ, làm tiêu bản dịch
II.KỸ THUẬT NHUỘM
Có nhiều cách nhuộm nhưng trong huyết học thường nhuộm Giemsa
Dụng cụ:
Giá nhuộm, ống đong hoặc cốc có vạch hoặc pipet
Hóa chất: Giemsa mẹ, cồn cố định, nước cất, nước thường
Pha thuốc nhuộm Giemsa tỉ lệ 1/10
Đặt lam cần nhuộm lên giá
Phủ lên khắp tiêu bản dd Giemsa 1/10
Để 15 phút, rửa nước thường cho sạch hết cặn
Để khô trên giá đỡ thẳng đứng
Trang 14- Bệnh nhân:
+ Để bệnh nhân ngồi hoặc nằm thoải mái
+ Chọn vị trí lấy máu ở đầu ngón tay 3,4(người lớn)
hoặc ở gót chân, đầu ngón chân cái đối với trẻ en nhỏ
II TIẾN HÀNH:
Sát khuẩn nơi định lấy máu bằng bông tẩm cồn 700
Để khô tự nhiên
Garo đầu ngón tay
Dùng kim tiệt khuẩn chích sâu độ 1-1,5 mm
Lau bỏ giọt máu đầu bằng bông khô
Lấy máu để xét nghiệm từ giọt thứ 2 trở đi
Sau khi lấy đủ máu, ta tháo dây garo, lau sạch máu nơi đã chích cho bệnh nhân
Trang 15Đặt đúng hướng của TM đi lên, đầu vát của kim hướng lên trênĐặt kim tiêm so với cánh tay 1 góc khoảng 300
Tỳ chắc ngón tay vào đốc kim và chọc qua da với động tác dứt khoát
II TIẾN HÀNH (TT)
Luồn kim vào TM
Khi kim vào TM có thể nới dây garo ra và rút máu sao cho đủ số lượng cần thiết
Tháo dây garo, đặt miếng bông tẩm cồn lên chỗ tiêm chích, rút kim
ra với động tác nhanh, bảo bệnh nhân ép lên chỗ lấy máu khoảng 5pTháo kim ra cho vào thùng hủy kim, bơm đủ số lượng máu vào lọ chứa mẫu