Tuyển chọn một số chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn cần giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase

Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ1 .... 3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH

-

Nguyễn Thị Hà

TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME

CHITINASE CAO

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRẦN THANH THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh - 2011

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Tác giả luận văn

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy là giảng viên khoa sinh học trường

Đại học su phạm TP HCM, người đã định hướng đề tài cho tôi, quan tâm, giúp đỡ và thông cảm cho hoàn cảnh của tôi Người đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quí báu cho tôi, đã nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cám ơn TS Dương Thị Hương Giang là giảng viên giảng dạy môn Enzyme

học, viện công nghệ sinh học trường Đại học Cần Thơ, người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin cám ơn các em sinh viên: Phạm Thị Mỹ Ánh, Cao Thị Mỹ Phương, Nguyễn Huỳnh

Trang Thu Hương, Nguyễn Trần Khiết lớp Công nghệ sinh học tiên tiến K33, Quang Anh Thư, Trần Kim Thoa, Vương Thị Hồng Thắm lớp Sư phạm Sinh học K34 đã nhiệt tình hỗ trợ tôi trong

quá trình thực nghiệm và tổng hợp kết quả

Tôi xin cám ơn cha mẹ, chồng và các người thân của tôi, những người đã chăm sóc cho con tôi,

và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình đi học và thực hiện đề tài

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2011

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

1

LỜI CAM ĐOAN1 2

1

LỜI CÁM ƠN1 3

1

MỤC LỤC1 4

1

DANH MỤC VIẾT TẮT1 8

1

MỞ ĐẦU1 1

1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1 2

1

1.1 NS trong hệ sinh thái RNM1 2

1

1.1.1 Giới thiệu về RNM1 2

1

1.1 2 Đặc điểm sinh học NS ở RNM1 3

1

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái1 3

1

1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản1 4

1

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa1 4

1

1.1.2.4 Đặc điểm phân loại nấm sợi1 7

1

1.1.2.5 Vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM1 9

1

1.2 Chitin và chitinase1 10

1

1.2.1 Nguồn chitin:1 10

1

1.2.2 Chitinase1 13

1

1.2.2.1 Ngu ồn chitinase:1 13

1

1.2.2.2 Cơ chế hoạt động:1 13

1

1.2.2.3 Các nhân tố ảnh hưởng lên HT chitinase:1 14

1

1.2.2.4 Tính chất sinh hóa của chitinase1 14

1

1.2.2.5 Phân loại chitinase1 15

1

1.2.2.6 Ứng dụng của chitinase1 16

1.2.3 NS với khả năng sinh enzyme chitinase 19

1.2.3.1 Một số chủng NS có HT chitinase cao1 19

1

1

1

1.3.1 Ngoài nước1 21

1

1.3.2 Trong nước1 24

1

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP1 25

1

2.1 Vật liệu1 25

1

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu1 25

1

2.1.2 Hóa chất, nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ1 25

1

2.1.3 Môi tr ường1 26

1

2.2 Phương pháp nghiên cứu1 27

1

2.2.1 Phương pháp kích hoạt giống1 27

1

2.2.2 Phương pháp bảo quản nấm sợi1 27

1

2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại NS1 28

1

2.2.4 Phương pháp xác định mật số BT vi sinh vật [5]1 28

1

2.2.5 Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng KL1 29

1

2.2.6 Phương pháp nuôi cấy NS trên MT bán rắn thu enzyme chitinase1 29

1

2.2.7 Phương pháp tách chiết enzym thô từ canh trường nuôi cấy1 29

1

2.2.8 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vòng phân giải1 30

1

2.2.9 Phương pháp xác định HT của enzyme chitinase bằng phương pháp so màu1 30

1

2.2.10 Phương pháp định lượng protein [8]1 33

1

2.2.11 Khảo sát MT và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp chitinase của các chủng

NS [4], [10], [23], [32], [33]1 35

1

2.2.11.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon trong MT nuôi cấy1 35

2.2.11.2.Khảo sát thời gian nuôi cấy 35

2.2.11.3 Khảo sát pH của MT1 35

1

2.2.11.4 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy1 36

1

2.2.11.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl1 36

1

2.2.11.6 Khảo sát hàm lượng cơ chất chitin1 36

1

2.2.12 Tối ưu điều kiện nuôi cấy nấm P citrinum bằng qui hoạch thực nghiệm [10], [17]1 36

1

2.2.13 Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P citrinum [4], [43], [44]1 39

1

2.2.13.1 Thu nhận tủa protein1 39

1

1

1

2.2.14 Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm tăng sinh khối NS Rhizoctonia solani của chế phẩm enzyme chitinase [4], [20]1 40

1

2.2.15 Ứng dụng chế phẩm chitinase vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm [4], [46]1 41

1

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1 42

1

3.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme chitinase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ1

42

1

1

3.2.1 Chủng nấm số 161 43

1

3.2.2 Chủng nấm số 101 45

1

3.3 Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2

chủng NS P citrinum và A protuberus1 47

1

3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn C trong MT nuôi cấy1 47

1

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy1 48

1

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy1 51

3.3.6 Ảnh hưởng của HL chitin trong MT nuôi cấy 53

3.3.7 Kết quả qui hoạch thực nghiệm để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng P citrinum1 55

1

3.4 Nghiên cứu đặc điểm của CP chitinase thô từ chủng P citrinum1 58

1

3.4.1 Thu nhận CP chitinase thô bằng muối (NHR4R)R2RSOR4R1 58

1

3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên HT của CP chitinase1 58

1

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên HT của CPE chitinase thô1 60

1

3.5 Bước đầu thử nghiệm ứng dụng CPE chitinase thô để phòng trừ nấm hại cây trồng1 62

1

3.5.1 Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc kìm hãm tăng sinh khối nấm Rhizoctonia solani1 62

1

3.5.2 Ứng dụng CPE chitinase thô vào việc ức chế BT nấm Fusarium oxysporum nảy mầm1 64

1

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ1 66

1

4.1 Kết luận1 66

1

4.2 Kiến nghị1 67

1

TÀI LIỆU THAM KHẢO1 67

1

PHỤ LỤC1 74

1

1

1

1

PHỤ LỤC 4 MỘT SỐ HÌNH ẢNH1 77

1

DANH MỤC VIẾT TẮT

BSA: Bovine serum albumin

CPE: chế phẩm enzyme

DNS: 3,5 – dinitrosalicylic axit

OD: mật độ quang

∆OD: hiệu số giữa mật độ quang của mẫu đối chứng và mẫu thật

U: đơn vị hoạt độ enzyme

MỞ ĐẦU

cho sinh vật, cũng như NS có tính thích nghi cao và tạo ra sản phẩm trao đổi chất đặc biệt hơn so với điều kiện khác Hệ vi sinh vật ở đây rất đa dạng, phong phú, sinh tổng hợp nhiều chất có HT sinh học như các loại enzyme xenlulase, protease, chitinase, lipase… và chất kháng sinh để có thể phân hủy các chất có trong hệ sinh thái RNM thường xuyên bị ô nhiễm

Một trong những nguồn rác thải dồi dào ở RNM đó là các loại vỏ của động vật chân khớp ở biển như: tôm, cua, ghẹ…có thành phần chủ yếu là chitin Chitin là chất khó phân hủy Có thể sử dụng nhiều biện pháp hóa lý khác nhau để phân hủy chitin nhưng chi phí rất cao Hiện nay người ta đã nghiên cứu chiết tách enzyme chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau: động vật, thực vật, vi khuẩn, nấm… nhưng chỉ có enzyme chitinase do vi sinh vật tổng hợp đặc biệt là do nấm tổng hợp mới

Ngoài ra enzyme chitinase còn có rất nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghiệp và y học Khả năng khử chitin làm cho chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, giảm ô nhiễm MT Chitinase được khai thác sử dụng như là tác nhân phòng trừ sinh học Chúng cũng có vai trò quan trọng trong sự hình thành thể nguyên sinh nấm, phòng trừ muỗi, sản xuất các chitooligosaccharid hoạt hóa

Trong vitro những thí nghiệm thử HT kháng nấm bằng cách sử dụng Trichderma harzianum đã làm phân hủy thành tế bào của nấm gây bệnh Colletotrichum gloeosporioides

Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn một số chủng NS từ RNM Cần

Giờ có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase cao”

Mục tiêu của đề tài:

Góp phần tìm hiểu đặc điểm và vai trò của enzyme chitinase từ các chủng NS có nguồn gốc từ RNM Cần Giờ làm cơ sở cho việc ứng dụng trong thực tiễn

Nhiệm vụ của đề tài

trong phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐH Sư phạm TPHCM Chọn ra 2 chủng có khả năng sinh enzyme chitinase cao

2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại đến loài 2 chủng thu được

3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp chitinase của 2 chủng NS đã chọn Chọn ra 1 chủng NS có HT enzyme chitinase cao để tối ưu hóa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm

trồng

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu nội dung 1 tại PTN Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp HCM

Nghiên cứu nội dung 2 tại Phòng Xét Nghiệm NK – Biotek, quận 7, Tp HCM

Nghiên cứu nội dung 3,4,5 tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ

Đề tài được tiến hành trong thời gian từ tháng 4 năm 2011 đến tháng 9 năm 2011

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NS trong hệ sinh thái RNM

1.1.1 Giới thiệu về RNM

* Giới thiệu chung về RNM

Diện tích RNM trên thế giới khoảng 15.429.000 ha Khu vực châu Á có diện tích RNM lớn nhất

là Ấn Độ-Thái Bình Dương với diện tích khoảng 6.9 triệu ha Nước có diện tích RNM lớn nhất châu Á

RNM được hình thành nhờ phù sa do các con sông cùng với trầm tích biển do thủy triều mang vào tạo thành các bãi lầy RNM chịu tác động của cả biển lẫn lục địa nên tài nguyên sinh vật rất đa dạng phong phú và chính sự tác động này đã làm cho sinh vật có những cơ chế tồn tại rất đặc biệt

RNM có những vai trò hết sức quan trọng: Hạn chế tác hại của song thần và bão lớn, bảo vệ đê biển, làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường, bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ

nước ngầm, làm sạch MT nước khi có lũ quét, sạt lở đất, cung cấp nhiều sản phẩm phục vụ cho nhu cầu

và lợi ích của con người

* Giới thiệu về RNM Cần Giờ - Tp HCM

RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn, nằm ở cửa ngõ đông nam thành phố Hồ Chí Minh Thuộc xã Long Hòa, huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh

0

P

C, biên độ dao động nhiệt

0

P

C, thời điểm có nhiệt độ cao nhất: tháng 12, tháng 1 Độ mặn trung bình: 1,5 – 2,5 %, tùy theo khu vực có thể lên đến 18%, độ mặn phụ thuộc vào thủy triều của biển đông và lưu lượng nước sông Đồng Nai, sông Sài Gòn Độ mặn lớn nhất khi triều cường, nhỏ nhất khi triều kém

Hệ sinh vật: thực vật trên 150 loài, động vật thủy sinh không xương sống trên 700 loài, cá trên

137 loài, động vật có xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài động vật có vú, chim có khoảng 130 loài

đối với hệ sinh thái RNM Vi sinh vật phân bố rộng rãi và có mặt trong mọi cơ chất của RNM Nhiều vi sinh vật có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người Tuy nhiên cho đến nay những nghiên cứu về vi sinh vật ở RNM còn rất ít, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của hệ vi sinh vật RNM

1.1.2 Đặc điểm sinh học NS ở RNM

1.1 2.1 Đặc điểm hình thái

bào, màng sinh chất, chất nguyên sinh và nhân phân hóa Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng gọi là neocercosporin

Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên

cơ quan sinh sản, đó chính là cuống sinh BT Từ cuống sinh BT sẽ hình thành BT là một tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Mỗi loài nấm có hình dạng BT và màu sắc BT có khác nhau Chính màu sắc của BT đã tạo nên màu sắc của các KL và màu sắc đặc trưng của các chi và loài nấm

Sợi nấm có đường kính trung bình 5-10µm, đôi khi rất lớn tới 25µm nhưng cũng có khi rất nhỏ chỉ 1-2µm Chiều dài sợi nấm có thể đạt vài chục centimet Sợi nấm có thể có vách ngăn tạo thành dạng đa bào, tuy nhiên do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào có thể có một, hai nhiều nhân hay chẳng có nhân nào Sợi nấm cũng có thể không có vách ngăn, bên trong sợi nấm chứa nhiều nhân được gọi là các tế bào đa nhân, gặp ở các lớp Trichomycetes, Oomycetes

Hệ sợi nấm gồm khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Trên khuẩn ti khí sinh sẽ hình thành nên

cơ quan sinh sản là cuống sinh BT Từ cuống sinh BT sẽ hình thành nên các BT BT là một tế bào sinh sản, thường có dạng hình cầu Khi BT được phân tán từ cơ thể mẹ đến nguồn cơ chất thích hợp nó sẽ nảy mầm, phát triển theo cả 3 chiều tạo thành hệ sợi nấm mới Sau vài ngày, số lượng sợi nấm tăng lên rất nhiều tạo thành một đám, ta có thể quan sát bằng mắt thường Hệ sợi nấm phát triển đến giai này được gọi là KL Tùy theo loài mà KL có các hình dạng khác nhau nhưng thường có hình cầu Sau một thời gian, trên các sợi nấm khí sinh sẽ hình thành các BT có hình dạng và màu sắc khác nhau đặc trưng cho từng loài

1.1.2.2 Đặc điểm sinh sản

số hình thức sinh sản ở NS:

Sinh sản vô tính: Sinh sản vô tính theo kiểu đứt đoạn, sinh sản vô tính bằng BT áo, sinh sản vô

tính bằng BT kín, sinh sản vô tính bằng BT đính

Sinh sản hữu tính: sinh sản hữu tính bằng BT túi (Ascospore), sinh sản hữu tính bằng BT đảm

(Zigospore)

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí – sinh hóa

- Sinh lí:

Các loài sinh vật nói chung và NS nói riêng có sự sinh trưởng, phát triển và đặc điểm phân bố phụ thuộc rất lớn vào các yếu tố MT RNM là một hệ sinh thái chịu nhiều tác động của gió bão, chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền (chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp) lẫn chất thải từ MT biển…Vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS ở RNM

Nhiệt độ: NS thuộc nhóm VSV ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 20P

0

P

0

P

C, cá

0

P

0

P

C

tính chất của màng tế bào và làm ảnh hưởng đến sự phân ly của các cấu tử thức ăn trong MT Do đó, sự hấp thu các loại thức ăn vào trong tế bào bị thay đổi MT có pH quá cao hay quá thấp đều làm cho sự sinh trưởng của NS yếu đi

Ánh sáng: ánh sáng không cần cho quá trình sinh trưởng của hầu hết các loài NS, nhưng ánh sáng lại ảnh hưởng đến sự hình thành BT của một số loài nấm

Khí oxi: nồng độ oxi rất cần cho hoạt động sống của NS vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc

Nguồn C: cơ thể nấm không có diệp lục nên không có khả năng tự dưỡng và phải sống kí sinh,

hoại sinh hay cộng sinh Chúng là những VSV dị dưỡng hóa năng hữu cơ NS có khả năng đồng hóa nhiều nguồn C khác nhau, ngoài những đường đơn dễ hấp thụ như glucose chúng cũng sử dụng trực tiếp các đường như mantose, saccarose…

Nguồn N: N đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia thành phần cấu tạo của các protein và

đặc biệt là enzyme NS có khả năng đồng hóa cả nguồn N hữu cơ lẫn vô cơ, các chủng NS khác nhau

có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn N

Độ mặn: Đa số các NS ở RNM đều có khả năng chịu mặn cao Chúng có thể sinh trưởng ở nồng

độ muối từ 2% - 20% Thậm chí một số NS ở RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% Đây

là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM

- Sinh hóa [1]

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển NS tiết ra MT ngoài nhiều sản phẩm như các sắc tố, các chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm, trong đó nhiều chất có HT sinh học có ý nghĩa quan trọng đối với con người cũng như hệ sinh thái như các các enzyme, kích thích tố tăng trưởng, vitamin, kháng

nấm ở đất liền Do đó, các sản phẩm trao đổi chất của chúng, trong đó đặc biệt là hệ enzyme cũng mang tính chất khác lạ hơn

HT enzyme thủy phân ngoại bào

Cellulase: là enzyme ngoại bào có khả năng cắt đứt liên kết 1–4 β - glucosid của phân tử cellulose để tạo thành các đơn phân glucose Cellulose là thành phần chủ yếu trong xác thực vật do đó enzyme này có vai trò quan trọng trong việc phân giải những hợp chất hữu cơ tồn đọng trong MT Enzyme này được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm nhờ khả năng phân giải cellulose Những NS có khả năng phân giải cellulose là các nấm thuộc chi