Trong phản ứng dị ứng, các tế bào miễn dịch như tế bào mast, bạch cầu ưa eosin, bạch cầu ưa bazơ và các đại thực bào khi được hoạt hóa bởi phản ứng kháng nguyên – kháng thể sẽ giải phóng
Trang 1TÁC DỤNG CỦA CÂY SÀI ĐẤT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
Trang 2TÁC DỤNG CỦA CÂY SÀI ĐẤT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1 PGS.TS Đào Thị Vui
2 TS Đỗ Thị Nguyệt Quế Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội
HÀ NỘI - 2016
Trang 3PGS.TS Đào Thị Vui – Trưởng bộ môn Dược lực, Trường Đại
học Dược Hà Nội
TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Giảng viên bộ môn Dược lực, Trường
Đại học Dược Hà Nội
Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và
giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt
nghiệp
Em cũng xin được bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới CN Phí Thị
Xuyến – Khoa Dược lý, Viên Dược liệu đã giúp đỡ em thực hiện đề
tài Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên
trong Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình
giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong quá trình học tập và
thực hiện đề tài
Em xin được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong Ban giám hiệu
Nhà trường, các phòng ban, các bộ môn của Trường Đại học Dược
Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại
trường
Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người
thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng
hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời
gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2016
Sinh viên
Đinh Thị Kiều Giang
Trang 4DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN……… 3
1.1 Tổng quan về bệnh dị ứng……… 3
1.1.1 Định nghĩa dị ứng……… 3
1.1.2 Tình hình dịch tễ dị ứng……… 3
1.1.3 Phân loại dị ứng……… 3
1.1.4 Cơ chế bệnh sinh của dị ứng typ I……… 4
1.2 Các thuốc được sử dụng trong điều trị dị ứng……… 7
1.2.1 Các thuốc kháng histamin H1……… 7
1.2.2 Các loại corticoid sử dụng trong điều trị dị ứng……… 8
1.3 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu chống dị ứng……… 9
1.3.1 Mô hình nghiên cứu in vivo……… 9
1.3.2 Một số mô hình nghiên cứu in vitro……… 11
1.4 Tổng quan một số nghiên cứu đánh giá khả năng bài tiết beta-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3……… 12
1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước……… 13
1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước……… 14
1.5 Tổng quan về dược liệu nghiên cứu……… 15
1.5.1 Đặc điểm thực vật……… 15
1.5.2 Thành phần hóa học……… 15
1.5.3 Tác dụng và công dụng……… 16
Trang 52.1.1 Nguyên liệu……… 17
2.1.2 Tế bào dùng trong nghiên cứu……… 17
2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm……… 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu……… 20
2.2.1 Triển khai mô hình đánh giá khả năng tiết β-hexosaminidase và β-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3……… 20
2.2.1.1 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào RBL-2H3 20
2.2.1.2 Đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase và β-hexosaminidase toàn phần……… 22
2.2.2 Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng tiết β-hexosaminidase và β-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3……… 24
2.2.2.1 Đánh giá độc tính của cắn dịch chiết nước sài đất lên tế bào RBL-2H3 ……… 25
2.2.2.2 Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng tiết β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3……… 27
2.2.3 Xử lý số liệu……… 29
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 30
3.1 Kết quả……… 30
3.1.1 Triển khai mô hình đánh giá khả năng tiết β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3……… 31
3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng bài tiết β-hexosaminidase và trên β-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3……… 34
3.1.2.1 Khả năng gây độc tế bào RBL-2H3 của cắn dịch chiết nước sài
Trang 6trên β-hexosaminidase toàn phần……… 35
3.2 Bàn luận……… 38 3.2.1 Bàn luận về triển khai mô hình……… 38
3.2.2 Bàn luận về tác dụng của dịch chiết nước sài đất lên khả năng
tiết β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3……… 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Trang 82.1 Một số hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm 18
3.1 Giá trị mật độ quang thu được khi định lượng
β-hexosaminidase trong dịch nuôi cấy tế bào 30
3.2 Giá trị mật độ quang thu được khi định lượng
Trang 91.1 Cơ chế giảỉ phóng chất hóa học trung gian gây dị ứng 5
2.1 Quy trình chuẩn bị cắn dịch chiết nước sài đất 17
3.2 Qui trình đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase và
β-hexosaminidase toàn phần trên tế bào RBL-2H3 34
3.3 Ảnh hưởng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng
bài tiết β-hexosaminidase 36
3.4 Ảnh hưởng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng
bài tiết β-hexosaminidase toàn phần 38
Trang 10ĐẶT VẤN ĐỀ
Dị ứng là đáp ứng miễn dịch bình thường của cơ thể nhằm chống lại các chất có trong môi trường (chất gây dị ứng) [8] Dị ứng bao gồm những rối loạn cấp tính hoặc mạn tính Các rối loạn mạn tính thường không đe dọa tính mạng nhưng gây ảnh hưởng đến sức khỏe, sinh hoạt của bệnh nhân, làm giảm chất lượng cuộc sống Dị ứng cấp tính có thể gặp ở mức độ nặng (như sốc phản vệ, hen) đe dọa tính mạng người bệnh [10]
Tỷ lệ người mắc dị ứng khá lớn (khoảng 25% người lớn) và có xu hướng gia tăng do những thay đổi về môi trường sống (ô nhiễm không khí, các chất hóa học … ) [8] Trong phản ứng dị ứng, các tế bào miễn dịch như tế bào mast, bạch cầu ưa eosin, bạch cầu ưa bazơ và các đại thực bào khi được hoạt hóa bởi phản ứng kháng nguyên – kháng thể sẽ giải phóng một số chất trung gian hóa học (như histamin, leukotrien, prostaglandin …) gây ra các triệu chứng dị ứng và đồng thời cũng giải phóng ra các enzym như -hexosamininase, β- D-glucoronidase,β- D-galactosidase [26]
Để nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc chống dị ứng trên thực
nghiệm, đã có một số mô hình nghiên cứu in vivo và in vitro Các protocol
đánh giá sự giải phóng các chất hóa học trung gian từ tế bào mast, tế bào bạch
cầu là phương pháp nghiên cứu in vitro thường được sử dụng để sàng lọc tác
dụng hoặc để chứng minh cơ chế tác dụng chống dị ứng của các thuốc 2H3 là tế bào bạch cầu ưa bazơ được phân lập từ chuột cống và được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm từ năm 1978 Trên bề mặt tế bào RBL-2H3 có các IgE receptor ái lực cao Khi được hoạt hóa bởi phản ứng kháng nguyên kháng thể, tế bào RBL-2H3 giải phóng ra các chất hóa học trung gian gây dị ứng tương tự tế bào mast [41] Trong hầu hết các mô hình thực nghiệm đánh giá khả năng bài tiết các chất trung gian hóa học đặc biệt histamin của tế bào RBL-2H3 được đánh giá thông qua khả năng bài tiết -hexosamininase do -
Trang 11RBL-hexosamininase luôn được giải phóng ra khỏi tế bào đồng thời với histamin
và histamin kém bền vững trong môi trường thực nghiệm hơn so với hexosamininase Cho đến thời điểm hiện tại, mô hình nghiên cứu này vẫn chưa được triển khai ở Việt Nam Với mong muốn triển khai một mô hình
-nghiên cứu in vitro không quá đắt tiền, phù hợp với việc đánh giá sàng lọc tác
dụng chống dị ứng và cũng là công cụ giúp nghiên cứu khẳng định cơ chế tác
dụng chống dị ứng của các thuốc mới, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Triển
khai mô hình đánh giá khả năng bài tiết beta- hexosaminidase của tế bào RBL-2H3 và áp dụng để đánh giá tác dụng của cây sài đất” tại phòng thí
nghiệm bộ môn Dược lực với 2 mục tiêu:
1- Triển khai mô hình đánh giá khả năng bài tiết beta-hexosaminidase
và beta-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3
2- Áp dụng đánh giá tác dụng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng bài tiết beta-hexosaminidase và trên beta-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3
Nội dung nghiên cứu:
1- Triển khai nuôi cấy và đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase và beta-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3
beta-2- Đánh giá tác dụng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng bài tiết beta-hexosaminidase và trên beta-hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3 đồng thời đánh giá khả năng gây độc tế bào RBL-2H3 của cắn dịch chiết nước sài đất
Trang 12CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về bệnh dị ứng
1.1.1 Định nghĩa dị ứng
Dị ứng là đáp ứng miễn dịch của cơ thể nhằm chống lại các chất có trong môi trường (chất gây dị ứng) gây ra các tổn thương tổ chức và rối loạn chức năng của các cơ quan [8] Các chất gây dị ứng (dị nguyên) gồm thức ăn, phấn hoa, bụi, mỹ phẩm, bào tử nấm, lông động vật… Dị ứng thường biểu hiện ở nhiều cơ quan khác nhau (ngoài da, mắt, mũi xoang ) và có thể gây viêm mũi dị ứng, mẩn đỏ, eczema…
1.1.2 Tình hình dịch tễ dị ứng
Dị ứng là một trong những bệnh thường gặp ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng cuộc sống và trong một số trường hợp dị ứng nặng thậm chí có thể ảnh hưởng đến tính mạng bệnh nhân (như sốc phản vệ, hen) Một số bệnh dị ứng thường gặp là viêm mũi dị ứng và hen suyễn đã có xu hướng gia tăng trong vòng 2 - 3 thập kỷ qua [42] Có tới 10 - 20% dân số trên thế giới bị viêm mũi dị ứng [44] Bệnh hen suyễn dị ứng và các rối loạn dị ứng khác tăng nhanh trong các quốc gia công nghiệp vào những năm 1960 và 1970, và gia tăng nhiều hơn nữa trong những năm 1980 và 1990 [9] Có khoảng 300 triệu bệnh nhân hen phế quản (trong đó nguyên nhân chính dẫn đến hen phế quản
là do dị ứng) và con số này sẽ có thể sẽ tăng lên là 400 triệu bệnh nhân vào năm 2025 [19]
1.1.3 Phân loại dị ứng
Có nhiều cách phân loại dị ứng Có thể phân loại dị ứng theo nguồn gốc
và bản chất dị nguyên, theo hệ thống cơ quan bị tổn thương hoặc theo typ Theo nguồn gốc và bản chất dị nguyên, dị ứng có thể do dị nguyên ngoại sinh (không nhiễm trùng, nhiễm trùng); Do dị nguyên nội sinh Dị ứng phân loại theo hệ thống cơ quan bị tổn thương như da, đường hô hấp, mắt, dạ dày –
Trang 13ruột, gan, thận, toàn thân Tuy nhiên cách phân loại dị ứng hay được sử dụng
nhất là phân loại theo các typ quá mẫn Theo các typ quá mẫn, dị ứng được
- Dị ứng typ IV: Được gọi là dị ứng muộn Dị nguyên là vi khuẩn, virut, độc tố vi khuẩn, một số nhỏ là thuốc Kháng thể là các lympho T mẫn cảm Dị ứng gây ra do đáp ứng qua trung gian tế lympho T với kháng nguyên,
từ đó hoạt hóa đại thực bào
1.1.4 Cơ chế bệnh sinh của dị ứng typ I
Đối tượng nghiên cứu trong đề tài này là dị ứng typ I vì vậy đề tài chỉ xin tổng quan cơ chế bệnh sinh đối với dị ứng typ I Phản ứng dị ứng typ I là đáp ứng miễn dịch thông qua IgE và chủ yếu gây tăng tiết histamin từ tế bào mast và từ tế bào bạch cầu ưa bazơ [40], [47] Tăng bạch cầu ưa eosin trong máu và tại mô là đặc điểm của viêm do dị ứng và hen [43] Dị nguyên là phấn hoa, huyết thanh, lông vũ, bụi Các kháng thể được sinh ra
là IgE và IgG Tế bào mast và bạch cầu ưa bazơ là những tế bào quan trọng nhất tham gia phản ứng dị ứng typ I Khi được hoạt hóa, tế bào mast và tế bào bạch cầu ưa bazơ giải phóng ra hàng loạt các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, các prostaglandin, các proteoglycan, các leukotrien, các cytokin và các serin protease như β- hexosaminidase,
Trang 14β- D-glucoronidase, β- D-galactosidase Cơ chế giải phóng các chất hóa học trung gian từ tế bào mast, tế bào bạch cầu như sau:
Hình 1.1 Cơ chế giảỉ phóng chất trung gian hóa học gây dị ứng
Phản ứng viêm dị ứng biểu hiện qua trung gian Th2 của tế bào T và tế bào lympho B để tạo kháng thể IgE đặc hiệu đối với từng kháng nguyên [17] IgE sau đó gắn vào FcεRI receptor nằm trên bề mặt tế bào Phức hợp kháng nguyên – kháng thể (IgE–FcεRI) hoạt hóa Lyn kinase do phosphoryl hóa phân
tử tyrosin trong phần FcεRI ITAMs (Immunoreceptor tyrosine-based activation motif) nằm trên IgE receptor (FcεRI), kết quả là gây hoạt hóa Syk tyrosine kinase vì vậy gây phosphoryl hóa một số protein trong đó có phospholipase C γ (PLCγ) PLCγ hoạt hóa xúc tác cho phản ứng tạo in IP3 và DAG từ phosphatidylinositol 4,5-biphosphat hydrolysis [8] IP3 gắn vào receptor tại lưới nội bào hoạt hóa store-operated Ca2 + entry (SOCE) gây giải phóng Ca2 + nội bào, DAG cùng với Ca2 + hoạt hóa protein kinase C [49]
Trang 15Những tín hiệu này dẫn đến vỡ tế bào mast giải phóng ra hàng loạt các chất hóa học trung gian, các cytokin gây phản ứng dị ứng cả pha sớm và pha muộn [17]
Đối với phản ứng dị ứng typ I, histamin đóng vai trò quan trọng nhất trong các chất trung gian hóa học Histamin được tổng hợp trong hầu hết các
tế bào động vật nhờ phản ứng đề carboxyl hóa acid amin histidin xúc tác bởi enzym L- histidin decarboxylase Trong đó histamin được tổng hợp chủ yếu ở
tế bào mast và tế bào bạch cầu ưa bazơ và được tổng hợp song song với β- hexosaminidase Histamin sau khi được tổng hợp sẽ được dự trữ trong các hạt tiết trong tế bào Trong các hạt tiết (pH = 5,5) histamin mang điện tích dương sẽ gắn vào các protease, heparin hoặc chondroitin sulfate proteoglycan
Sự bài tiết histamin bình thường thấp Histamin sau khi được bài tiết sẽ bị chuyển hóa theo 2 con đường chuyển hóa chính là methyl hóa tạo thành N-methylhistamin nhờ histamin-N-methyltransferase và thông qua con đường đề amin oxy hóa nhờ các enzym diamin oxidase, tạo thành imidazol acetic acid Hầu hết N-methylhistamin được tạo thành sau đó sẽ chuyển thành N-methylimidazol acetic acid nhờ monoamine oxidase (MAO) Imidazol acetic acid sau đó tiếp tục được chuyển hóa thành imidazol acetic acid ribosid [38] Trong cơ thể histamin nhanh chóng bị chuyển hóa do đó người ta thường tiến hành định lượng N-methylhistamin trong nước tiểu để đánh giá histamin thay bằng việc định lượng trực tiếp histamin Histamin gây co thắt mạch não, đau đầu, chóng mặt, hôn mê, co thắt phế quản dẫn đến khó thở, tăng tính thấm mao mạch phế quản, kích thích tận cùng thần kinh dưới da gây ngứa, giãn mạch gây tụt huyết áp Trên lâm sàng phản ứng dị ứng có thể biểu hiện ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau Phản ứng cấp tính có thể rất nặng như sốc phản
vệ hoặc cũng có thể gây ra một số bệnh trên một số cơ quan như bệnh viêm mũi, sốt mùa, hen phế quản do phấn hoa, mày đay, phù quincke
Trang 161.2 Các thuốc đƣợc sử dụng trong điều trị dị ứng
Khi kháng nguyên xâm nhập cơ thể, kháng nguyên sẽ kết hợp với kháng thể IgE Phức hợp này gắn lên bề mặt tế bào mast và bạch cầu làm hoạt hóa phospholipase C Phospholipase C là enzym xúc tác cho quá trình chuyển phosphatidyl inositoldiphosphat thành diacylglycerol và inositol triphosphat, làm thay đổi tính thấm của màng tế bào mast và bạch cầu Các tế bào này sẽ giải phóng ra các chất trung gian hóa học của phản ứng dị ứng như histamin, bradykinin, serotonin…làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch, gây viêm, thể hiện bằng các triệu chứng trên lâm sàng như: mề đay, mẩn ngứa, hen phế quản, phù quinkce, sốc phản vệ… Các thuốc chống dị ứng là những thuốc làm giảm các triệu chứng dị ứng này thông qua các đích tác dụng như: đối kháng cạnh tranh với histamin tại receptor H1 ở tế bào đích, các thuốc có khả năng
ức chế enzym phospholipase C làm giảm giải phóng histamin và các chất
trung gian hóa học gây dị ứng [4]…
1.2.1 Các thuốc kháng histamin H1
Cơ chế tác dụng: Các thuốc kháng histamin H1 đối kháng cạnh tranh với histamin tại receptor H1 ở tế bào đích, vì vậy nó ngăn được tác dụng của histamin lên tế bào đích [4]
Các thuốc kháng histamin H1 được chia làm 2 thế hệ
Thuốc kháng H 1 thế hệ 1: Gồm 5 nhóm
- Ethanolamin: diphenhydramin, doxylamin
- Ethylendiamin: mepramin, tripeleamin
- Alkylamin: chlopheniramin, phenyramin
- Piperazin: buclizin, cinarizin
- Phenothiazin: promethazin, propiomazin
Các thuốc kháng H1 là những amin hòa tan trong lipid, hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa, thời gian thể hiện tác dụng sau 15 - 30 phút, đạt nồng độ
Trang 17tối đa sau 2 giờ và kéo dài 3 – 6 giờ Thuốc phân bố khắp các tổ chức trong cơ thể kể cả thần kinh trung ương Thuốc kháng H1 đối kháng cạnh tranh với histamin tại receptor H1 của tế bào đích vì vậy nó ngăn được tác dụng làm giãn mạch, tăng tính thấm thành mạch của histamin trên mao mạch do đó làm giảm hoặc mất phản ứng viêm và dị ứng, giảm phù, giảm ngứa Tuy nhiên thuốc có tác dụng ức chế thần kinh trung ương nên gây an thần, ngủ gà gật hoặc kích thích thần kinh trung ương ngay ở liều điều trị [4], [20]
Thuốc kháng H 1 thế hệ 2: Gồm 3 nhóm: Alkylamin (acryvastin), piperazin (cetirizin) và nhóm piperidin (gồm astemizol, loratadin)
Thuốc kháng H1 thế hệ 2 là các thuốc chống dị ứng thế hệ mới ra đời nhằm tăng thời gian tác dụng của thuốc (thời gian tác dụng của thuốc có thể kéo dài tới 20 giờ) đồng thời hạn chế tác dụng phụ gây ức chế thần kinh trung ương, an thần gây ngủ của các nhóm thuốc kháng H1 thế hệ 1 Tỷ lệ liên kết của thuốc với protein huyết tương cao Thuốc khó qua hàng rào máu não vì vậy ít gây tác dụng an thần gây ngủ hơn nhóm kháng H1 thế hệ 1 [4], [20]
1.2.2 Các loại corticoid sử dụng trong điều trị dị ứng
Cơ chế tác dụng: Các thuốc corticosteroid có khả năng ức chế enzym phospholipase C làm giảm giải phóng histamin và các chất trung gian hóa học gây dị ứng [4] Do đó thuốc có tác dụng điều trị dị ứng
Các dạng thuốc corticoid thường sử dụng:
- Thuốc dạng xịt mũi: Fluticason, mometason, budesonid…
- Corticoid dạng hít: Fluticason, budesonid, beclomethason…
- Dạng thuốc nhỏ mắt: Dexamethason, fluorometholon, prednisolon…
- Kem bôi da chứa corticoid: Bao gồm các thuốc như hydrocortison, triamcinolon, flucina…
Trang 18- Corticoid đường uống: Gồm dạng thuốc viên và dung dịch, được sử dụng để điều trị các triệu chứng nghiêm trọng gây ra bởi tất cả các loại phản ứng dị ứng
1.3 Tổng quan về các mô hình nghiên cứu chống dị ứng
Hiện nay đã có một số mô hình nghiên cứu in vivo và in vitro để nghiên
cứu tác dụng dược lý của thuốc chống dị ứng trên thực nghiệm
1.3.1 Mô hình nghiên cứu in vivo
Các mô hình nghiên cứu tác dụng chống dị ứng in vivo thường được
tiến hành trên động vật với cách gây dị ứng và các thông số nghiên cứu thường được áp dụng như sau:
Động vật nghiên cứu: Động vật được sử dụng trong các test đánh giá
tác dụng chống dị ứng (như hen dị ứng, viêm mũi dị ứng… ) trong hầu hết các nghiên cứu là chuột lang Một số động vật khác cũng được sử dụng như chuột cống, chó, khỉ, mèo [50]
Kháng nguyên: Kháng nguyên được sử dụng với mục đích gây phản
ứng dị ứng hoặc gây các bệnh do dị ứng ở động vật thí nghiệm gồm ovalbumin, kháng nguyên lấy từ bọ rệp, kháng nguyên từ phấn hoa, kháng nguyên lấy từ nhựa cây (latex protein allergen), kháng nguyên từ nọc ong, kháng nguyên lấy từ mèo [50]
Nguyên tắc gây dị ứng cho động vật nghiên cứu: Khi cho động vật
nghiên cứu tiếp xúc với kháng nguyên, kháng thể kháng lại kháng nguyên được sinh ra trên bề mặt tế bào hoặc trong huyết thanh Tiếp tục cho động vật phơi nhiễm với kháng nguyên để tạo phản ứng giữa kháng nguyên với kháng thể kháng kháng nguyên đó Phản ứng này hoạt hóa tế bào mast giải phóng
ra hàng loạt các chất hóa học trung gian gây dị ứng như histamin, serotonin, các prostaglandin, các proteoglycan, các leukotrien, các cytokin
Các bước tiến hành gây dị ứng cho động vật thí nghiệm
Trang 19Động vật nghiên cứu được gây dị ứng cho theo hai bước:
- Bước 1: Gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên đã lựa chọn trong khoảng thời gian nhất định để tạo kháng thể kháng lại kháng nguyên trên bề mặt tế bào hoặc trong huyết thanh Ví dụ, để gây dị ứng cho động vật nghiên cứu bằng ovalbumin, tài liệu [50] hướng dẫn như sau: gây mẫn cảm cho động vật nghiên cứu bằng ovalbumin bằng cách tiêm màng bụng 3 lần ovalbumin với liều 10µg/lần trong đó ovalbumin đã được phân tán vào 200µl phosphat-bufferedsaline (PBS) có chứa 1,5 mg Al(OH)3, vào các ngày thứ 1, thứ 14 và thứ 21
- Bước 2: Cho động vật phơi nhiễm với kháng nguyên để tạo phản ứng
dị ứng Động vật nghiên cứu sau đó được tiếp xúc với kháng nguyên ovalbumin dạng aerosol (1% trong PBS) qua đường hô hấp 2 lần/ngày, trong
2 ngày liên tục/1 tuần, trong vòng 12 tuần Để đánh giá phản ứng viêm gây ra trên đường hô hấp và những thay đổi về sinh lý phổi cần tiến hành sau khi động vật tiếp xúc với kháng nguyên qua đường hô hấp sau 6 tuần và kết thúc sau 12 tuần
+ IgE và các cytokin trong huyết thanh: Thu mẫu máu động vật nghiên cứu sau khi tiếp xúc với dị nguyên lần cuối cùng 18 giờ để định lượng IgE và các cytokin huyết thanh
+ Định lượng cytokin trong lách động vật nghiên cứu bằng cách tách các tế bào lách động vật, nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có chứa 2
Trang 20mmol L–glutamin; 0,1mM acid amin không thiết yếu, 100 U/ml penicillin,
100 μg/ml streptomycin, 10% huyết thanh bò và ovalbumin (50 μg/ml) trong
72 giờ Định lượng cytokin trong dịch nuôi cấy và trong tế bào bằng phương pháp ELISA
+ Đánh giá mô bệnh học phổi: Kiểm tra hình thái sợi collagen và các tổn thương của tế bào nội mô đường hô hấp, lớp tế bào cơ trên đường hô hấp
1.3.2 Một số mô hình nghiên cứu in vitro
Các mô hình nghiên cứu tác dụng chống dị ứng typ I thường tập trung vào đánh giá khả năng bài tiết các chất hóa học trung gian khi kháng nguyên kết hợp với kháng thể trong phản ứng dị ứng Thuốc chống dị ứng sẽ làm giảm hoặc mất khả năng bài tiết các chất trung gian hóa học gây dị ứng
Đánh giá khả năng bài tiết các chất hóa học trung gian in vitro thường
được tiến hành trên các tế bào như tế bào mast, tế bào bạch cầu ưa bazơ
- Trên tế bào mast: Tế bào mast được sử dụng trong các nghiên cứu
đánh giá tác dụng chống dị ứng hoặc phòng dị ứng in vitro có thể có nguồn
gốc khác nhau như nguồn gốc từ tế bào tủy xương (Marrow - derived mast cell: BMMC) từ chuột nhắt BALB/c giống đực BMMC được tách ra và nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 (đã bổ xung 2 mmol L-glutamin; 0,1 mmol acid amin không thiết yếu, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin và 10% huyết thanh bò) Sau 3 tuần BMMC có thể được dùng để đánh giá khả năng bài tiết các chất trung gian hóa học gây ra phản ứng dị ứng [13] Trong một nghiên cứu khác lại sử dụng tế bào mast có nguồn gốc từ ruột non [32]
- Loại tế bào thứ hai thường được dùng trong các nghiên cứu in vitro
đánh giá tác dụng phòng hoặc điều trị dị ứng là tế bào bạch cầu Trong các nghiên cứu mà chúng tôi tập hợp được rất nhiều nghiên cứu sử dụng dòng tế bào RBL-2H3 để nghiên cứu tác dụng chống dị ứng của các mẫu thử RBL-2H3 là tế bào bạch cầu ưa bazơ được phân lập từ chuột cống và được nuôi cấy
Trang 21trong phòng thí nghiệm từ năm 1978 Bề mặt tế bào RBL-2H3 có các IgE receptor có ái lực cao Kháng nguyên đặc hiệu gắn vào các IgE receptor trên
bề mặt tế bào làm giải phóng histamin và các chất hóa học trung gian khác
Tế bào RBL-2H3 là dòng tế bào được dùng phổ biến trong các nghiên cứu chống viêm, chống dị ứng và miễn dịch Mặc dù tế bào RBL-2H3 có nguồn gốc từ tế bào bạch cầu ưa bazơ nhưng tế bào RBL-2H3 mang nhiều đặc tính phù hợp và được các nghiên cứu tế bào sử dụng như tế bào mast [26] Cũng giống như tế bào mast, tế bào RBL-2H3 bị kích thích bởi dinitrophenylated-IgE, giải phóng ra các chất hóa học trung gian như histamin, β-hexosaminidase, interleukin-13, TNF-α Do đó tế bào RBL-2H3 phù hợp để
sử dụng trong các nghiên cứu quá trình bài tiết các chất hóa học trung gian dưới tác dụng của các yếu tố thông qua trung gian IgE [41]
Các thông số đánh giá thường được áp dụng:
- Các chất hóa học trung gian được tiết ra từ tế bào gây phản ứng dị ứng như histamin, serotonin, các prostaglandin, các proteoglycan, các serin protease, các leukotrien và các cytokin Vì vậy đây cũng là các thông số được
đánh giá trong các mô hình nghiên cứu in vitro Trong đó histamin là thông số
nghiên cứu thường được quan tâm nhất Tuy nhiên do histamin kém bền nên thường được đánh giá thông qua β-hexosaminidase, là enzym được tổng hợp
và bài tiết đồng thời song song cùng histamin
- Định lượng hoạt độ β-hexosaminidase bằng phương pháp đo mật độ quang
- Đánh giá tác dụng ức chế tiết PGD2 và LTC4 Đánh giá tác dụng này thông qua định lượng PGD2 và LTC4 trong dịch nuôi cấy tế bào
1.4 Tổng quan một số nghiên cứu đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase của tế bào RBL-2H3
Trang 22beta-1.4.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Đã có khá nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng giảm tiết các chất hóa học trung gian của tế bào RBL-2H3 thông qua đánh giá khả năng bài tiết β-hexosaminidase được đăng tải trên các tạp chí khoa học quốc tế Đề tài xin được tổng hợp một số nghiên cứu đánh giá khả năng bài tiết β-hexosaminidase như sau:
Marcela de Souza Santos và cộng sự, năm 2013, đã chứng minh pyridovericin có tác dụng làm giảm tiết β-hexosaminidase từ tế bào RBL-2H3 [23]
Năm 2014 Thana Juckmeta và cộng sự đã đánh giá tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase từ tế bào RBL-2H3 của dịch chiết và một số chất được chiết tách từ Benchalokawichian, một bài thuốc của Thái lan dùng để điều trị
dị ứng [48]
Lee SS cùng cộng sự đã nghiên cứu tác dụng chống dị ứng của dược
liệu Zizania latifolia, trong đó nhóm tác giả này đánh giá tác dụng ức chế tiết
β-hexosaminidase từ tế bào RBL-2H3 của các phân đoạn ethylacetat, butanol
và phân đoạn nước dịch chiết methanol toàn phần Zizania latifolia, các chất
chiết tách được từ phân đoạn ethylacetat Kết quả cho thấy các dẫn chất tricin
có trong Z latifolia là thành phần gây ra tác dụng chống dị ứng, chống viêm
của dược liệu này [21]
Năm 2014 tác giả Jai-aue A và cộng sự cũng áp dụng phương pháp đánh giá khả năng bài tiết β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3 để nghiên cứu tác dụng chống dị ứng của một bài thuốc tại Thái lan (Prabchompoothaweep remedy) [16]
Hagenlocher Y và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của cinnamaldehyd ,
thành phần chính trong dịch chiết cinnamon trên khả năng bài tiết
β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3 và tác dụng của cinnamaldehyd trên
Trang 23một số đích tác dụng trong quá trình bài tiết β-hexosaminidase của tế bào RBL-2H3 [13]
Hong SS và cộng sự nghiên cứu tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase
của tế bào RBL-2H3 của dịch chiết ethanol Pinus thunbergii và của một số
chất chiết tách được từ dịch chiết này là pinusthunbergisid A (1), một neolignan glycosid mới và 6 neolignan glycosid khác (2-7) Kết quả cho thấy các chất 2, 3, 5 và 6 đều có tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase với nồng
độ ức chế 50% (IC₅₀) từ 52,3 đến 75,3 μmol [26]
Một số dược liệu hoặc chất chiết tách từ dược liệu khác đã được chứng
minh có tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase như: Cissus sicyoides [25], [53] Các stilben và phenanthren từ rễ Rheum undulatum, củ Gymnadenia
conopsea toàn cây Cyperus longus [29], [31], [38] Các diarylheptanoid gồm
các curcuminoid từ vỏ Myrica rubra, Acer nikoense và rễ Curcuma zedoaria,
C comosa [27], [32], [33], [37] 3-phenyl-isocoumarin từ lá Hydrangea macrophylla var thunbergii [28].các phenylpropanoid từ rễ Alpinia galangal
[45] Các alkaloid loại β-carbolin từ rễ Stellaria dichotoma [35] Các sesquiterpen từ rễ Hedychium coronarium và từ quả Alpinia oxyphylla [34], [36] Các meroterpen từ hạt Psoralea corylifolia [30] Vitis vinifera L [19],
dịch chiết rễ Dioscorea membranacea Pierre ex Prain & Burkill trong đó
thành phần chính có tác dụng được xác định là một quinon (dioscoreanon)
[23], dịch chiết lá Rhinacanthus nasutus Kuntze, dịch chiết này khá giàu naphthoquinon 1,4-naphthoquinones chiết tách từ R nasutus đã được chứng
minh có tác dụng ức chế hiện tượng vỡ hạt tiết của RBL-2H3 đồng thời giảm sản xuất (TNF)-α và interleukin [17]
1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Hiện nay các mô hình này chưa được triển khai tại các phòng thí nghiệm trong nước
Trang 241.5 Tổng quan về dƣợc liệu nghiên cứu
Sài đất (Wedelia chinensis (Osb.) Merr.), họ Cúc (Asteraceae) Sài đất
còn có tên gọi là Cúc nháp, Ngổ núi, Húng trám, Hoa múc
1.5.1 Đặc điểm thực vật
Sài đất thuộc loài cây cỏ sống dai, có
thể cao hơn 50 cm thân cây màu xanh, mọc
bò, lan tới đâu mọc rễ tới đó, mang lông
trắng cứng nhỏ Thân và lá có lông ráp Lá
gần như không cuống, mọc đối, hình bầu dục
thon, hai đầu hơi nhọn, có lông cứng cả 2
mặt Mép có răng cưa to và nông Lá tươi vò
có mùi như trám và để lại màu xanh đen ở
tay Cụm hoa hình đầu màu vàng, có cuống
dài 5-10 cm mọc ở kẽ lá hay ngọn cành Cây
sài đất trước đây mọc hoang, hiện nay được
trồng tại nhiều nơi, trồng bằng những mẩu
thân, rất dễ sống [1] Hình 1.5 Ảnh cây sài đất
1.5.2 Thành phần hoá học
Phần trên mặt đất của cây sài đất có chứa các nhóm hoạt chất chính sau
[1]:
- Các dẫn chất coumarin thuộc nhóm coumestan:
wedelolacton, dimethyl wedelolacton, norwedelolacton, norwedelic acid
- Các flavonoid như quercetin 3- O-β-D-glucosid, kaempferon 3-O-
β-D-apiosyl-(1-2)-β-D-glucosid, kaempferon 3-O-β-D- glucosid, apigenin,
luteolin
- Ngoài ra cây còn chứa một ít tinh dầu, nhiều muối vô cơ, có vị mặn
(độ tro toàn phần đến 20%)
Trang 251.5.3 Tác dụng và công dụng
- Tác dụng trên miễn dịch: theo Koul S và cộng sự, dịch chiết ethanol
toàn cây sài đất Wedelia chinensis với liều 200 và 400 mg/kg đều ức chế phản
ứng quá mẫn pha muộn và làm tăng chỉ số thực bào trên cừu [18]
- Tác dụng bảo vệ gan: một số tác giả đã đánh giá tác dụng bảo vệ gan
của Wedelia chinensis trên động vật được gây độc gan bằng carbon tetrachlorid, acetaminophen theo đó Wedelia chinensis có tác dụng bảo vệ
gan, chống lại tác dụng gây độc gan của các hóa chất trên động vật nghiên cứu [11], [22], [39], [51] Theo Mishra G và cộng sự, dịch chiết cồn với liều
500 μg/kg cho tác dụng bảo vệ gan rõ rệt hơn so với dịch chiết nước [11] Theo Wagner H và cộng sự, phân đoạn ethyl acetat của dịch chiết cồn có tác dụng bảo vệ gan trên động vật gây độc gan bằng carbon tetrachlorid [51]
- Tác dụng trên thần kinh trung ương: Suresh V và cộng sự đã chứng
minh dịch chiết ethanol toàn cây Wedelia chinensis với liều 200 và 300 mg/kg
làm giảm hoạt động tự nhiên, giảm hoạt động khám phá, gây giãn cơ và làm tăng thời gian ngủ do phenobarbital trên động vật nghiên cứu [46]
- Theo Rehana B và cộng sự dịch chiết methanol lá Wedelia chinensis
có tác dụng ức chế sự phát triển của 15 vi khuẩn, cả vi khuẩn Gram (+) và
Gram (-) và 5 chủng nấm trong đó các chủng steptococus là vi khuẩn Gram (+) nhạy cảm nhất, Candida albican là loại nấm nhạy cảm nhất với dịch chiết methanol lá Wedelia chinensis [7]
- Theo tổng kết của Irshad Nomani và cộng sự, Wedelia chinensis còn
được chứng minh có tác dụng chống ung thư, giảm đau, chống viêm, làm lành
vết thương [15]
Trang 26CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nguyên liệu
Cắn dịch chiết nước phần trên mặt đất của cây Sài đất (Wedelia
chinensis) thu tại Thanh Ba, Phú Thọ Quy trình chuẩn bị như sau:
Hình 2.1 Quy trình chuẩn bị cắn dịch chiết nước sài đất
2.1.2 Tế bào dùng trong nghiên cứu
Tế bào RBL-2H3 (tế bào bạch cầu ưa bazơ chuột cống) được cung cấp bởi American Type Culture Collection (ATCC®
CRL-2256™), được lưu giữ trong nitơ lỏng
Phần trên mặt đất cây sài đất
Dược liệu khô
Dịch chiết nước sài đất
Cắn chiết nước sài đất
Chiết hồi lưu 3h, 2 lần
Cô cách thủyRửa sạch, cắt khúc, phơi/ sấy khô
Trang 272.1.3 Hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
Hóa chất thí nghiệm
Bảng 2.1 Một số hóa chất dùng trong thí nghiệm
Tên hóa chất Nguồn gốc Nước sản
piperazineethanesulfonic acid) Sigma Hoa Kỳ Tetrazolium salt, 3-4,5 dimethylthiazol-2,5
diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Sigma Hoa Kỳ
Trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm
- Hốt nuôi cấy vô trùng Bio Air Euro Clone S.p.A via Figino 20/22
Trang 28- Máy chỉnh pH Eutech instrument pH 510
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5702 R - Đức
- Tủ lạnh -800 C MDF của hãng Sanyo - Nhật Bản
- Máy ủ lắc khay của hãng Awareness – Mỹ
- Micropipette 8 kênh điều chỉnh thể tích của hãng Eppendorf – Đức
- Cân phân tích Precisa XB 220A
- Chai nuôi cấy, đĩa nuôi cấy, ống effendor… Do hãng Corning cung cấp
- Máy móc và dụng cụ thí nghiệm khác thuộc bộ môn Dược lực – trường Đại học Dược Hà Nội
Trang 292.2 Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu (sơ đồ mô hình nghiên cứu):
Hình 2.2 Sơ đồ mô hình nghiên cứu 2.2.1 Triển khai mô hình đánh giá khả năng tiết β-hexosaminidase và β-
hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL-2H3
2.2.1.1 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào RBL-2H3
Tế bào RBL-2H3 được lưu giữ trong điều kiện nhiệt độ lạnh - 1960
C (trong nitơ lỏng) Tế bào được hoạt hóa và nuôi cấy với các bước tiến hành cụ
thể như sau:
RBL-2H3
Triển khai mô hình đánh
giá khả năng bài tiết
β-hexosaminidase và
β-hexosaminidase toàn
phần Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước
cây sài đất lên khả năng bài tiết β-hexosaminidase và β-
hexosaminidase toàn phần
Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng bài tiết β-hexosaminidase và β-hexosaminidase toàn phần
Đánh giá độc tính của cắn dịch chiết nước sài đất lên tế bào RBL-2H3
Đánh giá khả năng bài tiết
