Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên động vật thực nghiệm của cao sắn dây củ tròn di thực tại việt nam

Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng khối lượng cơ quan sinh dục phụ .... Về tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của cao sắn dây củ tròn trên chuột cống cái trưở

MAI THỊ NGOAN

Mã sinh viên: 1101362

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG

HOẠT TÍNH ESTROGEN TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA CAO SẮN DÂY CỦ TRÒN

DI THỰC TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

MAI THỊ NGOAN

Mã sinh viên: 1101362

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TĂNG CƯỜNG

HOẠT TÍNH ESTROGEN TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA CAO SẮN DÂY CỦ TRÒN

DI THỰC TẠI VIỆT NAM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi lời cảm ơn tới:

PGS.TS Đào Thị Vui - Bộ môn Dược lực-Trường Đại học dược Hà Nội

DS Đặng Thị Vân Anh - Trường Đại học Y khoa Vinh

Những người cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận Các cô đã dành nhiều thời gian và tâm huyết tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận Các cô còn là tấm gương về tác phong làm việc và lối sống đạo đức cho tôi noi theo

Xin gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thu Hằng và các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược Lực trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi về điều kiện cũng như kỹ thuật để tôi có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại bộ môn

Nhân dịp nà tôi cũng in gửi lời cảm ơn đến an giám hiệu c ng toàn thể các thầ cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạ d và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự êu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn

bè đã luôn bên tôi, ủng hộ tôi và là ch dựa tinh thần của tôi khi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong cuộc sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận nà c n có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp của các thầ cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Mai Thị Ngoan

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 3

1.1 Estrogen và sự thiếu hụt estrogen 3

1.1.1 Estrogen 3

1.1.2 Sự thiếu hụt estrogen 5

1.2 Một số mô hình dược l nghiên cứu tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen 10

1.2.1 In vitro 11

1.2.2 In vivo 13

1.3 Tổng quan về câ sắn dâ củ tr n 16

1.3.1 Tên gọi 16

1.3.2 Đặc điểm thực vật 17

1.3.3 Phân bố 17

1.3.4 Bộ phận dùng 17

1.3.5 Thành phần hóa học 18

1.3.6 Các nghiên cứu về cây sắn dây củ tròn 18

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.1.2 Liều sử dụng trong nghiên cứu 24

2.1.3 Động vật th nghiệm 24

2.1.4 ụng cụ, h ch t nghi n cứu 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Nội dung nghiên cứu 25

2.2.2 Phương pháp nghi n cứu 26

2.3 Xử l số liệu 32

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33

3.1 Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của sắn dâ củ tr n trên chuột cống cái non 33 3.1.1 Trên sự tăng trưởng tử cung 33

3.1.2 Trên sự tăng trưởng buồng trứng 35

3.1.3 Trên sự tăng trưởng âm đạo 37

3.2 Tác dụng estrogen của sắn dâ củ tr n trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 40

3.2.1 Kiểm tra việc cắt buồng trứng 40

3.2.2 Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo 41

3.2.3 Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng khối lượng cơ quan sinh dục phụ 47

3.2.4 Tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên nồng độ estradiol máu 53

3.3 àn luận 54

3.3.1 Về tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của cao sắn dây củ tròn trên chuột cống cái non 55

3.3.2 Về tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của cao sắn dây củ tròn trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 61

KẾT LUẬN 61

ĐỀ XUẤT 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BC Bạch cầu

DMSO Dimethylsulfoxid

ER Thụ thể estrogen (Estrogen receptor)

ERT Liệu pháp thay thế estrogen (Estrogen replacement therapy)

YES Mô hình sàng lọc estrogen trên các tế bào nấm men tái tổ hợp (Yeast

estrogen screening of recombinant yeast cells)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng tử cung chuột cống cái non 33 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng buồng trứng chuột cống cái non 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng âm đạo chuột cống cái non 38 Bảng 3.4: Ngà đầu tiên xuất hiện tế bào sừng trên các lô chuột thí nghiệm 42 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn trên sự tăng trưởng tế bào biểu mô

âm đạo của chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 43 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn trên phần trăm tế bào sừng âm đạo của chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 46 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng tử cung chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 48 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng âm đạo chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 52 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên nồng độ estradiol máu của chuột cái trưởng thành cắt buồng trứng sau 14 ngà điều trị 53

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Sự tha đổi nồng độ hormon trong chu kì kinh nguyệt 4 Hình 1.2: Pueraria mirifica Airy Shaw & Suvat.; họ Đậu-Fabaceae 17 Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của (a) miroestrol, (b) genistein, (c) puerarin và (d) estradiol 18 Hình 2.1: Cao bán thành phẩm Sắn dây củ tròn 23 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 26 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng estrogen trên chuột cống cái non 28 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tác dụng estrogen trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 31 Hình 3.1: Hình ảnh tử cung sau khi bóc tách trên chuột cống cái non 34 Hình 3.2: Kiểm tra dịch tiết âm đạo trên chuột cắt buồng trứng 41 Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn trên sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 45 Hình 3.4: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn trên phần trăm tế bào sừng âm đạo của chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 47 Hình 3.5: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên sự tăng trưởng khối lượng tử cung chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 49 Hình 3.6: Hình ảnh tử cung sau khi bóc tách trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 50 Hình 3.7: Ảnh hưởng của cao sắn dây củ tròn lên nồng độ estradiol máu chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Estrogen là hormon sinh dục được bài tiết chủ yếu từ buồng trứng trong chu kì kinh nguyệt, đóng vai tr quan trọng đối với sự phát triển nữ giới Estrogen làm xuất hiện và duy trì các đặc tính nữ như phát triển về tầm vóc, dáng mềm mại, vai hẹp, hông nở, giọng nói trong, phát triển tử cung, vòi trứng, âm đạo, tuyến vú [3] Việc suy giảm nồng độ estrogen có thể gây ra rối loạn trên nhiều cơ quan trong cơ thể như rối loạn kinh nguyệt, rối loạn vận mạch, rối loạn tiết niệu- sinh dục, rối loạn tâm lý và nhận thức [5] Do vậy, việc nghiên cứu để tìm ra các thuốc mới có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen có nghĩa quan trọng giúp cải thiện các triệu chứng liên quan đến việc suy giảm nội tiết tố nữ ở giai đoạn tiền mãn kinh và mãn kinh, cũng như cải thiện chức năng sinh dục ở các đối tượng có suy giảm hoạt động

và chức năng buồng trứng Bên cạnh các hợp chất estrogen tổng hợp, gần đâ việc tìm ra các phytoestrogen đang là hướng đi mới trong các liệu pháp bổ sung estrogen Người ta đã phát hiện các loài cây giàu phytoestrogen, trong đó nổi bật là cây sắn dây củ tròn

Sắn dây củ tròn tên khoa học là Pueraria mirifica phân bố ở vùng cao phía bắc

Thái Lan, Mianma Ở Thái Lan, sắn dây củ tr n đã được sử dụng từ rất lâu với mục đích làm thuốc bổ và làm đẹp cho phụ nữ Từ thế kỷ 20, các nhà khoa học Thái Lan, Nhật Bản, Anh đã tiến hành nghiên cứu các tác dụng cũng như thành phần của cao chiết xuất từ củ sắn dây củ tròn Cao sắn dây củ tr n được ác định có chứa các phytoestrogen có tác dụng tương tự nội tiết tố nữ estrogen: kích thích sự phát triển của các tuyến ngực và mô ngực do đó giúp ngực nở và săn chắc, chống lão hóa như kích thích mọc tóc, chống bạc tóc sớm, giảm nếp nhăn và tàn nhang; giúp vóc dáng

eo thon, giảm ngu cơ béo phì và ung thư….[29]

Với tác dụng tốt và giá trị kinh tế cao, sắn dâ củ tr n được trồng di thực tại Việt Nam Tu nhiên, cũng như các loài câ thực vật khác, hoạt chất dược liệu phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, dinh dưỡng, thổ nhưỡng, thời gian trồng, … Liệu câ trồng ở Việt Nam có giữ được tác dụng như ở bản địa, mức độ tác dụng như thế nào? Để trả lời câu hỏi được đặt ra, đề tài thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cống non của sắn dây củ tròn

2 Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng của sắn dây củ tròn

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN Estrogen và sự thiếu hụt estrogen

1.1.1 Estrogen

1.1.1.1 Giới thiệu

Estrogen trong cơ thể gồm các chất: Estradiol, estron và estriol là các estrogen được nhau thai và buồng trứng tiết ra, trong đó estradiol có hoạt tính mạnh nhất và

là sản phẩm bài tiết chính của buồng trứng Ngoài ra tuyến thượng thận, gan, não,

mô mỡ và tinh hoàn tiết ra 1 lượng nhỏ Estron và estradiol có thể được tổng hợp từ

1.1.1.2 Sự điều hò estrogen thông qu trục dưới đồi-tuyến y n-tuyến sinh dục

Các hormon sinh dục được điều hòa thông qua hệ thống trục v ng dưới đồi - tuyến yên - tuyến sinh dục (HPG) Trước dậ thì, v ng dưới đồi tiết ít GnRH Tuyến ên cũng tiết ít hormon hướng sinh dục (FSH, LH), tăng tiết dần dần theo thời gian khiến buồng trứng cũng dần dần tăng tiết estrogen Khi v ng dưới đồi phát triển hoàn thiện, tiết đầ đủ hormon GnRH, kích thích tuyến yên tiết FSH, LH và cuối cùng buồng trứng cũng tiết đầ đủ các hormon sinh dục nữ làm tha đổi rõ rệt niêm mạc tử cung dẫn đến kinh nguyệt, bắt đầu tuổi dậy thì [1]

Chu kì kinh nguyệt gồm có 4 pha: Pha nang trứng, pha rụng trứng, pha hoàng thể, pha kinh nguyệt Pha nang trứng (14 ngà đầu chu kì kinh nguyệt) bắt đầu khi progesteron và estrogen ở mức thấp, gâ feedback âm tính lên v ng dưới đồi và

th trước tuyến ên V ng dưới đồi tiết GnRH, kích thích th trước tuyến yên bài tiết FSH và LH, kích thích nang phát triển Tế bào nang trứng lớn lên, giải phóng estrogen, làm dầy lên niêm mạc tử cung Khi nồng độ estrogen tăng, gâ feedback dương tính lên v ng dưới đồi và tuyến ên làm tăng tiết LH Giữa chu kì (pha trứng rụng), LH đạt đỉnh, kích thích trứng rụng, estrogen đạt đỉnh Nang trứng vỡ, giải phóng trứng vào vòi trứng Sau đó, tu ến yên vẫn tiếp tục bài tiết FSH và LH Dưới tác dụng của LH, một ít tế bào hạt còn lại ở vỏ nang trứng vỡ được biến đổi thành hoàng thể (pha hoàng thể) Hoàng thể tiếp tục bài tiết progesteron và estrogen Dưới tác dụng của estrogen, lớp niêm mạc tử cung tiếp tục được tăng sinh Dưới tác dụng

của progesteron, niêm mạc tử cung đã được chuẩn bị bởi estrogen ở giai đoạn trước dày lên nhanh chóng và bài tiết dịch Nếu trứng không được thụ tinh, hoàng thể tiêu biến, nồng độ estrogen và progesteron đột ngột giảm xuống mức thấp, niêm mạc tử cung bong ra, gây ra hiện tượng kinh nguyệt (pha kinh nguyệt) Mô, máu, trứng không thụ tinh ra theo máu kinh Giai đoạn này kéo dài 3 - 7 ngày [3] [47] Đến thời

kì mãn kinh, buồng trứng đã su kiệt, đã quá giảm nhạy cảm trước sự kích thích của FSH, LH, nên không còn tiết đủ các hormon sinh dục estrogen, progesteron và không còn chu kì kinh nguyệt [1]

Hình 1.1: Sự thay đổi nồng độ hormon trong chu kì kinh nguyệt

1.1.1.3 Tác dụng củ estrogen

Trên chức năng sinh dục, estrogen có vai trò quan trọng trong chu kì kinh nguyệt Ở nồng độ sinh lý, estrogen có tác dụng làm phát triển giới tính và cơ quan sinh dục nữ như âm đạo, vòi trứng, nội mạc tử cung …; tạo nên các đặc tính thứ

phát của giới nữ như giọng nói thanh, vai nhỏ, ngực nở và điều hòa phân bố tạo hình dáng phụ nữ, làm phát triển ương, tóc …

Ngoài ra, estrogen còn có các tác dụng khác như: tăng đồng hóa protid, ngăn ngừa tiêu ương do ức chế tác dụng của hormon cận giáp và kích thích giải phóng calcitonin, làm giảm LDL và tăng HDL - cholesterol nên có tác dụng ngăn ngừa ơ vữa động mạch ở giai đoạn tiền và hậu mãn kinh, liều cao gâ tăng đông máu và tăng kết dính tiểu cầu…[2]

1.1.1.4 Cơ chế hoạt động ở mức độ phân tử củ estrogen

Để tạo ra những tác dụng trên, estrogen hoạt động theo cơ chế gắn với

thụ thể nhân (NR) ER-α được tìm thấy chủ yếu ở tinh hoàn, tế bào biểu mô tử cung,

tế bào ung thư vú,… ER-β được tìm thấy chủ yếu ở buồng trứng (tế bào hạt, tế bào

vỏ, thể vàng và noãn bào), ruột kết, não, ống Fallop, phổi, mô mỡ, thận, ương, tim, bang quang, tuyến thượng thận, tinh hoàn và tuyến tiền liệt Estrogen khuếch tán qua màng tế bào để gắn với ER, tạo thành phức hợp hormon - receptor (H-R) Phức hợp H-R sẽ gắn vào những vị trí đặc hiệu của phân tử ADN nhân, hoạt hóa sự sao chép gen để tạo ra ARN thông tin (mARN) Sau khi được tạo thành, mARN sẽ khuếch tán từ nhân ra bào tương và thúc đẩy quá trình dịch mã tại ribosom để tổng hợp các protein mới, từ đó tạo ra các đáp ứng sinh học đặc biệt của hormon [3]

1.1.2 Sự thiếu hụt estrogen

1.1.2.1 Một số trường hợp thiếu hụt estrogen

Sự thiếu hụt estrogen có thể diễn ra trong nhiều giai đoạn khác nhau suốt cuộc

đời của phụ nữ Khi bước vào tuổi dậy thì, estrogen có tác dụng làm phát triển cơ

thể, phát triển các đặc tính nữ như giọng nói thanh, ngực nở, phát triển ương, Sự thiếu hụt estrogen dẫn đến cơ thể chậm phát triển, chậm dậy thì, kinh nguyệt không đều hoặc vô kinh Sự thiếu hụt estrogen và vô kinh có thể liên quan đến suy dinh dưỡng, thiểu năng cơ quan sinh dục (buồng trứng), thiểu năng v ng dưới đồi, thiếu aromatase bẩm sinh (enzym chuyển hóa testosteron thành estrogen) hoặc kháng estrogen (estrogen receptor đột biến) [48]

Khi người phụ nữ đến gi i đoạn tiền mãn kinh và mãn kinh, buồng trứng đã

suy kiệt, đã giảm nhạy cảm trước sự kích thích của FSH, LH, nên không còn tiết đủ estrogen [1]

Dựa vào nguyên nhân gây suy giảm buồng trứng, có thể chia thành 2 loại: mãn kinh tự nhiên và mãn kinh nhân tạo Mãn kinh tự nhiên là sự ngừng kinh nguyệt vĩnh viễn do buồng trứng mất khả năng tạo noãn Mãn kinh tự nhiên được ác định khi không còn kinh nguyệt nữa sau 12 tháng liên tiếp hoặc không do một nguyên nhân sinh lý hay bệnh lý nào khác gây ra Mãn kinh nhân tạo là tình trạng ngừng kinh nguyệt sau khi cắt bỏ 2 buồng trứng, suy buồng trứng sau khi điều trị hóa chất, phóng xạ

1.1.2.2 Các rối loạn do sự thiếu hụt estrogen

Sự thiếu hụt estrogen có thể gây ra rối loạn trên nhiều cơ quan trong cơ thể như rối loạn kinh nguyệt, rối loạn vận mạch, rối loạn tiết niệu - sinh dục, rối loạn tâm lý và nhận thức

Rối loạn kinh nguyệt

Rối loạn kinh nguyệt là triệu chứng thường gặp và rõ rệt nhất của phụ nữ khi bước sang giai đoạn tiền mãn kinh - mãn kinh [4] ước sang giai đoạn tiền mãn kinh, hoạt động của buồng trứng bắt đầu giảm xuống, số lượng nang noãn còn rất ít, nồng độ estrogen bài tiết ra không đủ khă năng gâ bài tiết FSH và LH cần thiết để phóng noãn Không có hiện tượng phóng noãn, hoàng thể không được hình thành, progesteron không được bài tiết trong giai đoạn sau của chu kì kinh nguyệt do vậy không xuất hiện kinh nguyệt, chu kì kinh nguyệt không đều, kinh thưa hoặc vô kinh

Rối loạn vận mạch:

Rối loạn vận mạch là một trong những triệu chứng điển hình của giai đoạn tiền mãn kinh - mãn kinh với các biểu hiện: bốc hỏa, ra mồ hôi đêm Cơ chế của rối loạn vận mạch được cho là có liên quan đến rối loạn chức năng điều nhiệt và mất cân bằng các chất dẫn truyền thần kinh Một số bằng chứng nghiên cứu cho thấy, thay đổi nồng độ estrogen làm tha đổi nồng độ norepinerphrin và serotonin Nồng độ

norepinerphrin và serotonin tăng lên gâ hạ thấp ngưỡng điều hòa nhiệt độ cơ thể [49]

Rối loạn tiết niệu sinh dục:

Sự suy giảm nồng độ estrogen gây nên các biến đổi về cấu trúc, chức năng của các cơ quan, bộ phận thuộc hệ thống tiết niệu - sinh dục, đặc biệt là các cơ quan như

âm đạo và niệu đạo Với các biểu hiện là teo, khô, ngứa, rát, nhiễm khuẩn âm đạo ình thường, estrogen có tác dụng kích thích các tuyến của âm đạo phát triển, làm biểu mô âm đạo tha đổi từ dạng khối sang dạng tầng Cấu trúc biểu mô dạng tầng vững chắc hơn, do vậ tăng khả năng chống đỡ của âm đạo với những chấn thương

và nhiễm trùng [3] Khi thiếu estrogen, quá trình phân bào của các tế bào giảm, các

mô liên kết dưới biểu mô niêm mạc và các tuyến teo dần, phá vỡ cấu trúc dạng tầng của biểu mô âm đạo Âm đạo giảm tiết hoặc không tiết chất nhờn

Các rối loạn tâm lý và nhận thức:

Những rối loạn tâm l như dễ cáu gắt, lo lắng, trầm cảm, khó chịu, mệt mỏi…có thể xảy ra trong thời kì mãn kinh Nguyên nhân của các triệu chứng này có thể do nhiều yếu tố c ng tham gia như ảnh hưởng của rối loạn vận mạch, rối loạn giấc ngủ, rối loạn sinh dục, tiếu niệu làm cho phụ nữ giai đoạn mãn kinh cảm thấy mệt mỏi, dễ rơi vào trạng thái ức chế, trầm cảm

Suy giảm trí nhớ, hay quên là những rối loạn nhận thức thường gặp ở tuổi mãn kinh Trên não, estrogen có tác dụng bảo vệ và dinh dưỡng tế bào thần kinh do đó thúc đầy khả năng tăng trưởng, tự sửa chữa và tái tạo các tế bào thần kinh khi bị tổn thương Ngoài ra, estrogen còn hoạt động như một tác nhân chống viêm, bảo vệ mạch máu khỏi tổn thương bởi các cytokin và các gốc tự do Hơn thế, estrogen còn kích thích giải phóng NO, gây giãn mạch và do đó giúp tăng tưới máu và cung cấp dinh dưỡng cho não Vì vậy, khi nồng độ estrogen giảm có thể làm giảm số lượng tế bào thần kinh, giảm khối lượng não [33] Não chủ yếu bị teo ở vùng hải mã và thùy đỉnh là các khu vực liên quan chủ yếu tới bộ nhớ và nhận thức

Rối loạn chuyển h :

Thiếu hụt estrogen làm giảm khả năng tổng hợp protein tại các mô và cơ quan

Da trở nên khô và nhiều nếp nhăn hơn do giảm sản xuất collagen lớp dưới da, làm giảm độ căng chắc của da Tóc trở nên khô, thưa và dễ rụng Estrogen làm tích tụ chất béo ở dưới da đ i và mông Khi mãn kinh, nồng độ estrogen giảm xuống làm tha đổi sự phấn bố mỡ trong cơ thể Mỡ tập trung nhiều ở vùng bụng, tỷ lệ vòng eo/mông tăng Trọng lượng cơ thể một số phụ nữ tăng Hậu quả của tăng cân có thể dẫn tới ngu cơ đái tháo đường typ 2 [11]

gã ương Do đó, loãng ương thực sự là một vấn đề cần quan tâm đối với nhiều phụ nữ khi bước sang tuổi mãn kinh

Bệnh tim mạch:

Sau mãn kinh, ngu cơ mắc các bệnh tim mạch ở phụ nữ cao hơn nam giới Các rối loạn tim mạch thường gặp nhất là ơ vữa động mạch, tăng hu ết áp Suy giảm estrogen được cho là một trong các ngu ên nhân làm gia tăng các bệnh tim mạch ở phụ nữ mãn kinh và sau mãn kinh Estrogen có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol LDL và tăng nồng độ cholesterol HDL trong máu; kích thích tế bào nội mạc mạch vành sản xuất NO gây giãn mạch, tăng lưu lượng máu lưu thông và các chất dinh dưỡng nuôi tế bào cơ tim; ngăn ngừa hình thành các mảng ơ vữa động mạch [22] Do đó, su giảm estrogen làm gia tăng nồng độ LDL cholesterol trong máu và ngu cơ ơ vữa động mạch; giảm sản xuất NO, gia tăng sức cản của long mạch, giảm cung cấp máu cho các cơ quan nội tạng quan trọng như tim, não Ngoài

ra, estrogen suy giảm có thể gây nên các rối loạn chuyển hóa, đặc biệt là hiện tượng kháng insulin, ngu cơ hình thành các bệnh về tim mạch như rối loạn lipid máu, đái tháo đường, rối loạn chức năng nội mạc mạch máu, gia tăng ngu cơ hu ết khối và viêm mạch máu,…

1.1.2.4 Điều trị

Mức độ của những rối loạn thời kì tiền mãn kinh - mãn kinh có thể khác nhau, phụ thuộc vào từng đối tượng, tha đổi lối sống lành mạnh là điều cần thiết cho tất

cả các phụ nữ khi chuẩn bị bước sang giai đoạn này và việc điều trị bằng thuốc thực

sự là cần thiết khi các rối loạn ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe và chất lượng cuộc sống

Chế độ dinh dưỡng:

Chế độ dinh dưỡng phù hợp sẽ giúp duy trì chức năng sinh l và chống lại các tác động của stress và bệnh tật: Nhu cầu về năng lượng duy trì khoảng 1900 kcal/ngày, bổ sung đầ đủ vitamin, nước và khoáng chất, chế độ ăn giàu chất ơ, hạn chế chất béo

Th y đổi lối sống:

Tập luyện thể dục - thể thao phù hợp tình trạng sinh lý, sức khỏe, bên cạnh đó, hạn chế sử dụng các chất kích thích như rượu, cà phê, thuốc lá; du trì thái độ sống

tích cực, tăng cường tham gia các hoạt động xã hội để giảm căng thẳng, duy trì tâm

lý tích cực, thoải mái

Điều trị bằng thuốc: Bao gồm điều trị bằng liệu pháp hormon và điều trị h trợ

bằng các thuốc không có hoạt tính hormon

- Điều trị bằng liệu pháp hormon: Là phương pháp bổ sung estrogen cho cơ thể nhằm điều trị các rối loạn tiền mãn kinh - mãn kinh do thiếu hụt estrogen Liệu pháp hormon chia thành 2 loại chính: liệu pháp estrogen đơn độc (viên uống estrogen; estrogen liên hợp (premarin); miếng dán estrogen; kem estrogen; estrogen âm đạo;…) và liệu pháp estrogen phối hợp progesteron (estrogen liên hợp +

- Điều trị h trợ:

Các thuốc h trợ điều trị rối loạn vận mạch: Clonidin, gabapentin, các thuốc

ức chế tái hấp thu serotonin (SSRIs) và ức chế tái hấp thu serotonin-norepineprin (SNRIs) [13], [23]

Các thuốc điều trị và dự ph ng loãng ương: Calci và vitamin D, các biphosphonat, calcitonin, parathyroid hormone (PTH), các thuốc tác dụng trên bộ điều biến thụ thể estrogen chọn lọc SERMs (selective estrogen receptor modulators), strontium ranelat [7]

Sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên: Được chú ý nhiều nhất hiện nay là

thực vật chứa phytoestrogen Các phytoestrogen có tác dụng tương tự estrogen nội sinh, làm giảm các rối loạn tuổi mãn kinh, đặc biệt không gâ ung thư, các bệnh về tim mạch như khi sử dụng liệu pháp hormon

Một số mô hình dược lý nghiên cứu tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen

Có nhiều mô hình đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen, nhìn

chung có thể chia thành 2 nhóm chính: in vitro (nghiên cứu trong ống nghiệm) và in

vivo (nghiên cứu trên động vật thực nghiệm)

- Nghiên cứu in vitro:

 Mô hình theo dõi sự tăng trưởng số lượng tế bào MCF-7 (MCF-7 proliferation assay)

 Mô hình sàng lọc estrogen trên các tế bào nấm men tái tổ hợp (YES assay)

- Nghiên cứu in vivo:

 Mô hình đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cái non

 Mô hình đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cái trưởng thành cắt buồng trứng

1.1.1 In vitro

1.1.1.1 Mô hình theo dõi sự tăng trưởng số lượng tế bào MCF-7

Nguyên tắc: Estrogen có tác dụng kích thích sự phát triển của dòng tế bào ung

thư vú MCF-7 Vì vậy, theo dõi sự gia tăng số lượng tế bào MCF-7 phụ thuộc estrogen giúp ác định tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen [9], [45]

Cách tiến hành:

Nuôi cấy tế bào ung thư vú người MCF-7 trong môi trường dinh dưỡng phù hợp [15], [25], [38] Sau 3 - 4 ngày, chuyển tế bào sang môi trường dinh dưỡng mới

để tối ưu hóa điều kiện phát triển

Chuẩn bị môi trường dung dịch thuốc thử, dung dịch chứng: Hòa tan thuốc thử vào môi trường nuôi cấy được môi trường dung dịch thuốc thử [15] Môi trường dung dịch chứng là môi trường nuôi cấy

Phân lập tế bào và nuôi cấy trong môi trường dung dịch thuốc thử, dung dịch chứng: Tế bào MCF-7 được nuôi cấy ở trên được phân cắt tách riêng từng tế bào đơn (bằng tr psin) sau đó cấ vào đĩa 96 giếng Sau 24h, thay môi trường nuôi cấy bằng môi trường thuốc đã chuẩn bị Các đĩa được nuôi ở 37 0C, 5% CO2 trong 3

ngày [15], [38]

Tính toán kết quả bằng phương pháp MTT: Loại bỏ môi trường cũ, thu lấy tế bào, rửa sạch bằng dung dịch đệm phosphat, thêm 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sau đó đĩa được ủ ở 370C trong 4h Loại bỏ môi trường và MTT còn lại, thu được các tinh thể MTT-formazan Các tinh thể này được h a tan vào dimeth lsulfo id (DMSO) Sau 10 phút đo độ hấp thụ tại 560 nm

Thông số đánh giá: Sự tăng trưởng số lượng tế bào được đánh giá bằng cách

so sánh độ hấp thụ của dung dịch thử so với dung dịch chứng [15], [25], [38]

Chất nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng

tỷ lệ số lượng tế bào MCF-7 (>100%)

1.1.1.2 Mô hình sàng lọc estrogen tr n các tế bào n m men tái tổ hợp

Nguyên tắc: YES được tiến hành bằng cách chuyển receptor estrogen người

(hER) và yếu tố đồng hoạt hóa vào tế bào nấm men, khi gắn vào cơ chất, tương tác với DNA dẫn đến sự biểu hiện của các gen đích ứng với cơ chất Tác dụng tăng cường estrogen được định lượng bằng mức độ biểu hiện của gen mã hóa enzym β-galactosidase, tức là làm tăng hoạt tính β-galactosidase [8], [27]

Nuôi cấ trong môi trường thuốc thử: Pha loãng dịch nấm men đến giá trị OD

600 nm là 0,03 trong môi trường chọn lọc thêm 50 μM CuSO4 để kích thích sản xuất thụ thể, sau đó nuôi cấ trong các bình nón 50ml, đồng thời thêm thuốc thử, ủ trong 18 h trong tủ nuôi cấy, lắc ở 300C [8], [27]

Đánh giá kết quả bằng phương pháp β-galactosidase: Sau khi ủ bệnh, pha loãng dịch nấm men với môi trường chọn lọc thích hợp để giá trị OD 600 nm là 0,25 Tiến hành phản ứng beta-galactosidase như sau: D ng 100 μl dịch nấm men (dịch và tế bào) chuyển sang đĩa 96 giếng có chứa hệ đệm Na-phosphat 0,1M pH 7.0 và 1mg/ml Z mol ase 20T (ez m để phá vỡ hoàn toàn tế bào), ủ 15 phút ở 370C

để phá tế bào Tiếp đó, 40 μl cơ chất ONPG (4mg/ml galactopyranoside trong Natri phosphat 0,1M; pH 7,0) được bổ sung, ủ phản ứng ở

o-nitrophenyl-β-D-30°C trong 30 phút Khi màu vàng của o-nitrophenol (ONP) xuất hiện, dừng phản ứng với 100 µl Na2CO3 1M Đo độ hấp thụ OD tại 420 nm và 550 nm [8]

Thông số đánh giá: Hoạt tính β-galactosidase được tính theo đơn vị Miller [8]

Đơn vị Miller (nmol/phút/ml) = [(OD420 – 1,75 x OD550)] x V1/(T x V2 x OD600 x 0,0045)

Trong đó, 420: bước sóng hấp thụ của ONP; 550: bước sóng tán sắc do tế bào

có trong h n hợp phản ứng; OD600: mật độ tế bào của dịch nấm men mang xác định hoạt tính; T: thời gian thực hiện phản ứng (phút); V1: tổng thể tích phản ứng; V2: thể tích dịch nuôi cấy tế bào mang thử hoạt tính; 0,0045: hệ số hấp thụ của ONP ở bước sóng 420nm

Chất nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng hoạt tính β-galactosidase so với mẫu chứng

Nhận xét: Mô hình theo dõi sự gia tăng số lượng tế bào MCF-7 và mô hình

sàng lọc estrogen trên tế bào nấm men tái tổ hợp có ưu điểm là nhanh, do đó d ng

để nhanh chóng phát hiện các hợp chất có hoạt tính estrogen Tuy nhiên, hạn chế

của mô hình in vitro là kết quả không thể áp dụng trực tiếp cho người bởi vì quá

trình trao đổi chất (hấp thu, phân bố, chuyển hóa) của estrogen và các hợp chất giống estrogen khác với tế bào nấm men, tế bào MCF-7

1.1.2 In vivo

1.1.2.1 Mô hình đánh giá tác dụng tăng cường estrogen tr n chuột cái non

Estrogen là hormon sinh dục nữ, có tác dụng phát triển cơ thể, phát triển và

du trì các đặc tính nữ Trên lâm sàng, sự thiếu hụt estrogen làm trẻ chậm dậy thì, chậm phát triển hoặc vô kinh Vì vậy, trên thử nghiệm động vật, chuột cái non là một trong những đối tượng nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng cường estrogen Trên động vật non vì vẫn còn trục dưới đồi - tuyến yên - buồng trứng (HPG) nên những chất có hoạt tính estrogen có thể tác động lên trục HPG thay vì chỉ tác dụng lên estrogen receptor [35] Người ta đánh giá tác dụng tăng cường estrogen thông qua

sự tăng trưởng khối lượng các cơ quan sinh dục phụ theo phương pháp uterotrophic

Nguyên tắc: Những chất có hoạt tính estrogen có tác dụng làm tăng khối lượng

của các cơ quan sinh dục phụ Vì vậy mô hình chứng minh tác dụng estrogen thông qua so sánh khối lượng cơ quan sinh dục phụ giữa lô dùng thuốc thử và lô chứng sau thời gian điều trị [47]

Cách tiến hành: Chuột cái non được chia ngẫu nhiên thành các lô, cho uống

thuốc liên tục trong 3 ngà [28], [47] Ngà thứ 4, giết chuột, bóc tách tử cung, buồng trứng, âm đạo và cân nga trên cân phân tích Sau đó tử cung, buồng trứng,

âm đạo được sấy trong tủ sấy 700C đến khối lượng không đổi

Thông số đánh giá: Khối lượng cơ quan sinh dục phụ ướt/khô của lô thử so

với lô chứng [47] Chất nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng khối lượng cơ quan sinh dục phụ so với lô chứng

Nhận xét: Đâ là mô hình kinh điển để đánh giá hoạt tính estrogen, khắc phục

được nhược điểm của các mô hình in vitro vì được thực hiện trên cơ thể sống, diễn

ra quá trình trao đổi chất; có thể bao phủ cả các chất có hoạt tính estrogen do tương tác với trục HPG và các chất chỉ tác dụng lên estrogen receptor

1.1.2.2 Mô hình đánh giá tác dụng tăng cường hoạt t nh estrogen tr n chuột cái

trưởng thành cắt buồng trứng

Sự thiếu hụt estrogen không chỉ có thể xảy ra ở trẻ em mà còn phổ biến ở phụ

nữ thời kì tiền mãn kinh - mãn kinh do buồng trứng đã su kiệt hay ở phụ nữ cắt bỏ

2 buồng trứng Chuột cái trưởng thành cắt buồng trứng là đối tượng thí nghiệm mô phỏng cho các trường hợp trên

Nguyên tắc: Trên mô hình chuột cái trưởng thành cắt buồng trứng, việc cắt

buồng trứng đã làm mất chức năng trục dưới đồi-tu ến ên-buồng trứng, mất khả năng sản sinh estrogen từ buồng trứng, dẫn đến hàm lượng estrogen nội sinh lưu thông trong máu ở mức độ thấp Do vậ , những tha đổi trên tử cung và âm đạo do tác dụng của estrogen nội sinh được loại trừ Những chất có hoạt tính estrogen có tác dụng làm tăng khối lượng của các cơ quan sinh dục phụ (tử cung, âm đạo) [47] Bên cạnh đó, những chất này có tác dụng kích thích biệt hóa tế bào biểu mô âm đạo thành tế bào sừng [45] Do vậ , đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của

các chất ngoại sinh thông qua các chỉ tiêu: sự tăng trưởng cơ quan sinh dục phụ, sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo, nồng độ estradiol máu

Cách tiến hành:

ước 1: Cắt buồng trứng: Chuột cái trưởng thành khỏe mạnh, tiến hành cắt buồng trứng, sau đó nuôi hồi phục là ít nhất 14 ngà (đối với chuột cống), 7 ngày (đối với chuột nhắt) [47]

ước 2: Lựa chọn chuột vào nghiên cứu: Chuột cắt buồng trứng hoàn toàn được đưa vào nghiên cứu, chia ngẫu nhiên thành các lô

ước 3: Cho chuột uống thuốc trong 1 thời gian nhất định

ước 4: Đánh giá các chỉ tiêu

- Đánh giá tr n sự tăng trưởng cơ qu n sinh dục phụ theo phương pháp

uterotrophic [47] Ngà cuối c ng, giết chuột, bóc tách tử cung, âm đạo và cân ngay trên cân phân tích Sau đó tử cung, âm đạo được sấy trong tủ sấy 700

C đến khối lượng không đổi

Thông số đánh giá: Khối lượng cơ quan sinh dục phụ (tử cung, âm đạo)

ướt/khô của lô thử được so sánh với lô chứng [47] Chất nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng khối lượng cơ quan sinh dục phụ so với lô chứng

- Đánh giá tr n sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo [30], [37], [45]: Kiểm

tra dịch tiết âm đạo hằng ngày Phết dịch tiết lên phiến kính và nhuộm bằng dung dịch xanh methylen, quan sát dưới kính hiển vi, đánh giá sự có mặt của bạch cầu, tế bào biểu mô có nhân và tế bào sừng

Thông số đánh giá: Sự có mặt của các tế bào sừng là chất chỉ thị cho hoạt tính

estrogen Chất nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi trên vi trường quan sát có nhiều tế bào sừng

- Đánh giá tr n nồng độ estradiol máu [6] [37]: Lấy máu vào khoảng thời gian

nhất định, li tâm lấy huyết thanh định lượng nồng độ estradiol trong huyết thanh

Thông số đánh giá: nồng độ estradiol trong huyết thanh Thuốc được coi là có

tác dụng estrogen khi làm tăng nồng độ hormon estrogen trong huyết thanh

Nhận xét: Mô hình đánh giá tác dụng tăng cường estrogen trên chuột cái

trưởng thành cắt buồng trứng được coi là có độ nhạ cao hơn trên chuột cái non do việc cắt buồng trứng đã làm mất chức năng trục dưới đồi - tu ến ên - buồng trứng, mất khả năng sản sinh estrogen từ buồng trứng Điều nà làm cho việc đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của các chất ngoại sinh được thuận lợi và chính

ác hơn Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên sự tăng trưởng các

cơ quan sinh dục phụ là công cụ hữu dụng để đánh giá hoạt tính estrogen, tuy nhiên cũng có hạn chế như: giết động vật, không theo dõi sự tha đổi cân nặng tử cung trong quá trình điều trị và sau điều trị Đánh giá tác dụng tăng cường estrogen trên

sự tăng trưởng tế bào âm đạo khắc phục được hạn chế đó: không phải giết động vật,

có thể theo dõi được quá trình sau khi không dùng thuốc và kết quả thu được cũng

có độ nhạy cao [14] Định lượng nồng độ estradiol máu đưa ra một cái nhìn trực tiếp về tác dụng tăng cường estrogen, cách thực hiện đơn giản, thường thực hiện cùng các chỉ tiêu đánh giá khác để thấ được mối liên hệ giữa nồng độ hormon và

sự tăng trưởng các cơ quan sinh dục phụ cũng như sự tăng trưởng tế bào âm đạo

Tổng quan về cây sắn dây củ tròn

1.1.1 Tên gọi

Sắn dây củ tròn tên latinh là Pueraria mirificaAiry Shaw & Suvat.; họ Đậu

(Fabaceae) Tên đồng nghĩa: Pueraria candollei var mirifica (Airy Shaw & Suvat.) Niyomdham Sắn dây củ tr n c n được gọi là Kwao Krua hay White Kwwao Krua [29] Tại Việt Nam, câ được gọi là Kwao Krua Trắng, Sắn dây củ tròn, Sâm tố nữ

(Rosidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [26]

Cây dây leo cứng, leo quanh các gốc cây lớn Lá hình chân vịt, có 3 lá chét trên 1 cuống Lá đơn, hình trứng, đỉnh nhọn Hoa màu tím hơi anh, cụm hoa dài 30 cm, mọc ở đầu cành Hoa tương tự như hoa đậu, có 5 cánh Cánh ở ngoài cùng lớn nhất, hai cánh hai bên uốn cong, cái ở trong cùng bao bọc bầu hoa Cây nở hoa vào tháng

2 đến tháng 3 và tạo quả vào tháng 4 Quả dài 3cm, rộng 7 mm Quả già có vỏ màu nâu, có lông, có 3-5 hạt [26] Rễ củ có nhiều kích thước khác nhau Bên ngoài trông giống củ khoai lang, bên trong màu trắng, khi nếm có thể gâ đau đầu, chóng mặt

Củ to hay nhỏ là phụ thuộc vào điều kiện môi trường, thổ nhưỡng và thời gian trồng [29], [40]

1.1.5 Thành phần hóa học

Rễ củ cây sắn dây củ tròn có chứa các hợp chất giống estrogen như miroestrol, deoxymiroestrol và các isoflavonoid như puerarin, daidzin, genistin, daidzein và genistein [10] Cũng như đặc điểm của các dược liệu khác, hàm lượng các phytoestrogen trong rễ củ của câ tha đổi và phụ thuộc vào điều kiện trồng [17] Bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao đã phát hiện ra ít nhất 17 hợp chất phytoestrogen, có thể chia thành 3 nhóm: 10 isoflavonoid (daidzin, daidzein, genistin, genistein, kwakhurin, kwakhurin hydrat, tuberosin, puerarin, mirificin, puemiricarpen) (i); 4 coumestran: coumestrol, mirificoumestran, mirificoumestan glycol, mirificoumestan hydrate (ii); 3 chromene: miroestrol, deoxymiroestrol,

phụ nữ Cụ thể giúp tăng kích thước và làm tăng kích thước vòng ngực Câ được

sử dụng từ lâu trong dân gian, được d ng như một chất bổ sung dinh dưỡng có tác dụng làm giảm các triệu chứng của quá trình lão hóa như chảy xệ ngực, nhăn da, loãng ương, bạc tóc, v.v… Câ là nguồn giàu sterol và các chất giống hormon có tác dụng trong điều trị nhăn và lão hóa da [29]

Dịch chiết thô và các thành phần tinh khiết từ câ SDCT đã được chứng minh

có tác dụng estrogen trong nhiều thí nghiệm tiến hành trên chuột non [38], chuột cái [24], chuột cắt buồng trứng [14], khỉ cái [41] và trong thử nghiệm lâm sàng trên người [34]

Trên mô hình trên chuột cống cái non, Sookvanichsilp N đã phát hiện ra hoạt

tính estrogen của các dịch chiết từ rễ loài Pueraria mirifica, bao gồm: dịch chiết

cồn (PM1), dịch chiết cồn - nước (PM2) và dịch chiết dichloromethan (PM3) PM1 liều 5 - 10 mg/kg, PM2 liều 10 - 100 mg/kg, PM 3 liều 0,1 - 1 mg/kg có tác dụng làm tăng khối lượng tử cung chuột cống non so với lô chứng Sự tăng trưởng khối lượng tử cung phụ thuộc vào liều

Trên mô hình chuột cống cái cắt buồng trứng, Malaivijitnond S và cộng sự đã tiến hành đánh giá tác dụng estrogen của cây SDCT trồng tại 3 vùng khác nhau của Thái Lan tại các mức liều 10 mg/kg, 100 mg/kg và 1000 mg/kg Kết quả đánh giá

sự tăng trưởng cơ quan sinh dục phụ cho thấy: Ở mức liều 10 mg/kg cả 3 mẫu SDCT không làm tăng khối lượng tử cung so với lô chứng; ở mức liều 100 mg/kg, chỉ có 1 mẫu SDCT làm tăng khối lượng tử cung có nghĩa thống kê so với lô chứng (p<0,001); với mức liều 1000 mg/kg cả 3 mẫu đều thể hiện tác dụng làm tăng khối lượng tử cung có nghĩa thống kê so với lô chứng Kết quả đánh giá sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo cho thấ , trước điều trị, chuột chỉ xuất hiện tế bào bạch cầu Sau điều trị, ngà đầu tiên xuất hiện tế bào sừng khác nhau giữa các mức liều và vùng trồng [30] Nghiên cứu của Cherdshewasart W và cộng sự tiến hành trên các mức liều 100 mg/kg, 1000 mg/kg của cây SDCT ở các vùng khác nhau và thu hái vào các mùa khác nhau cũng cho thấy tác dụng tăng cường estrogen của cây SDCT phụ thuộc vào vùng, mùa thu hái và mức liều sử dụng [16]

Cherdshewasart W và cộng sự đã tiến hành một thử nghiệm lâm sàng đánh giá lợi ích của dịch chiết củ SDCT đường uống trên các triệu chứng mãn kinh và thu được kết quả: Dùng SDCT liều 200mg/ngà trong 4 tháng sau đó 200 mg/2 ngà trong 8 tháng cải thiện một cách rõ rệt triệu chứng như: trầm cảm, rối loạn giấc ngủ, khô da, cholesteron máu tăng, vô kinh,…[34]

Lee Y.S và cộng sự đã tiến hành các khảo sát về tác dụng của SDCT trên các

mô hình trên tế bào nấm men tái tổ hợp, mô hình theo dõi sự tăng trưởng số lượng

tính estrogen trên thí nghiệm tế bào nấm men, nhưng lại có tác dụng estrogen trong các tế bào MCF-7 mang những enzym chuyển hóa của con người Các kết quả đã

Nghiên cứu của Udomsuk L trên chuột đực chủng C57BL/6 cho thấy miroestrol và deoxymiroestrol phân lập từ rễ củ của SDCT có tác dụng trên các enzym trong con đường sinh tổng hợp các hormon sinh dục tương tự estradiol Cụ thể, hai chất này tăng biểu hiện của CYP2B9, giảm biểu hiện của CYP1A2 [42]

tiến hành chứng minh tác dụng này trên chuột đực vào năm 2007 [43] Các tác giả

nà cũng tiến hành nghiên cứu tác dụng chống loãng ương của cây trên chuột cái

đã cắt bỏ buồng trứng vào năm 2008 [44] Nghiên cứu cho thấy tác dụng chống loãng ương của cây phụ thuộc vào loại ương, vị trí ương, và khoang ương Tại liều 100 mg/kg và 1000 mg/kg của SDCT có tác dụng chống loãng ương thể hiện trên cả mật độ ương và khối lượng ương

1.1.6.2 Tác dụng chống oxy h

Udomsuk L đã nghiên cứu tác dụng của Miroestrol và deoxymiroestrol – các

phytoestrogen chiết xuất từ loài Pueraria candollei var mirifica trên chuột cho thấy

các hợp chất này có tác dụng trên các enzym Cytochrome P450 của gan, cụ thể: gây tăng hoạt tính benzyloxyresorufin O-dealkylase và giảm hoạt tính methoxyresorufin O-dealkylase [42] Kết quả này khẳng định ảnh hưởng của miroestrol và

deoxymiroestrol trên hai enzym Cytochrome P450 là CYP2B9 (kích thích) và CYP1A2 (ức chế)

Sucontphunt A đã nghiên cứu dịch chiết cồn SDCT trên tế bào thần kinh đại não chuột chủng HT22 thấy có tác dụng chống o hóa và kháng độc với glutamat

thể hiện trên hình ảnh vi học tế bào và số lượng tế bào còn sống [39]

1.1.6.3 Tác dụng tr n chuyển h

Okamura S và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối

chứng chứng minh tác dụng của các phytoestrogen tách từ rễ củ Pueraria mirifica

lên sự chuyển hóa lipid trên những phụ nữ trong thời kỳ mãn kinh Kết quả cho thấy các phytoestrogen có tác dụng làm tăng đáng kể nồng độ Lipoprotein tỷ trọng cao – HDL (34%) và apolipoprotein A-1 (40%), đồng thời giảm nồng độ Lipoprotein tỷ trọng thấp – LDL (17%) và aplipoprotein B (9%) Khi xét tỷ lệ LDL/HDL và Apo B/Apo A thấy hai tỷ lệ này giảm rõ rệt (lần lượt là 37% và 35%) sau 2 tháng dùng thuốc [36]

1.1.6.4 Tác dụng ức chế gây đột biến

Nghiên cứu của Cherdshewasart W trên vi khuẩn Salmonella typhimurium chủng TA98 và TA100 thấy dịch chiết từ Pueraria mirifica (Thái Lan) không gây

đột biến tế bào, mặt khác còn thể hiện rõ tác dụng ức chế đột biến liều dùng 2,5; 5;

10 và 20mg/đĩa khi sử dụng tác nhân gâ đột biến là acrylamide và benzo(a)pyrene [18]

2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)-1.1.6.5 Độc t nh:

Qua thử nghiệm độc tính trên các loài động vật khác nhau chỉ ra rằng

P.mirifica không xuất hiện độc tính có nghĩa thống kê

Nghiên cứu độc tính cấp trên chuột cho thấy liều LD50 cao hơn 2 - 16g/kg cân nặng [20] Liều này cao gấp khoảng 400 lần so với liều người Thái sử dụng (250mg/50kg cân nặng x ngày hoặc 5mg/kg cân nặng x ngày)

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên chuột cống cái uống P.mirifica tại

các liều 10, 100 và 1000 mg/(kg cân nặng x ngày) trong vòng 90 ngày cho thấy:

Liều 10, 100 mg/(kg cân nặng x ngày) không gây ra bất thường trên các chỉ số hóa sinh, huyết học hay trên mô bệnh học các cơ quan nội tạng [20]

Bên cạnh đó, thử nghiệm độc tính trường diễn tại liều 2 và 40 mg/(kg x ngày) trong vòng 6 tháng trên chuột cống cái chỉ ra rằng: không xuất hiện độc tính thể hiện qua: không có sự tha đổi cân nặng các cơ quan nội tạng, chức năng gan, thận, các chỉ số hóa sinh [32] Tuy nhiên tác dụng không mong muốn trên huyết học xuất hiện khi dùng liều 250 mg/kg cân nặng trong 6 tháng điều trị [19], tại liều 300 - 800 mg/kg cân nặng độc tính trên gen, tế bào được ghi nhận

Dựa trên các nghiên cứu trên, liều an toàn của SDCT dùng cho thực phẩm chức năng là 1-2mg/(kg.ngày) hoặc 50 - 100 mg/ngày Phụ nữ mãn kinh sử dụng

viên nang P.mirifica đường uống liều 20 - 100 mg/ngày trong 6 tháng, hoặc liều

100 - 200mg/ngày trong 12 tháng cho thấ không có tha đổi có nghĩa thống kê trên huyết học, chức năng gan, thận [34] Hơn nữa, SDCT không gây ra bất kì bất thường nào trên thỏ, lợn

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng

2.1.1 Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu: Cao bán thành phẩm SDCT.250313 nhập nội (trồng tại Bắc

Giang, Việt Nam) được bào chế dưới dạng cao khô Chế phẩm do tiến sĩ Ngu ễn Quốc Huy cung cấp

Hình 2.1: Cao bán thành phẩm Sắn dây củ tròn

Quy trình chiết xu t c o sắn dây củ tròn nhập nội:

Cân chính xác khoảng 300,00 g bột dược liệu Thấm ẩm dược liệu với 500 ml

3 -4 cm và để ngâm 12h Sau đó liên tục bổ sung dung môi và rút dịch chiết, tốc độ

d ng là 1 ml/phút Tổng lượng dung môi chiết uất sử dụng là 4,5 lít

Dịch chiết dược liệu sau đó được gộp lại, cất qua chân không thu hồi dung môi EtOH đến c n khoảng 1/3 thể tích, sau đó đun cách thủ đến cao khô (khối lượng cao không tha đổi nhiều ở 2 lần cân cuối) Chú khuấ trộn dịch chiết

khoảng 2h/lần khi đun cách thủ Khối lượng cao khô thu được là 171,50 g Cao được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh trong quá trình sử dụng Khi d ng cho chuột thí nghiệm uống, cao được h a trở lại bằng nước cất với tỉ lệ thích hợp và d ng các mức liều tính theo dược liệu khô

Mẫu c o Sắn dây củ tròn mu ở Thái L n:

Tiến hành chiết uất tương tự như mẫu của Việt Nam Khối lượng dược liệu

sử dụng là 100 g, thu được 40 g cao khô

2.1.2 Liều sử dụng trong nghiên cứu

Đề tài sử dụng 4 mức liều tính theo dược liệu khô là 50, 100, 200, 500 mg/kg

để đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen của cây sắn dây củ tròn

2.1.3 Động vật th nghiệm

Chuột cống cái trắng non giống cái mới cai sữa, 21-22 ngày tuổi, khối lượng

60 - 80 g, khỏe mạnh, do Viện Quân Y cung cấp

Chuột cống cái trắng, trưởng thành khỏe mạnh, 60 ngày tuổi, khối lượng 180 -

220 g, do Viện Quân Y cung cấp

Chuột sau khi mua về, được nuôi ổn định 5 ngày với điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường ĐH Dược Hà Nội, được nuôi dưỡng bằng thức

ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.4 Dụng cụ hóa ch t nghiên cứu

- Xylazin (biệt dược Xylazine 20 Inj của Kepro, Hà Lan)

- Povidone Iod 10%, thuốc dùng ngoài da, do công ty CP TW Medipharco Tenamyd (Việt Nam) cung cấp

- Xanh metylen (hóa chất tinh khiết Trung Quốc), do công ty CP hóa chất Công nghệ mới Việt Nam cung cấp

Dụng cụ, máy móc thí nghiệm

- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu)

- Cân kĩ thuật Precisa-BJ610C, TE 412 (Sartorius)

- Kính hiển vi kết nối máy tính Nikon (Nhật Bản)

- ơm, kim tiêm nhựa, bộ dụng cụ mổ chuột

- Dụng cụ lấy máu, cốc có mỏ, bình định mức

- Micropipet 10 ÷ 100 µl

- Một số dụng cụ d ng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội

Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Nội dung nghiên cứu

Đề tài thực hiện với các nội dung:

- Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cống cái non:

 Trên sự tăng trưởng cơ quan sinh dục phụ

- Đánh giá tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng:

 Trên sự tăng trưởng cơ quan sinh dục phụ

 Trên sự tăng trưởng tế bào biểu mô âm đạo

 Trên nồng độ estradiol máu

Nghiên cứu được tiến hành theo sơ đồ sau:

Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1 Đánh giá tác dụng estrogen củ sắn dây củ tròn tr n chuột cống cái non

Nguy n tắc: Estrogen là hormon sinh dục nữ có vai tr làm phát triền và du

trì các đặc tính nữ, làm phát triển tử cung, v i trứng, âm đạo, tu ến vú Những chất

có hoạt tính estrogen sẽ có tác dụng làm tăng các khối lượng nà Do đó, để chứng minh chế phẩm thử có hoạt tính estrogen có thể so sánh khối lượng tương đối các cơ

Đánh giá tác dụng estrogen trên sự tăng trưởng khối lượng cơ quan sinh dục phụ

Đánh giá tác dụng estrogen trên nồng độ estradiol máu

Các mức liều

Đánh giá tác dụng estrogen trên chuột cống cái trưởng thành cắt buồng trứng Lựa chọn mức liều

quan sinh dục phụ (tử cung, buồng trứng, âm đạo) giữa lô thử d ng SDCT và lô chứng theo phương pháp uterotrophic [35]

Các bước tiến hành:

Chuột cống cái non được đánh dấu để phân biệt chuột, chia ngẫu nhiên chuột thành các lô:

Lô 1: Lô chứng, uống nước cất

Lô 2: Lô chứng dương, chuột được tiêm dưới da dung dịch estradiol 10μg/kg cân nặng

Lô 3: Chuột được uống cao SDCT nhập nội liều 50 mg/kg cân nặng

Lô 4: Chuột được uống cao SDCT nhập nội liều 100 mg/kg cân nặng

Lô 5: Chuột được uống cao SDCT nhập nội liều 200 mg/kg cân nặng

Lô 6: Chuột được uống cao SDCT nhập nội liều 500 mg/kg cân nặng

Lô 7: Chuột được uống cao SDCT nhập từ Thái Lan liều 100 mg/kg cân nặng

Các lô được dùng thuốc liên tục trong 3 ngày Ngày thứ 4, giết chuột, bóc tách tử cung, buồng trứng, âm đạo và cân nga trên cân phân tích Sau đó tử cung, buồng trứng, âm đạo được sấy trong tủ sấy 700C đến khối lượng không đổi

Thông số đánh giá:

- Khối lượng tương đối cơ quan sinh dục phụ (buồng trứng, âm đạo, tử cung) ướt: khối lượng cơ quan sinh dục phụ (buồng trứng, âm đạo, tử cung) vừa bóc tách xong (mg)/100g khối lượng cơ thể chuột

- Khối lượng tương đối cơ quan sinh dục phụ (buồng trứng, âm đạo, tử cung) khô: khối lượng cơ quan sinh dục phụ (buồng trứng, âm đạo, tử cung) sau khi sấy khô (mg)/100g khối lượng cơ thể chuột

- Phần trăm tăng khối lượng các cơ quan sinh dục phụ của lô thử so với lô chứng

So sánh kết quả giữa các lô để đánh giá và rút ra kết luận Chế phẩm nghiên cứu được coi là có tác dụng tăng cường hoạt tính estrogen khi làm tăng khối lượng cơ quan sinh dục phụ so với lô chứng

vị trí ban đầu (không cắt buồng trứng) rồi khâu trở lại Tiêm thuốc giảm đau sau đó

Cân chuột

Cho chuột uống thuốc

đặt nhẹ nhàng động vật tại nơi ấm áp, chăm sóc cẩn thận sau phẫu thuật Hàng ngày

vệ sinh vết mổ để đảm bảo không có nhiễm khuẩn Chuột được nuôi phục hồi trong vòng 14 ngày [35]

Lựa chọn chuột vào nghiên cứu

Sau khi nuôi hồi phục 14 ngày, tiến hành kiểm tra tế bào biểu mô âm đạo để đảm bảo việc cắt buồng trứng có đạt hay không

Lấy dịch âm đạo vào lúc 9 h Tiến hành lấy dịch tiết âm đạo bằng pipet Dùng pipet hút 100 µl nước cất, bơm vào âm đạo và hút ra 25 µl Phết dịch tiết lên phiến kính

và nhuộm trong vòng 1 phút bằng dung dịch xanh metylen 0,5% quan sát dưới kính hiển vi, đánh giá sự có mặt của bạch cầu, tế bào biểu mô có nhân và tế bào sừng Cách tính điểm [45]:

0 điểm: Chủ yếu bạch cầu đa nhân trung tính

1 điểm: Bạch cầu đa nhân trung tính và tế bào biểu mô

2 điểm: Tế bào có nhân và tế bào sừng

3 điểm: Chủ yếu tế bào sừng

Ở lô cắt buồng trứng (OVX), chuột đạt điểm 2-3 coi như buồng trứng chưa được cắt hoàn toàn, sẽ bị loại ra khỏi thí nghiệm; chuột đạt điểm 0-1 được đưa vào nghiên cứu

Sau khi tiến hành sàng lọc, đánh dấu để phân biệt chuột, chia ngẫu nhiên chuột thành các lô

Lô 1: (lô chứng trắng) Lô cắt buồng trứng giả, uống nước cất

Lô 2: (lô chứng bệnh) Lô cắt buồng trứng, uống nước cất

Lô 3: (lô chứng dương) Lô cắt buồng trứng, được tiêm dưới da dung dịch estradiol 2 mg/kg cân nặng

Lô 4: Lô cắt buồng trứng, được uống cao SDCT nhập nội liều 100 mg/kg cân nặng

Lô 5: Lô cắt buồng trứng, được uống cao SDCT nhập nội liều 200 mg/kg cân nặng