Nghiên cứu triển khai kỹ thuật western blot để đánh giá biểu hiện gen ở mô gan chuột

Tuy nhiên, việc đánh giá biểu hiện gen từ các mô tự nhiên là vô cùng quan trọng, nó không chỉ thể hiện tác dụng của các chất đối với bản thân gen và protein mà còn đánh giá được những th

- -

NGUYỄN THỊ THÙY SAO

Mã sinh viên: 1101436

THUẬT WESTERN BLOT ĐỂ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN

Ở MÔ GAN CHUỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THÙY SAO

Mã sinh viên: 1101436

NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ

THUẬT WESTERN BLOT ĐỂ

ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN

Ở MÔ GAN CHUỘT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

PGS TS Phùng Thanh Hương

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn hóa sinh

2 Viện Công nghệ Sinh học, Viện

Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và sự kính trọng tới ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, các thầy cô trong trường đã tạo điều kiện cũng như truyền thụ những kiến thức quý báu để em có thể hoàn thành khóa học

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến PGS TS Phùng Thanh Hương, người thầy tâm huyết đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất để em có thể hoàn thành khóa luận này Cô luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong cả quá trình nghiên cứu khoa học lẫn trong cuộc sống, là nguồn động lực lớn giúp em vượt qua được những khó khăn trong quá trình hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chị NCS Hà Thị Thu, chị đã luôn bên cạnh hướng dẫn, giúp đỡ, truyền thụ những kinh nghiệm quý báu và đưa ra những lời khuyên để em có thể đưa ra những lựa chọn đúng đắn nhất

Xin cảm ơn các anh, chị, bạn đang công tác tại Phòng Vi sinh phân tử -Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Cuối cùng xin cảm ơn gia đình, anh chị em, bạn bè đã luôn ủng hộ, khích lệ

và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian và sự hiểu biết của bản thân có hạn nên khóa luận khó tránh khỏi sai sót Em mong nhận được những lời góp ý, chỉ bảo của thầy cô để em có thể hoàn thiện hơn khóa luận của mình

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy Sao

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I :TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về kỹ thuật Western blot 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.3 Vai trò, ứng dụng 3

1.1.4 Nguyên tắc 3

1.1.5 Các giai đoạn 3

1.1.6 Ứng dụng của Western blot để đánh giá biểu hiện gen 12

1.2 Đại cương về AMPK 12

1.2.1 Giới thiệu về nguồn gốc, cấu trúc 12

1.2.2 Vai trò của AMPK trong chuyển hóa 14

1.2.3 Một số nghiên cứu về AMPK ở tế bào 19

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất 20

2.1.3 Thiết bị 21

2.1.4 Dụng cụ 21

2.2.1 Khảo sát phương pháp tách chiết protein ra khỏi mô gan chuột 22

2.2.2 Phương pháp Western blot 23

2.2.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian ép phim 27

2.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm phim trong thuốc hiện màu 27

2.2.5 Phương pháp khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp Western blot đối với protein AMPKα1 28

2.2.6 Phương pháp khảo sát mức độ biểu hiện AMPK ở các lô khác nhau 28

2.2.7 Phương pháp biểu diễn và xử lý số liệu 29

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 30

3.1 Kết quả 30

3.1.1 Kết quả khảo sát một số thông số quá trình của kỹ thuật Western blot 30

3.1.2 Kết quả sử dụng Western blot để sơ bộ đánh giá mức độ biểu hiện AMPK ở tế bào gan chuột 34

3.2 Bàn luận 38

3.2.1 Bàn luận về kết quả khảo sát một số thông số quá trình của kỹ thuật Western blot 38

3.2.2 Về kết quả sử dụng Western blot để sơ bộ đánh giá mức độ biểu hiện AMPK ở tế bào gan chuột 41

KẾT LUẬN 44

ĐỀ XUẤT 44

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACC1 Acetyl CoA carboxylase 1

AMPK Adenosine monophosphate–activated protein kinase

AP Alkaline phosphatase

APS Ammonium persulphat

AS160 Akt substrate of 160kDa

BPB Bromophenol blue

BSA Bovine serum albumin

CaMKKβ Calmodulin-mediated kinase kinase β

CBM Carbohydrat-binding modul

CBS Cystathionine-β-synthase

CCD Charge Coupled Device

CPT1 Carnatine-acylcarnitine translocase 1

ĐTĐ Đái tháo đường

ECL Enhanced chemiluminescence

FA Fatty acid

FASN Fatty acid synthase

GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase

GBD Glycogen-binding domain

GEF GLUT4 enhancer factor

GLUT4 Glucose transporter type 4

HDAC Histon deacetylase

HMGCoA Hydroxymethylglutaryl CoA

HMGCR Hydroxymethylglutaryl CoA reductase

HRP Horseradish peroxidase

LKB1 Liver kinase B1

MEF2 Myocyte enhancer factor 2

mTORC1 Mammalian target of rapamycin complex 1

pAMPK AMPK phosphoryl hóa

PBS Phosphate buffered saline

PGC-1α Peroxisom proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α

PI3K Phosphatidylinositol 3- kinase

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluorid

PVDF Polyvinylidine difluorid

Rab GAPs Rab GTPase-activating proteins

SDS Sodium dodecyl sulfat

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis Ser Serin

SIRT1 Sirtuin

SREBP1 Sterol regulatory element-binding protein-1

TAK1 Transforming growth factor-bactivated kinase 1

TBC1D1 (Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16) Domain Family, Member 1

TBS Tris/Tris buffered salin

Temed Tetramethylethylenediamin

Thr Threonin

TSC Tuberous sclerosis complex

TTBS Tween Tris/Tris buffered salin

ULK1 UNC-51 like kinase 1

Bảng 2.1: Công thức cho 1 bản gel 24Bảng 3.1: Nồng độ protein (mg/ml) thu được bằng các phương pháp chiết tách khác nhau 30Bảng 3.2: Kết quả cường độ tín hiệu hóa phát quang thí nghiệm khảo sát khoảng tuyến tính đối với AMPKα1 35Bảng 3.3: Cường độ tín hiệu ở các lô chuột 37

Hình 1.1: Mô hình điện di trên gel 4

Hình 1.2: Vai trò của SDS 5

Hình 1.3: Mô hình điện dịch chuyển 6

Hình 1.4: Kháng thể thứ cấp giúp khuếch đại tín hiệu 7

Hình 1.5: Phát hiện tín hiệu nhờ phát quang hóa học 9

Hình 1.6: Phát hiện tín hiệu nhờ hóa huỳnh quang 10

Hình 1.7: Cấu trúc các tiểu đơn vị của AMPK 14

Hình 1.8: Vai trò của AMPK trong chuyển hóa 15

Hình 1.9: Vai trò của AMPK trong chuyển hóa lipid và glucose 18

Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu……… ………22

Hình 3.2: Cường độ tín hiệu hóa phát quang sau các thời gian ép phim khác nhau 32

Hình 3.3: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu được với những thời gian ngâm phim trong thuốc hiện màu khác nhau 33

Hình 3.4: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu được trong thí nghiệm khảo sát khoảng tuyến tính đối với AMPKα1 35

Hình 3.5 Mối tương quan giữa cường độ tín hiệu của AMPKα1và lượng protein tổng số 36

Hình 3.6: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu được trong thí nghiệm khảo sát biểu hiện AMPK ở các lô chuột 36

Hình 3.7: So sánh mức độ biểu hiện gen AMPK ở các lô chuột 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự biểu hiện gen chính là toàn bộ quá trình tổng quát theo đó thông tin di truyền chuyển từ gen thành protein [2] Như vậy, protein chính là sản phẩm của biểu hiện gen Protein là những đại phân tử đóng vai trò chủ yếu trong sự hình thành, duy trì cấu trúc và chức năng của cơ thể sống [7] Việc nghiên cứu protein, tức nghiên cứu về biểu hiện gen, giúp đánh giá những thay đổi về cấu trúc, chức năng của protein, có ý nghĩa to lớn trong ngành Dược khi nghiên cứu những thay đổi của cơ thể trong những điều kiện khác nhau, sinh lý hay bệnh lý, thay đổi khi dùng hay không dùng thuốc, góp phần chứng minh cơ chế tác dụng của thuốc

Protein tuy được xem là đại phân tử của tế bào nhưng nhiều loại protein nội bào khó có thể quan sát bằng mắt thường do số lượng quá nhỏ Việc nghiên cứu protein cần đến những kỹ thuật tinh vi hơn Đã có nhiều kỹ thuật được ứng dụng trong nghiên cứu protein như điện di 2 chiều, khối phổ, Western blot … [55] Đặc biệt kỹ thuật Western blot đã được sử dụng khá phổ biến trên thế giới [55] Tại Việt Nam, đã có một số phòng thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật Western blot trong đánh giá biểu hiện gen như một kỹ thuật thường quy Mẫu protein được nghiên cứu thường là các protein tái tổ hợp, protein tách ra từ tế bào nuôi cấy Tuy nhiên, việc đánh giá biểu hiện gen từ các mô tự nhiên là vô cùng quan trọng,

nó không chỉ thể hiện tác dụng của các chất đối với bản thân gen và protein mà còn đánh giá được những thay đổi, ảnh hưởng của cơ thể đến chất cần quan tâm,

từ phân bố hấp thu chuyển hóa thải trừ, đến điều hòa của cơ thể khi sử dụng các chất, dẫn đến sự thay đổi của gen và protein Ở Việt Nam, hầu như rất ít nghiên cứu về sự biểu hiện gen ở mô động vật sử dụng kỹ thuật Western blot Những

khó khăn trong việc chiết tách protein từ mô động vật và phát hiện protein mục tiêu từ hỗn hợp protein phức tạp của mô động vật có thể là lý do kỹ thuật này chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam Với lý do đó, chúng tôi tiến hành triển khai đề tài “Nghiên cứu triển khai kỹ thuật Western blot để đánh giá biểu hiện gen ở mô gan chuột” với hai mục tiêu:

1 Khảo sát một số thông số quá trình của Western blot đối với nghiên cứu biểu hiện gen ở mô gan chuột

2 Sử dụng Western blot để sơ bộ đánh giá mức độ biểu hiện gen AMPK ở

mô gan chuột

CHƯƠNG I :TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kỹ thuật Western blot

1.1.1 Định nghĩa

Western blot là kỹ thuật được sử dụng với mục đích phát hiện và phân tích protein, dựa vào việc phát hiện phức hợp kháng thể đặc hiệu - protein được gắn trên màng [21]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

Kỹ thuật này lần đầu tiên được giới thiệu bởi Towbin năm 1979 [57] Tuy nhiên đến năm 1981, cái tên “Western blot” mới được chính thức thừa nhận và sử dụng rộng rãi [14,35] Kể từ lúc được phát hiện đến nay, kỹ thuật

đã không ngừng được phát triển để tối ưu hóa cũng như tăng tính ứng dụng

1.1.3 Vai trò, ứng dụng

Western blot có thể được dùng để xác định sự có mặt của protein, xác định trọng lượng phân tử của protein hoặc để xác định sự thay đổi của lượng protein do sự thay đổi mức độ biểu hiện gen [16,21] Kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử, miễn dịch di truyền học và một số ngành khác Trong lĩnh vực y tế, kỹ thuật đã được sử dụng để chẩn đoán HIV, một số thể bệnh Lyms, viêm gan B [52]

1.1.4 Nguyên tắc

Western blot hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các protein từ một hỗn hợp bằng điện di trên gel, sau đó chuyển protein lên màng, phát hiện protein bằng kháng thể đặc hiệu Thông qua các băng protein mà có thể định tính, bán

định lượng protein đích trong mẫu [28,55]

1.1.5 Các giai đoạn

1.1.5.1 Chuẩn bị mẫu

Mục đích là giải phóng tối đa protein ra khỏi tế bào, mô mà không làm ảnh hưởng tới đặc tính của các protein cần quan tâm Việc lựa chọn cách ly giải mẫu phụ thuộc vào đặc tính của mẫu và protein đích [28] Các nhóm tác nhân bao gồm: chất tẩy rửa, ly giải bằng đóng/rã băng, shock thẩm thấu, siêu

âm, phương pháp vật lý, dùng enzym ly giải, giảm áp suất, hoặc kết hợp các phương pháp trên [21]

1.1.5.2 Điện di trên gel

Điện di trên gel là phương pháp tách các protein dựa vào kích thước,

hình dạng và/hoặc điện tích (hình 1.1) Các phân tử sẽ di chuyển trong mạng lưới gel từ cực âm sang cực dương, sau đó tách thành các băng khác nhau ở các vị trí khác nhau [55] Polyacrylamid được dùng phổ biến nhất để tách các protein vì kích thước của các lỗ trên gel này tương tự với kích thước của nhiều protein [21]

Hình 1.1: Mô hình điện di trên gel [21]

Gel polyacrylamid gồm 2 phần: gel cô và gel tách Gel cô có nồng độ

polyacrylamid thấp hơn, có tác dụng cô mẫu lại thành mẫu đặc hơn trước khi các protein được tách khi chạy trong gel tách [46,55]

SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis) là kiểu điện di gel được sử dụng để phân tách các protein dựa vào khối lượng phân tử SDS được thêm vào có tác dụng làm thay đổi cấu trúc protein từ cấu trúc bậc 4 hay bậc 3 sang trạng thái duỗi thẳng nhờ vào việc cắt các liên kết disulfid [21] (hình 1.2) Ngoài ra, SDS (Sodium dodecyl sulphate) còn phủ lên protein một lớp điện tích âm, điện tích âm này lớn hơn nhiều so với điện tích của bản thân protein về mặt trị số Vì vậy, việc di chuyển của protein trong gel không phụ thuộc vào điện tích mà dựa vào khối lượng phân

tử của protein

Hình 1.2: Vai trò của SDS [11]

1.1.5.3 Chuyển màng

Mục đích: Nếu protein chỉ được giới hạn trong gel, các đầu dò phân tử

sẽ khó có thể tiếp cận trực tiếp với protein Khi protein được dịch chuyển lên màng, việc tiếp cận này sẽ dễ dàng hơn nhiều [35]

Các kiểu chuyển màng: Có 3 loại dịch chuyển là điện dịch chuyển, khuếch tán đơn thuần và khuếch tán chân không Trong đó điện dịch chuyển là phương pháp được sử dụng nhiều nhất [36]

Nguyên tắc điện dịch chuyển: Protein tích điện âm, khi đặt trong điện

trường sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương, tức di chuyển từ gel sang màng (hình 1.3) Từ đó, các vạch protein sau khi được tách trong gel sẽ được chuyển lên màng, giữ nguyên vị trí tương đối của chúng Phương pháp này được sử dụng nhiều nhất do tốc độ dịch chuyển nhanh, hiệu quả dịch chuyển tốt [21]

Hình 1.3: Mô hình điện dịch chuyển [21]

Loại màng

Màng nitrocellulose hay được sử dụng do tính tương hợp cao với nhiều

protein và có nền thấp [16,21] Nhưng khó thao tác rửa màng và tái ủ kháng thể do khi khô màng giòn, dễ rách Protein liên kết với màng thông qua các liên kết không cộng trị và kỵ nước [22,55]

Màng PVDF (Polyvinylidine difluoride) có khả năng liên kết với protein

cao hơn (tương tác lưỡng cực và tương tác kỵ nước) và độ bền cơ học cũng

lớn hơn so với nitrocellulose nên có thể tái rửa và ủ lại kháng thể [22,35,55] Tuy nhiên màng có nền cao [16,21,55].

1.1.5.4 Ủ kháng thể

Nguyên lý: Một kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào để liên kết đặc

hiệu với protein đích được gắn trên màng Sau đó, kháng thể thứ 2 sẽ được thêm vào để liên kết với các quyết định kháng nguyên (epitop) trên kháng thể thứ nhất Nhiều phân tử kháng thể thứ 2 có thể gắn trên cùng 1 phân tử kháng thể thứ nhất, vì vậy, việc gắn này sẽ khuếch đại tín hiệu lên nhiều lần (hình 1.4)

Hình 1.4: Kháng thể thứ cấp giúp khuếch đại tín hiệu [21]

Block màng trước khi ủ kháng thể

Khi ủ kháng thể, kháng thể có thể liên kết trực tiếp với màng, làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu cũng như độ nhạy của kỹ thuật Vì vậy cần làm bất hoạt các vị trí không liên kết với protein trên màng (block màng) để các vị trí

đó không thể liên kết với kháng thể được nữa, trước khi ủ kháng thể [55] Việc lựa chọn cách block màng tùy thuộc vào mẫu và kháng thể sử dụng Tác nhân

được sử dụng phải có ái lực với màng lớn hơn so với kháng thể sử dụng, nhưng lại không được phá vỡ liên kết giữa màng và protein đã gắn trên nó Hai nhóm tác nhân block màng thường xuyên được sử dụng là protein và chất

tẩy không ion hóa Protein là nhóm tác nhân gắn trực tiếp vào màng, block

màng một cách bền vững, gồm sữa gầy, BSA, casein… Chất tẩy không ion hóa là nhóm tác nhân không gắn trực tiếp vào màng, block màng không bền vững, dễ dàng bị rửa trôi, gồm SDS, Trixon X-100, Tween-20, NP 40 Đệm pha thường dùng là TBS (Tris/Tris buffered saline) hoặc PBS (phosphate buffered saline)

Ủ kháng thể sơ cấp: Kháng thể sơ cấp gắn đặc hiệu với quyết định kháng

nguyên của protein đích gắn trên màng Việc lựa chọn nồng độ kháng thể rất quan trọng, nếu quá thấp tín hiệu phát hiện được yếu làm giảm độ nhạy của kỹ thuật, nếu quá cao sẽ có nền cao và có nhiều liên kết không đặc hiệu làm giảm

độ đặc hiệu của kỹ thuật Kháng thể thường được pha loãng trong dung dịch TBS hoặc PBS Thời gian ủ là 1 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc ủ qua đêm ở 40C

Rửa màng: Màng cần được rửa để loại hết kháng thể dư thừa, tránh làm cho

nền cao Đệm rửa thường dùng là PBS hoặc TBS có bổ sung 0,05-0,1%

Tween-20 để tăng cường hiệu quả rửa Màng cần được rửa ít nhất 3 lần, mỗi lần ít nhất 5 phút, lượng dung dịch rửa khoảng 4 ml/cm2

Ủ kháng thể thứ cấp: Màng tiếp tục được ủ với kháng thể thứ cấp Kháng thể

thứ cấp sẽ gắn đặc hiệu với phức hợp protein-kháng thể sơ cấp Việc lựa chọn kháng thể thứ cấp phụ thuộc nhiều vào phương pháp phát hiện của kỹ thuật Kháng thể thứ cấp thường là kháng thể được gắn với enzym, chất huỳnh

quang, kháng thể biotin hóa [21]

1.1.5.5 Phát hiện

Phát quang hóa học: Là phương pháp phát hiện sử dụng kháng thể thứ

cấp có gắn enzym, thường là HRP Khi có mặt hydrogen peroxid, HRP (horseradish peroxidase) xúc tác cho phản ứng oxi hóa luminol tạo thành chất phát quang ở bước sóng 428 nm Ánh sáng quang học phát ra được phát hiện trên phim X-quang hoặc cảm biến CCD (charge coupled device) [8,36] (hình 1.5)

Hình 1.5: Phát hiện tín hiệu nhờ phát quang hóa học

Phát quang huỳnh quang: Phương pháp phát hiện ứng dụng hiện tượng

hấp thụ ánh sáng của phân tử huỳnh quang Khi ở trạng thái cơ bản, phân tử huỳnh quang không phát xạ, nhưng khi nhận được năng lượng kích thích phù hợp, các phân tử sẽ chuyển lên trạng thái kích thích có mức năng lượng cao hơn Sau một thời gian rất ngắn, phân tử ở trạng thái kích thích sẽ phục hồi về

trạng thái cơ bản ban đầu kèm theo phát xạ huỳnh quang [1]

Hóa huỳnh quang: Phương pháp này là sự kết hợp của 2 phương pháp

trên Kháng thể thứ cấp liên kết với enzym AP (alkaline phosphatase), enzym

này sẽ loại nhóm phosphat của cơ chất để tạo thành một phân tử huỳnh quang [59] (hình 1.6)

Hình 1.6: Phát hiện tín hiệu nhờ hóa huỳnh quang [21]

1.1.5.6 Ghi lại tín hiệu

Tín hiệu ánh sáng phát ra được ghi lại nhờ các thiết bị: phim X-ray hoặc CCD Phim X-ray là thiết bị ghi lại tín hiệu hình ảnh lên 1 tấm phim, gọi là phim X-quang Cảm biến CCD là cảm biến chuyển đổi hình ảnh quang học sang tín hiệu điện trong các máy thu nhận hình ảnh [21]

1.1.5.7 Phân tích kết quả

Để có thể sử dụng kết quả thu được cho phân tích bán định lượng, trước tiên cần quan tâm đến một số kết quả thứ yếu Bao gồm: độ nhạy của tín hiệu, khoảng tuyến tính, độ ổn định của tín hiệu, chuẩn hóa tín hiệu và tỷ lệ tín hiệu/nền nhiễu

Về độ nhạy của tín hiệu, được xác định là lượng protein tối thiểu mà kỹ

thuật có thể phát hiện được Độ nhạy phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm

chất lượng kháng thể, nồng độ kháng thể, thời gian ủ và phương pháp phát hiện [21]

Khoảng tuyến tính là khoảng giới hạn nồng độ protein mà trong khoảng

đó cường độ tín hiệu tỷ lệ thuận với nồng độ protein Để có thể sử dụng kỹ thuật Western blot cho phân tích bán định lượng, chỉ khi các kết quả nằm trong khoảng này thì việc so sánh các mẫu mới có ý nghĩa [55,56]

Độ ổn định của tín hiệu: tùy thuộc vào phương pháp phát hiện, mỗi tín

hiệu có một độ ổn định riêng Với những tín hiệu có độ ổn định tốt, bằng cách tăng cường thời gian tiếp xúc giữa màng và tác nhân phát hiện, ta có thể tăng cường độ tín hiệu, từ đó có thể tăng độ nhạy của kỹ thuật Điều này sẽ khó ứng dụng được với tín hiệu có độ ổn định thấp bởi sau một thời gian, tín hiệu sẽ mất đi, cường độ tín hiệu sẽ yếu dần Phương pháp phát hiện bằng phát quang hóa học thường gặp trở ngại này [21]

Chuẩn hóa tín hiệu: Để phân tích chính xác nồng độ protein đích có

trong mẫu thì nồng độ protein cần được chuẩn hóa, tránh sai số trong quá trình thao tác thí nghiệm, đặc biệt là giai đoạn cân bằng nồng độ protein trong các mẫu, tra mẫu vào gel làm lượng protein tổng giữa các mẫu có thể có sai lệch tương đối Vì vậy, protein chứng (control) được dùng Protein chứng là protein

có mức độ biểu hiện đồng đều ở mô trong những điều kiện thay đổi Các protein chứng thường được dùng gồm beta actin, tubulin, GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate dehydrogenase )…[22] Việc so sánh đối chiếu giữa các tỷ lệ cường độ tín hiệu của protein mục tiêu/protein chứng sẽ làm

chuẩn hóa kết quả, tránh sai số nêu trên

Tỷ lệ tín hiệu/nền nhiễu: Tỷ lệ này góp phần vào độ nhạy của kỹ thuật [13] Tử số chính là cường độ tín hiệu của protein đích Mẫu số phụ thuộc vào

2 yếu tố: nền (background) và nhiễu Nền thấp sẽ cho kết quả định lượng chính xác hơn Nền cao có thể do nhiều nguyên nhân như nồng độ kháng thể quá cao tạo nên liên kết không đặc hiệu với các protein khác, block màng không thích hợp khiến kháng thể sơ cấp liên kết với màng, lựa chọn màng không phù hợp, hoặc vấn đề ở bước phát hiện tín hiệu [55] Nhiễu là tín hiệu mang tính chất hệ thống, gây ra bởi bản chất của phương pháp phát hiện [21]

1.1.6 Ứng dụng của Western blot để đánh giá biểu hiện gen

Biểu hiện gen là quá trình chuyển thông tin di truyền từ gen trong nhân

tế bào thành protein trong tế bào, từ kiểu gen sang kiểu hình của cơ thể [2]

Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng kỹ thuật Western blot trong đánh giá biểu hiện gen Đó là các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi biểu hiện gen giữa các mô, các tế bào khác nhau, giữa các cá thể khác nhau, giữa tế bào bệnh và tế bào lành để chẩn đoán 1 số bệnh (ví dụ như Lyms, HIV1), giữa các tế bào được dùng thuốc với những tế bào khác để chứng minh cơ chế tác dụng của thuốc…

1.2 Đại cương về AMPK

1.2.1 Giới thiệu về nguồn gốc, cấu trúc

AMPK (adenosine monophosphate–activated protein kinase) là 1 protein tồn tại trong tất cả các tế bào sinh vật nhân chuẩn, được cấu tạo bởi 3 tiểu đơn vị: tiểu đơn vị xúc tác α và 2 tiểu đơn vị điều hòa β và γ Mỗi tiểu đơn vị gồm các dạng đồng phân khác nhau α (α1 và α2), β (β1 và β2), γ (γ1, γ2 và γ3) (hình 1.7) Các phức hợp đồng phân bộ 3 tiểu đơn vị trên của AMPK khác nhau về mức độ biểu hiện trong các mô và về hoạt tính [27,33,49]

Tiểu đơn vị α Tiểu đơn vị α1 chủ yếu biểu hiện ở trong bào tương của tế bào gan và tế bào mỡ còn tiểu đơn vị α2 chủ yếu biểu hiện trong nhân các tế bào não, tim và

cơ xương [45] Đầu N tận của tiểu đơn vị α chứa miền xúc tác, có chứa Thr172, nếu phosphoryl hóa sẽ thể hiện hoạt tính của AMPK [54] Đầu C tận chứa vùng ức chế tự động, kế tiếp với miền xúc tác ở đầu N tận, và vùng liên kết với 2 tiểu đơn vị còn lại β và γ [62]

Tiểu đơn vị β Đầu C tận của tiểu đơn vị β liên kết với cả 2 tiểu đơn vị α và γ [49] Vùng trung tâm của tiểu đơn vị là vùng liên kết với glycogen (GBD hoặc CBM), vùng này cho phép protein phát hiện ra sự thay đổi nồng độ glycogen trong tế bào [42] Ngoài ra, vùng này còn liên quan đến việc bảo vệ AMPK khỏi phosphatase của tế bào, từ đó bảo vệ AMPK tránh khỏi sự khử phosphoryl hóa [33] Tiểu đơn vị β1 phân bố chủ yếu trong gan, tụy, thận, não và các mô mỡ màu nâu [61] Tiểu đơn vị β2 lại tập trung chủ yếu ở tim và cơ xương GBD ở tiểu đơn vị β2 liên kết chặt chẽ với oligosaccharid hơn so với tiểu đơn vị β1 [33]

Tiểu đơn vị γ Tiểu đơn vị γ1 phân bố rộng rãi khắp các mô trong cơ thể, tiểu đơn vị γ2 giới hạn phân bố trong cơ xương, tiểu đơn vị γ3 phân bố rộng rãi trong cơ thể, nhiều nhất là ở tim, sau đó là não, nhau thai và cơ xương [53] Tiểu đơn vị γ đóng vai trò là phần hoạt hóa dị lập thể của phức hợp AMPK Tiểu đơn vị này chứa 4 đoạn cấu trúc lặp lại được gọi là cystathionine-β-synthase (CBS), được gọi là vùng Bateman, liên kết với AMP/ADP/ATP, yếu tố quan trọng trong hoạt tính của AMPK

Hai vị trí, được đặt tên là CBS1 và CBS3, thay đổi liên kết với hoặc AMP hoặc ATP, cho phép AMPK đáp ứng với sự thay đổi tỷ lệ AMP/ATP [33,49] Tiểu đơn vị γ khi liên kết với AMP tạo nên tương tác dị lập thể làm tăng sự nhạy cảm của AMPK với những thay đổi nhỏ của nồng độ AMP Tuy nhiên, khi liên kết với ATP không gây ra sự biến đổi trong cấu trúc protein, chống lại

sự hoạt hóa AMPK [33] Khi AMP/ADP liên kết với tiểu đơn vị γ sẽ làm cho vùng liên kết với tiểu đơn vị α mất tính mềm dẻo nên không nhạy cảm với tác động khử phosphoryl hóa của phosphatase Ngược lại khi gắn với ATP, vùng này tăng tính mềm dẻo nên tăng tính nhạy cảm với phosphatase

Hình 1.7: Cấu trúc các tiểu đơn vị của AMPK [50]

1.2.2 Vai trò của AMPK trong chuyển hóa

Protein AMPK được kích hoạt bởi 2 cơ chế chính Thứ nhất, Thr172 của tiểu đơn vị α bị phosphoryl hóa bởi 1 trong 3 kinase: : LKB1 (liver kinase B1), CaMKKβ (calmodulin-mediated kinase kinase β) và TAK1 (transforming growth factor-bactivated kinase 1) Thứ hai, khi AMP gắn với tiểu đơn vị γ của AMPK dẫn đến hoạt hóa dị lập thể AMPK nhằm bảo vệ Thr 172 đã được phosphoryl hóa nhằm tránh tác động khử phosphoryl hóa của phosphatase

Khi AMPK được kích hoạt, nó sẽ tham gia vào các chu trình chuyển hóa và thể hiện vai trò của nó [10,27] (hình 1.8)

Hình 1.8: Vai trò của AMPK trong chuyển hóa [49]

1.2.2.1 Điều hòa chuyển hóa lipid

AMPK đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình β oxy hóa, tổng hợp acid béo cũng như tổng hợp cholesterol [25,26] (hình 1.8) AMPK tham gia vào những quá trình này thông qua việc hoặc phosphoryl hóa hoặc ức chế các enzym: acetyl CoA carboxylase 1 (ACC1) và hydroxymethyl glutaryl CoA reductase (HMGCR)

Các enzym ACC1/ACC2 cần thiết cho quá trình tổng hợp acid béo, tương tự HMGCR cần thiết cho quá trình tổng hợp cholesterol

ACC1/ACC2 cần thiết cho quá trình carboxyl hóa acetyl CoA để tạo ra malonyl CoA Manonyl CoA ức chế carnitine palmitoyl transferase 1 (CPT1) – một enzym cần thiết cho quá trình β oxy hóa Quá trình β oxy hóa sẽ dẫn đến tăng tổng hợp ATP Tóm lại, AMPK ức chế hoạt tính ACC1 thông qua việc tạo dạng phosphoryl hóa của enzym này, dẫn đến tăng hoạt tính CPT1, thúc đẩy quá trình β oxy hóa và tổng hợp ATP [33] Ngoài ra,việc ức chế quá trình carboxyl hóa acetyl CoA tạo manolyl CoA bởi AMPK sẽ ức chế quá trình tổng hợp acid béo [60]

Tương tự, thông qua quá trình phosphoryl hóa, HMGCR bị bất hoạt, dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol thông qua giảm tạo mevalonat từ hydroxymethylglutaryl CoA (HMGCoA) [23,30]

AMPK cũng ức chế quá trình tổng hợp acid béo thông qua ức chế hoạt tính của sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP1) [39] SREBP1

là một nhân tố phiên mã liên quan đến biểu hiện của enzym tổng hợp acid béo FASN (fatty acid synthase) và ACC1 AMPK ức chế SREBP1, từ đó ức chế biểu hiện của FASN và ACC1, làm giảm quá trình tổng hợp acid béo [19,24] Chuyển hóa acid béo thông qua quá trình β oxy hóa sẽ tạo ra acetyl CoA, chất này sẽ tham gia vào chu trình citric để tạo ra ATP Mặc khác, cả quá trình tổng hợp acid béo và cholesterol đều là các quá trình cần có ATP Vì vậy, tác động của AMPK lên chuyển hóa lipid cũng làm tăng ATP [4]

1.2.2.2 Điều hòa chuyển hóa glucose

AMPK tham gia vào sự dịch chuyển GLUT4 (glucose transporter type 4)

từ các túi dự trữ nội bào [37] Sự dịch chuyển và hòa màng tế bào của GLUT4

được điều hòa bởi phân nhóm Rab của protein G khi liên kết với GTP (thể hoạt động) [53] Phân nhóm Rab này lại bị ức chế bởi Rab GTPase-activating proteins (Rab GAPs), ví dụ như Akt substrate 160 (AS160 hoặc TBC1D4) và TBC1D1 ((Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16) Domain Family, Member 1) [33] AMPK phosphoryl hóa TBC1D1 ở vị trí Ser237, thúc đẩy liên kết với 14-3-3 scaffolding protein, ức chế hoạt tính của TBC1D1 [49] pAMPK ức chế hoạt tính của Rab GTPases, ngăn chặn sự thủy phân của Rab GTP, từ đó tăng dịch chuyển túi dự trữ GLUT4 ra màng tế bào, tăng thu nhận glucose vào tế bào [53,33] pAMPK cũng tác động đến AS160 dẫn đến những kết quả tương tự, tuy nhiên việc có tác động trực tiếp hay qua các trung gian khác vẫn chưa được biết rõ [49]

Trong cơ xương, AMPK phosphoryl hóa IRS-1 (insulin receptor substrate 1) tại Ser789, kích thích hoạt tính của phức hợp PI3K/Akt làm tăng liên kết của AS160 với 14-3-3 protein [49] (hình 1.8)

Ngoài ra, AMPK làm tăng phosphoryl hóa GEF (GLUT4 enhancer factor), dịch chuyển nó từ bào tương vào nhân tế bào Nó cũng làm tăng lượng Myocyte enhancer factor 2 (MEF2) trong nhân tế bào Trong nhân tế bào, GEF

và MEF2 sẽ gắn với promoter GLUT4 làm tăng biểu hiện gen của GLUT4 mRNA [29] AMPK cũng phosphoryl hóa và ức chế histon deacetylase 5 (HDAC5) thông qua sự liên kết của HDAC5 với 14-3-3 và dịch chuyển HDAC5 ra khỏi nhân tế bào, tăng cường hoạt tính của promoter GLUT4 [49]

Hình 1.9: Vai trò của AMPK trong chuyển hóa lipid và glucose [33]

1.2.2.3 Điều hòa chuyển hóa protein

AMPK hoạt hóa phức hợp TSC1/TSC2 (tuberous sclerosis complex) thông qua phosphoryl hóa TSC2 ở Thr12227 và Ser1345 khi stress Khi được hoạt hóa, phức hợp này sẽ ức chế hoạt tính của Mammalian target of rapamycin complex 1 (mTORC1) dẫn đến ức chế dịch mã tổng hợp protein, tăng cường quá trình thoái hóa protein [49]

1.2.2.4 Điều hòa tổng hợp ty lạp thể

AMPK phosphoryl hóa và hoạt hóa trực tiếp peroxisom activated receptor gamma coactivator-1α (PGC-1α) [31] hoặc thông qua

proliferator-SIRT1 (sirtuin 1), khởi xướng quá trình phiên mã để tổng hợp các gen ty lạp thể [15]

AMPK tham gia điều hòa quá trình loại bỏ các ty lạp thể bị hư hỏng (autography) AMPK có thể liên kết và phosphoryl hóa UNC-51 like kinase 1 (ULK1), là yếu tố khởi xướng cho cho quá trình autography [17] Mặt khác, ULK1 lại có feedback ngược âm tính đối với AMPK, điều hòa quá trình autography theo chiều ngược lại [41]

1.2.3 Một số nghiên cứu về AMPK ở tế bào

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về vai trò của AMPK trong đái tháo đường và ung thư [49] Một số thuốc được sử dụng để điều trị các bệnh này có cơ chế liên quan đến AMPK như metformin, thiazolidinedion trong điều trị đái tháo đường, berberin trong điều trị đái tháo đường và ung thư Ngoài ra còn một số hợp chất khác như salicylat, các hợp chất tự nhiên resveratrol, curcumin, puerarin, α-liproic acid… đang tiếp tục được nghiên cứu [27,33,64] Kỹ thuật Western blot cũng thường được sử dụng để đánh giá biểu hiện AMPK Ví dụ như các nghiên cứu về chức năng điều hòa của AMPK trong đái tháo đường [18], nghiên cứu về tác dụng của AMPK lên điều hòa giãn cơ trơn thể hang [9]…

Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu chứng minh tác dụng của dược liệu trong điều trị đái tháo đường thông qua đích AMPK Trong đó có nghiên cứu

về tác dụng hạ glucose huyết của rễ cây chóc máu Nam Bộ, ứng dụng kỹ thuật Western blot với dòng tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt) [6]

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mô gan chuột cống trắng, giống đực, gồm 3 lô: lô chuột bình thường (lô sinh lý), lô chuột gây đái tháo đường typ 2 thực nghiệm (lô bệnh lý) và lô chuột đái tháo đường typ 2 được cho uống metformin (lô chứng dương) Phương pháp gây đái tháo đường typ 2 thực nghiệm tiến hành theo mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm kiểu ĐTĐ typ 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều thấp của Leelavinothan, Vicker SP [38,58] Mô hình này đã được triển khai bởi một số tác giả Việt Nam [4,5,6] Metformin được dùng với liều 120 mg/kg

Các mẫu mô sau khi được tách ra khỏi cơ thể động vật ngay lập tức được đông lạnh bằng nitơ lỏng, bảo quản ở -800C

2.1.2 Hóa chất

Nitơ lỏng, đệm tách mô động vật EZLys™ Tissue Protein Extraction Reagent (Biovision Mỹ), thủy tinh, hóa chất đổ gel (tris-HCl, pH 8,8 3M, tris-HCl, pH 6,8 1M, acrylamid 30%, glycerol 50%, SDS 10%, APS (ammonium persulphate ) 10%, Temed (tetramethylethylenediamine)), sample buffer 5X (tris HCl pH 6,8, glycerol, SDS, 2-Mercaptoetanol, bromophenol blue (BPB), H2O), marker màu Prestained Protein Fermentas, SDS page 1X, blotting buffer 10X, methanol, TBS 1X, tween 20, sữa gầy: Lactogen Nestle, kháng thể beta actin antibody (Thermo scientific), kháng thể AMPKα1 Polyclonal Antibody (BioVision), kháng thể Anti – Rabbit IgG (A merspam), dung dịch AmershamTMECLTM Prime Western blotting Detection Reagent (GE Healthcare), dung dịch

rửa phim, Amersham Hyperfilm ECL 18 × 24 cm (GE Healthcare Life Science- Thụy Điển), nước khử RO

2.1.3 Thiết bị

Thiết bị điện di (Bio- Rad), thiết bị chuyển màng Western- Blot (Bio- Rad), cân phân tích (Metter Toledo), máy nanodrop (Thermo scientific), máy nghiền đồng thể (Ati instruments), máy lắc (IKA), máy ly tâm (Biofuge Fresco Heraeus), catsette 18 x 24, tủ lạnh 40C (Toshiba), tủ lạnh -800C (Sanyo)

2.1.4 Dụng cụ

Bộ chày cối nghiền mẫu, ống Eppendorf 2,0 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, micropipet

và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5 – 10 µL, 2 – 20 µL, 20 – 200 µL,

100-1000 µL, khuấy từ, dụng cụ thủy tinh: cốc đong, chai đựng hóa chất, dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống eppendorf, kẹp, kéo

Các dụng cụ đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm các nội dung chính được trình bày ở sơ đồ hình 2.1