Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ streptomyces 183.221

Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề tài:“Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.221” với mục tiêu: - Cải tạo giống

TỪ STREPTOMYCES 183.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Hà Nội - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ NGÀ

MSV: 1101359

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CHẤT KHÁNG SINH ĐƯỢC SINH TỔNG HỢP

TỪ STREPTOMYCES 183.221

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

đã tận tình hướng dẫn em từ những ngày đầu tiên nghiên cứu khoa học tới khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp- lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ kỹ thuật viên giảng dạy công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học, Bộ môn công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội; Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học

tự nhiên Hà Nội; Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Hóa học thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các Thầy Cô giáo, cán bộ, viên chức trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện khóa luận này

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến

từ thầy cô và bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Sinh viên

VŨ THỊ NGÀ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 2

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 2

1.1.2 Phân loại kháng sinh 2

1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 3

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh 3

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN 4

1.2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước 4

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn 4

1.2.3 Đặc điểm của xạ khuẩn chi streptomyces……… ……… 5

1.2.4 Phân loại streptomyces……… 6

1.2.5 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn……… ……6

1.3 CẢI TẠO GIỐNG VI SINH VẬT 7

1.3.1 Mục đích 7

1.3.2 Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật 7

1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH 8

1.4.1 Khái niệm lên men 8

1.4.2 Phương pháp lên men 9

1.5 CHIẾT TÁCH VÀ TINH CHẾ 9

1.5.1 Chiết xuất kháng sinh (Chiết lỏng- lỏng) 9

1.5.2 Tách và tinh chế kháng sinh 10

1.6 SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH 11

1.6.1 Phổ hồng ngoại 11

1.6.2 Phổ UV-VIS 11

1.6.3 Phổ khối 11

AP-123 và hiệu ứng độc tế bào 12

1.7.2 Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh……….12

1.7.3 Phương pháp làm tăng khả năng chống nấm của các nystatin mới được tổng hợp từ Streptomyces noursei 12

CHƯƠNG 2.ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 14

2.1 ĐỐI TƯỢNG 14

2.1.1 Giống vi sinh vật 14

2.1.2 Các môi trường nuôi cấy 14

2.1.3 Dụng cụ và hóa chất 16

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 17

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống 17

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán……… 17

2.2.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 18

2.2.4 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên 19

2.2.5 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 19

2.2.6 Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men 20

2.2.7 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ 21

2.2.8 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh……… 21

2.2.9 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 24

3.1 KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CỦA STREPTOMYCES 183.221 TRÊN MT PHÂN LẬP - MT 2 24

3.2 KẾT QUẢ CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 24

3.3 KẾT QUẢ CẢI TẠO GIỐNG 26

3.3.1 Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên 26

3.3.2 Kết quả đột biến 26

3.4.1 Chọn môi trường lên men tốt nhất 28

3.4.2 Lựa chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất 29

3.5 ẢNH HƯỞNG CỦA pH, NHIỆT ĐỘ ĐẾN ĐỘ BỀN VỮNG KHÁNG SINH 29

3.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 29

3.5.2 Ảnh hưởng của pH 30

3.6 KẾT QUẢ CHỌN LỌC DUNG MÔI VÀ pH CHIẾT 30

3.7 KẾT QUẢ TÁCH KHÁNG SINH BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 32

3.8 KẾT QUẢ CHẠY SẮC KÝ CỘT 33

3.9 SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA KHÁNG SINH 37

BÀN LUẬN 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

CM Màng tế bào chất - Cytoplasmic membrane

Bảng 1 1 Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn 7

Bảng 2 3 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 16

Bảng 3.1 Kết quả hoạt tính kháng sinh của Streptomyces 183.221 trên

Bảng 3 7 Kết quả chọn dạng chủng, biến chủng lên men 29 Bảng 3 8 Độ bền vững của kháng sinh với nhiệt độ 30 Bảng 3 9 Ảnh hưởng của pH tới độ bền vững kháng sinh 30 Bảng 3.10 Kết quả lựa chọn hệ dung môi và pH chiết kháng sinh 31

Bảng 3.12 Kết quả thử hoạt tính của các phân đoạn sau chạy sắc ký cột lần 1 34

Bảng 3.14 Kết quả thử hoạt tính các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35 Bảng 3.15 SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35

Hình P2: Sự hình thành chuỗi bào tử dài ở xạ khuẩn chi Streptomyces

Hình P3: Chủng Streptomyces 183.221 sau khi được cấy zigzag trong đĩa petri sau

6 ngày trong tủ ấm 28o C

Hình P4: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh với chủng vi khuẩn B subitilis

Hình P5: Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn sau đột biến 2

Hình P6: Hình ảnh bình nhân giống cấp 1 trong lên men chọn chủng

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vấn đề kháng kháng sinh đã mang tính toàn cầu và đặc biệt nổi trội ở các nước đang phát tiển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới đắt tiền Tổ

chức y tế thế giới WHO cho rằng kháng kháng sinh "là một mối nguy lớn đối với y

tế công cộng trên toàn cầu mà chúng ta cần hành động ngay để giải quyết chúng"

Có thể nói rằng, vi khuẩn càng phơi nhiễm nhiều với kháng sinh thì “sức ép

về thuốc” càng lớn, các chủng kháng thuốc càng có nhiều cơ hội để phát triển và lây lan Mặc dù kháng kháng sinh là vấn đề căn bản thuộc về y tế, trong đó sức ép

về thuốc là yếu tố nội tại quan trọng nhất thúc đẩy sự phát triển và gia tăng tình trạng kháng kháng sinh Tuy nhiên, vấn đề này còn chịu sự chi phối của nhiều lĩnh vực khác bao gồm các yếu tố về sinh thái học, dịch tễ học, văn hoá-xã hội và kinh

tế Nhiệm vụ bức thiết đặt ra không chỉ với lĩnh vực nghiên cứu y học, công nghiệp kháng sinh nói riêng mà còn là nhiệm vụ của toàn nhân loại nói chung là tìm ra các kháng sinh mới để có thể giải quyết tạm thời hoặc triệt để nạn kháng thuốc

Để góp phần vào công cuộc tìm ra các chất kháng sinh mới, tôi chọn đề

tài:“Góp phần nghiên cứu chất kháng sinh được sinh tổng hợp từ Streptomyces 183.221” với mục tiêu:

- Cải tạo giống nhằm nâng cao khả năng tổng hợp KS của Streptomyces

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH

1.1.1 Định nghĩa kháng sinh

Có nhiều định nghĩa khác nhau về KS Hiện nay, giới y học quan niệm rằng:

KS là những chất tạo thành do chuyển hóa sinh học, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn (bacteriostatic) hoặc tiêu diệt vi khuẩn (bactericidal) ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các KS tự nhiên [1], [3], [6]

1.1.2 Phân loại kháng sinh

a Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh

b Dựa vào cơ chế tác dụng của kháng sinh

c Dựa vào cấu trúc hóa học

Dựa vào cấu trúc hóa học là cách phân loại hay được sử dụng, kháng sinh chia thành các nhóm chính sau:

- Nhóm β – lactam

+ Penicillin: benzylpenicillin, oxacilin, ampicillin…

+ Cephalosporin: cephalexin, cefotaxim, cefaclor…

+ Các β–lactam khác: carbapenem, chất ức chế β – lactamase

- Nhóm aminoglycosid ( aminosid ): streptomycin, gentamicin…

- Nhóm macrolid: erythromycin, clarithromyci…

- Nhóm lincosamid: lincomycin, clindamycin…

- Nhóm phenicol: cloramphenicol, thiamphenicol…

- Nhóm tetracycllin: tetracyclin, doxycyclin…

- Nhóm peptid:

+ Glucopeptid: Vancomycin

+ Polypeptid: polymycin, bacitracin

- Nhóm quinolon: acid nalidixic, ciprofloxacin…

Ngoài ra KS có thể được phân loại theo dược động học – dược lực học

- Thay đổi tính thấm của màng sinh chất

- Kháng chuyển hóa ( ức chế tổng hợp acid folic) [1], [4], [5]

1.1.4 Ứng dụng của kháng sinh

1.1.4.1 Trong y học

Ngày nay có nhiều KS được phát hiện và được ứng dụng có hiệu quả trong y học KS không chỉ sử dụng trong phòng và điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ( nhiễm khuẩn hô hấp, tiết niệu,…) mà còn được dùng để điều trị các loại bệnh phổ biến do nấm gây ra ( nấm da, nấm tóc,…), bệnh ung thư ( ung thư vú, phổi, dạ dày,…) [22]

1.1.4.2 Trong nông nghiệp

 Trong chăn nuôi

KS được sử dụng để phòng, điều trị các bệnh cho động vật (bệnh viêm phổi cấp tính, viêm vú của trâu bò,…) và được dùng như một chất kích thích tăng trọng đàn gia súc, gia cầm Ngoài ra, KS còn được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi có tác dụng ức chế và loại bỏ sự hoạt động của VK, đặc biệt là VK gây bệnh đường tiêu hóa và hô hấp [15]

 Trong trồng trọt

Việc sử dụng KS để bảo vệ thực vật đem lại hiệu quả kinh tế cao, khắc phục được nhược điểm của các thuốc hóa học ( hiện tượng kháng thuốc của sâu bệnh, ô nhiễm MT, chất độc tồn dư trong sản phẩm có thể gây độc cho con người,…)

1.1.4.3 Trong công nghiệp thực phẩm

Một số KS là những chất bảo quản thực phẩm tươi và đóng hộp lý tưởng,

như: nisin, subtilin, clotetracyclin,…với ưu điểm: thời gian khử trùng bằng nhiệt ngắn đi, nhiệt độ khử trùng giảm Nồng độ KS rất thấp, bảo quản được lâu dài, chất lượng tốt hơn, vitamin không bị phá hủy, hương vị ít bị biến đổi [10], [13]

1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA XẠ KHUẨN

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn thật, là các VK Gr(+), có tỷ lệ G+C >55% Đại đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh [4]

1.2.1 Đặc điểm hình thái và kích thước

 Khuẩn ty: khuẩn ty của xạ khuẩn thường không có vách ngăn và không tự đứt đoạn, đường kính 0,3 –2,0 µm Màu sắc của khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú: màu trắng, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen, Hệ sợi của VK chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh [5], [11]

- Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Sợi cơ chất sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh

- Khuẩn ty khí sinh: khuẩn ty cơ chất của xạ khuẩn phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành những khuẩn ty khí sinh

Hình ảnh khuẩn ty của xạ khuẩn trong phụ lục Hình P1

 Khuẩn lạc xạ khuẩn

Tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn Đặc điểm: không trơn ướt, thường ở dạng rắn chắc, thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ, hoặc đường tròn đồng tâm,… Kích thước khuẩn lạc khác nhau tùy thuộc từng loài và điều kiện nuôi cấy [4]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo của tế bào xạ khuẩn

- Thành tế bào xạ khuẩn: Có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm Có chức năng bảo vệ tế bào và giữ hình dáng của khuẩn ty Ngoài ra thành tế bào xạ khuẩn có thể cho nhiều chất ( kháng sinh, acid amin,…) đi qua dễ dàng Các chất dinh dưỡng từ MT cũng được thẩm thấu một cách chọn lọc qua thành tế bào

Căn cứ vào thành phần hóa học, thành tế bào chia làm 4 loại: Nhóm CW I

(chứa L-DAP ( L-diaminopimelat, glycin), chi Streptomyces thuộc nhóm này;

nhóm CW II (chứa meso- DAP, glycin); nhóm CW III (chứa meso- DAP); nhóm

CW IV (chứa meso- DAP, arabinose và galactose)

- Màng tế bào chất: dày khoảng 7,5-10,0 nm Thành phần chính là protein

và phospholipid Chức năng: là hàng rào đối với tất cả các phân tử tan trong nước, là nơi mà tế bào thực hiện các chức năng hô hấp

- Vùng nhân: chưa có nhân điển hình, nhiễm sắc thể có quy mô lớn nhất trong các Prokaryota (8-9.106bp)

- Mesosom: nằm phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng,… Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất gồm: hạt phosphat, hạt polysaccarid [4], [17]

1.2.3 Đặc điểm của xạ khuẩn chi Streptomyces

 Đặc điểm hình thái

Đối với các xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, sau một thời gian phát triển,

trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử Chuỗi bào tử có thể mọc đơn, mọc vòng và có nhiều hình thái cơ bản: thẳng, uốn cong, xoắn lò xo,…Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của xạ khuẩn, có nhiều hình dạng như: hình cầu, hình bầu dục, hình trụ,…Bề mặt của bào tử trần có thể là trơn nhẵn (sm), sần sùi

da cóc (wa) , có gai (sp) hoặc có tóc (ha) [7]

Bào tử trần được hình thành theo hai phương thức khác nhau:

- Vách ngăn được hình thành từ bên trong của CW và tiến dần vào trong tạo thành những vách ngăn không hoàn chỉnh, sau đó chuỗi bào tử mới được phân cách thành các bào tử trần

- Thành tế bào và CM đồng thời xuất hiện vách ngăn tiến dần vào phía trong, làm cho sợi tiền chuỗi bào tử phân cách tạo thành chuỗi bào tử trần

Khả năng tạo sắc tố của Streptomyces chia thành 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc

tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh và sắc tố melanoid [9],[10]

 Đặc điểm sinh lý và dinh dưỡng

- Streptomyces thuộc xạ khuẩn hô hấp hiếu khí, nhiệt độ phát triển tối

thích 22- 32oC, một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn ( xạ khuẩn ưa nhiệt hoặc ưa lạnh); pH tối thích 6,5- 7,5

- Streptomyces là VSV dị dưỡng, có tính oxi hóa cao Để phát triển chúng

phân giải các hydratcarbon làm nguồn thức ăn cung cấp vật chất và nguồn năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như gelatin, casein, tinh bột Ngoài ra chúng cũng có thể khử nitrat thành nitrit [4], [5]

1.2.4 Phân loại Streptomyces

Tại hội nghị “Vi sinh vật thế giới lần X” tổ chức tại Mexico năm 1970 chọn khóa phân loại của E.B.Shirling & Gottlieb làm khóa phân loại chính để phân loại

chi Streptomyces và đặt tên quốc tế là International Streptomyces Project ( ISP)

Khóa phân loại dựa vào các đặc điểm:

- Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn: màu sắc của khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh, hình dạng chuỗi bào tử, bề mặt bào tử

- Đặc điểm sinh lý học: khả năng tạo sắc tố hòa tan, sắc tố melanoid và khả năng sử dụng các nguồn đường [4], [7],[25]

Phương pháp này hiện ít sử dụng thay vào đó người ta sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S- rAND

1.2.5 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Đặc tính quan trọng của xạ khuẩn là khả năng hình thành KS, 60-70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh KS KS là sản phẩm trao đổi thứ cấp của VSV Có nhiều giả thiết khác nhau về sự hình thành chất KS từ xạ khuẩn Có 3 con đường sinh tổng hợp KS ở xạ khuẩn:

- KS được tổng hợp từ 1 chất trao đổi bậc I, qua 1 chuỗi phản ứng enzym

- KS được hình thành từ 2 hoặc 3 chất trao đổi bậc I khác nhau

- KS được hình thành bằng cách polime hóa các chất trao đổi bậc I, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều KS có cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học tương tự nhau Bảng 1.1 giới thiệu một số

1.3.2 Phương pháp cải tạo và bảo quản giống vi sinh vật

1.3.2.1 Phương pháp cải tạo

 Phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên

Các VSV có sự đột biến tự nhiên với tần số khoảng 10-10 – 10-5 trong ống giống thuần khiết tạo ra các biến chủng khác nhau Trong đó có biến chủng có hoạt tính KS mạnh hơn 20-30% những cá thể khác Cần phải chọn ngẫu nhiên lấy cá thể

có hoạt tính cao nhất trong ống giống để nghiên cứu tiếp

 Đột biến nhân tạo

- Đột biến nhân tạo là quá trình xử lý tế bào bằng các tác nhân gây đột biến Các tác nhân khi được sử dụng với liều lượng thích hợp sẽ giết chết hầu hết các

VSV, những cá thể sống sót sẽ có sự biến đổi NST, gây đột biến gen, làm thay đổi một hay nhiều nucleotid trong trình tự mã hóa gen gọi là đột biến điểm

- Các tác nhân đột biến có thể là: vật lý, hóa học, sinh học [16], [18]

+ Ánh sáng UV có khả năng đâm xuyên kém, với tế bào VSV có kích thước nhỏ ( 0,3-3,0μm) thì nó có thể xuyên thấu tới vùng nhân, gây đột biến mạnh, vì vậy ánh sáng UV được sử dụng phổ biến trong cải tạo giống VSV

+ Cơ chế: ánh sáng UV tác dụng lên ADN mạnh nhất ở vùng 260nm làm đứt các liên kết hydro trong mạch kép ADN của tế bào VSV (dime hóa thymin)

Thymin gần nhau liên kết cộng hóa trị với nhau ở C5, C6 Hậu quả là sao chép bị sai lầm vì ADN polymerase dễ lắp 1 nucleotid không chính xác vào vị trí trên Đồng thời trên sợi ADN xuất hiện một dimepyrimidin khác gọi là quang sản phẩm 6-4 Ở đây C6 của 5’ ( thymin hoặc cytozin) được liên kết với C4 của 3’( thường là cytozin) Các dimer này làm ngăn chặn sự phiên mã và sao chép ADN

và gây chết nếu không sửa chúng

+ Các yếu tố ảnh hưởng tới phương pháp đột biến bằng UV:

Liều lượng chiếu: được đặc trưng bởi các yếu tố: khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, độ pha loãng bào tử Thực nghiệm cho thấy đột biến dương thường xuất hiện ở liều lượng sống sót bào tử từ 0,1- 1,0%

Ánh sáng thường: sau khi đột biến bằng ánh sáng UV, hỗn dịch bào tử được

để yên trong bóng tối, nếu đem chiếu ánh sáng thường (λ= 320-480nm), có khoảng 50-80% tế bào được phục hồi, mất đi tính đột biến do tác dụng của enzym photolyase Hiện tượng này gọi là hiện tượng quang phục hoạt [15]

1.3.2.2 Bảo quản giống

- Mục tiêu: bảo quản VSV một cách khoa học, đúng kỹ thuật để giữ được quần thể các tế bào giống sống sót với tỉ lệ cao, ổn định và giữ được các đặc tính ban đầu, không bị tạp nhiễm bởi các VSV lạ

- Các phương pháp bảo quản: phương pháp bảo quản lạnh; giữ giống trên môi trường đất, cát và trên hạt ngũ cốc; phương pháp lạnh sâu; phương pháp đông khô

Để giữ giống, bảo quản xạ khuẩn trong phòng thí nghiệm có thể sử dụng

phương pháp trên môi trường thạch nghiêng để trong tủ lạnh 2oC [6], [14]

1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH

1.4.1 Khái niệm lên men

Lên men là quá trình nuôi cấy VSV trong những điều kiện nhất định nhằm tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có ích từ chính các VSV hoặc từ các thành phần

Ưu điểm: đơn giản, dễ thực hiện, đầu tư trang thiết bị thấp

Nhược điểm: hiệu suất sử dụng thấp, khó giữ vô trùng, khó cơ giới hóa, tự động hóa, tốn diện tích, nhân công

 Phương pháp lên men chìm

Phương pháp lên men chìm là kiểu lên men mà VSV phát triển trong không gian 3 chiều của MT lỏng

Ưu điểm: sử dụng MT dinh dưỡng tối ưu, đáp ứng nhu cầu sinh lý và dinh dưỡng của VSV; hiệu suất quá trình lên men cao; giữ vô trùng, dễ kiểm soát toàn

bộ, dễ cơ giới hóa, tự động hóa, tốn ít diện tích, chi phí nhân lực thấp

Nhược điểm: kinh phí cho trang thiết bị lớn ( trang thiết bị chuyên dụng, chịu

áp lực, điều kiện vô trùng tuyệt đối), cần cán bộ chuyên môn hóa, có kinh nghiệm, không thể xử lý cục bộ

Các kiểu lên men chìm: lên men mẻ (chu kì, gián đoạn), lên men có bổ sung,

lên men liên tục, lên men bán liên tục [14], [15]

Một số phương pháp tách chiết được sử dụng: chiết bằng DMHC; phương pháp tạo phức kết tủa, trao đổi ion, … Trong công nghiệp thường áp dụng các phương pháp tinh chế như: sắc ký, sắc ký ion, sắc ký sàng phân tử, kết tinh phân đoạn,…

1.5.1 Chiết xuất kháng sinh (Chiết lỏng- lỏng)

Chiết là phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) không đồng tan

để tách một số chất hay một nhóm chất từ hỗn hợp chất cần nghiên cứu bằng cách chuyển từ pha này sang pha khác Thực tế thường dùng cân bằng nước - dung môi hữu cơ không tan trong nước hoặc cân bằng lỏng – rắn để tách và tinh chế KS

Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không đồng tan với nhau Các phương pháp chiết lỏng – lỏng: chiết 1 lần (chiết đơn), chiết nhiều lần (chiết

+ Pha động: là một hệ thống dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi Pha động di chuyển qua bản mỏng nhờ lực mao dẫn hoặc tác động của trọng lực

+ Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf

Với dv: khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

ddm: khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (cm) Phát hiện các chất phân tích trên bản mỏng: xác định trực tiếp chất khi dùng

ánh sáng kích thích; đưa thêm vào các chất phát huỳnh quang và dùng ánh sáng

UV chiếu vào để ghi nhận mẫu hoặc hiện hình bằng thuốc thử đặc hiệu: ninhydrin, VSV,…

 Sắc ký cột:

- Pha tĩnh: là cột chứa chất nhồi như: silicagel, cellulose, nhôm oxyd…

- Pha động: dung môi đơn hoặc hỗn hợp, thường sử dụng hỗn hợp dung môi để làm tăng sức rửa giải Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ áp suất hoặc trọng lực [2], [15]

1.6 SƠ BỘ NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC KHÁNG SINH

1.6.1 Phổ hồng ngoại

Phổ hồng ngoại là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc cường độ hấp thụ bức

xạ hồng ngoại của chất cần nghiên cứu ở các số sóng khác nhau [2]

Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ

bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối (MS) [2]

1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

Cộng hưởng từ hạt nhân (viết tắt NMR-Nuclear Magnetic Resonance) là

hiện tượng một hạt nhân nguyên tử nằm trong từ trường hấp thu hoặc phát xạ một bức xạ điện từ Cộng hưởng từ hạt nhân cũng được xem là một nhóm các phương pháp khoa học áp dụng cộng hưởng từ hạt nhân vào việc nghiên cứu các phân tử

Phổ NMR dựa trên sự ghi lại quá trình cộng hưởng từ sinh ra bởi các hạt nhân spin khác 0 được kích thích bởi năng lượng của tần số sóng radio RF dưới tác động của từ trường Bo bên ngoài Quá trình này sẽ tạo ra sự khác biệt về trạng thái spin của các hạt nhân và mức năng lượng tương ứng của chúng

Tần số cộng hưởng (tần số Larmor) tỉ lệ thuận với từ trường :

với là hệ số gyromagnetic (hay magnetogyric) [19]

1.7 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU GẦN ĐÂY LIÊN QUAN ĐẾN KHÁNG SINH

STREPTOMYCES SP

1.7.1 Hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm chuyển hóa của Streptomyces AP-123 và hiệu ứng độc tế bào

Streptomyces AP-123 có dạng sợi, có nguồn gốc từ khu vực biển của Andra

Pradesh, Ấn Độ Streptomyces AP-123 có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với tất cả các VK thử nghiệm so với các chủng Streptomyces khác Sự có mặt của glycin và

acid L-diaminopimelic trong thành tế bào chỉ ra các chủng thuộc về chi

Streptomyces sp Giải trình tự gen 16S rADN của Streptomyces AP-123 cho thấy

99% trình tự tương đồng với Streptomyces flavogriseus Các chất KS được chiết

xuất bằng hexan và ethylacetat

Một hợp chất thu được bằng cách chiết xuất sử dụng dầu thô với các nồng

độ khác nhau của dung môi sau đó được tinh chế bằng sắc ký Hợp chất thể hiện hoạt tính kháng khuẩn cao đối với VK Gr (+), Gr (-), đồng thời thực nghiệm cho thấy khả năng gây độc tế bào mạnh với các dòng tế bào ác tính - tế bào Vero ( thận khỉ xanh ) và HEP2 (tế bào ung thư thanh quản) trong ống nghiệm Nồng độ ức

chế tối thiểu (MIC) của hợp chất chống lại VK B subtilis và S aureus tương ứng

là 25 và 37,5 μg/ mL; chống lại VK E coli và P aeruginosa tương ứng là 50 và 37,58 μg/ mL Với Candida albicans và Aspergillus niger tương ứng các giá trị

MIC là 12,5 và 25 μg/ ml [20]

1.7.2 Phương pháp làm tăng sản lượng kháng sinh

Một yếu tố quan trọng trong việc sản xuất thương mại các thuốc KS là tăng

hiệu suất sinh tổng hợp KS GS Bibb và các cộng sự đã nghiên cứu áp dụng phương pháp tái tổ hợp ADN, đồng thời khuếch đại các cụm gen cụ thể chịu trách nhiệm trong sản xuất KS, góp phần nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS

Nghiên cứu chứng minh rằng các yếu tố di truyền được xác định trong

S.kanamyceticus có thể khuếch đại từ 4 đến 12 lần một phân đoạn cụ thể của ADN

trong S coelicolor có chứa các cụm gen chịu trách nhiệm sản xuất KS dẫn đến tăng hơn 20 lần trong sản xuất actinorhodin [12], [24]

1.7.3 Phương pháp làm tăng khả năng chống nấm của các nystatin mới được tổng hợp từ Streptomyces noursei

Kháng sinh nhóm macrolid, bao gồm nystatin và amphotericin B đang được sử dụng để điều trị nhiễm nấm Tuy nhiên, do độc tính và đặc điểm hấp thu của nystatin, các ứng dụng lâm sàng là tương đối hạn chế Các chỉ số điều trị của các thuốc thế hệ mới macrolid được cải thiện bằng cách thêm vào hoặc /và loại bỏ nhóm hydroxyl ở C9 -C10 của heptaen nystatin Kỹ thuật thay đổi này liên quan đến khả năng bất hoạt P450 monooxygenase của NysL Sau đó, các thay đổi được kết hợp với sự thay thế của exocyclic C16-carboxyl bằng nhóm methyl thông qua bất hoạt P 450 monooxygenase của NysL Sử dụng kỹ thuật di truyền, thu được bốn macrolid mới tương tự nystatin với hiệu suất sản xuất tương đối cao (lên đến 0,51 g / lít ), tinh chế, xác định cấu trúc đặc trưng , xét nghiệm in vitro cho thấy có khả năng kháng nấm và tan huyết của chúng Nếu thay thế C16 -carboxyl với một nhóm methyl vào các phân tử với một sửa đổi ở C9 -C10 sẽ làm gia tăng hoạt tính kháng nấm trong khi giảm các hoạt động tan huyết [21]

Giống xạ khuẩn Streptomyces 183.221 được phân lập từ mẫu đất Quận 9Tp

HCM tại bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, có khả năng sinh

- Vi nấm: Aspergillus sp 514, Microsporum sp 014 [8]

2.1.2 Các môi trường nuôi cấy

Các MT phân lập, nuôi cấy, khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh Thành phần các môi trường được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn

MT lên men dịch thể (MTdt) tương tự MT nuôi cấy xạ khuẩn nhưng không

có thạch Chủng Streptomyces 183.221 được phân lập, nuôi cấy trên môi trường 2 (

MT2)

Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Pepton (%)

Tác nhân gây đột biến: ánh sáng UV (λ=254nm), nguồn Toshiba 60W, 220V; máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 Lf, máy cất quay Buchi R220; tủ ấm Memmert, Binder; tủ sấy SL shellab; tủ cấy vô trùng Aura VF 48; tủ lạnh Sanyo; nồi hấp vô trùng Hirayama Model HL303; cân kỹ thuật Sartorius TE 210; cân phân tích Sartorius BP 121 S; bơm chân không Waterbath B480; máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt; các dụng cụ khác như: thước kẹp Palmer ( độ chính xác 0,02mm), hộp Petri, Buret, bình chiết, patuyn, pipet các loại, ống nghiệm, bình nón, ống đong, cốc có mỏ, giấy lọc, que cấy, giấy thử pH, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim mũi mác,…

2.2 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và giữ giống

Chủng Streptomyces 183.221 được cấy zigzag trên ống thạch nghiêng, cho

vào tủ ấm 28-30oC, sau 6-10 ngày chủng phát triển tốt, cho các ống giống vào tủ lạnh bảo quản 2-4oC, định kỳ 3-6 tháng cấy truyền một lần

2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán

- Nguyên tắc: mẫu thử được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng có chứa VSV

kiểm định KS từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn, vô nấm

- Tiến hành:

- Kết quả được tính theo công thức sau:

Với D: đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)

Di: đường kính vòng vô khuẩn thứ i (mm)

s: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh

n: số thí nghiệm làm song song (không có hướng dẫn khác thì n=3)

2.2.3 Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp

Trong tủ cấy vô trùng , Streptomyces183.221 được cấy zigzag lên MT1 đến

MT7 trong đĩa Petri, để vào tủ ấm 6 ngày Sau đó thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch Dựa vào kết quả chọn ra MT cho hoạt tính KS cao nhất là MT nuôi cấy thích hợp

Chuẩn bị MT nuôi cấy VSV kiểm định (MT canh thang ( VK), hỗn dịch VSV kiểm định)

Đưa mẫu thử vào đĩa Petri có chứa VSV kiểm định (Khoanh giấy, giếng thạch, khối thạch)

Nuôi cấy

VK (37oC; 18- 24h ) Đánh giá kết quả

Đo đường kính vòng vô khuẩn

2.2.4 Chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên

- Chuẩn bị MT: cân MT2, tiệt khuẩn 120oC/ 30 phút, đổ ra đĩa Petri vô trùng

- Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.221

cho vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc đều, thu được hỗn dịch bào tử

có độ pha loãng 10-1 ( định ước) Sau đó pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 bằng nước vô trùng

- Phân tán hỗn dịch bào tử: hút chính xác 0,1 ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4 đến 10-6 nhỏ vào đĩa Petri chứa MT Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch Mỗi nồng độ tiến hành trên 3 đĩa Cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 28oC

Sau 6 ngày, các khuẩn lạc xạ khuẩn đã phát triển, chọn các khuẩn lạc phát triển đa dạng, mọc riêng rẽ cấy zigzag lên đĩa Petri có MT, để vào tủ ấm 6 ngày rồi thử hoạt tính KS bằng phương pháp khối thạch Dựa vào kết quả đường kính vòng

vô khuẩn lựa chọn và giữ lại 3 dạng chủng có hoạt tính KS tốt nhất cho nghiên cứu tiếp theo

2.2.5 Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV

- Pha hỗn dịch bào tử: lấy một vòng que cấy bào tử Streptomyces 183.221 cho

vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô trùng, lắc đều, được hỗn dịch bào tử có độ pha loãng 10-1( định ước ) Sau đó dùng 1ml pha loãng tiếp đến nồng độ 10-6 rồi nhỏ vào đĩa Petri làm mẫu chứng

- Đột biến bằng ánh sáng UV: 9 ml còn lại của nồng độ 10-1 đổ ra đĩa Petri vô trùng Chiếu ánh sáng UV (λ=254 nm) với khoảng cách, thời gian thích hợp (60cm -

5 phút) Lấy ra, để vào chỗ tối 2 giờ, dùng pipet vô trùng pha loãng đến nồng độ 10-5

- Phân tán hỗn dịch bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-4 và 10-5 nhỏ vào đĩa Petri

chứa MT Dùng que chang vô trùng dàn đều hỗn dịch bào tử trên bề mặt thạch, mỗi

độ pha loãng làm 3 đĩa; cho các đĩa đã phân tán bào tử vào tủ ấm 28oC trong 6 ngày

sẽ xuất hiện các khuẩn lạc, đếm số khuẩn lạc, xác định % độ sống sót theo công thức:

Với Nm: số khuẩn lạc sau đột biến ở nồng độ bào tử 10-k

No: số khuẩn lạc trong mẫu chứng

- Chọn lọc ngẫu nhiên các khuẩn lạc sau đột biến, làm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi hoạt tính của biến chủng thứ I được tính theo công thức:

Với Di: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến (mm)

Do: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng (mm)

- Sau đột biến, dựa vào kết quả thu được lựa chọn và giữ 3 biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.6 Lên men chìm và đánh giá hoạt tính kháng sinh trong dịch lên men

- Tạo giống cấp 1: chủng giống Streptomyces 183.221 nuôi cấy trên thạch

nghiêng (MT2) được 6 ngày, cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2dt bằng 10ml nước vô trùng, lắc trên máy lắc tròn ở nhiệt độ 28 ± 0,1oC, tốc độ quay

140 vòng/phút trong 48h

- Sau 48h trên máy lắc, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang các bình nón 500ml chứa 100ml MTdt với tỷ lệ Vgiống : Vmôi trường = 1:10 Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28 ± 0,1oC, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120h

- Sau 120h lọc hoặc li tâm dịch lên men rồi thử hoạt tính KS bằng phương pháp giếng thạch

2.2.7 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ

Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối được chỉnh về pH thích hợp bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N rồi chiết với từng dung môi chiết

Dịch lọc và dung môi hữu cơ cho vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi : Vdịch lọc = 1:5, lắc trong 1-3 phút, để phân lớp 1 giờ sau đó gạn riêng lớp dung môi và lớp nước Thử hoạt tính của lớp dung môi và lớp nước sau mỗi lần chiết bằng phương pháp khoanh giấy lọc Có thể chiết một lần hoặc chiết lặp lại để chiết kiệt được KS trong dịch lọc

2.2.8 Phương pháp xác đinh độ bền nhiệt, độ bền pH của kháng sinh

 Xác định độ bền pH:

- Mục đích: xác định ảnh hưởng của pH khác nhau lên độ bền vững của KS,

từ đó biết được pH tối thích để bảo quản, chiết tách KS

- Tiến hành: lấy 5 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống 5ml, chỉnh pH dịch lên men trong ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N Thử hoạt tính dịch trong ống sau 1 ngày và 6 ngày (sau khi điều chỉnh pH về trung tính) bằng phương pháp giếng thạch

2.2.9 Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký

 Sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng sắc ký được hoạt hóa ở 110oC/ 30 phút Dung môi pha đúng theo tỷ lệ, đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi không quá 1cm), để bão hòa trong 30 phút Chấm dịch chiết DMHC lên bản mỏng, cách mép dưới 1,5cm; cách mép bên 1cm, để khô tự nhiên hoặc sấy ở 40- 50oC

- Khai triển sắc ký: đặt bản mỏng vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến