Nghiên cứu bào chế vi hạt che vị azithromycin bằng phương pháp tạo hạt và bao tầng sôi

Để khắc phục những hạn chế trên, cần thiết phải nghiên cứu một chế phẩm có khả năng che vị tốt cho azithromycin đồng thời cải thiện độ ổn định của thuốc trong môi trường dạ dày.. Các ngh

HÀ NỘI – 2016

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Thạch Tùng

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn bào chế

2 Viện Công nghệ Dƣợc phẩm quốc gia

3 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia

HÀ NỘI – 2016

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin được gửi lời biết ơn sâu sắc nhất đến thầy giáo TS

Nguyễn Thạch Tùng và TS Trần Cao Sơn đã luôn luôn tận tâm hướng dẫn, động

viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập nghiên cứu cũng như hoàn thành khóa luận này

Em xin được gửi lời cảm ơn tới toàn thể thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế, Viện Công nghệ Dược phẩm quốc gia, các anh chị đang công tác tại Viện vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia đã hết lòng quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để em hoàn thành được khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn an gi m hiệu nhà trường, phòng đào tạo và c c phòng an liên quan trong nhà trường đã có nhiều giúp đỡ thiết thực về cơ s vật chất, trang thiết ị và hóa chất th nghiệm trong qu tr nh em thực hiện đề tài

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đ nh và ạn bè, những người đã luôn ên, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong suốt một năm qua

à Nội, Th ng 5 năm 2016

Sinh viên

Trịnh Thành Đạt

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về azithromycin 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Tính chất lý hóa 2

1.1.3 Đặc điểm dược động học 3

1.1.4 Tác dụng không mong muốn 3

1.1.5 Một số chế phẩm chứa dược chất azithromycin trên thị trường 4

1.1.6 Các nghiên cứu che vị cho dược chất azithromycin 4

1.2 Tổng quan về máy tầng sôi 4

1.2.1 Phân loại máy tầng sôi 4

1.2.2 Cơ chế tạo hạt bằng máy tầng sôi 5

1.2.3 Cơ chế bao tầng sôi 6

1.2.4 Các nghiên cứu che vị bằng phương ph p ao tầng sôi 7

1.3 Tổng quan về đánh giá sinh khả dụng thuốc dùng theo đường uống 7

1.3.1 Đ nh gi sinh khả dụng của thuốc dùng theo đường uống 7

1.3.2 Phương ph p định lượng thuốc trong huyết tương 8

1.3.3 Các nghiên cứu định lượng azithromycin trong huyết tương và dịch cơ thể……… 11

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Bào chế vi hạt che vị azithromycin 13

2 2 2 Sơ ộ đ nh gi sinh khả dụng 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2 3 1 Phương ph p ào chế 13

2 3 2 Phương ph p đ nh gi 15

2 3 3 Phương ph p đ nh gi sinh khả dụng thuốc theo đường uống 19

2 3 4 Phương ph p xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn định lượng azithromycin bằng phương pháp UV – VIS và HPLC 22

3 1 1 Phương ph p định lượng azithromcin bằng UV – VIS 22

3 1 2 Phương ph p định lượng azithromycin bằng HPLC 23

3.2 Nghiên cứu phương pháp tạo hạt azithromycin 23

3.2.1 Khảo s t phương ph p tạo hạt qua xát hạt ướt 24

3.2.2 Phát triển phương ph p tạo hạt bằng máy tầng sôi 25

3.2.3 So sánh tạo hạt tầng sôi và tạo hạt qua xát hạt ướt 27

3.3 Bào chế vi hạt che vị azithromycin bằng phương pháp bao tầng sôi 27

3.3.1 Khảo sát ảnh hư ng của thông số kỹ thuật đến quá trình bao hạt 27

3.3.2 Khảo sát thành phần màng bao 31

3.3.3 Ảnh hư ng chất điều chỉnh p đến khả năng giải phóng dược chất 36

3.4 Sơ bộ đánh giá sinh khả dụng 39

3.4.1 Khảo s t phương ph p phân t ch 39

3.4.2 Sơ ộ đánh giá sinh khả dụng và các thông số dược động học 41

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

USP Dược điển Mỹ (United States Pharmacopoeia)

Eudragit RL100 Eud RL100

HPMC E6 Hydroxy propyl methyl cellulose E6

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography

tandem mass spectrometry)

ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionization)

SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron

Microscopy)

UV – VIS Hấp thụ tử ngoại – khả kiến

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Mức độ ứng dụng của các loại thiết bị tầng sôi 5

Bảng 1.2 Động vật sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng đường uống 8

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 12

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát sử dụng tá dược độn 24

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát lượng tá dược độn sử dụng 25

Bảng 3.3 Thông số kỹ thuật quá trình tạo hạt tầng sôi 27

Bảng 3.4 So sánh tạo hạt qua xát hạt ướt và tạo hạt tầng sôi 27

Bảng 3.5 Công thức dịch bao khảo sát thông số kỹ thuật quá trình bao 28

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát lưu lượng khí đầu vào 28

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát nhiệt độ khí đầu vào 30

Bảng 3.11 Thiết kế thí nghiệm lựa chọn polyme bao che vị 31

Bảng 3.12 Khả năng che vị của vi hạt bao bằng các polyme 32

Bảng 3.13 Khả năng che vị của vi hạt bao bằng tá dược A với độ dày

Bảng 3.14 Thiết kế thí nghiệm bao với màng bao phối hợp 2 polyme 34

Bảng 3.15 Khả năng che vị của vi hạt bao bằng các công thức 34

Bảng 3.19 Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ thu hồi 40

Bảng 3.20 Thông số dược động học đánh giá sinh khả dụng trên thỏ 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng

Hình 3.3 Mô tả cách lắp máy trong tạo hạt tầng sôi 26

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện % dược chất giải phóng theo thời gian của vi

Hình 3.5 Đồ thị thể hiện % dược chất giải phóng theo thời gian của vi

hạt bao bằng tá dược A với lượng dịch bao khác nhau 33

Hình 3.6 Đồ thị thể hiện % dược chất giải phóng theo thời gian của vi

Hình 3.7 Hình ảnh chụp SEM của vi hạt tối ưu 36

Hình 3.8 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của chất điều chỉnh pH đến sự

Hình 3.9 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của lượng chất điều chỉnh pH sử

Hình 3.10 Đường chuẩn AZI trong huyết tương trắng 40

Hình 3.11 Nồng độ azithromycin trong huyết tương thỏ của vi hạt che

ĐẶT VẤN ĐỀ

Azithromycin là kháng sinh bán tổng hợp thuộc nhóm macrolid, có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng mạnh trên nhiều loại vi khuẩn gram âm và gram dương Thuốc được hấp thu nhanh và phân bố rộng khắp cơ thể Đặc biệt thuốc đạt nồng

độ trong tế bào cao hơn trong huyết tương (từ 10 – 100 lần), vì vậy dùng điều trị nhiễm khuẩn nội bào tốt Thời gian bán thải của azithromycin dài (từ 40 – 68 giờ)

là điều rất thuận lợi, đặc biệt đối với bệnh nhân là trẻ em và người cao tuổi vì sẽ giảm được tối thiểu số lần dùng thuốc, điều đó giúp các bệnh nhân dễ tuân thủ liệu trình điều trị hơn

Tuy nhiên, thuốc vẫn còn một số điểm hạn chế như: thuốc có vị rất đắng, dẫn đến hạn chế sự phát triển của các chế phẩm uống và ứng dụng trên lâm sàng của thuốc, giảm tuân thủ điều trị của bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em và người cao tuổi Bên cạnh

đó, azithromyin kém bền trong môi trường acid dịch vị, dẫn đến sinh khả dụng đường uống không cao (khoảng 40 %)

Để khắc phục những hạn chế trên, cần thiết phải nghiên cứu một chế phẩm có khả năng che vị tốt cho azithromycin đồng thời cải thiện độ ổn định của thuốc trong

môi trường dạ dày Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế vi hạt che vị azithromycin bằng phương pháp tạo hạt và bao tầng sôi” với những mục

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về azithromycin

(dimethylamino)-β-D-xylo-hexopyranosyl]oxy]-1-oxa-6-azacyclopentadecan Công thức phân tử: C38H72N2O12

- Khối lượng phân tử: 749,0

Là kháng sinh nhóm macrolid, thuộc phân nhóm azalid do có nhóm methyl nitrogen thay cho nhóm carbonyl

1.1.2 Tính chất lý hóa

- Cảm quan: là chất bột màu trắng đến trắng ngà, không mùi, vị rất đắng [2]

- Tính chất vật lý: thực tế không tan trong nước, tan tốt trong acid loãng, tan rất tốt trong các dung môi hữu cơ như methanol, ethanol, diclomethan, aceton, ethyl acetat, cloroform [2]

- Tính chất hoá học [2]:

 Tạo phản ứng màu với acid HCl, H2SO4

 Có tính base yếu pH 9 – 11

 Azithromycin kém bền trong môi trường acid mạnh do bị thủy phân cắt đường cladinose dưới sự xúc tác của acid

- Định lượng [2]:

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Đo mật độ quang của sản phẩm giáng hoá

1.1.3 Đặc điểm dược động học

- Hấp thu: Azithromycin sau khi uống, sinh khả dụng khoảng 40% Thức ăn làm giảm khả năng hấp thu azithromycin khoảng 50% Sau khi dùng thuốc, nồng độ đỉnh huyết tương đạt được trong vòng từ 2 đến 3 giờ [12]

- Phân bố: thuốc được phân bố rộng rãi trong cơ thể, ngoại trừ não và dịch não tủy; phân bố chủ yếu trong các mô như: phổi, amidan, tiền liệt tuyến, bạch cầu hạt và đại thực bào , cao hơn trong máu nhiều lần (khoảng 50 lần nồng

độ tối đa tìm thấy trong huyết tương) [12]

- Chuyển hóa và thải trừ: chuyển hóa ở gan thành chất không có hoạt tính, thải trừ chủ yếu qua mật; chỉ có khoảng 12 % được thải trừ qua nước tiểu ở dạng còn hoạt tính Thời gian bán thải của thuốc dài (40 – 68h) [12]

1.1.4 Tác dụng không mong muốn

Tỷ lệ số bệnh nhân gặp phải tác dụng không mong muốn khoảng 13 % Hay gặp nhất là rối loạn tiêu hóa (khoảng 10%) với các triệu chứng như buồn nôn, đau bụng,

co cứng cơ bụng, nôn, đầy hơi, ỉa chảy Các tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa liên quan đến nồng độ thuốc tự do tại dạ dày và tá tràng [3]

Ngoài ra, còn có thể thấy biến đổi nhất thời số lượng bạch cầu trung tính hay tăng nhất thời enzym gan, đôi khi có thể gặp phát ban, đau đầu và chóng mặt Ảnh

hưởng thính giác: sử dụng lâu dài ở liều cao, azithromycin có thể làm giảm sức nghe có hồi phục ở một số người bệnh [3]

1.1.5 Một số chế phẩm chứa dược chất azithromycin trên thị trường

- Bột pha hỗn dịch uống: Glazi 250, Zithromax 200 mg (Pfizer)

- Viên nang: Azithromycin 250 mg (Bidiphar), Azithromycin 250 (DHG)

1.1.6 Các nghiên cứu che vị cho dược chất azithromycin

- Nghiên cứu của Nikita Shet và cộng sự (2013) về xây dựng công thức che vị cho azithromycin dihydrat sử dụng phương pháp tạo phức với Kyron - T134 tỉ

lệ AZI : Kyron (1:3) ở pH 8 Cho hiệu quả che vị tốt [22]

- Nghiên cứu của Maulik A Acharya (2012) và cộng sự khi bào chế vi cầu chứa azithromycin với tá dược là chitosan bằng phương pháp phun sấy tạo hệ phân tán rắn nhằm mục đích che vị và kiểm soát giải phóng Kết quả vi cầu có khả năng che vị rất tốt, khả năng giải phóng kéo dài trong vòng 72 giờ [11]

- Nghiên cứu của Liandong Hu và cộng sự (2009) khi bào chế vi cầu che vị cho dược chất azithromycin với tá dược là ethyl cellulose bằng phương pháp khuếch tán dung môi Hiệu quả che vị rất cao và sinh khả dụng đạt 102,7% so với sản phẩm đối chiếu [16]

1.2 Tổng quan về máy tầng sôi

1.2.1 Phân loại máy tầng sôi

Công nghệ tầng sôi là một phương pháp tiềm năng để nghiên cứu và phát triển thuốc Dựa vào vị trí súng phun, máy tầng sôi được chia làm 3 kiểu [23]:

- Kiểu có súng phun từ trên xuống

- Kiểu có súng phun từ dưới lên

- Kiểu phun tiếp tuyến

Hình 1.1 Các loại thiết bị tầng sôi

Công nghệ tầng sôi được ứng dụng trong sấy, trong tạo hạt, tạo pellet và bao màng [23] Mỗi loại thiết bị tầng sôi có mức độ ứng dụng khác nhau được thể hiện như bảng 1.1 [18]

Bảng 1.1 Mức độ ứng dụng của các loại thiết bị tầng sôi

trên xuống

Súng phun từ dưới lên

Phun tiếp tuyến

Chú thích: số lượng dấu “+” tăng theo mức độ ứng dụng của thiết bị

1.2.2 Cơ chế tạo hạt bằng máy tầng sôi

Các thiết bị tạo hạt kiểu tầng sôi được phát triển và ứng dụng trong công nghiệp dược từ những năm 1960 Phương pháp này có nhiều ưu điểm như hạn chế bụi, tạo hạt nhanh, hao phí và chi phí lao động thấp, thuận lợi để tự động hóa quá trình [4]

Phun từ trên xuống Phun từ dưới lên Phun tiếp tuyến

Súng phun

Súng phun

Ống Wurster

Đĩa quay tròn

Dòng

khí ra

Dòng

khí vào

Trong quá trình tạo hạt tầng sôi, sự kết tập tiểu phân chất rắn và quá trình sấy khô hạt được tiến hành đồng thời trên cùng một thiết bị Khối bột tạo hạt được đảo trộn bởi khí nóng Dịch tá dược dính được phun vào khối bột, làm ẩm và tạo cầu nối lỏng giữa các tiểu phân chất rắn Dưới tác dụng của khí nóng, dung môi bay hơi, tá dược dính tạo thành cầu nối rắn liên kết các tiểu phân chất rắn lại với nhau, tạo thành hạt [23]

Hình 1.2 Cơ chế tạo hạt bằng máy tầng sôi

1.2.3 Cơ chế bao tầng sôi

Trong quá trình bao tầng sôi, khí nóng được thổi từ dưới lên qua một tấm phân phối khí đặt ở đáy, các nhân bao được luồng khí này đảo trộn và thổi từ dưới lên đi qua vùng phun dịch, dung dịch hoặc hỗn dịch polyme bao được phân tán thành các giọt chất lỏng rất nhỏ bằng súng phun và bám vào nhân bao

Các giọt phun sẽ thấm ướt và lan rộng ra trên bề mặt nhân bao, hợp nhất thành lớp màng lỏng Nhân bao tiếp tục bị đẩy lên phía trên, lực trọng trường hút các nhân bao rơi xuống, cứ tiếp tục như vậy các nhân bao được đảo trộn và được treo trong buồng khí nóng, diện tích mặt thoáng lớn cùng với nhiệt độ làm dung môi bay hơi nhanh, các tiểu phân chất bao hợp nhất lại thành lớp màng liên tục gắn cố định trên

bề mặt nhân bao [4]

Quá trình hình thành màng được mô tả như hình 1.3 [4]

Tá dược dính Bột Cầu nối lỏng Cầu nối rắn Hạt

Phun dịch Làm ẩm Bốc hơi dung môi Kết thúc tạo hạt

Hình 1.3 Quá trình hình thành màng bao

1.2.4 Các nghiên cứu che vị bằng phương pháp bao tầng sôi

- Nghiên cứu của Ulrike Stange và cộng sự (2014) đã sử dụng Eudragit E100 che vị cho natri naproxen bằng phương pháp bao tầng sôi Kết quả cho thấy, màng bao với tỷ lệ hạt : Eudragit E100 là 1 : 1,576 cho vi hạt sau bao có khả năng che vị hơn 5 phút sau khi đưa vào miệng [24]

- Nghiên cứu của Xuelian Hu và cộng sự (2012) khi bào chế viên rã nhanh trong miệng berberin hydroclorid đã sử dụng phương pháp bao tầng sôi với polyme là Eudragit E100 Kết quả cho thấy, khi tỷ lệ dược chất : Eudragit E100 là 1 : 0,8; vi hạt thu được có khả năng che vị tốt, đánh giá tương đương sinh học giữa viên viên nén rã nhanh trong miệng bào chế từ vi hạt so với viên nén cho kết quả tốt, sinh khả dụng tương đối là 103,5% [17]

- Nghiên cứu của Dionysios Dennis Douroumis và cộng sự (2010) khi bào chế viên rã nhanh trong miệng chứa cetirizin hydroclorid đã sử dụng phương pháp bao tầng sôi với polyme là Eudragit RL-30D cho hiệu quả che vị tốt, sau 10 phút cho vào miệng chưa có cảm giác đắng [15]

1.3 Tổng quan về đánh giá sinh khả dụng thuốc dùng theo đường uống

1.3.1 Đánh giá sinh khả dụng của thuốc dùng theo đường uống

Tạo giọt phun Giọt phun di chuyển Va chạm vào nhân bao

 Định nghĩa về sinh khả dụng

Sinh khả dụng của thuốc là đại lượng chỉ mức độ và tốc độ xâm nhập của thuốc vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính so với với liều dùng [1] Trong đó, mức độ hấp thu dược chất được biểu thị bằng diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC) và nồng độ đỉnh Cmax, tốc độ hấp thu được xác định bằng thời gian đạt nồng độ đỉnh Tmax [12]

 Lựa chọn động vật thí nghiệm trong nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng thuốc dùng đường uống: Phải dựa vào mức độ giống nhau về mặt giải phẫu và sinh lý của đường tiêu hóa ở động vật và ở người [21]

Bảng 1.2 Động vật sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng đường uống

Rẻ tiền, sẵn có, dễ nuôi và chăm sóc Đường tiêu hóa và mô hình chuyển hóa

thuốc giống với người

Nhược điểm

Thời gian vận chuyển thuốc trong đường tiêu hóa ở chó ngắn hơn ở người

Đường tiêu hóa của thỏ khác xa người,

dạ dày thỏ chứa thức

ăn liên tục cho dù nhịn đói kéo dài

Khó cho khỉ uống thuốc và lấy máu liên tục, chi phí tốn kém hơn, đòi hỏi chăm sóc kỹ lưỡng hơn

1.3.2 Phương pháp định lượng thuốc trong huyết tương

1.3.2.1 Phương ph p xử lý mẫu

Các mẫu dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu…) thường chứa nhiều tạp chất, đặc biệt là một tỷ lệ lớn các protein làm cản trở khả năng phát hiện và định lượng dược chất Vì vậy, mẫu phải được loại tạp trước khi tiến hành phân tích Hiện nay để xử lý mẫu huyết tương người ta thường áp dụng ba kỹ thuật cơ bản là: kết tủa protein, chiết lỏng – lỏng, chiết pha rắn [10]

Bảng 1.3 Phương pháp xử lý mẫu huyết tương

Kết tủa protein Sử dụng tác nhân

tạo tủa để loại đi phần lớn lượng protein có trong mẫu

Đơn giản, kinh tế,

Chiết lỏng – lỏng Chuyển chất phân

tích từ mẫu huyết tương (pha nước) sang dung môi hữu cơ không đồng tan với nước

Mẫu thu được tương đối sạch và

có thể làm giàu mẫu

Phức tạp hơn so với phương pháp kết tủa protein

Chiết pha rắn Tách chất phân

tích từ mẫu bằng một chất rắn, sau

đó rửa giải bằng dung môi thích hợp

Nền mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu

Phức tạp, đòi hỏi người phân tích phải được đào tạo và có kinh nghiệm trong việc chọn cột và dung môi thích hợp

để rửa tạp và rửa giải

1.3.2.2 Kỹ thuật LC – MS

 Nguyên tắc của LC – MS

LC – MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phân tích khối phổ Các cấu tử của hỗn hợp sau khi được tách bằng sắc kí lỏng (LC)

có thể được nhận biết và xác định định lượng bằng phép đo khối phổ (MS) [6]

- Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách trong đó pha động là chất lỏng, pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lý hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [5]

- Khối phổ là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó được chuyển thành ion bằng những phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ [5]

 Nguyên lý hoạt động của máy khối phổ

- Mẫu chất cần phân tích sẽ được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó mới bắt đầu quá trình đo khối phổ

- Để đo được đặc tính của các phân tử cụ thể, máy khối phổ sẽ chuyển chúng thành các ion, kiểm soát chuyển động của chúng bởi các điện trường bên ngoài Quá trình được thực hiện trong môi trường chân không

- Ion sau khi tạo thành sẽ được phân tích bằng cách gia tốc và tập trung chúng thành một dòng tia mà sau đó sẽ bị uốn cong bởi một từ trường ngoài

- Các ion sau đó sẽ được thu nhận bằng đầu dò điện tử và thông tin tạo ra sẽ được phân tích và lưu trữ

 Cấu tạo thiết bị khối phổ [5]

- Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc dạng rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp

- Bộ nguồn ion: ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

- Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số khối lượng và điện tích ion (m/z) Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường

1.3.3 Các nghiên cứu định lượng azithromycin trong huyết tương và dịch cơ thể

Tên nghiên cứu Phương pháp chiết Kết quả

Định lượng AZI trong

huyết tương người

trong định lượng AZI

trong huyết tương

người (2007) [19]

Kết tủa protein LOQ: 4,69 ng/ml, khoảng tuyến

tính 4,69 – 600 ng/ml, độ lặp lại RSD < 8,24 %

Ứng dụng trong nghiên cứu sinh khả dụng trên người: cho 20 người tình nguyện uống AZI với liều 500

mg, lấy huyết tương định lượng bằng LC-MS/MS cho kết quả: Cmax là 425,71 ± 184,32 ng/mL, AUC0-120h là 3880,8 ± 1183,56 ng.h/mL

Định lượng AZI trong

huyết tương người và

Ứng dụng trong nghiên cứu tương đương sinh học giữa mẫu thử và mẫu đối chiếu cho sinh khả dụng tương đối là 99 %

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm

10 Hydroxy propyl methyl cellulose E6 Singapore Nhà sản xuất

thuốc trung ương DĐVN IV

Zithromax – Bột pha hỗn dịch uống

(số lô: 532200, ngày sản xuất

01/10/2015)

Pfizer - Ý Nhà sản xuất

2.1.2 Thiết bị nghiên cứu

- Máy tầng sôi Mini – Glatt (Đức)

- Máy thử độ hòa tan ERWERKA DT 600 (Đức)

- Máy ly tâm ROTINA 46 (Đức)

- Máy quang phổ UV-VIS OPTIMA SP-3000 (Nhật)

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent HPLC 1260 (Mỹ)

- Máy đo pH Eutech Instruments pH 510 (Nhật)

- Kính hiển vi điện tử quét S4800 Hitachi (Nhật)

- Tủ sấy tĩnh Memmert (Đức)

- Cân kỹ thuật Sarturius TE212, cân phân tích Sarturius BP12 (Đức)

- Máy khối phổ Agilent 1290/6460 (Mỹ)

- Bộ rây các cỡ, bình định mức, pipet các loại…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Bào chế vi hạt che vị azithromycin

Phát triển bào chế hạt AZI bằng phương pháp xát hạt ướt và tạo hạt tầng sôi Bào chế vi hạt che vị bằng phương pháp bao tầng sôi Khảo sát và lựa chọn thành phần màng bao, thông số kỹ thuật máy tầng sôi Đánh giá một số đặc điểm của vi hạt che vị: khả năng che vị, khả năng giải phóng dược chất, chụp SEM

2.2.2 Sơ bộ đánh giá sinh khả dụng

Khảo sát và thẩm định phương pháp định lượng AZI trong huyết tương thỏ bằng

 Tạo hạt bằng phương pháp xát hạt ướt

Mô tả tạo hạt ướt:

 Cân dược chất và tá dược độn, nghiền, rây qua rây 125 µm

 Trộn bột kép

 Pha tá dược dính là dung dịch HPMC E6 3% trong nước

 Nhào ẩm khối bột với lượng tá dược dính vừa đủ, ủ khối bột ẩm trong 15 – 30 phút

 Xát hạt ướt qua rây 350 µm, sấy ở 45 – 60o

C/24 h

 Sửa hạt và chọn hạt trong khoảng kích thước từ 125 – 350 µm

 Bảo quản hạt trong túi nilon 2 lớp và để trong bình hút ẩm đến khi sử dụng

 Tạo hạt bằng máy tầng sôi Mini – Glatt

Thiết bị: máy tầng sôi Mini – Glatt

Quy trình tạo hạt:

 Dược chất được nghiền, rây qua rây 125 µm, cho vào máy tầng sôi khoảng 40g dược chất

 Pha tá dược dính là dung dịch HPMC E6 3% trong nước

 Phun tá dược dính 30 phút, tiếp tục sấy hạt trong 5 phút

 Rây thu hạt có kích thước 150 – 250 µm, bảo quản trong túi nilon 2 lớp để trong bình hút ẩm đến khi sử dụng

 Phần hạt kích thước lớn hơn sẽ được nghiền, rây qua rây 125 µm; cùng phần kích thước nhỏ hơn sẽ được cho vào tạo hạt lại

2.3.1.2 Bào chế vi hạt che vị AZI bằng phương ph p ao tầng sôi

Hạt chứa dược chất được bao che vị theo công thức dưới đây:

Bảng 2.2 Thành phần màng bao che vị

(100 ml dịch bao) Vai trò

1 Polyme (thay đổi) Thay đổi Polyme tạo màng che vị

2 DBP Thay đổi (20 % khối lượng

polyme trong công thức) Chất hóa dẻo

Thông số máy tầng sôi quá trình bao:

Hình 2.1 Lắp máy tầng sôi bao hạt

 Lưu lượng khí đầu vào : Khảo sát

 Nhiệt độ khí đầu vào : Khảo sát

 Áp suất khí phun : Khảo sát

 Tốc độ phun dịch : Khảo sát

 Đường kính vòi phun : 0,5 mm

 Thời gian giũ : 4 s/lần

Sau khi hết dịch bao, vi hạt được sấy tiếp

trong 5 phút Bảo quản trong túi nilon 2 lớp

để trong bình hút ẩm

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2 3 2 1 Phương ph p định lượng AZI

 Định lượng AZI bằng phương pháp HPLC

Điều kiện chạy sắc ký [2]:

 Cột C18 (25 cm x 4,6 mm) kích thước hạt nhồi 5µm

 Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 215 nm

 Pha động: methanol – nước – ammoniac đậm đặc (80 : 19,9 : 0,1) (v/v)

Súng phun

 Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

 Thể tích tiêm: 50 µl

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: hòa tan một lượng chính xác khoảng 125 mg AZI

với 20 ml pha động trong bình định mức 25 ml, thêm pha động cho vừa đủ thể tích Dung dịch gốc thu được có nồng độ 5 mg/ml Hút chính xác lần lượt 1; 2; 3; 4; 5 ml dung dịch gốc cho vào 5 bình định mức 10 ml bổ sung vừa đủ thể tích bằng pha động Dãy dung dịch chuẩn thu được có nồng độ lần lượt là 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/ml Các dung dịch chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45 µm

Cách tiến hành: tiêm lần lượt các dung dịch chuẩn theo thứ tự nồng độ tăng dần

Lập đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic theo nồng độ

Dung dịch thử được chuẩn bị để có nồng độ trong khoảng từ 0,5 đến 2,5 mg/ml Tiến hành sắc ký đối với dung dịch thử Sau khi thu được diện tích pic ta thay giá trị

đó vào phương trình đường chuẩn sẽ tính được nồng độ dung dịch thử

 Định lượng AZI bằng phương pháp UV – VIS [7]

Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 62,5 mg dược chất cho

vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 2,5 ml EtOH lắc cho tan hoàn toàn, bổ sung vừa đủ thể tích dung dịch đệm phosphat pH 6,0, siêu âm đến khi trong suốt ta được dung dịch gốc A Hút chính xác 10 ml dung dịch gốc A cho vào bình định mức 50 ml, bổ sung vừa đủ thể tích dung dịch đệm ta được dung dịch B Hút chính xác 2, 3, 4, 5, 6 ml dung dịch B cho vào 5 bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đủ thể tích dung dịch đệm, ta được các dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 25; 37,5; 50; 62,5; 75 µg/ml

Phản ứng giáng hóa: Hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn cho vào ống nghiệm

có nắp đậy Bổ sung chính xác 5 ml dung dịch H2SO4 70 % (v/v) vào từng lọ, đậy ngay nắp và lắc xoáy mức 6 trong 30s Để yên 30 phút ở nhiệt độ 25 oC sau đó đo quang ở bước sóng 482 nm Mẫu trắng làm tương tự mẫu thử nhưng thay dung dịch thử bằng môi trường pha mẫu

Tính kết quả: Dựa vào độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn ta dựng được

đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ quang với nồng độ dược chất trong dung dịch

2 3 2 2 Phương ph p đ nh gi vi hạt che vị AZI

 Phương pháp định lượng AZI trong vi hạt

Tiến hành định lượng AZI trong vi hạt bằng phương pháp đo quang với các bước tiến hành như sau:

Chuẩn bị mẫu thử: cân chính xác 50 mg vi hạt, cho vào bình định mức 50 ml,

thêm khoảng 40 ml EtOH tuyệt đối sau đó siêu âm 30 phút, tiếp tục bổ sung EtOH tuyệt đối tới vạch Lọc qua giấy lọc, hút chính xác 1 ml dịch lọc cho vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch đệm pH 6,0 đến vạch, đem định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang của sản phẩm giáng hóa Mẫu trắng làm tương tự mẫu thử nhưng thay dung dịch thử bằng môi trường pha mẫu

Tính kết quả: nồng độ dung dịch thử được tính dựa vào phương trình đường

chuẩn

Trong đó:

Ct: nồng độ dung dịch thử (mg/ml)

d: hệ số pha loãng

m: khối lượng vi hạt (mg)

 Đánh giá khả năng che vị của vi hạt

Khả năng che vị của vi hạt được đánh giá thông qua ngưỡng đắng của dược chất, với ngưỡng đắng là nồng độ nhỏ nhất mà ở đó dung dịch còn có vị đắng

Ngưỡng đắng của một chất được xác định thông qua độ đắng, theo dược điển châu Âu độ đắng của một chất có giá trị bằng số ml nước cất lớn nhất dùng để hòa tan 1 g chất đó thành dung dịch còn có vị đắng [14]

Tiến hành xác định ngưỡng đắng của azithromycin theo hướng dẫn của dược điển châu Âu [14]:

- Quinin hydroclorid có độ đắng là 200000, là một chất rất đắng vì thế người

ta chọn chất này làm chất chuẩn để thử độ đắng cho các chất khác [14]

- Cần ít nhất 6 người tình nguyện, để khắc phục sự khác nhau về cảm nhận vị đắng giữa các thành viên trong nhóm tình nguyện cần xác định một hệ số hiệu chỉnh cho từng thành viên

- Pha một dung dịch Quinin có nồng độ 0,001% trong nước cất (dd A) Lấy 4,4; 4,6; 4,8; 5; 5,2; 5,4; 5,6 ml dd A cho vào các bình định mức 10 ml, bổ sung nước cất vừa đủ được các dung dịch thử Cho lần lượt 10 ml các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao vào giữa lưỡi của tình nguyện viên, ngậm trong 30s sau đó nhổ ra và ghi lại cảm nhận về vị đắng Sau mỗi lần thử rửa sạch miệng và chờ 10 phút để thử dung dịch tiếp theo Hệ số hiệu chỉnh cho mỗi thành viên được tính theo công thức: K = ⁄ (trong đó K, n lần lượt là: hệ số điều chỉnh cá thể và số ml dung dịch A nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng) [14]

- Thử độ đắng của dược chất AZI: lấy 0,1g AZI hòa tan trong 1000 ml nước

cất thu được dd B có độ pha loãng 10000 lần Hút lần lượt 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9 ml dd B cho vào các bình định mức 10 ml, thêm nước cất vừa đủ được các dung dịch thử Cho các thành viên thử lần lượt các dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao và ghi lại kết quả Độ đắng của AZI được tính theo công thức: B =

(trong đó B, X lần lượt là: độ đắng của AZI và số

ml dung dịch B nhỏ nhất dùng để pha dung dịch thử có vị đắng) [9], [14] Ngưỡng đắng của AZI là 32,43 µg/ml được tham khảo từ khóa luận tốt nghiệp

dược sĩ “Nghiên cứu bào chế vi hạt che vị azithromycin” [9]

Đánh giá khả che vị của vị hạt theo phương pháp ngưỡng đắng được tiến hành như sau: Lấy một lượng vi hạt tương đương 200 mg AZI cho vào ống nghiệm có nắp đậy, sau đó thêm 10ml nước cất và lắc xoáy ở mức 2 trong 30s, lọc qua giấy lọc lấy dịch lọc đem định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang của sản phẩm

giáng hóa Nồng độ AZI trong dịch lọc được so sánh với ngưỡng đắng, nếu nhỏ hơn ngưỡng đắng thì mẫu vi hạt đó được coi là có khả năng che vị hoàn toàn [16]

 Đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ vi hạt

Điều kiện hòa tan[2]:

 Thiết bị hòa tan: kiểu cánh khuấy

 Thể t ch môi trường: 750 ml dung dịch đệm pH 6,0

 Tốc độ quay: 100 vòng/phút

 Nhiệt độ môi trường: 37±0,5o

C

Tiến hành: cho lượng vi hạt tương đương 200 mg dược chất vào cốc thử hòa tan,

sau khoảng thời gian 15 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút hút 10

ml dung dịch hòa tan lọc qua giấy lọc và định lượng bằng phương pháp đo mật độ quang của sản phẩm giáng hóa

Xử lý kết quả: nồng độ dung dịch thử được tính dựa trên phương trình đường

chuẩn Các dung dịch chuẩn được pha bằng môi trường hòa tan

Trong đó:

2.3.3 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng thuốc theo đường uống

2.3.3.1 Thiết kế mô h nh đ nh gi sinh khả dụng

Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 6 con thỏ đực trưởng thành có trọng lượng 2 – 2,5

kg được nuôi trong phòng dược lý trường Đại học Dược Hà Nội Cho thỏ nhịn ăn và uống trong vòng 24 h trước khi tiến hành thí nghiệm

Chuẩn bị mẫu thuốc:

 Vi hạt che vi được phân tán trong môi trường nước có chứa các chất điều chỉnh pH

 Sản phẩm đối chiếu Zithromax được phân tán thành hỗn dịch trong môi trường nước

Mô h nh đ nh gi SKD: 6 con thỏ sẽ được chia làm 2 nhóm (mỗi nhóm 3 con)

Cân khối lượng thỏ và điều chỉnh liều dùng theo cân nặng của thỏ

 Nhóm 1: cho uống sản phẩm đối chiều Zithromax với mức liều 10 mg/kg

 Nhóm 2: cho uống hỗn dịch chứa vi hạt với mức liều 10 mg/kg

Lấy mẫu và xử lý huyết tương: sau khi cho thỏ uống mẫu thuốc 5 phút, 15 phút,

30 phút, 45 phút, 60 phút, 90 phút, 2 giờ, 4 giờ, 6 giờ, 8 giờ, 24 giờ tiến hành hút 3

ml máu thỏ cho vào ống có tráng heparin Ly tâm mẫu máu ở tốc độ v = 8000 vòng/phút trong 5 phút Thu huyết tương, bảo quản ở nhiệt độ -10oC trước khi đi phân tích LC – MS/MS

2 3 3 2 Phương ph p chiết lỏng – lỏng

Tham khảo phương pháp chiết lỏng – lỏng trong tài liệu [8], tiến hành chiết theo quy trình: hút chính xác 1 ml huyết tương cho vào ống ly tâm 15 ml, thêm 20 µl dung dịch ROXI 1 µg/ml và 0,5 ml dung dịch NH4OH 0,1M, lắc nhẹ Thêm 2 ml diethyl ether, lắc xoáy 5 phút, ly tâm v = 6000 vòng/phút trong 5 phút Hút 0,8 ml dịch nổi, bay hơi dung môi dưới dòng khí nitơ, hòa tan cắn trong 1 ml MeOH, lắc xoáy 60 giây, lọc qua màng lọc 0,45 µm, đưa đi định lượng bằng phương pháp LC – MS/MS

2 3 3 3 Phương ph p phân tích AZI trong huyết tương ằng kỹ thuật LC – MS/MS

a Khảo sát phương pháp phân tích

 Tối ưu hóa điều kiện phân tích

Để tối ưu hóa điều kiện phân tích, tiến hành tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn AZI

và ROXI ở nồng độ 100 ng/ml vào MS với nguồn ESI, chế độ ion dương Ion phân

tử được lựa chọn dựa vào khối lượng phân tử, thường có dạng [M-H]+ Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử thành các ion con, lựa chọn ion con có cường độ cao nhất để định lượng và ion có cường độ thấp hơn để xác nhận Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) tự động theo phần mềm của thiết bị

Các thông số kỹ thuật khác của khối phổ được trình bày trong bảng PL 3.1

 Thẩm định: khoảng tuyến tính và đường chuẩn; độ lặp lại và độ thu hồi

b Tiến hành định lượng AZI trong huyết tương bằng kỹ thuật LC – MS/MS

Sau khi tối ưu điều kiện phân tích, tiến hành định lượng AZI trong huyết tương như sau:

 Sử dụng phương pháp thêm nội chuẩn (IS): Roxithromycin

 Tiến hành định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS với các điều kiện HPLC như sau:

 Cột sắc ký: Eclipseplus C18 (10 cm x 2,1 mm), kích thước hạt nhồi 5 µm

 Pha động gồm có acetonitril và dung dịch amoniaceat 10mM với chương trình gradient nồng độ như sau: từ phút thứ 0 đến phút thứ 0,5 acetonitril chiếm 5% Từ phút thứ 0,5 đến phút thứ 3 lượng acetonitril tăng từ 5 lến 90% Lượng acetonitril này được duy trì từ phút thứ 3 đến phút thứ 4 Từ phút thứ 4 tới phút 4,01 lượng acetonitril giảm từ 90 % xuống 5% và được duy trì tới khi chu kỳ kết thúc