Tiếp tục nghiên cứu bào chế viên nén hai lớp amoxicilin và acid clavulanic giải phóng kéo dài

……… 20 Bảng 3.1 Kết quả của phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid… 24 Bảng 3.2 Kết quả thăm dò dung môi phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic... Để góp phần vào nghiên cứu c

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VĂN HƯNG

M INH VIÊN: 1101232

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG INH HỌC MỘT Ố DẪN

CHẤT ACYL HÓA CỦA

N-METHYLASIMILOBIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC Ĩ

HÀ NỘI – 2016

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ VĂN HƯNG

M INH VIÊN: 1101232

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG INH HỌC MỘT Ố DẪN

CHẤT ACYL HÓA CỦA

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành

nhất tới TS Nguyễn Văn Hải, giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược - người thầy

đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, Trưởng

Bộ môn Công nghiệp Dược, ThS Nguyễn Văn Giang đã cho tôi nhiều ý kiến trao

đổi khoa học và nhận xét bổ ích trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành được đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại Phòng thí nghiệm Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn ở bên, giúp đỡ, là nguồn động viên to lớn giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

H Nội ng y 5 6

Sinh viên

Lê Văn Hưng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC H U, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Cây sen 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Th nh phần hóa học 2

1.1.3 Công dụng 3

1.2 Nuciferin 3

1.2.1 Công thức tính chất lí hóa 3

1.2.2 Tác dụng dược lý 3

1.2.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu 5

1.3 N- Methylasimilobin 7

1.3.1 Công thức tính chất lí hóa 7

1.3.2 Tác dụng dược lý 7

1.3.3 Phương pháp tổng hợp N-methylasimilobin 8

1.4 Tổng quan về các phương pháp acyl hóa 10

1.4.1 Các phương pháp acyl hóa OH phenol 10

1.4.2 Các phương pháp acyl hóa aporphin alkaloid 11

CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu 14

2.2 Thiết bị v dụng cụ 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen 16

2.3.2 Tổng hợp N-methylasimilobin từ nuciferin bằng phản ứng demethyl 16

2.3.3 Tổng hợp một số dẫn chất acyl hóa N-methylasimilobin 16

2.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm acyl hóa 16

2.3.5 Xác định cấu trúc sản phẩm acyl hóa 16

2.3.6 Thử tác dụng sinh học của sản phẩm acyl hóa 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 17

2.4.1 Phương pháp chiết xuất v phân lập tinh chế nuciferin từ lá sen 17

2.4.2 Phương pháp tổng hợp dẫn chất acyl hóa của N-methylasimilobin… 8

2.4.3 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm acyl hóa………….19

2.4.4 Phương pháp xác định cấu trúc sản phẩm 18

2.4.5 Phương pháp thử tác dụng sinh học 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 Chiết xuất phân lập tinh chế nuciferin từ lá sen quy mô g mẻ 21

3.1.1 Quy trình chiết alkaloid to n phần từ lá sen 21

3.1.2 Tinh chế nuciferin từ alkaloid to n phần 21

3.2 Tổng hợp N-methylasimilobin từ nuciferin 21

3.2.1 Tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid quy mô 5 g mẻ 21

3.2.2 Tổng hợp N-methylasimilobin 23

3.3 Tổng hợp 4-methoxy-1-(2-(N-methylacetamido)ethyl)phenanthren-3-yl acetat (H-1) 24

3.3.1 Sơ đồ phản ứng 24

3.3.2 Thăm dò một số yếu tố của phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic 25

3.3.4 Kết quả 28

3.4 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl propionamid (H-2) 29

3.4.1 Điều chế tác nhân propionyl clorid bằng phản ứng của acid propionic với thionyl clorid 29

3.4.2 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl propionamid (H-2) 30

3.5 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl butyramid (H-3) 33

3.5.1 Điều chế tác nhân butyryl clorid bằng phản ứng của acid butytic với thionyl clorid 33

3.5.2 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl butyramid (H-3) 33

3.6 Kết quả phân tích cấu trúc các sản phẩm 35

3.6.1 Xác định cấu trúc sản phẩm H-1 36

3.6.2 Xác định cấu trúc sản phẩm H-2 39

3.6.3 Xác định cấu trúc sản phẩm H-3 42

3.7 Thử tác dụng kháng khuẩn của H-1, H-2, H-3 45

3.8 B n luận 46

3.8.1 Về quy trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 46

3.8.2 Về phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin 47

3.8.3 Về phản ứng tổng hợp H-1 48

3.8.4 Về phản ứng tổng hợp H-2, H-3 50

3.8.5 Về cấu trúc các sản phẩm……… ………… 50

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……… ………54

Kết luận 54

Đề xuất 54

TÀI LI U THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC K HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngo i)

IU International Unit Đơn vị quốc tế

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry (Hiệp hội Hóa

học Quốc tế thuần túy v ứng dụng)

Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ

SKLM Sắc ký lớp mỏng

SN2 Nucleophilic Substitution (Phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử)

tonc Nhiệt độ nóng chảy

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số alkaloid trong lá sen……… 2

Bảng 1.2 Kết quả phản ứng acyl hóa apomorphin bằng Ac2O của J Borgman 12

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm … 14

Bảng 2.2 Các máy móc dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm ……… 15

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn ……… 20

Bảng 3.1 Kết quả của phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid… 24 Bảng 3.2 Kết quả thăm dò dung môi phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic 27

Bảng 3.3 Kết quả thăm dò nhiệt độ phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic 28

Bảng 3.4 Kết quả thăm dò dung môi phản ứng acyl hóa bằng propionyl clorid 32

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ khối lượng ESI-MS MeOH của N-methyl

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ h t nhân proton của N-methyl

asimilobin hydrobromid (1H-NMR 5 MHz MeOH ……… 36

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của H-1……… 37 Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ h t nhân proton của H-1 (1

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu t o nuciferin……… 2

Hình 1.2 Công thức cấu t o nhân aporphin……… 2

Hình 1.3 Công thức cấu t o của N-methylasimilobin……… 7

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin của Feutril v cộng sự 8

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin của Roshan Ahmad… 9

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin của Nguyễn Đắc Tùng 9

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp N-methylasimilobin của Cấn Thị Quỳnh Liên ……… 10

Hình 1.8 Sơ đồ acyl hóa OH phenol bằng clorid acid của Makoto Hashimoto… 10

Hình 1.9 Sơ đồ acyl hóa -methoxylphenol bằng Ac2O của Zhang Haiyan…… 11

Hình 1.10 Sơ đồ acyl hóa asimilobin bằng Ac2O của Masao Tomita……… 11

Hình 1.11 Sơ đồ acyl hóa apomorphin bằng Ac2O của R J Borgman v cộng sự 12

Hình 1.12 Phản ứng acyl hóa boldine bằng benzoyl clorid……… 13 Hình 1.13 Sơ đồ phản ứng acyl hóa cassythicin bằng anhydrid acetic 13 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát tổng hợp các dẫn chất acyl hóa của N-methyl

asimilobin 18

Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid………… 23

Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin……… 25

Hình 3.3 Sơ đồ phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng anhydrid acetic… 25

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phản ứng điều chế tác nhân propionyl clorid… 30

Hình 3.5 Sơ đồ phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng propionyl clorid… 31

Hình 3.6 Sơ đồ phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng butyryl clorid…… 34

Hình 3.7 Cơ chế của phản ứng O-demethyl với tác nhân HBr……… 42

Hình 3.8 Sơ đồ định hướng acyl hóa v o OH phenol t o dẫn chất acyl hóa 49

Hình 3.10 Cơ chế phản ứng mở vòng khung arpophin 50

Hình 3.11 Các d ng cộng hưởng của H-1……… 52 Hình 3.12 Các d ng cộng hưởng của H-2……… 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn dược liệu phong phú đa

d ng cùng những bài thuốc y học cổ truyền đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc phòng v điều trị bệnh, vì vậy việc phát triển thuốc có nguồn gốc dược liệu dần trở thành thế m nh của ngành Dược Việt Nam Trong rất nhiều lo i dược liệu có ứng dụng trong điều trị, phải kể đến Sen - một loài cây rất quen thuộc với người Việt với nhiều bộ phận (h t, lá, củ… có hiệu quả chữa bệnh cao Ngó sen

có tác dụng cầm máu, h t sen là thuốc bổ, chữa di tinh, mất ngủ suy nhược thần kinh Lá sen có tác dụng chữa huyết ứ băng huyết, tiểu tiện ra máu…[ ]

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng của sen Trong cây sen, alkaloid chiếm tới 0,7% - 8% trong đó nuciferin là alkaloid chính Nhiều công trình nghiên cứu đã chỉ ra được rất nhiều tác dụng mới của dịch chiết các bộ phận cây sen cũng như của nuciferin điển hình như tác dụng chống ung thư [31] chống HIV [35] chống tăng lipid máu [28] chống oxy hóa m nh [3 ]… Việt Nam đã có nhiều lo i thuốc được sản xuất từ cao tâm sen v cao lá sen nhưng chưa có cơ sở n o sản xuất nuciferin tinh khiết Gần đây một số nh nghiên cứu đã chiết xuất th nh công nuciferin từ lá sen bằng phương pháp chiết nóng với

dung môi hữu cơ Từ nuciferin chiết xuất được các tác giả đã điều chế được

N-methylasimilobin bằng phương pháp demethyl hóa [3, 5] Ở Việt Nam v trên thế

giới hầu hết các nghiên cứu về N-methylasimilobin chỉ tập trung v o các phản

ứng akyl hóa trên nguyên tử oxy v nitơ m chưa có nghiên cứu n o về phản ứng

acyl hóa N-methylasimilobin

Để góp phần vào nghiên cứu các dẫn chất N-methylasimilobin trên cơ sở

học tập kế thừa ứng dụng các nghiên cứu đã có trong v ngo i nước chúng tôi

thực hiện đề t i “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học một số dẫn chất

acyl hóa của N-methylasimilobin” Đề t i được thực hiện với hai mục tiêu sau:

 Tổng hợp được một số dẫn chất acyl hóa của N-methylasimilobin

 Thử tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất acyl hóa đã tổng hợp được

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Cây sen

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa học: Nelumbo nucifera Gaerth Họ Nelumbonaceae [2]

Phân bố: V ng nhiệt đới châu Á châu Mĩ v ở Việt Nam

Đặc điểm: Sen l một lo i cây mọc dưới nước Thân rễ hình trụ mọc trong

b n Lá mọc lên khỏi mặt nước cuống lá d i có gai nhỏ phiến lá hình khiên có gân tỏa tròn Hoa to m u trắng hay đỏ hồng lưỡng tính đ i 3-5 m u lục tr ng gồm rất nhiều cánh m u hồng hay trắng những cánh ngo i có m u lục như lá đ i nhị nhiều bao phấn ô nứt theo kẽ dọc noãn rời nhau Quả chứa h t không nội nhũ Hai lá mầm dày [2,5]

Thu hái: Sen được trồng ở nhiều nơi trong nước ta, dùng để ăn v làm thuốc

Mùa thu hái từ tháng 7 đến tháng 9 h ng năm [2]

1.1.2 Thành phần hóa học

Lá sen: Chứa nhiều alkaloid (0,77- 0,84%) bao gồm: nuciferin, anonalin,

roemetin, armepavin, N-methylcoclaurin, pronuciferin, liriodenin… Trong đó

nuciferin là alkaloid chính [2,5] Ngoài ra, lá sen còn có một số flavonoid như: quercetin, isoquercitrin, leucocyanidin…

Tâm sen: Cũng có nhiều alkaloid như: liensinin isoliensinin neferin lotusin

methylcoryparin, nuciferin, pronuciferin [2]

Bảng 1.1 Một số alkaloid có trong lá sen

1.1.3 Công dụng

Tâm sen: Dùng chữa hồi hộp, mất ngủ, di tinh mộng tinh Ngày uống 4-10 g

tâm sen khô dưới d ng thuốc sắc hoặc thuốc pha Ngoài ra, tâm sen có tác dụng thanh tâm khứ nhiệt, dùng chữa tâm phiền, thổ huyết [2]

Lá sen: Có tác dụng tiêu ứ, cầm máu, dùng chữa một số bệnh như: đ i tiện ra

máu băng đới băng huyết, nôn ra máu [2]

Tính chất lí - hóa: Nuciferin là chất rắn, tinh thể hình khối,

màu trắng ánh xanh, không mùi, không vị, tan tốt trong cloroform, methanol, ethanol nóng, hầu như không tan trong nước, nhiệt độ nóng chảy 164 - 165oC, phổ

UV (trong MeOH có độ hấp thụ cực đ it i bước sóng 210, 228, và 270 nm [4]

1.2.2 Tác dụng dược lý

1.2.2.1 Tác dụng dược lí của aporphin alkaloid

Trong những năm gần đây tác dụng của các alkaloid có

nhân aporphin đang l đề tài của rất nhiều nghiên cứu bởi

mối liên hệ với cấu trúc nhân apomorphin cũng như các tác

dụng không thể không thừa nhận của các b i thuốc y học cổ

truyền có chứa những alkaloid trên Sau đây l một số tác

dụng được lý chung của các aporphin alkaloid đã được tìm

 Ảnh hưởng đến ho t động của nhiều enzym

 Gây đột biến gây độc cho gen phá hủy cấu trúc nhiễm sắc thể [19, 32]

1.2.2.2 Tác dụng dược lí của nuciferin

Tác dụng trên hệ thần kinh, cơ: Nuciferin l m giãn cơ trơn ức chế thần kinh

trung ương kháng serotonin phong bế thụ thể adrenergic ngo i ra tăng cường quá trình ức chế các tế b o thần kinh v ng vỏ não cảm giác - vận động v thể lưới thân não trên chuột có tác dụng an thần kéo d i giấc ngủ của pentobarbital trên chuột thí nghiệm [7]

Tác dụng tăng tiết insulin: Nuciferin kích thích tiểu đảo tụy tiết insulin,

chống bệnh đái tháo đường theo cơ chế đóng các kênh K+- ATPase Nuciferin kích thích tiết insulin ở nồng độ 3,3 và 16,7 mM So với glibenclamid, nuciferin có tác dụng m nh hơn v ít độc tế b o hơn [25]

Tác dụng chống HIV: Theo Yoshiki Hashiwada và cộng sự, nuciferin cùng

một số alkaloid có trong dịch chiết lá sen trong cồn 96% có tác dụng kháng HIV Trong đó EC50 nồng độ có tác dụng một nửa tối đa l 0,8 µg/mL, TI (chỉ số trị liệu) là 36,3 [35]

Tác dụng chống ung thư: Nuciferin có tác dụng đáng kể trong việc ức chế

nicotin gây ra ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) tiến triển thông qua việc

làm giảm ho t động của tín hiệu Wnt/β-catenin Thử nghiệm trên chuột cho thấy

nuciferin không chỉ ức chế sự tăng trưởng của NSCLC mà còn làm giảm đáng kể các tổn thương gây ra bởi nicotin trong chức năng gan [22] Nuciferin và liensinin được thử nghiệm trên chuột ở nồng độ không gây độc tế bào, cho thấy tác dụng ức

chế sự ho t hóa thụ thể của yếu tố gây hủy xương Ngo i ra liensinin v nuciferin còn ức chế việc tăng sinh tế b o ung thư vú ở người [10]

Tác dụng chống oxy hóa: Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết cồn của h t Nelumbo nucifera để nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in vitro và

in vivo

Kết quả cho thấy dịch chiết có tác dụng chống gốc tự do tốt thể hiện qua các giá trị IC50 thu được Tác dụng chống oxy hóa sử dụng phương pháp DPPH -diphenyl-2-picrylhydrazyl) cho IC50 bằng 6,12 ± 0,41 µg/mL, còn với phương pháp sử dụng nitơ monoxit là 84,86 ± 3,56 µg/mL Các giá trị IC50 ở trên đều ít hơn so với giá trị IC50 ở rutin trong thử tác dụng chống oxy hóa với các phương pháp tương tự Ngo i ra người ta đánh giá độc tính cấp của dịch chiết ở chuột

b ch t ng Thụy Sĩ không thấy có dấu hiệu độc tính ở liều uống lên đến 1000 mg/kg trọng lượng cơ thể [4]

Với rất nhiều ho t tính sinh học có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị bệnh đã

v đang được tiếp tục nghiên cứu, nuciferin có tiềm năng trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng trong ngành Dược không chỉ của Việt Nam mà của toàn thế giới

1.2.3 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu 1.2.3.1 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế alkaloid từ dược liệu [1,6]

 Phương pháp chiết xuất

Chiết alkaloid dưới dạng base bằng dung môi hữu cơ không phân cực

Chuẩn bị nguyên liệu: Xay nhỏ dược liệu thành bột Kiềm hóa l m trương

nở bằng dung dịch kiềm để chuyển alkaloid trong dược liệu sang d ng base

Chiết xuất: Sử dụng dung môi chiết là các dung môi hữu cơ Trong phòng thí

nghiệm thường sử dụng benzen, cloroform, ether + cloroform Trong sản xuất công nghiệp thường dùng dung môi rẻ tiền ít độc (dầu hỏa) Có thể d ng phương pháp chiết nguội hoặc chiết nóng

Tinh chế: bằng cách chuyển d ng muối với acid - base và chiết chúng giữa

hai pha dầu - nước để lo i t p không phải alkaloid

Chiết alkaloid dưới dạng muối bằng nước, nước acid hoặc cồn acid

Chuẩn bị nguyên liệu: Nguyên liệu được xay nhỏ, làm ẩm, ngâm trương nở

bằng dung môi thích hợp nước nước acid, cồn acid)

Chiết xuất: Chiết bột dược liệu bằng dung môi nước nước acid hoặc cồn

acid (thường d ng nước nóng hoặc ethanol có các nồng độ khác nhau) Các

alkaloid ở d ng muối sẽ tan trong các dung môi trên

Tinh chế: Lọc dịch chiết, kiềm hóa về d ng base, cô bớt dung môi dưới áp

suất giảm Chiết lấy alkaloid d ng base bằng dung môi thích hợp Cất thu hồi dung

môi hữu cơ sấy khô, thu được alkaloid toàn phần

 Phân lập và tinh chế

Sử dụng phổ biến nhất 3 phương pháp sau:

Kết tinh phân đoạn

Dựa v o độ hòa tan khác nhau của các chất khi hòa tan hỗn hợp vào một hoặc một hỗn hợp dung môi Trong quá trình dung môi bốc hơi từ từ, thành phần khó tan nhất sẽ tủa hoặc kết tinh trước Lọc lấy phần tinh thể thô, kết tinh l i, thu được chất tinh khiết Bay hơi dung môi phần dung dịch còn l i, kết tinh để tách các chất khác Để quá trình kết tinh hiệu quả hơn có thể kết hợp việc bay hơi dung môi và giảm nhiệt độ Hòa tan/kết tinh phân đo n thường dùng một dung môi, trong trường hợp các chất khó kết tinh có thể dùng hỗn hợp hai hay ba dung môi

Phân lập alkaloid bằng sắc kí cột

Lắc silica gel với hệ dung môi đã chọn thành hỗn dịch, ngâm 3 phút sau đó nhồi cột Hòa cắn alkaloid toàn phần vào một lượng nhỏ dung môi thích hợp t o thành dịch alkaloid đậm đặc, sau đó đưa v o cột sắc kí đã chuẩn bị Ch y cột với tốc độ khoảng 30 giọt/phút, hứng mỗi phân đo n khoảng 25 mL vào các bình nón, kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng Chọn riêng các phân đo n chỉ có một vết trên sắc

kí, bốc hơi dung môi thu được cắn alkaloid tinh khiết

Phân lập alkaloid bằng sắc kí lớp mỏng điều chế

Chấm dung dịch alkaloid toàn phần lên bản mỏng có kích thước 20x20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G Merck đã ho t hóa ở 110o C trong 1 giờ

Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH : NH4OH (50:9:1) Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, soi đèn tử ngo i để phát hiện, đánh dấu vết alkaloid C o lấy vùng silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng methanol Đểmethanol bốc hơi tự nhiên, sau đó hòa tan l i bằng ethanol 96%, làm l nh, cho kết tinh l i, thu được nuciferin

1.2.3.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin từ dược liệu

Sử dụng phương pháp chiết alkaloid bằng dung môi hữu cơ và phân lập, tinh

chế bằng phương pháp kết tinh như đã trình b y trong phần 1.2.3.1)

methanol từ nụ hoa và lá của hoa sen đã được chứng minh là có tác dụng ức chế

ho t động t o khối u ác tính tế bào B16, 4A5 ở chuột

Hình 1.3 Công thức cấu t o

của N-methylasimilobin

Trong số các thành phần phân lập được thì nuciferin và N-methylasimilobin

ức chế sự biểu hiện của mRNA tyrosinase ở nồng độ 3-30 µM,

N-methylasimilobin ức chế sự biểu hiện của TRP-1 mRNA nồng độ 3-30 µM, và nuciferin ức chế sự biểu hiện của TRP-2 mRNA ở nồng độ 10-30 µM [5,13]

Các alkaloid aporphin phân lập từ Nelumbo nucifera có tác dụng ức chế acetylcholinesterase (AChE): N-methylasimilobin là một chất ức chế m nh

receptor AChE (ức chế 50% ho t động của AChE ở nồng độ 1,5 ± 0,2 µg.mL-1trong khi giá trị IC50 tiêu chuẩn của physostigmin là 0,013 ± 0,002 µg.mL-1) Hai alkaloid aporphin có tác dụng kém hơn l nuciferin và nornuciferin [5,16]

Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ

lá sen đã được thử nghiệm Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt rét v chống nấm như roemerin Tuy nuciferin không có tác dụng n y nhưng người ta phát hiện ra một mối liên hệ cấu trúc và tác dụng có liên quan mật thiết đến nhóm thế ở vị trí C1 và

C trên vòng aporphin Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới với việc gắn nhóm thế vào 2 vị trí này ở nuciferin [33]

Tác dụng chống oxy hóa: Chi-Ming Liu và cộng sự tiến hành thử ho t tính

chống oxy hóa của dịch chiết lá sen bằng phương pháp ABTS v Chelating Kết

quả thu được như sau: khả năng chống oxy hóa của N-methylasimilobin ở nồng độ

100 mM với phương pháp ABTS l 23,6%, Chelating là 6,9% [21]

1.3.3 Phương pháp tổng hợp N-methylasimilobin

 Phản ứng của Feutrill và cộng sự năm 1970 với tác nhân EtSNa

Hình 1.4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin của Feutril và cộng sự

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và natri thioethoxyd lượng gấp 6- 2,7

số mol của nuciferin) vào dung môi DMF, đun hồi lưu có sục nitơ liên tục ở nhiệt

độ o

C trong 3 giờ Xử lý phản ứng, thu được sản phẩm N-methylasimilobin với

hiệu suất khoảng 94-98% [12,20]

 Phản ứng của Roshan Ahmad và cộng sự năm 1977

Hình 1.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin của Roshan Ahmad

Tiến hành phản ứng: Khuấy dibenzyl diselenid trong DMF, thêm lượng dư

NaBH4 sục nitơ, sau 15 phút, thêm nuciferin DMF v o hỗn hợp Đun hồi lưu hỗn hợp trong 2 giờ, sục nitơ trong quá trình phản ứng Xử lí phản ứng, thu được sản phẩm với hiệu suất 75% [27]

 Phản ứng của Nguyễn Đắc Tùng năm 2014 với tác nhân HBr 48%

Tiến hành phản ứng: Cho nuciferin và xúc tác KI vào dung dich HBr 48%,

duy trì nhiệt độ -125oC sục nitơ trong suốt quá trình phản ứng Kết thúc phản ứng sau 4 giờ xử lý hỗn hợp thu được sản phẩm N-methylasimilobin với hiệu suất 6 9% [5]

 Phản ứng của Cấn Thị Quỳnh Liên năm 2015 với tác nhân HBr 48%

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin củaNguyễn Đắc Tùng

Tiến hành phản ứng: Cho 0,2 g nuciferin và 0,12 g KI vào 10 mL dung dịch

HBr 48% duy trì nhiệt độ 122-125oC sục nitơ trong suốt quá trình phản ứng Kết

thúc phản ứng sau 3,5 giờ xử lý phản ứng thu được sản phẩm N-methylasimilobin

với hiệu suất 83,4% [3]

1.4 Tổng quan về các phương pháp acyl hóa aporphin alkaloid

1.4.1 Các phương pháp acyl hóa OH phenol

 Phản ứng của Makoto Hashimoto và cộng sự năm 2011

Hình 1.8 Sơ đồ acyl hóa OH phenol bằng clorid acid của Makoto Hashimoto

Makoto Hashimoto v cộng sự tiến h nh phản ứng acyl hóa với tác nhân clorid acid trong 1% TfOH (acid trifluoromethansulfonic) và CH3CN ở điều kiện nhiệt độ thường trong giờ

Kết quả thu được: với tác nhân propionyl clorid, thu được sản phẩm với hiệu suất 95%, với tác nhân butyryl clorid, hiệu suất 99% [24]

Hình 1.7 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin củaCấn Thị Quỳnh Liên

 Phản ứng acyl hóa 2-methoxylphenol bằng Ac 2 O của Zhang Haiyan

Hình 1.9 Sơ đồ acyl hóa -methoxylphenol bằng Ac2O của Zhang Haiyan

Tiến hành: cho 20,5 g 2-methoxylphenol v o bình cầu 5 mL, thêm vào 330

mL Ac2O và 2 mL H2SO4 Khuấy hỗn hợp ở oC trong 6 giờ Xử lí phản ứng, thu đƣợc 6,0 g sản phẩm hiệu suất 93,7%) [37]

1.4.2 Các phương pháp acyl hóa aporphin alkaloid

 Phản ứng của Masao Tomita và Mutsuo Kozuka năm 1965

Hình 1.10 Sơ đồ acyl hóa asimilobin bằng Ac2O của Masao Tomita

Tiến hành phản ứng: cho 100 mg asimilobin phản ứng với 2 mL Ac2O ở nhiệt độ 80 - 90oC sau giờ thu đƣợc sản phẩm O, N-diacetylasimilobin với hiệu

suất 8 % [36]

 Phản ứng của R J Borgman và cộng sự năm 1975 [8]

R J Borgman v cộng sự tiến h nh khảo sát phản ứng giữa apomorphin và

Ac2O ở các điều kiện xúc tác thời gian khác nhau Phản ứng theo Hình 1.11

Nhận xét: phản ứng acyl apomorphin với các điều kiện khác nhau sẽ t o ra

các sản phẩm khác nhau Khi tác nhân c ng m nh thời gian phản ứng c ng lâu thì

sẽ t o ra sản phẩn O, N-didemethyl hóa dẫn tới sự mở vòng apomorphin

Hình 1.11 Sơ đồ acyl hóa apomorphin bằng Ac2O của R J Borgman v cộng sự

Sản phẩm

Hiệu suất (%)

 Phản ứng acyl hóa boldine bằng benzoyl clorid

Sơ đồ phản ứng

2

Hình 1.12 Phản ứng acyl hóa boldine bằng benzoyl clorid

Khi tiến h nh đun hồi lưu một aporphin với clorid acid hoặc anhydrid acetic

sẽ thu được sản phẩm O, N-diacyl dẫn tới việc mở vòng B của khung aporphin Ví

dụ trên là phản ứng acy hóa boldine bằng benzoyl clorid[23]

 Phản ứng acyl hóa cassythicine của S R Johns và cộng sự

Sơ đồ phản ứng

3

Hình 1.13 Sơ đồ phản ứng acyl hóa cassythicine bằng anhydrid acetic

1 Tiến hành phản ứng: Cho 50 mg cassythicine hòa tan trong 2 mL anhydrid

acetic chứa 0,1 mL pyridin và hỗn hợp được đun cách thủy trong 2 giờ Kết thúc phản ứng lo i bỏ anhydrid acetic, pyridin, sản phẩm thu được đem kết tinh trong cồn 96% thu được tinh thể hình kim có tonc=151-152oC, hiệu suất 57% [29]

2

3

2 CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

Nguyên liệu: Lá sen khô được thu mua t i phố Lãn Ông, Hà Nội Qua quá

trình chiết xuất, tinh chế, phân lập t i phòng Tổng hợp hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đ i học Dược Hà Nội thu được nuciferin làm nguyên liệu cho các phản ứng bán tổng hợp

Các hóa chất khác sử dụng trong quá trình thực nghiệm được thống kê trong

Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong quá trình thực nghiệm

14 n-hexan Trung Quốc

2.2 Thiết bị và dụng cụ

Các máy móc dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm được liệt kê

trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm

8 Cốc có mỏ 5 mL, 100 mL, 250 mL, 1 L Đức

12 Mao quản chấm sắc ký đo nhiệt độ nóng chảy Việt Nam

13 Máy cất quay chân không Buchi R-210 Thụy Sỹ

15 Máy đo phổ cộng hưởng từ h t nhân proton 1H-NMR)

Bruker AV-500

Mỹ

16 Máy đo phổ khối lượng Agilent LC-MS/MS 1290/6460 Mỹ

20 Pipet chia v ch mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL Đức

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Chiết nuciferin từ lá sen

 Thực hiện chiết alkaloid toàn phần trong lá sen

 Phân lập, tinh chế nuciferin từ alkaloid to n phần

 Kiểm tra độ tinh khiết của nuciferin bằng phương pháp SKLM v đo nhiệt

 Tinh chế muối N-methylasimilobin hydrobromid

 Kiểm tra độ tinh khiết của muối N-methylasimilobin hydrobromid bằng

phương pháp SKLM v đo nhiệt độ nóng chảy

 Chuyển muối N-methylasimilobin hydrobromid thành N-methylasimilobin

2.3.3 Tổng hợp một số dẫn chất acyl hóa của N-methylasimilobin

 Điều chế tác nhân propionyl clorid, butyryl clorid

 Thực hiện phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng tác nhân anhydrid acetic, propionyl clorid và butyryl clorid

 Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp kết tinh, sắc ký cột, sắc ký điều chế

2.3.4 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm acyl hóa

 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm acyl hóa bằng phương pháp SKLM v

đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.5 Xác định cấu trúc sản phẩm acyl hóa

 Cấu trúc sản phẩm được xác định thông qua phổ MS NMR IR

2.3.6 Thử tác dụng sinh học của sản phẩm acyl hóa

 Thử tác dụng kháng khuẩn của sản phẩm acyl hóa bằng phương pháp khuếch tán trên th ch trên một số chủng vi khuẩn t i Bộ môn Vi sinh-Sinh học-Trường đ i học Dược H Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen

 Sử dụng phương pháp chiết alkaloid base bằng dung môi hữu cơ không

phân cực

 Phân lập, tinh chế nuciferin bằng phương pháp chiết, kết tinh (trong dung

môi aceton), tẩy màu (bằng than ho t)

2.4.2 Phương pháp tổng hợp các dẫn chất acyl hóa của N-methylasimilobin

 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để

tổng hợp các chất dự kiến: phương pháp O-demethyl hóa, acyl hóa…

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát tổng hợp các dẫn chất acyl hóa của N-methylasimilobin

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng SKLM để theo dõi tiến triển của phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết SKLM được thực hiện với bản mỏng silica gel 60 F254 v hệ dung môi khai triển thích hợp Hệ dung môi l cloroform:

methanol (9:1), hệ dung môi là n-hexan:ethyl acetat (3:7) Pha dung dịch thử v

dung dịch mẫu trong methanol, cloroform; để khô bản mỏng ngo i không khí sau

đó triển khai sắc ký đến khi dung môi đi được 5 cm; quan sát dưới đèn tử ngo i ở bước sóng 54 nm

 Sử dụng các phương pháp kết tinh, sắc ký cột và sắc ký điều chế để tinh chế sản phẩm

2.4.3 Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm acyl hóa

 Sử dụng phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở mục

2.42 Chấm sắc kí chất thử với các nồng độ khác nhau Dựa vào đặc điểm hình

thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

 Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

 Phổ hồng ngo i IR : Được ghi t i Bộ môn Hóa học vô cơ Khoa Hóa học

Đ i học Khoa học tự nhiên – Đ i học Quốc gia H Nội trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén kali bromid trong v ng 4 – 400 cm-1

 Phổ khối lượng (MS): Được ghi t i Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia, trên máy LC-MS/MS Agilent 1290/6460 (Mỹ) với chế độ đo ESI

 Phổ cộng hưởng từ (1H-NMR và 13C-NMR): Được ghi t i Phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Đ i học Khoa học tự nhiên – Đ i học Quốc gia

Hà Nội, trên máy Bruker 500 MHz Ascend, sử dụng dung môi CD3Cl, với chất chuẩn nội là tetramethylsilan

Escherichia coli ATCC 25922 E coli

Proteus mirabilis BV 108 P mirabilis

Shigella flexneri DT 112 S flexneri

Salmonella typhi DT 220 S typhi

Vi khuẩn Gram (+)

Staphylococcus aureus ATCC 1128 S aureus

Bacillus pumilus ATCC 10241 B pumilus

Bacillus subtilis ATCC 6633 B subtilis

Bacillus cereus ATCC 9946 B cereus

Sarcina lutea ATCC 9341 S lutea

2.4.5.2 Môi trường thử nghiệm

Môi trường nuôi cấy VSV được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

2.4.5.3 Mẫu kháng sinh chuẩn

Streptomycin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (-)

Benzathin penicillin G: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (+)

2.4.5.4 Phương pháp thử

Đánh giá ho t tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán

Nguyên tắc: Mẫu thử (có chứa ho t chất thử được đặt lên lớp th ch dinh

dưỡng đã cấy VSV kiểm định, ho t chất từ mẫu thử khuếch tán v o môi trường

th ch sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định, t o thành vòng vô khuẩn

Tiến hành:

 Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (cloroform) với nồng độ cho

các mẫu như sau: Nuciferin: μg mL, HungC2: μg mL, HungC3:

μg mL v HungC4: 10 μg mL Các khoanh giấy lọc vô tr ng v được sấy

khô được tẩm ba lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm khoanh giấy lọc chứa mẫu thử đều được sấy dưới 60 C đến khô hết dung môi

 Chuẩn bị môi trường và cấy VSV kiểm định: Vi khuẩn kiểm định được cấy

v o môi trường canh thang, rồi ủ cho phát triển trong tủ ấm 37 C trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dịch chuẩn) Môi trường th ch thường vô trùng (tiệt trùng ở 118 C 3 phút được làm

l nh về 45 - 50 C v được cấy giống VSV kiểm định vào với tỉ lệ 2,5 mL/100 mL Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường th ch, rồi đổ v o đĩa petri với thể tích 20 mL đĩa v để cho đông l i

 Đặt mẫu thử và chứng: khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử, tẩm kháng sinh chứng chuẩn và xử lý được đặt lên bề mặt môi trường th ch chứa VSV kiểm định theo sơ đồ định sẵn

 Ủ các đĩa petri có mẫu thử và chứng trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 C trong

18-24 giờ sau đó đọc kết quả Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp Panmer



 1 s =

1

) (

s : Độ lệch thực nghiệm có hiệu chuẩn

n: Số thí nghiệm làm song song (n =3)

3 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ lá sen quy mô 20 g/mẻ

3.1.1 Chiết alkaloid toàn phần từ lá sen

Nguyên liệu: 5 kg lá sen khô được xay nhỏ thành bột

Quy trình: Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong (ủ trong 24 giờ để

thấm đều dược liệu), để khô tự nhiên Cho bột lá sen vào 5 túi vải kích thước 17x150 cm, cho các túi vải vào bình cầu 50 L Chiết nóng bằng 30 L dầu hỏa ở nhiệt độ 100-110oC trong 3 giờ Dịch chiết dầu hỏa được lắc kĩ với 5 L acid H2SO40,5 % Sau đó g n lấy lớp dầu, đổ l i v o bình v chiết tiếp bã lá sen vừa rồi trong 1,5 giờ, lớp dầu thu được tiếp tục chiết với dịch acid trên Như vậy cứ mỗi kg lá sen sẽ sử dụng 6 L dầu hỏa và 1 L H2SO4 0,5% (chiết hai lần) Kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa đến pH = 8, lọc hút chân không thu được tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC

Kết quả: Khối lượng alkaloid toàn phần thu được là 52,5 g (1,1%)

3.1.2 Tinh chế nuciferin từ alkaloid toàn phần

Phương pháp: Kết tinh trong aceton

Tiến hành: Hòa tan nóng hoàn toàn alkaloid to n phần thu được vào 1 L

aceton Tẩy m u bằng 1,0 g than ho t đun sôi khuấy trong 15 phút lọc nóng lấy dịch Để l nh trong 4 giờ Lọc lấy tinh thể, kết tinh l i trong 500 mL aceton

Kết quả:

 m Nuciferin = 21,2 g (0,43%) tính theo khối lượng dược liệu khô

 Cảm quan: Tinh thể hình khối, màu trắng

 t o

nc: 166-167oC (theo tài liệu [4] là 164-165oC)

 Độ tinh khiết: Kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM với hai hệ dung môi Hệ

dung môi cloroform:methanol (9:1) cho 1 vết với Rf = 0,67, hệ dung môi n-hexan:

ethyl acetat (3:7) cho một vết với Rf =0,50

3.2 Tổng hợp N-methylasimilobin từ nuciferin

3.2.1 Tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid quy mô 5 g/mẻ

Chúng tôi tiến hành tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid bằng phản

ứng demethyl hóa nuciferin theo phương pháp của Cấn Thị Quỳnh Liên thực hiện năm 5 [3]

 Nguyên lý phản ứng

KI t o ion I- là tác nhân ái nhân, có vai trò ho t hóa l m tăng tốc độ phản ứng qua đó l m giảm thời gian phản ứng

 Cách tiến hành phản ứng

huẩn bị phản ứng: Cho hỗn hợp gồm nuciferin (5,0 g; 0,017 mol), HBr

48% (200 mL; 1,2 mol), KI (2,8 g; 0,017 mol v o bình cầu hai cổ 500 mL khuấy liên tục, sục khí nitơ và lắp sinh h n hồi lưu

Tiến hành phản ứng: Đun hồi lưu hỗn hợp ở nhiệt độ 115 – 120o

C trong 3 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM hệ dung môi cloroform: methanol (9:1)

Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Cất kiệt dịch trong phản ứng, thu được chất rắn

m u trắng Hòa tan chất rắn thu được vào 2 L ethanol 96% nóng Cất quay dịch còn khoảng 5 0 mL Để l nh cho kết tinh hoàn toàn trong 4 giờ, lọc hút chân không được tinh thể m u trắng hình kim mịn Sấy khô ở 7 oC

 Kết quả

Chúng tôi đã tiến h nh phản ứng demethyl hóa nuciferin sáu lần với lượng nuciferin tăng dần để xem xét độ ổn định của phản ứng

Độ tinh khiết của sản phẩm được đánh giá qua hai tiêu chí là SKLM (được

triển khai với hệ dung môi cloroform: methanol (9:1), chấm vết chuẩn là N-methyl

Hình 3.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin hydrobromid

asimilobin, vết thử là sản phẩm của phản ứng, sau khi chấm thì hơ NH3 5 phút rồi mới ch y sắc kí, từ đó tính Rf ) và nhiệt độ phân hủy

Hiệu suất (%)

Nhiệt độ phân hủy ( o C)

Hiệu suất trung bình 84,8%

Nhận xét: Từ kết quả trên có thể thấy phản ứng demethyl hóa nuciferin bằng

HBr 48% xảy ra khá ổn định Khi tăng quy mô lên 5 g mẻ thì hiệu suất tăng lên so với quy mô 5 g mẻ do giảm sự hao hụt trong quá trình xử lí

3.2.2 Tổng hợp N-methylasimilobin

 Nguyên tắc phản ứng

Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp N-methylasimilobin

Cách tiến h nh phản ứng

Hòa tan hoàn toàn 0,50 g (1,50 mmol) N-methylasimilobin hydrobromid vào

5 mL nước cất nóng Để nguội về nhiệt độ phòng, cho vào bình chiết 500 mL

cùng với 50 mL dicloromethan Kiềm hóa pha nước bằng dung dịch NaHCO3

loãng (pH=9) đến khi pH=8, lắc chiết để N-methylasimilobin base tan sang pha

dicloromethan Thu dịch chiết dicloromethan vào bình nón 250 mL Tiến hành chiết khoảng 3 lần, mỗi lần 50 mL dicloromethan, gộp dịch chiết vào bình nón Rửa l i dịch chiết với nước đến pH trung tính (khoảng ba lần) Dịch chiết được làm khan bằng 5,00 g Na2SO4 khan, khuấy liên tục trong 2 giờ Sau 2 giờ lọc lấy dịch, cất đến kiệt để thu hồi dicloromethan Cắn thu được đem sấy khô ở 600C

 iểm tra độ tinh khiết bằng SKLM: Triển khai với hệ dung môi cloroform :

methanol (9:1) Sắc kí cho một vết với Rf = 0,60

3.3 Tổng hợp 4-methoxy-1-(2-(N-methylacetamido)ethyl)phenanthren-3-yl acetat (H-1)

3.3.1 Sơ đồ phản ứng

Chúng tôi sử dụng tác nhân sẵn có l anhydrid acetic Đây l một tác nhân acyl hóa trung bình, có khả năng acyl hóa OH phenol v amin nhưng khi phản ứng đòi hỏi phải có nhiệt độ cao

Hình 3.3: Sơ đồ phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng anhydrid acetic

3.3.2 Thăm dò một số yếu tố của phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic

Chúng tôi tiến h nh thăm dò dung môi v nhiệt độ của phản ứng nhằm đưa ra

những điều kiện thích hợp v đề xuất một quy trình acyl hóa N-methylasimilobin

bằng anhydrid acetic thích hợp nhất trong ph m vi nghiên cứu

ách đánh giá kết quả: Phản ứng được theo dõi bằng SKLM, khai triển với

hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (3:7), quan sát dưới đèn tử ngo i ở bước sóng

254 nm Trên SKLM có thể quan sát thấy các vết sau:

- Vết nguyên liệu N-methyasimilobin: Rf = 0,50

- Vết của sản phẩm H-1: nằm dưới vết nguyên liệu với Rf = 0,40

- Vết của sản phẩm phụ: L tất cả các vết không tr ng với vết nguyên liệu v

sản phẩm

Từ các vết trên SKLM, chúng tôi sẽ đánh giá kết quả dựa trên việc nguyên liệu hết hay chưa nhiều sản phẩm phụ hay không Phản ứng được coi là kết thúc khi không quan sát thấy vết nguyên liệu trên SKLM

 Thăm dò dung môi và thời gian phản ứng

Ba dung môi được lựa chọn để thăm dò là nước cất, cloroform và 1,4-dioxan Lượng dung môi được sử dụng l như nhau phản ứng được tiến h nh ở nhiệt độ sôi của dung môi thời gian phản ứng sẽ được khảo sát cụ thể với từng dung môi

Dung môi th ch hợp của phản ứng là dung môi mà khi tiến hành phản ứng

trong dung môi đó thì nguyên liệu hết v lượng sản phẩm phụ là nhỏ nhất

Thời gian th ch hợp của phản ứng l thời gian tối thiểu trong đó nguyên liệu

đã hết v lượng sản phẩm phụ l ít nhất

Tiến hành phản ứng

Dung môi nước: Cân 0,13 g (0,36 mmol) N-methylasimilobin hydrobromid

và 0,1 g (0,9 mmol) Na2CO3, cho vào bình cầu một cổ 50 mL, thêm vào 5 mL

H2O Nhỏ từ từ vào bình phản ứng 1 mL (0,01 mol) anhydrid acetic, khuấy liên tục bằng khuấy từ ở nhiệt độ 20-25oC Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung

môi n-hexan: ethyl acetat (3:7) để xác định thời điểm phản ứng kết thúc

Với hai dung môi là cloroform và 1,4-dioxan: Hòa tan 0,10 g (0,36 mmol)

N-methylasimilobin vào 5 mL dung môi phản ứng, thêm 0,10 g Na2CO3 (0,9 mmol) Đun đến nhiệt độ sôi của dung môi, sau 5 phút thêm từ từ 1,0 mL (0,01 mol) anhydrid acetic, khuấy liên tục bằng khấy từ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với

hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (3:7) để xác định thời điểm phản ứng kết thúc

Kết quả khảo sát đƣợc thể hiện trong Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả thăm dò dung môi của phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic

Dung môi Nhiệt độ

( 0 C)

Thời gian (giờ)

Vết các thành phần trên sắc ký lớp mỏng Nguyên liệu Sản phẩm Tạp

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy ở hai dung môi là H2O và CHCl3, phản ứng xảy ra không hoàn toàn, với dung môi 1,4-dioxan, phản ứng hoàn toàn sau 10 giờ Vì vậy chúng tôi chọn 1,4-dioxan làm dung môi cho phản ứng và thời gian thích hợp cho phản ứng là 10 giờ

Bảng 3.3 Kết quả thăm dò nhiệt độ của phản ứng acyl hóa bằng anhydrid acetic

Dung môi Nhiệt

độ( 0 C)

Thời gian ( giờ)

Vết các thành phần trên SKLM Nguyên liệu Sản phẩm Tạp

1,4-dioxan

50-60 >24 Có (nhiều) Có (ít) Không 75-85 >15 Có ít) Có nhiều) Có (ít)

95-105 10 Không Có (nhiều) Có (ít)

Kết quả: Với dung môi 1,4-dioxan, ở 95-105oC phản ứng xảy ra hoàn toàn, ít

t p nhất, trong thời gian nhanh nhất là 10 giờ

Kết luận: Dung môi được chọn để tiến hành phản ứng là 1,4-dioxan, thời gian của phản ứng là 10 giờ ở 95-105 0

C

Đề xuất quy trình phản ứng

Tiến hành phản ứng: Hòa tan 0,50 g (1,8 mmol) N-methylasimilobin vào 25

mL 1,4-dioxan trong bình cầu hai cổ 100 mL, thêm 0,50 g Na2CO3 (4,5 mmol) Đun đến nhiệt độ sôi 95-105o

C, sau 5 phút thêm từ từ 5,0 mL (0,05 mol) anhydrid acetic, khuấy liên tục bằng khấy từ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung

môi n-hexan: ethyl acetat (3:7) để xác định thời điểm phản ứng kết thúc Sau 10

giờ thì phản ứng kết thúc

Xử lí phản ứng: Cất quay đến kiệt để lo i bỏ 1,4-dioxan, hòa tan cắn bằng 50

mL dicloromethan Cho dịch dicloromethan vào bình chiết 250 mL, rửa bằng dung dịch NaHCO3 loãng (pH=9), l nh đến khi pH pha nước không đổi (khoảng bốn

lần)

Tiếp tục rửa dịch dicloromethan bằng nước cất khoảng ba lần Dịch dicloromethan sau đó được làm khan bằng 2,50 g Na2SO4 khan, khuấy liên tục trong giờ Sau 2 giờ lọc lo i bỏ Na2SO4, cất quay dịch đến thể tích khoảng 5 mL Dùng sắc kí điều chế để tách sản phẩm tinh khiết

Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau

Chấm dịch lên những bản mỏng có kích thước 20x cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G Merck đã ho t hóa ở 110oC trong 1 giờ Hệ dung môi khai

triển là hệ n-hexan:ethyl acetat (5:5) Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, soi dưới

đèn UV để đánh dấu vùng chứa sản phẩm C o lấy vùng silica gel chứa sản phẩm, phản hấp phụ bằng CHCl3, lọc lấy dịch Bay hơi hết dung môi, thu được sản phẩm

H-1 tinh khiết

3.3.3 Kết quả

Phản ứng được tiến h nh theo quy trình đề xuất ở trên cho kết quả như sau:

 Thu được 0,35 g sản phẩm H-1, hiệu suất 78,2%

 Thử tinh khiết bằng phương pháp S LM: hệ dung môi n-hexan:

ethyl acetat (3:7) cho thấy sản phẩm thu được tinh khiết với Rf = 0,40 Kết quả phổ

MS và 1H-NMR, 13C-NMR đã chứng minh cấu trúc sản phẩm thu được l đúng

3.4 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl propionamid (H-2)

Phản ứng n y sử dụng tác nhân không sẵn có l propionyl clorid nên chúng tôi tiến h nh điều chế tác nhân

3.4.1 Điều chế tác nhân propionyl clorid bằng phản ứng của acid propionic với thionyl clorid

Sơ đồ phản ứng

Chuẩn bị: Bình cầu 2 cổ dung tích 250 mL, bình nhỏ giọt, sinh hàn, bộ phận

bẫy khí, bộ phận ngăn ẩm, một cốc đựng dung dịch kiềm loãng, thiết bị cất, nhiệt

kế thủy ngân, 2 bình nón có nút mài

Bố trí dụng cụ thí nghiệm như sơ đồ sau:

Hình 3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phản ứng điều chế tác nhân clorid acid

Tiến hành phản ứng: Cho 64,5 mL (0,9 mol) thionyl clorid vào bình cầu 2 cổ

250 mL d ng pipet lấy 75,0 mL acid propionic (1,0 mol) vào bình nhỏ giọt Đun cách thủy phản ứng ở nhiệt độ khoảng 90 C, nhỏ từ từ acid vào bình cầu trong 60-

70 phút, khuấy từ liên tục Sau khi toàn bộ acid đã nhỏ hết, tiếp tục đun và khuấy

Phản ứng kết thúc khi không còn bọt khí nổi lên ở cốc đựng dung dịch kiềm Cất phân đo n 77-79o

C thu sản phẩm propionyl clorid

Kết quả: thu được 22,5 mL propionyl clorid

3.4.2 Tổng hợp N-(2-(3-hydroxy-4-methoxyphenanthren-1-yl)ethyl)-N-methyl propionamid (H-2)

3.4.2.1 Sơ đồ phản ứng

3.4.2.2 Thăm dò một số yếu tố của phản ứng acyl hóa bằng propionyl clorid

Chúng tôi tiến h nh khảo sát dung môi, nhiệt độ v thời gian của phản ứng

nhằm đưa ra những điều kiện thích hợp v đề xuất một quy trình acyl hóa

N-methyl asimilobin bằng propionyl clorid thích hợp nhất trong ph m vi nghiên cứu

ách đánh giá kết quả: Phản ứng được theo dõi bằng SKLM khai triển với

hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (3:7) quan sát dưới đèn tử ngo i ở bước sóng

54 nm Trên SKLM có thể quan sát thấy các vết sau:

- Vết nguyên liệu N-methyasimilobin: Rf = 0,50

- Vết của sản phẩm H-2 nằm trên vết nguyên liệu với Rf= 0,60

- Vết sản phẩm phụ: Là các vết không tr ng với vết nguyên liệu v sản phẩm

Từ các vết trên SKLM, chúng tôi sẽ đánh giá kết quả dựa trên việc nguyên liệu hết hay chưa nhiều sản phẩm phụ hay không Phản ứng được coi là kết thúc khi không quan sát thấy vết nguyên liệu trên SKLM

Hình 3.5 Sơ đồ phản ứng acyl hóa N-methylasimilobin bằng propionyl clorid

 Khảo sát dung môi và nhiệt độ và thời gian phản ứng

Chúng tôi chọn dung môi khảo sát là cloroform và 1,4-dioxan Lượng dung môi được sử dụng l như nhau phản ứng được tiến h nh ở nhiệt độ sôi của dung môi Thời gian phản ứng sẽ được khảo sát cụ thể với từng dung môi

Dung môi th ch hợp của phản ứng l dung môi m khi tiến h nh phản ứng

trong dung môi đó thì nguyên liệu hết v lượng t p l nhỏ nhất

Nhiệt độ th ch hợp của phản ứng là nhiệt độ mà ở đó nguyên liệu hết và

lượng t p là nhỏ nhất trong thời gian ngắn nhất

Tiến hành phản ứng: Hòa tan 0,10 g (0,36 mmol) N-methylasimilobin vào 5

mL dung môi phản ứng, thêm 0,10 g (0,9 mmol) Na2CO3 Đun đến nhiệt độ sôi của dung môi, sau 5 phút thêm từ từ 1,0 mL (0,011 mol) propionyl clorid, khuấy

liên tục bằng khấy từ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi n-hexan:

ethyl acetat (3:7) để xác định thời điểm phản ứng kết thúc

Kết quả khảo sát được thể hiện trong Bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả thăm dò dung môi của phản ứng acyl hóa bằng propionyl clorid

Dung môi Nhiệt

độ( 0 C)

Thời gian (giờ)

Vết các thành phần trên SKLM Nguyên liệu Sản phẩm Tạp

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy với dung môi 1,4-dioxan thời gian phản ứng ngắn hơn nhưng nhiều t p hơn Với dung môi CHCl3 ở nhiệt độ thường phản