Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH HÀ MÃ SINH VIÊN: 1101133 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT CỦA CURCUMIN VỚI THUỐC THỬ GIRARD P KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S

ĐỖ THỊ THANH HÀ

MÃ SINH VIÊN: 1101133

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT CỦA CURCUMIN VỚI THUỐC THỬ

GIRARD P

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ THANH HÀ

MÃ SINH VIÊN: 1101133

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC DẪN CHẤT CỦA CURCUMIN VỚI THUỐC THỬ

GIRARD P KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

thành nhất đến thầy PGS.TS Nguyễn Đình Luyện - nguời đã trực tiếp hướng dẫn,

truyền đạt cho em những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện giúp

đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang,

ThS Phạm Thị Hiền, CN Phan Tiến Thành cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh

chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn

Em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là nguồn động viên to lớn đối với em trong cuộc sống và trong học tập

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, nên khóa luận không tránh khỏi còn nhiều thiếu sót Em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Đỗ Thị Thanh Hà

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chương 1: TỔNG QUAN……… 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN 3

1.1.1 Cấu trúc phân tử curcumin 3

1.1.2 Nguồn gốc 3

1.1.3 Tính chất vật lý 4

1.1.4 Độ ổn định 4

1.1.5 Tính chất hóa học 6

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CURCUMIN VÀ DẪN CHẤT CỦA CURCUMIN 9

1.2.1 Tác dụng chống oxy hóa 9

1.2.2 Tác dụng phòng và điều trị ung thư 10

1.2.3 Tác dụng chống viêm 11

1.2.4 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, làm lành vết thương và liền sẹo 12 1.2.5 Tác dụng bảo vệ dạ dày, tá tràng 13

1.2.6 Các tác dụng khác 13

1.3 TỔNG QUAN VỀ THUỐC THỬ GIRARD P 14

1.3.1 Công thức phân tử 14

1.3.2 Nguồn gốc, tính chất vật lý 14

1.3.3 Tác dụng dược lý 15

1.3.4 Một số nghiên cứu về sử dụng thuốc thử Girard P để làm tăng độ tan của các chất 15

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DẪN CHẤT IMIN CỦA CURCUMIN 16

1.4 PHÂN TÍCH LỰA CHỌN HƯỚNG NGHIÊN CỨU 19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.3.1 Tổng hợp hóa học 22

2.3.2 Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết 22

2.3.3 Xác định cấu trúc hóa học 23

2.3.4 Xác định độ tan 23

2.3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa 24

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 26

3.1.1 Tổng hợp ethyl cloroacetat 26

3.1.2 Tổng hợp thuốc thử Girard P 26

3.1.3 Tổng hợp dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P 27

3.2 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 31

3.2.1 Xác định cấu trúc của thuốc thử Girard P tổng hợp được 31

3.2.2 Xác định cấu trúc dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P 32

3.3 XÁC ĐỊNH ĐỘ TAN 34

3.4 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 35

3.4.1 Tiến hành 35

3.4.2 Kết quả thực nghiệm 36

3.5 THỦ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 37

3.5.1 Tiến hành 37

3.5.2 Kết quả 37

3.6 BÀN LUẬN 38

3.6.1 Tổng hợp hóa học 38

3.6.2 Về xác định cấu trúc 40

3.6.3 Về xác định độ tan và thử hoạt tính sinh học 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

KẾT LUẬN 44

(Proton - Nuclear Magnetic Resonance spSCtroscopy) CTCT Công thức cấu tạo

CTPT

T°nc

Công thức phân tử Nhiệt độ nóng chảy

đvC

DPPH

Đơn vị carbon Diphenylpicrylhydrazy

SC50 Nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH (Scavenging

Concentration at 50% )

EtOH Ethanol

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người

(Human immunodeficiency virus)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High-performance liquid chromatography)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy)

MS Phổ khối lượng ( Mass spectrometry)

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ thiết bị

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng Bảng 3.2 Kết quả khảo sát nhiệt độ phản ứng

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỉ lệ tác nhân: curcumin

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát điều kiện pH của phản ứng

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ IR của thuốc thử Girard P tổng hợp được Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ MS của thuốc thử Girard P tổng hợp được Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ IR sản phẩm SP

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ MS sản phẩm SP

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR sản phẩm SP

Bảng 3.10 Kết quả thử độ tan của sản phẩm

Bảng 3.11 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn

Bảng 3.12 Bảng kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa

Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp curcumin

Hình 1.3 Sự điện li theo pH của curcumin

Hình 1.4 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

Hình 1.5 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của oxy và ánh sáng Hình 1.6 Dạng hỗn biến ceton-enol trong dung dịch

Hình 1.7 Phản ứng của curcumin với gốc tự do

Hình 1.8 Cơ chế phản ứng imin hóa

Hình 1.9 Một số dẫn chất chứa nhóm acetoxy của curcumin

Hình 1.10 Công thức cấu tạo thuốc thử Girard P

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp thuốc thử Girard P

Hình 3.2 Sơ đồ phản ứng tổng hợp thuốc thử Girard P

Hình 3.3 Sơ phản ứng hợp dẫn chất curcumin với thuốc thử Girard P Hình 3.4 Sản phẩm phụ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa, củ nghệ (Curcuma longa L.) đã được sử dụng như một gia vị truyền

thống trong các món ăn ở châu Á Bên cạnh đó, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý giúp làm lành vết thương, liền sẹo, trị mụn nhọt…đặc biệt là dùng

để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, người ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid là hoạt chất

chính tạo nên các tác dụng sinh học của củ nghệ

Trong nhóm hoạt chất curcuminoid, curcumin methoxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5-dion) là chất có vai trò quan trọng nhất trong tác dụng chữa bệnh của nó Curcumin đã được nghiên cứu và chứng minh nhiều tác dụng dược lý như: chống viêm, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virut, [2] Tuy nhiên, tác dụng điều trị của curcumin bị hạn chế đáng kể bởi sinh khả dụng thấp khi dùng đường uống do hấp thu kém, chuyển hóa và đào thải nhanh ra khỏi

((1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-cơ thể Một trong những nguyên nhân làm sinh khả dụng của curcumin thấp là do hoạt chất này kém tan trong nước [14], [27], [31] Để cải thiện sinh khả dụng của curcumin, có nhiều phương pháp tiếp cận, một số phương pháp vật lý như: tạo nhũ tương nano dầu trong nước, tạo phức với β-cyclodextrin, tạo hệ phân tán rắn, hoặc tạo dẫn chất methoxypoly(ethylenglycol)-palmitat Hầu hết các phương pháp này đều chỉ ra rằng, hoạt tính hệ thu được cao hơn so với curcumin ban đầu

Một cách tiếp cận khác là dùng phương pháp hóa học để cải thiện độ tan, tăng hoạt tính sinh học của curcumin, đó là tạo dẫn chất có khung curcumin và nhóm thân nước như: lai hóa curcumin với acid amin, với các phân tử đường, hoặc tạo dẫn chất sulfat [27] Các phương pháp biến đổi hóa học này không chỉ tăng độ tan, cải thiện độ ổn định của curcumin mà còn có thể tạo ra hợp chất có dược tính mới, nhiều trường hợp độc tính giảm Một trong những phương pháp hóa học để cải thiện độ tan và tăng hoạt tính sinh học của curcumin là tạo dẫn chất imin của curcumin Đây là hướng có nhiều triển vọng, nhiều dẫn chất imin của curcumin thu hút sự chú ý đặc biệt của các nhà nghiên cứu [3], [6], [26], [34]

Nhận thấy ưu điểm và tiềm năng nhóm các dẫn chất imin của curcumin chúng

tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính sinh học dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P”

Mục tiêu của đề tài này là:

1 Tổng hợp dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P

2 Thử hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa của dẫn chất tổng hợp được

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CURCUMIN

1.1.1 Cấu trúc phân tử curcumin

- Cấu trúc phân tử (Hình 1.1)

Hình 1 1 Cấu trúc phân tử của curcumin

- Tên khoa học: 3,5-dion

(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-dien Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I

- CTPT: C21H20O6

- Khối lượng phân tử: 368,37 đvC [36]

1.1.2 Nguồn gốc

- Tự nhiên: Curcumin được phân lập từ thân rễ của cây nghệ vàng (curcuma

longa L.) Sơ bộ về quy trình phân lập curcumin theo phương pháp của Trịnh

Hoàng Dương và Hà Diệu Ly[4]

Nguyên liệu : Củ nghệ vàng

+ Chiết xuất, phân lập: chiết bằng dung môi ethanol, sau khi cất loại dung

môi, cao thu được được chiết lại với n-hexan để loại bỏ tinh dầu và kết tinh

lại thu curcuminoid thô

+ Tinh chế: sản phẩm curcuminoid thô được tiến hành sắc kí cột trên silicagel, thu được curcumin tinh khiết

+ Xây dựng bộ dữ liệu chuẩn curcumin trên phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại- khả kiến, xác định cấu trúc, độ tinh khiết, định lượng curcumin bằng HPLC

- Tổng hợp hóa học toàn phần curcumin: Phương pháp thông thường sử dụng

để tổng hợp curcumin là phương pháp đi từ valinin và aceton [9] Sơ đồ phản ứng

(Hình 1.2.)

Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp curcumin

1.1.3 Tính chất vật lý

- Dạng thù hình: Curcumin tồn tại dưới dạng bột vô định hình hoặc tinh thể

hình kim màu vàng cam Tinh thể curcumin có 3 dạng thù hình khác nhau tùy thuộc

vào dung môi và tốc độ kết tinh [36]

- Điểm chảy: 183oC [36]

- Sự hấp thụ ánh sáng:

+ Các phân tử curcumin có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo ra màu

vàng Cực đại hấp thụ của curcumin là 429 nm [16]

+ Curcumin có khả năng phát huỳnh quang (520 nm) khi hấp thụ bức xạ tử ngoại có bước sóng 350 nm [36]

- Độ tan

+ Curcumin tan được trong acid acetic, ethanol, methanol, aceton,

dicloromethan, cloroform, ít tan trong n-hexan, không tan trong ether [32]

+ Curcumin thực tế không tan trong nước ở môi trường acid hay trung tính (độ tan < 10mg ở 25 C), tan trong kiềm tạo dung dịch màu đỏ máu sau sang chuyển sang tím [1]

+ Curcumin tan được trong nước khi có mặt các chất hoạt động bề mặt như: natri dodecylsulphat, cetylpyridin bromid, gelatin, polysaccharid, polyethylenglycol, cyclodextrin [19]

1.1.4 Độ ổn định

- Ảnh hưởng của pH trong dung dịch nước

Nghiên cứu sự điện li theo pH của curcumin bằng phương pháp HPLC cho kết

quả như sau ( hình 1.3.) [34]

+ pH < 1: dung dịch curcumin có màu đỏ do curcumin ở trạng thái proton hóa H4A+

+ pH = 1-7: curcumin ở trạng thái trung tính H3A, trong khoảng pH này, curcumin khó tan trong nước và tạo huyền phù màu vàng

+ pH > 7,5, dung dịch curcumin có màu đỏ vì curcumin tồn tại các dạng

H2A, HA2-, A3- Giá trị hằng số phân ly proton pKa1, pKa2, pKa3 ( tương ứng của H2A-, HA2-, A3-) lần lượt là 7,8; 8,5 và 9

Hình 1.3 Sự điện li theo pH của curcumin

- Phân hủy curcumin trong môi trường kiềm: Curcumin tương đối ổn định ở

pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7 Nghiên cứu quá trình phân hủy curcumin trong khoảng pH = 7-10 bằng phương pháp HPLC, sản phẩm của quá trình phân hủy là acid ferulic và feruloylmethan, sau đó feruloylmethan tiếp tục

phân hủy thành vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành 4-vinylguaniacol và cacbon dioxid(hình 1.4.) [12]

Hình 1.4 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

- Ảnh hưởng của ánh sáng

Dưới tác dụng của ánh sáng curcumin phân hủy thành vanillin, acid vanillic, anhydrid ferulic, acid ferulic [12] Curcumin cũng kém bền ngay cả khi không có mặt oxy Khi có mặt oxy và ánh sáng, curcumin bị phân hủy thành 4-

vinylguaniacol và vanillin (hình 1.5.)

Hình 1.5 Sự phân hủy của curcumin dưới tác dụng của oxi và ánh sáng

1.1.5 Tính chất hóa học

- Hiện tượng hỗ biến:

Curcumin và dẫn chất tồn tại trong dung dịch ở dạng cân bằng hỗ biến của dạng diceton đối xứng và dạng ceton - enol được ổn định bằng liên kết hydro nội phân tử

(hình 1.6.) [19]

Sản phẩm ngưng tụ

Hình 1.6 Dạng hỗn biến ceton-enol trong dung dịch

Trong dung dịch nước, ở pH acid và trung tính, curcumin tồn tại chủ yếu dưới dạng diceton; ngược lại, ở pH >8, dạng enol chiếm ưu thế hơn [32] Tùy theo từng dung môi thích hợp có thể có trên 90% curcumin tồn tại dạng enol [19]

-Tính chất của nhóm hydroxyl trên vòng thơm

Các cặp electron chưa liên kết của oxy trong nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen, làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl linh động hơn, điều này giải thích tính acid và khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin [33] Ngoài ra, khả năng phản ứng với các gốc tự do của curcumin còn liên quan đến

sự chuyển nguyên tử hydro của nhóm methylen ở cacbon giữa mạch, làm giảm hoạt tính của nhóm này Hai hướng phản ứng này góp phần giải thích tính oxy hóa mạnh

của curcumin khi ứng dụng nó trong ngành dược (hình1.7.)

Hình 1.7 Phản ứng của curcumin với gốc tự do

- Phản ứng cộng với H 2

Trong phân tử curcumin có các nối đôi trong mạch cacbon, nên có thể cộng 1,2 hoặc 3 phân tử H2 khi có mặt các xúc tác kim loại hoặc oxit kim loại như Ni, PtO2 tạo ra các dẫn chất dihydrocurrcumin, tetrahydrocurcumin hay hexahydrocurcumin Các dẫn chất tạo ra này cũng có hoạt tính chống oxy hóa [7], [30]

- Phản ứng tạo phức β-diceton

Curcumin với cấu trúc β-diceton trong môi trường acid hay trung tính tồn tại dưới dạng ceton-enol đối xứng và ổn định, có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác nhau như Mn2+, Fe2+, Cu2+…[5]

- Phản ứng imin hóa

Curcumin là hợp chất β-diceton nên có thể phản ứng với các amin bậc nhất như RNH2, hydroxyamin (NH2OH), hydrazin (NH2NH2), semicarbazid (NH2NHCONH2) tạo ra các imin hoặc dẫn chất imin tương ứng [28], [29]

Cơ chế phản ứng:

Hình 1.8 Cơ chế phản ứng imin hóa

Giai đoạn đầu phản ứng là sự tấn công của đôi điện tử tự do trên nguyên tử nitơ của amin vào nguyên tử carbon mang một phần điện tích dương của nhóm carbonyl Phản ứng xảy ra theo cơ chế cộng hợp ái nhân thông thường hình thành hợp chất trung gian chứa đồng thời hai nhóm chức anion alkoxid và cation amonium Hợp chất trung gian này chuyển hóa nhanh thành hợp chất trung gian bền hơn là carbinolamin Phản ứng này cần một lượng nhỏ acid làm xúc tác để cân bằng phản ứng chuyển dịch về phía tách nước từ hợp chất trung gian carbinolamin,

sinh ra dạng proton hóa của imin hoặc các dẫn xuất của imin Cuối cùng là giai đoạn tách proton để tạo thành imin hoặc các dẫn chất của imin [28]

Trong phản ứng imin hóa, pH môi trường phản ứng đóng vai trò quan trọng Nếu môi trường quá acid, toàn bộ các amin bị proton hóa, các amin bị proton hóa sẽ không phản ứng được với nhóm chức ceton Ngược lại, nếu giảm môi trường acid

sẽ giảm khả năng tách nước tạo imin Điều kiện pH thích hợp cho phản ứng imin hóa là pH~4,5 [29]

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CURCUMIN VÀ DẪN CHẤT CỦA CURCUMIN

Các nghiên cứu chỉ ra rằng, curcumin không gây độc đối với con người với liều

8000 mg/ngày trong 3 tháng [8]

Bên cạnh đó curcumin có rất nhiều tác dụng đã được chứng minh có lợi cho việc phòng và điều trị bệnh Một số tác dụng nổi bật của curcumin như: chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, chống viêm loét dạ dày-tá tràng, kháng khuẩn, kháng nấm, làm lành vết thương, liền sẹo…[8],[32]

1.2.1 Tác dụng chống oxy hóa

Curcumin có tác dụng chống oxy hóa mạnh ở pH trung tính và acid Cơ chế hoạt động của nó bao gồm ức chế một số đường tín hiệu tế bào ở nhiều cấp độ, tác động lên các enzym màng tế bào như enzym cyclooxygenase và glutathion-S-tranferase, điều biến miễn dịch, các tác động lên thành mạch và sự kết dính tế bào-tế bào [32] Peroxynitrit là chất trung gian có tính độc tế bào được tạo ra bởi anion superoxid (O2-) và oxyd nitơ (NO) Các curcuminoid trong đó có curcumin có tác dụng dọn gốc tự do peroxynitrit với IC50 là 4,0 ± 0,04 μM [ 3]

Curcumin có tác dụng dọn gốc tự do như anion superoxid (O2-) và gốc tự do hydroxyl (OH·), đây là các gốc tự do gây ra sự peroxyl hóa lipid [20] Trong các nghiên cứu bảo vệ quá trình peroxy hóa lipid, curcumin đã thể hiện sự ức chế mạnh (18-80%) tùy thuộc liều dùng [2]

Năm 2008, M Majeed và cộng sự đã tiến hành tổng hợp tetrahydrocumin (THC)

và nghiên cứu trên in vitro so sánh tác dụng chống oxy hóa của tetrahydrocurcumin

và các curcuminoid Nghiên cứu được thực hiện trên tế bào hồng cầu của thỏ và gan chuột, sử dụng acid linoleic là chất nền trong hệ ethanol/nước, được phân tích bằng phương pháp thiocyanat và phương pháp TBA (thiobarbituric acid reacted substances) Kết quả cho thấy rằng tetrahydrocurcumin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong tất cả các curcuminoid Giải thích về cơ chế tác dụng và đặc tính chống oxy hóa mạnh hơn của THC so với curcumin, các tác giả cho rằng, THC là chất chuyển hóa chính của curcumin ở đường tiêu hóa Nhóm phenolic đóng vai trò dọn các gốc tự do trong giai đoạn đầu của quá trình chống oxy hóa Tuy nhiên, sự phân cắt liên kết C-C trong khung β-diceton cũng được quan sát thấy trong quá trình này Như vậy, nhóm β-diceton đóng vai trò dọn gốc tự do trong giai đoạn sau [23]

1.2.2 Tác dụng phòng và điều trị ung thƣ

Xuất phát từ một thực tế việc nghiên cứu dịch tễ học của ung thư ở một số vùng

Ấn Độ cho thấy tỷ lệ ung thư đại tràng ở những vùng có người dân ăn nhiều cary (dầu có chứa curcumin) có tỷ lệ rất thấp, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu

về tác dụng chống ung thư của curcumin, hiện có trên một nghìn công trình đã được tiến hành và kết quả bước đầu cho thấy [8]:

+ Curcumin ngăn các các tế bào ung thư đi vào pha S (pha tổng hợp của chu

kỳ tế bào)

+ Curcumin thúc đẩy các tế bào ung thư đi vào giai đoạn chết tế bào theo chu trình

+ Curcumin là chất ức chế tạo mạch máu mới

+ Curcumin làm hạ cholesterol huyết và chống bệnh Alzheimer (mất trí nhớ

ở người già)

Cơ chế của tác dụng chống ung thư của curcumin có thể là do khả năng chống oxy hóa và dọn gốc tự do, cũng như khả năng làm tăng gián tiếp nồng độ glutathion, do đó giúp giải độc gan và ức chế sự hình thành nitrosamin [8]

Năm 2012, M K Kim và cộng sự đã tiến hành tổng hợp dẫn chất chứa nhóm aceton gắn vào C4 của curcuminoid với mục tiêu cải thiện độ tan trong nước so với

curcuminoid ban đầu [21] Các dẫn chất acetoxy-curcuminoid (từ 1 đến 7) trong

nghiên cứu của M K Kim bao gồm:

Hình 1.9 Một số dẫn chất chứa nhóm acetoxy của curcumin

1 R1= OMe, R2=OH, R3=H, R4=OAc

2 R1=OMe, R2=OMe, R3=H, R4=OAc

3 R1=OMe, R2=OMe, R3=OMe, R4=OAc

4 R1=OH, R2=OH, R3=OMe, R4=OAc

dẫn chất từ 1 đến 4 đều có độ tan cao hơn so với các curcuminoid ban đầu, đồng thời ức chế cả ba dòng tế bào ung thư tốt Đáng chú ý nhất là 4 với giá trị SC50 khi thử trên ba dòng tế bào HCT116, LNCap, Huh-7 lần lượt là 16,9; 19,3; 20,1(µM) thấp hơn 2,5 lần so với SC50 của curcumin Kết quả này được giải thích là do dẫn

chất 4 có chứa nhóm meta-methoxy gắn với vòng thơm và cấu trúc catechol trong

+ Thứ hai, nghệ làm tăng tác dụng và kéo dài thời gian hoạt động của hormon tuyến thượng thận- cortisol- một chất chống viêm tự nhiên trong cơ thể

+ Thứ ba, nghệ giúp cải thiện tuần hoàn, do đó chất độc dễ bị loại ra khỏi các khớp nhỏ-nơi các chất thải tế bào và các chất gây viêm tích tụ [8]

Nghiên cứu của Sharma R A và các cộng sự khẳng định curcumin có khả năng

ức chế một số lượng lớn các phân tử khác nhau liên quan đến phản ứng viêm bao gồm, phospholipid, lipooxigenase, cyclooxigenase 2, leukotrien, thromboxan, prostaglandin, nitơ oxid, collagenase, elastase, hyaluronidase, monocyte chemoattractant protein-1, protein cảm ứng interferon, yếu tố hoại tử khối u (TNF),

và interleukin-12 (IL-12) [32]

Năm 2008, M Majeed và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm của curcumin và các dẫn xuất natri curcumin, tetrahydrocurcumin, triethylcurcumin [23] Nghiên cứu trên mô hình gây phù chân chuột bằng carragenib và mô hình gây viêm u hạt bằng dầu hạt bông trên chuột cống Hoạt lực chống viêm của curcumin

và các dẫn xuất của curcumin được sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau: natri curcumin > tetrahydrocurcumin > curcumin > triethylcurcumin

Khi so sánh curcumin và các dẫn chất của nó trong các mô hình gây viêm cấp và bán cấp thì kết quả cho thấy các dẫn xuất của curcumin có tác dụng chống viêm mạnh hơn cả curcumin [23]

1.2.4 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, làm lành vết thương và liền sẹo

Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng dịch chiết nghệ và curcumin có tác dụng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn, điển hình là Staphylococus aureus,

Salmonella paratyphi, Mycrocus pyogenes [2], [22] Dịch chiết ethanol của nghệ có

tác dụng chống lại Entamoeba histolytica [22]

Các nghiên cứu bổ sung bột nghệ vào môi trường nuôi cấy mô thực vật cho thấy bột nghệ ở nồng độ 0,8 và 1,0 g / L có hoạt tính ức chế đáng kể chống lại sự nhiễm nấm [35] Cơ chế kháng nấm của curcumin có thể là do ức chế desaturase (ERG3) làm giảm sản xuất và tích lũy các tiền chất sinh tổng hợp ergosterol của tế bào nấm,

dẫn đến chết tế bào [35] Giảm tiết proteinase và thay đổi các thuộc tính của lớp màng liên kết trong hoạt động của ATPase là yếu tố quan trọng khác có thể giải thích cho hoạt tính kháng nấm của curcumin

Chiếu xạ làm chậm sự co hẹp và thời gian làm lành vết thương ở chuột nhắt Điều trị với curcumin, tùy thuộc vào liều dùng, làm tăng sự co hẹp so với nhóm chứng Quá trình làm lành vết thương là do sự giải phóng chậm các chất chống oxy hóa và sự hỗ trợ tái tạo mô của collagen Một số nghiên cứu tạo liên kết giữa curcumin và collagen cho thấy: hoạt tính chống oxy hóa của curcumin có hiệu quả trong việc dọn các gốc tự do gây viêm loét Kết hợp với khả năng kích thích tăng sinh tế bào của collagen, curcumin đã hỗ trợ đáng kể trong quá trình điều trị vết thương ở mô [2]

1.2.5 Tác dụng bảo vệ dạ dày, tá tràng

Nghệ đã được chứng minh làm giảm tiết dịch vị và bảo vệ niêm mạc dạ dày - tá tràng; tăng gastrin, secretin, bicarbonat, và bài tiết enzym tụy Nghệ cũng được chứng minh có tác dụng ức chế hình thành vết loét, chống lại tác động của các yếu

tố gây loét như stress, rượu, một số thuốc như indomethacin, reserpin… làm tăng đáng kể chất nhầy ở thành dạ dày chuột [8]

Ngoài ra, chất curcumin đã cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đáng kể với giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) vào khoảng 5 - 50 mg/mL đối với 65 mẫu phân lập

lâm sàng của Helicobacter pylori [35]

Curcumin làm chậm tổn thương gan vốn gây nên bệnh xơ gan, giúp giảm tình trạng tắc ống mật đồng thời cải thiện tình trạng tổn thương và xơ hóa tế bào gan [2], [8]

1.3 TỔNG QUAN VỀ THUỐC THỬ GIRARD P

1.3.1 Công thức phân tử

-Cấu trúc phân tử

Hình 1.10 Công thức cấu tạo thuốc thử Girard P

-Tên khoa học: 1-(2-Hydrazino-2-oxoethyl)pyridinium chlorid

1.3.3 Tác dụng dƣợc lý

- Thuốc thử Girard P là một chất rất dễ tan trong nước, nó đã được nghiên cứu thử nghiệm về tác dụng dược lý Kết quả cho thấy thuốc thử Girard P có một số tác dụng dược lý như:

+ Ức chế hoạt động của histidin decarboxylase trong thận, gan, và mô tá tràng của động vật gặm nhấm [39]

+ Hoạt động như các catalase, vì vậy nó có tiềm năng sử dụng để bảo vệ chống lại sự oxy hóa [11]

+ Girard P có hoạt tính ức chế hoạt động của Mycobacterium tuberculosis trong

cả hai thử nghiệm in vitro và in vivo ( trong kiểm tra giác mạc chuột) [10]

+ Girard P cũng hoạt động như một chất ức chế trên aryl-sulfatase của

 Girard-P hydrazon và Girard-P hydrazon của 5-nitrofuryl đã được nghiên cứu như các tác nhân hóa học trị liệu ung thư [38]

 Dẫn xuất Girard-P 2-thiophen aldehyd và 5-nitro và 5-bromo-2 thiophen aldehyd đã được nghiên cứu và chứng minh là chất có hoạt tính độc tế bào [18]

 Các hydrazon Girard-P của p-nitrobenzaldehyd và p-acetylbenzaldehyd trong thử nghiệm in vitro cho thấy không có tác dung ức chế sự tăng trưởng của

Mycobacterium tuberculosis [25], mặc dù các hydrazid nói chung đều có hoạt tính

trên Mycobacterium tuberculosis Các hydrazon Girard-P của

phenanthridin-9-aldehyd và 7-carbethoxyamino-2,7-dicarbethoxyamino, và các dẫn xuất 2-nitro

trong thử nghiệm in vitro cho thấy có tác dụng ức chế mạnh sự phát triển của

Streptoccus, các hợp chất carbethoxyamino thì ít hiệu lực hơn, và tất cả các hợp

chất này đều cho thấy không có tác dụng trên Trypanocidal

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DẪN CHẤT IMIN CỦA CURCUMIN

Trong các nghiên cứu nhằm tăng độ tan và hoạt tính sinh học của curcumin thì các nghiên cứu về dẫn chất imin ngày càng thể hiện được nhiều tiềm năng trong dược phẩm

Shim J S và cộng sự [34] đã tổng hợp được hydrazinocurcumin (HC) và hydrazinobenzoylcurcumin ( HBC)

Hình 1.12 Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin

Hình 1.13 Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin

Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BASC (bonvine aortic endothelial cell), ngăn chặn quá trình angiogentisis (một trong các quá trình phát triển bệnh ung thư) cao hơn 30 lần so với curcumin Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào như: HT29 (tế bào ung thư đại tràng), NIH3T3 (tế bào nguyên phôi), Chang (tế bào ung thư gan)

Riêng BHC thể hiện khả năng ức chế tế bào BASC mạnh hơn curcumin nhưng kém hơn HC BHC có hoạt tính ức chế mạnh lên dòng tế bào HCT15 (tế bào ung thư trực tràng), ở nồng độ 40 µM thì hầu như toàn bộ tế bào HCT15 bị ức chế sau

48 giờ Tuy nhiên cũng giống như HC, BHC không thể hiện hoạt tính đối với APN (amino peptidase N)

Mishra S và cộng sự [26] đã tổng hợp và khảo sát khăng ức chế sự phát triển

của Plasmodium falciparum của một số dẫn chất curcumin qua đó tìm được hai dẫn chất có khả năng ức chế sự phát triển của Plasmodium flaciparum cao hơn

curcumin là: hydrazinocurcumin và 3-nitrophenyl pyprazole curcumin

Hình 1.14 hydrazinocurcumin

Hình 1.15 3-nitrophenyl pyprazole curcumin

Curcuminsemicarbazol được tổng hợp bằng bằng phản ứng thế một nguyên tử

oxy của nhóm β-diceton bằng semicarbazol Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng

chống peroxy hóa lipid của mecrosom gây ra bởi bức xạ γ trong thử nghiệm đo nồng độ acid thiobarbituric substance (TBARS) tương tự curcumin

Hình 1.16 Curcuminsemicarbazol

Curcumin thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do cao hơn Curcuminsemicarbazol điều này được giải thích do nhóm thế hút điện tử semicarbazol làm giảm giá trị thế của nhóm phenolic

Nhóm tác giả Đào Hùng Cường và Lê Hải Lợi ( Đại học Đà Nẵng) [3] đã tổng hợp dẫn chất phenylpyprazolcurcumin, dẫn chất hydroxylamin isoxazolcurcumin Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế gốc tự do DPPH của chúng cho thấy hai dẫn chất này đều có khả năng chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của

bốn chủng vi khuẩn E.coli, P aeruginosa, B.subtillis và S.aureus Tuy nhiên hoạt

tính sinh học của chúng đều kém hơn so với curcumin

Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất pydazol và isoxazol

Tác giả Lê Xuân Tiến ( Đại học Bách Khoa TPHCM) [6] đã tổng hợp được

isozalocurcumin (2) và hydrazinocurcumin (3) Qua khảo sat hoạt tính sinh học cho thấy cả hai dẫn chất này có hoạt tính chống oxy hóa tương tự curcumin Cả 2, 3 có hoạt tính gây độc tế bào Hep-G2 ( tế bào ung thư gan) cao hơn curcumin, riêng 3

cho hoạt tính cao gấp 2 lần curcumin

Hình1.16 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất isoxazolcurcumin (2) và hydazinocurcumin (3)

1.4 PHÂN TÍCH LỰA CHỌN HƯỚNG NGHIÊN CỨU

Từ các tài liệu đã tham khảo, chúng tôi nhận thấy có nhiều phương pháp để cải thiện hoạt tính sinh học và độ tan của curcumin Tuy nhiên, phương pháp tạo dẫn chất imin của curcumin cho nhiều kết quả khả quan Qua các nghiên cứu gần đây cho thấy dẫn chất imin này của curcumin làm tăng đáng kể hoạt tính sinh học của curcumin, cho thấy tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm Thuốc thử Girard là một chất dễ tan trong nước có khả năng tạo dẫn chất imin với curcumin,

nó cũng đã được nghiên cứu để làm tăng độ tan và hoạt tính sinh học của một số chất [18], [17], [25], [39] Nhận thấy ưu điểm và tiềm năng của nhóm dẫn chất này chúng tôi chọn tổng hợp dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P để đánh giá,

so sánh độ tan, và hoạt tính sinh học của nó

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

Để thực hiện khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng một số dung môi, hóa chất, dụng cụ và thiết bị của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công

nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem bảng 2.1 và bảng 2.2) Các

nguyên liệu và thiết bị dùng để xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ, thử nghiệm tác dụng sinh học được đề cập riêng trong phần phương pháp nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh mục các dung môi, hóa chất

Bộ lọc hút chân không Buchner

Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S

Cốc có mỏ 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL

Đèn tử ngoại

Đĩa petri

Giấy lọc

Máy cất quay chân không Buchi R210

Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt

Máy khuấy từ gia nhiệt IKA

Nhiệt kế thủy ngân

Mỹ Đức Trung Quốc Trung Quốc Đức

Đức Đức

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Tổng hợp dẫn chất của curcumin với thuốc thử Girard P theo sơ đồ:

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất curcumin với thuốc thử Girard P

2 Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được

3 Xác định cấu trúc của dẫn chất tổng hợp được

5 Xác định sơ bộ độ tan của dẫn chất tổng hợp được

4 Thử hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa dẫn chất tổng hợp được

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng

hợp dẫn chất dự kiến: phản ứng ester hóa, N-alkyl hóa, imin hóa

 Theo dõi tiến triển của phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) thực hiện trên bản mỏng silica gel GF254 Merck 70-230 mesh với hệ dung

môi khai triển khác nhau: n-butanol: acid acetic: nước (9:2:2,5) (hệ A), n-butanol:

acid acetic: nước (6:2:2,5) (hệ B) quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại

 Sử dụng phương pháp cất, chiết lỏng-lỏng, kết tinh,… để tinh chế sản phẩm

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được

 Sử dụng phương pháp SKLM thực hiện trên bản mỏng silicagel GF254Merck 70-230 mesh với hệ dung môi khai triển A, B quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại Dựa vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

 Sử dụng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy thực hiện trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Dựa vào khoảng giá trị nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá

độ tinh khiết của sản phẩm

2.3.3 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

 Phổ khối lượng (MS): Được ghi tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ dược phẩm Quốc gia, trên máy LCMS/MS AGILENT 1290/6460 với chế độ đo ESI

 Phổ hồng ngoại (IR): Được ghi tại Bộ môn Hóa học vô cơ, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR): Được ghi tại Phòng phân tích cấu trúc phân tử, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,trên máy Bruker AV-500, sử dụng dung môi DMSO

 Lấy một thể tích xác đinh dung dich bão hòa, bốc hơi dung môi, cân lượng chất rắn còn lại để xác định độ tan

 Các thí nghiệm cho mỗi mẫu được lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình

2.3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của dẫn chất tổng hợp đƣợc

- Mẫu thử (có chứa hoạt chất thử) được đặt trên lớp thạch dinh dưỡng

đã cấy vi sinh vật kiểm định, hoạt chất từ mẫu thử khuyếch tán vào môi trường thạch sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật kiểm đinh tạo thành vòng vô khuẩn

- Kết quả được đánh giá dựa trên đường kinh vòng vô khuẩn và được đánh giá theo công thức:

i i

: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm)

Di: đường kinh vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm có hiệu chỉnh

n:Số thí nghiệm làm song song (n =3)

Giống vi sinh vật kiểm định gồm 5 vi khuẩn Gram(+) và 4 vi khuẩn Gram(-)

 Vi khuẩn Gram(-):

Escherichia coli ATCC 25922 (E coli)

Proteus mirabilis BV 108 (P mirabilis)

Shigella flexneri DT 112 (S flexneri)

Salmonella typhi DT 220 (S typhi)

 Vi khuẩn Gram(+):

Staphylococcus aureus ATCC 1128 (S aureus)

Bacillus pumilus ATCC 10241(B pumilus)

Bacillus subtilis ATCC 6633 (B subtilis)