Góp phần nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225

Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên chọn chủng có hoạt tính cao Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh lên 20

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến

thầy giáo PGS.TS Cao Văn Thu- người đã trực tiếp hướng dẫn, hết lòng truyền

đạt những kiến thức quý báu và luôn luôntạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình

Trong quá trình nghiên cứu, tôi cũng nhận được rất nhiều sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược nói riêng, trường Đại học Dược

Hà Nội nói chungvà cả bộ môn Hóa Vật liệu – khoa Hóa – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội Tôi chân thành cảm ơn các Thầy Cô

Đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã quan tâm, ủng

hộ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận

Do thời gian thực hiện có hạn, điều kiện nghiên cứu và trình độ của bản thân còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót trong khóa luận Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ bảo của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Trần Thị Huế

MỤC LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

PHỤ LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptpmyces 2

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 3

1.1.3 Đặc điể i 3

1.1.4 i i củ e ce 3

1.2 Đại cương về kháng sinh 3

1.2.1 Đị ĩ i 3

1.2.2 P â ại i 3

1.2.3 Cơ c ế c dụ củ i 4

1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh 4

1.3.1 C c ươ c i ạ iố ……… 4

1.3.2 B qu iố vi i vậ 5

1.4 Lên men sinh tổng hợp sinh kháng sinh 6

1.4.1 i iệ ê e 6

1.4.2 C c ươ ê e 6

1.4.3 ố ếu ố ư đế qu ê e 7

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 7

1.5.1 P ươ c iế xuấ 8

1.5.2 P ươ i c ế 8

1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh 9

1.6.1 P ử ại- iế (UV-VIS) 9

1.6.2 P ồ ại (IR) 9

1.6.3 P ối ư ( ) 10

1.6.4 P c ư ừ ạ â (N R) 10

1.7. Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225 11

1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2 11

1.9 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D 12

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Giố xạ uẩ 14

2.1.2 Vi i vậ iể đị 14

2.1.3 ôi ườ uôi cấ V V iể đị 14

2.1.4 ôi ườ uôi cấ xạ uẩ 14

2.1.5 Dung môi 15

2.1.6 c iế ị 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2.1 C c c i ạ iố 16

2.2.2 ê e c iế c i c ế i 16

2.2.3 Bư c đ u x c đị ố c ấ v cấu c củ i

u đư c………16

2.3 Phương pháp th c nghiệm 16

2.3.1 P ươ uôi cấ iữ iố 17

2.3.2 Đ i ạ i ươ uếc 17

2.3.3 P ươ c ôi ườ uôi cấ c 18

2.3.4 P ươ c i ạ v c iố 18

2.3.5 P ươ ê e c i 21

2.3.6 P ươ x c đị đ ề H v đ ề iệ đ củ

i dịc c dịc ê e 21

2.3.7 C c ươ c iế c i 22

2.3.8 P ươ u i ể i i iế 23

2.3.9 ơ x c đị cấu c i i iế u đư c 23

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 24

3.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1 24

3.3 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2 25

3.4 Kết quả đột biến hóa học 27

3.5 Kết quả chọn môi trường lên men chìm tốt nhất 28

3.6 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất 288

3.7 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 29

3.8 Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh 30

3.9 Kết quả lên men chìm thu dịch lên men 31

3.10 Kết quả tách kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 32

3.10.1 C ạ ắc 1 32

3.10.2 C ạ ắc 2 34

3.10.3 C ạ ắc 3 35

3.10.4 Hiệu uấ qu c v i c ế i 36

3.11 Kết quả sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 37

3.11.1 Kháng sinh 2 377

3.11.2 Kháng sinh 1 388

3.12 Bàn luận 40

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 466

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT

ADN Acid 2'- deoxyribonucleic

B.subtilis Bacillus subtilis

DM Dung môi

DMHC Dung môi hữu cơ

Đường kính vòng vô khuẩn ĐBUV Đột biến UV

P.mirabilis Proteus mirabilis

s Sai số chuẩn đã hiệu chỉnh

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC BẢNG, HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 4

Bảng 2.1 Các vi sinh vật kiểm định 14

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định 14

Bảng 2.3 Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 14

Bảng 2.4 Các dung môi đã sử dụng 15

Bảng 3.1 Kết quả thử HTKS sau SLNN 24

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1 25

Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2 26

Bảng 3.4 Kết quả thử HTKS sau ĐBHH 27

Bảng 3.5 Kết quả chọn môi trường lên men 28

Bảng 3.6 Kết quả lên men chìm của các dạng và biến chủng trên MT2dt 29

Bảng 3.7a Kết quả ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh 30

Bảng 3.7b Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong dịch lọc 30

Bảng 3.8 Kết quả HTKS pha DM và pha nước ở pH = 7 31

Bảng 3.9 Kết quả thử HTKS của các phân đoạn sau chạy cột lần 1 32

Bảng 3.10 Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 1 33

Bảng 3.11 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 2 34

Bảng 3.12 Kết quả SKLM các phân đoạn sau chạy cột lần 2 35

Bảng 3.13 Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần 3 35

Bảng 3.14 Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau chạy cột lần 3 36 Hình 3.15 Cấu trúc hóa học của actinomycin X2 (1) và actinomycin D

(1a) 39s

PHỤ LỤC

Hình P.1 Sơ đồ cơ chế tác dụng của kháng sinh Hình P.2 Hình ảnh khuẩn lạc sau ĐBUV1 Hình P.3 Hình ảnh chạy sắc kí cột lần 1

Hình P.4 Hình ảnh bản mỏng sau chạy SKLM Hình P.5 Phổ tử ngoại của kháng sinh 1

Hình P.6 Phổ hồng ngoại của kháng sinh 1 Hình P.7 Phổ hồng ngoại của kháng sinh 2 Hình P.8 Phổ khối lượng của kháng sinh 2 Hình P.9 Phổ khối lượng của kháng sinh 1 Hình P.10 Phổ cộng hưởng từ của kháng sinh 1 Bảng P.11 Kết quả thử HTKS sau SLNN

Bảng P.12 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV1 Bảng P.13 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV2 Bảng P.14 Kết quả thử HTKS sau ĐBHH

Phần lớn kháng sinh hiện nay là do xạ khuẩn tạo ra và Streptomyces chiếm khoảng 60% Đây là một chi xạ khuẩn lớn, được đánh giá cao bởi các nhà khoa học bởi vì chúng sản xuất một loạt các “chất chuyển hóa thứ cấp", có tác dụng kháng khuẩn rất cao

Sau khi nắm bắt rõ được thực trạng này, chúng tôi quyết định tiến hành đề tài:

“Góp phần lên men sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225” vớicác mục

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes)

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố

rộng trong đất, nước, bùn… và cả cơ chất mà vi khuẩn cũng như nấm mốc không phát triển được Trung bình trong 1g đất có trên một triệu xạ khuẩn

Đa số xạ khuẩn là các VSV hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh, thuộc nhóm VK Gr(+), có tỷ lệ G + C > 55% Trong số 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố có khoảng 100 chi và 1000 loài xạ khuẩn[10]

1.1.1.Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn chi Streptomyces

Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti cơ chất và khuẩn ti khí sinh Đường kính của khuẩn ti khoảng 0,2 -1,0µm đến 2-3µm Đa số khuẩn ti không có vách ngăn và không tự đứt đoạn Màu sắc của khuẩn ti xạ khuẩn rất đa dạng : trắng, vàng, da cam, đỏ, lục, lam, tím, nâu, đen…

Khuẩn ti cơ chất còn có khả năng tiết ra các sắc tố vào môi trường.Khuẩn ti cơ chất là khuẩn ti cơ bản, phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh

Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh của khuẩn ti khí sinh sẽ xuất hiện chuỗi bào tử Chuỗi bào tử có thể có nhiều hình dạng khác nhau (thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng (vòng đơn cấp hoặc hai cấp), các đặc điểm này có ý nghĩa quan trọng khi định tên xạ khuẩn

Bào tử trần là cơ quan sinh sản của xạ khuẩn, có hình tròn, bầu dục, hình que, hình trụ… Bề mặt của bào tử có dạng trơn nhẵn, xù xì, có vẩy, có gai, có lông Khuẩn lạc xạ khuẩn có những đặc điểm riêng biệt: thô ráp, dạng phấn trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [8],[10]

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Cấu tạo tế bào xạ khuẩn chia làm ba phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế

bào chất Trong đó thành tế bào xạ khuẩn Streptomyces thuộc nhóm CW I, có chứa

L-diaminopimelic acid (L–ADP) và glycin, không chứa acid mycolic[8],[19]

1.1.3 Đặc điể sinh

Streptomyces là sinh vật dị dư ng, có tính oxy hóa cao Để phát triển, ch ng

phân giải các hydratcacbon làm ngu n cung cấp vật chất và năng lượng, đ ng thời

thủy phân các hợp chất như gelatin, casein khử nitrat thành nitrit.Streptomyces là

loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí hiệt độ tối thích là 22- 32o

C, pH tối thích thường là 6,8 – 7,5 Ngoài ra chúng còn có khả năng tạo sắc tố: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid[10],[25],[30]

1.1.4 h năng sinh tổng h p h ng sinh của Strepto ces

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra nhiều kháng sinh

nhất và có cấu tr c phức tạp Trong tổng số các kháng sinh đã tìm thấy do xạ khuẩn

tổng hợp thì có tới 60 được tổng hợp từ Streptomyces[10],[25]

1.2.Đại cương về kháng sinh

1.2.1.Định nghĩa h ng sinh

Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các ngu n khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ) hay tế bào ung thư ở n ng độ thấp [17]

1.2.2 Phân oại h ng sinh

a Dựa vào cấu trúc hóa học

Bảng 1.1 Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học

Nhóm kháng sinh Ví dụ

β – lactam Penicillin, cephalosporin,…

Fluoroquinolon Ciprofloxacin, ofloxacin,…

Aminoglycosid Streptomycin, gentamicin

Tetracyclin Tetracyclin, doxycyclin

Macrolid Erythromycin, clarithromycin, …

Polypeptid Polymycin, vancomycin,

Lincosamid Lincomycin, clindamycin,

Sulphonamid Cotrimoxazol

b Dựa vào nguồn gốc của kháng sinh

-Kháng sinh có ngu n gốc tự nhiên

-Kháng sinh có ngu n gốc bán tổng hợp tổng hợp

-Kháng sinh có ngu n gốc tổng hợp [5],[7]

1.2.3 Cơ chế t c dụng của h ng sinh

Có 5 cơ chế chính:

- Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: β –lactam, Vancomycin

- Thay đổi tính thấm màng tế bào chất: Polyen, Amphotericin,

- Ức chế tổng hợp AD của vi khuẩn : Actinomycin, anzamycin

- Ức chế chuyển hóa : Co-trimoxazol,…

- Ức chế hoặc thay đổi tổng hợp protein của vi khuẩn: Macrolid [8],[33]

Sơ đ cơ chế tác dụng kháng sinh được trình bày ở phụ lụcHìnhP.1

1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn sinh kháng sinh

1.3.1 C c phương ph p c i tạo giống

1.3.1.1 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên (chọn chủng có hoạt tính cao)

Các VSV luôn có biến dị tự nhiên với tần số khác nhau trong ống giống thuần khiết, có cá thể hoạt tính kháng sinh mạnh lên 20-30 những cá thể khác

Ch ng ta cần chọn lấy cá thể có HTKS cao nhất trong ống giống nghiên cứu tiếp để tiến hành nghiên cứu ban đầu, không có giá trị áp dụng vào sản xuất

1.3.1.2 Đột biến nhân tạo (cải tạo giống)

 Tác nhân gây đột biến:

+ Tác nhân hóa học: Ethylenamin, acid nitrơ (H O2), hydroxyamin, dimethylsulphat,

+ Tác nhân vật lý: tia X, tia neutron hay electron và ánh sáng tử ngoại (UV) tuy khả năng đâm xuyên kém nhưng với những tế bào vi sinh vật có kích thước nhỏ (0,5-3,0μm) thì có có thể xuyên thấu tới vùng nhân

=> Ánh sáng tử ngoại là tác nhân vật lý hay được dùng nhất, khả năng đột biến còn phụ thuộc vào khoảng cách chiếu, thời gian chiếu, cường độ bức xạ

+ Tác nhân sinh học: Transponson, Bacteriophage Mu,

 Các tác nhân vật lý và hóa học với liều lượng và thời gian thích hợp sẽ giết chết hết hầu hết các VSV hững cá thể nào còn sống sẽ có sự đột biến gen làm thay đổi các tính trạng dẫn đến hoặc làm mất khả năng tạo kháng sinh(đột biến âm) hoặc làm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh lên nhiều lần(đột biến dương)

 Phải sàng lọc, thu lấy biến chủng tốt đem nghiên cứu tiếp Để tạo ra biến chủng có hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh cao phải tiến hành đột biến bậc thang, kết hợp các phương pháp di truyền phân tử như tái tổ hợp giả hữu tính và dung hợp

tế bào trần [5],[10],[41],[42]

1.3.2 B o qu n giống vi sinh vật

- Mục đích: Giữ giống VSV có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không

bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bới các sinh vật lạ

- Các phương pháp bảo quản: bảo quản lạnh, làm khô, đông khô, đông lạnh

- Trong phòng thí nghiệm thường nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kì 3-6 tháng cấy

Kháng sinh là sản phẩm bậc 2, tạo thành l c gần kết th c quá trình sinh trưởng của xạ khuẩn,gần hoặc vào chính pha cân b ng [10],[17],[23]

=>Yêu cầu của lên men bề mặt là môi trường phải rộng, lớn và không quá sâu 10cm)

(5 Ưu điểm: thao tác đơn giản, dễ thực hiện, dễ xử lý cục bộ, đầu tư trang thiết bị ban đầu thấp

- hược điểm: hiệu suất sử dụng môi trườngthấp, tốn diện tích, khó cơ giới tự động hóa, tốn nhân công [9],[17],[23]

1.4.2.2 Lên men chìm

- à phương pháp VSV được nuôi cấy trong các bình lên men bình phản ứng sinh học, trong điều kiện sinh lý tối thích, VSV phát triển cả 3 chiều

- Ưu điểm: dễ cơ giới, tự động hóa, dễ kiểm soát toàn bộ quy trình, tốn ít diện

tích, chi phí nhân lực thấp, hiệu suất quá trình lên men cao

- Nhược điểm: đầu tư trang thiết bị ban đầu lớn, không thể xử lý cục bộ, cán bộ

cần chuyên môn hóa, phế liệu thải ra dễ ô nhiễm môi trường

- Các phương pháp lên men chìm: ên men mẻ, lên men bán liên tục, lên men liên tục, lên men có bổ sung[17],[20],[23],[24]

1.4.3 t số ếu tố nh hư ng đến qu tr nh ên en

- pH môi trường: nh hưởng đến quá trình lên men có thể do tác dụng trực tiếp của các ion H+

hay OH-đến tính chất keo của tế bào, hoạt lực của enzym hoặc là

tác dụng gián tiếp

- hiệt độ: hiệt độ không những ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng mà còn ảnh hưởng đến kiểu sinh sản, hình thái, trao đổi chất và nhu cầu dinh dư ng của VSV nhiệt độ thấp, VSV không phát triển được, ở nhiệt độ cao VSV bị chết do biến tính protein và kể cả AR Thiết bị lên men cần có bộ phận trao đổi nhiệt hữu hiệu để duy trì nhiệt độ sinh trưởng tối thích cho VSV

- Độ hòa tan oxy và sự thông khí: Thiếu oxy nhất thời sẽ phá v trao đổi chất trong tế bào Vì thế, phải cung cấp oxy sao cho tốc độ hòa tan oxy tương thích với tốc độ sử dụng oxy của VSV

hư vậy, trong sản xuất, cần nghiên cứu cụ thể ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình lên men để tìm các điều kiện tối thích tạo điều kiện thuận lợi nhất cho sinh tổng hợp chất mong muốn [17],[20],[23],[24]

1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men

Với riêng đặc tính của các loài khác nhau mà kháng sinh đó được tiết vào môi trường nuôi cấy (penicilin, streptomycin…) hoặc giữ lại trong tế bào (nystatin )

Vì vậy để thu lấy hoạt chất có độ tinh khiết cao cần chọn phương pháp chiết tách, tinh chế thích hợp để sản phẩm đạt chất lượng cao, độ bền lâu và gi p hạ giá thành

sản phẩm

Một số phương pháp chiết tách, tinh chế thường dùng:

- Phương pháp chiết b ng dung môi hữu cơ không đ ng tan với nước

- Phương pháp tạo phức kết tủa

- Phương pháp trao đổi ion

- Phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột, )

1.5.1 Phương ph p chiết xuất

- à phương pháp tách một hoặc một số chất ra khỏi hỗn hợp, là quá trình chuyển chất tan từ pha này sang pha khác: pha lỏng và pha rắn, hoặc giữa hai pha lỏng không đ ng tan (1 pha là nước, 1 pha là dung môi hữu cơ)

- Nguyên tắc: dựa vào sự phân bố chất tan giữa hai pha không hòa lẫn vào

 Phương pháp bao g m: chiết, thẩm thấu, sắc ký [21],[22]

 Quá trình sắc ký trải qua 3 giai đoạn: Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh, cho pha động chạy qua pha tĩnh, phát hiện vết cần tách

 Nguyên lý tách:

Mẫu phân tích hòa tan trong pha động => đưa lên pha tĩnh 1 cách liên tục và không hòa lẫn với nó => các chất tan của mẫu sẽ di chuyển qua pha tĩnh với tốc độ tùy thuộc sự tương tác giữa pha tĩnh, pha động, chất tan =>các thành phần sẽ được tách riêng biệt thành dải trên sắc ký đ nhờ tốc độ di chuyển khác nhau

 Một số phương pháp sắc ký thường dùng:

 Sắc ký lớp mỏng:

+ Là phương pháp tách các chất trong hỗn hợp dựa trên khả năng bị hấp phụ (là chủ yếu) khác nhau của ch ng trên bề mặt một chất rắn (chất hấp phụ)

+ Đại lượng đánh giá sự di chuyển của chất phân tích là hệ số Rf:

trong đó: dv: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết

ddm: Khoảng cách dung môi chạy

Rf phụ thuộc: cách tiến hành, tính chất hoạt độ của chất hấp thụ, tính chất của dung môi, chiều dày của lớp mỏng, quãng đường chạy sắc ký, lượng chất chấm

 Sắc ký cột:

+ Là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha: pha tĩnh là các chất lỏng bao bọc tạo thành tấm phim màng mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (chất mang) được nh i vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh

+ Quá trình rửa giải được thực hiện b ng cách thêm liên tục một lượng mới của pha động[1],[2],[3],[10],[21]

1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc của kháng sinh

1.6.1 Phổ tử ngoại- h iến (UV-VIS)

à đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ hấp thụ bức xạ UV vào bước sóng hay số sóng là phổ tử ngoại

Các bức xạ UV-VIS có năng lượng khá lớn làm thay đổi mức năng lượng của các electron từ trạng thái cơ bản lên kích thích

Phổ UV-VIS được sử dụng định tính b ng cách so sánh với phổ của chất chuẩn đã có sẵn (so sánh vị trí các cực đại, cực tiểu và tỉ lệ mật độ quang giữa các bước sóng đó), tuy nhiên phổ UV-VIS là phổ cho khá ít thông tin về cấu tr c, thông thường vẫn sử dụng phổ IR để xác định cấu tr c [3],[6]

1.6.2 Phổ hồng ngoại (IR)

Là đường cong biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ hấp thụ bức xạ h ng

ngoại của một chất vào số sóng hoặc bước sóng bức xạ

Ánh sáng h ng ngoại có năng lượng thấp nên chỉ dẫn đến sự thay đổi các mức năng lượng và chuyển động quay

Sử dụng để nhận dạng các nhóm chức đặc biệt trong phân tử và định tính b ng cách so sánh với phổ chuẩn Đối với hầu hết các hợp chất dạng của phổ IR là đơn nhất và đặc trưng trong vùng 1350-750cm-1

được gọi là “vùng vân tay” gười ta thường dựa vào tín hiệu trong vùng này để xác định sự “không” có mặt của một nhóm chức [1]

1.6.3 Phổ hối ư ng ( S)

Khối phổ khác với các kĩ thuật quang phổ, không sử dụng bức xạ điện từ

Là phương pháp nghiên cứu các hợp chất hữu cơ b ng cách đo chính xác khối lượng phân tử của chất đó nhờ kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Tỷ số này được biểu thị b ng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc b ng Dalton Các ion được tạo thành trong bu ng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện b ng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành khối phổ

đ hay phổ khối ó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu tr c và định lượng các chất[1],[10],[26]

1.7 Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 184.225

Tiến hành nuôi cấy chủng Streptomyces 184.225trên 5 môi trường khác nhau,

sau đó thử HTKS b ng phương pháp đặt khối thạch với 10 VSV kiểm định, thu

được MT2 là MT nuôi cấy bề mặt, lưu giữ chủng và Bacillus subtilis Gr (+),

Proteus mirabilis Gr (-) là 2 VSV kiểm định đại diện cho các thí nghiệm tiếp theo

Sau khi cải tạo giống theo phương pháp S và đột biến, HTKS đã ổn định và tăng lên đáng kể.Đề tài cũng khảo sát được ở pH=5, KS được chiết kiệt với dung môi Ethyl acetat và cho HTKS cao nhất

Tiến hành tinh chế 2 lần với hệ dung môi 3 để loại tạp và hệ dung môi Ethylacetat: Methanol: n-Hexan (25:1:1) để chạy sắc ký cột thu được 3 kháng sinh KS1, KS2, KS3 Kháng sinh 2có hiệu suất cao nhất trong số đó (H=17,27 ) được đem đi đo phổ IR, sơ bộ xác định được một số nhóm chức như amide, alcohols, phenols, ester, amin, aromatic, ankanes [14]

1.8 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin X2

Chủng xạ khuẩn Streptomyces 15.29 được phân lập tại phòng thí nghiệm Vi

sinh vật học tại Bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học Dược Hà ội Tên khoa học đã được xác định chính xác khi giải trình tự gen 16S AR là

Streptomyces microflavus

Từ dịch lọc lên men kháng sinh chiết được tốt nhất b ng ethylacetat ở pH 5,0 Sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4 thành phần Trong đó thành phần chính được tinh chế thu được hiệu suất 66 Bước đầu các tác giả đã xác định giá trị MIC của kháng sinh này khá thấp: từ 0,11-0,30 µg/ml đối với

S aureus, P mirabilis, S flexneri, S typhi

Tác giả sử dụng phương pháp chiết b ng DMHC ethyl acetat và phân lập b ng các phương pháp sắc ký kết hợp sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha đảo, với các hệ dung môi thích hợp thu được chất kháng sinh chính 1 (1,0 g)

Tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân và biện giải phổ, tác giả xác định được hợp chất 1 là actinomycin X2, một hợp chất cũng được phân lập từ chủng

Streptomyces spp và có hoạt tính chống ung thư cũng như hoạt tính kháng sinh rất

mạnh [27]

1.9 Một số nghiên cứu liên quan đến actinomycin D

Một nhóm tác giả tại Brazil thực hiện nghiên cứu với mục đích sản xuất được lượng

lớn nhất actinomycin D từ 3 biến chủng Streptomyces: S parvulusDAUFPE 3124, S

felleus DAUFPE 3079, S regenesis DAUFPE 3053.Môi trường phát triển được sử

dụng giống nhau g m có: tryptone 5 g/l và cao nấm men5 g/l

S parvulus ATCC 12434 sinh ra actinomycin, có hoạt tính sinh học lớn nhất

(152mg/l) và chỉ cung cấp actinomycin D ghiên cứu nh m cải thiện khả năng sản xuất kháng sinh trong các bình lắc b ng việc thay thế glucose b ng fructose n ng độ

20, 30 và 40g/l Sự thay thế này làm gia tăng khả năng sản xuất kháng sinh, đạt

n ng độ cao nhất 635mg/l với n ng độ fructose 30g/l Thí nghiệm trong bình lên men với các mức cấp khí khác nhau (0,5; 1 và 1,5vvm), tốc độ khuấy khác nhau (300 và 500 rpm) Môi trường lên men cho thấy hoạt động lưu biến của dung dịch dạng chất dẻo

Kết quả cho thấy lượng kháng sinh được sản xuất lớn nhất (1530 mg/l) với vận tốc cấp khí là 1,5vvm và tốc độ khuấy 500rpm phần lớn sản phẩm thu được từ chủng

S.parvulusDAUFPE 3124 khi nuôi cấy trong trong bình lắc.[35]

Trong một nghiên cứu được công bố bởi nhóm tác giả thuộc Bộ Khoa học và Công nghiệp của Ấn Độ, b ng phương pháp giải trình tự gen 16S rR A các tác giả đã xác

định được chủng xạ khuẩn mới được phân lập Streptomyces sindenensis có khả

năng sinh tổng hợp actinomycin D Trong nghiên cứu nhóm tác giả đã tiến hành tối

ưu hóa các điều kiện và thành phần môi trường lên men kết quả thu được từ chủng ban đầu có hoạt tính kháng sinh 80mg/ l, sau quá trình tối ưu, áp dụng vào lên men thu được 365 mg/ l sinh khối với tốc độ cấp khí 1.5 vvm, tốc độ khuấy 660 rmp[38], [40]

Trong một nghiên cứu khác được công bố bởi các tác giả trên tạp trí công nghệ sinh học Châu Phi, các tác giả đã tiến hành phân lập mẫu đất lấy từ Sudan phân lập

chủng xạ khuẩn Streptomyces sp Qua quá trình nghiên cứu lên men, tinh chế sản

phẩm thu được được xác định cấu tr c b ng phổ UV, MS, MR đã xác định được cấu tr c kháng sinh thu được là actinomycin D [29]

Sử dụng phương pháp đột biến b ng ánh sáng UV với chủng xạ khuẩn

Streptomyces sindenensis có khả năng sinh tổng hợp actinomycin D, các tác giả Ấn

Độ đã nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp actinomycin D gấp 400% ( 400 mg/l so với ban đầu là 80mg/l) Kết quả cho thấy việc sử dụng UV và các tác nhân gây đột biến vẫn là những tác nhân quan trọng trong việc nâng cao hiệu xuất sinh tổng hợp

kháng sinh từ vi sinh vật [39]

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Giống xạ huẩn

Chủng xạ khuẩn nghiên cứu: chủng xạ khuẩn Streptomyces 184.225 đã được

phân lập và tuyển chọn, do bộ môn Vi sinh– Sinh học Trường Đại học Dược Hà

Đặc trưng Tên VSV kiểm định Tên viết tắt

VK Gram (+) Bacillus subtilis ATCC 10241 B subtilis

VK Gram (-) Proteus mirabilis BV108 P mirabilis

2.1.3 Môi trường nuôi cấ VSV iể định

Bảng 2.2 Môi trường nuôi cấy VSV kiểm định

Thành phần

MT

NaCl (g)

Cao thịt (g)

Pepton (g)

Thạch (g)

Nước (ml) pH

Canh thang 0,5 0,3 0,5 0 100(vđ)

7,0-7,5 Thạch thường 0,5 0,3 0,5 1,6-1,8 100(vđ)

2.1.4 ôi trường nuôi cấ xạ huẩn

Bảng 2.3 Thành phần các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml)

Saccarose

Ch : Các MT nuôi cấy xạ khuẩn, MT lên men và MT nuôi cấy VSV kiểm định

được tiệt trùng ở 118-120oC trong 30 ph t

Triethylamin 0,726-0,728 89,50

n-Butylacetat 0,880- 0,885 117- 118

2.1.6 c thiết ị

- Đ n UV ( = 254nm), ngu n phát Toshiba 60W, điện thế 220V

- i hấp vô trùng Hirayama Model HL3030

- Cân phân tích Sartorius BP 121S, tủ ấm Memmert, Binder, Trung Quốc

- Tủ cấy vô trùng Aura VF 48, tủ sấy S shellab

- Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300 f, cân kỹ thuật

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy E2-Melt, máy đo UV-VIS HiTaChi U-1900

- Máy đo phổ MS-Xevo TQMS, máy đo phổ IR Impact 410-NicoLet-USA

2.2 Nội dung nghiên cứu

Ch n c c i tạo giống

- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất

- Đột biến b ng ánh sáng UV và tác nhân hóa học để nâng cao hoạt tính của

Streptomyces184.225

ên en chiết t ch tinh chế h ng sinh

- Từ 3 MT nuôi cấy bề mặt tốt nhất, chọn một MT lên men chìm tốt nhất

- Từ các dạng chủng và biến chủng tốt nhất thu được sau S và mỗi lần đột biến, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men chìm tạo kháng sinh mạnh nhất

- Tìm hệ DM khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất

- Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết DM hữu cơ

2.2.3 Bước đầu x c định t số t nh chất v cấu tr c của h ng sinh thu đư c

- Xác định nhiệt độ nóng chảy

- Đo phổ IR, phổ UV-VIS, phổ MS và phổ NMR

2.3 Phương pháp thực nghiệm

2.3.1 Phương ph p nuôi cấ giữ giống

 Mục đích:

Bảo quản các chủng giống thuần khiết đã phân lập, các dạng chủng sau sàng

lọc ngẫu nhiên, các biến chủng sau đột biến nhân tạo cho các nghiên cứu tiếp theo

 Tiến hành:

Chuẩn bị môi trường phân lập, đun sôi, khuấy trộn, phân đều vào các ống nghiệm, mỗi ống 5-6ml, n t bông Tiệt trùng ở 120o/120ph t, 1 atm r i đặt nghiêng cho đông Khi môi trường nguội, dùng que cấy vô trùng cấy zigzac các bào tử

Streptomyces 184.225đã thuần khiết lên bề mặt thạch nghiêng uôi cấy ở 28oC trong 6 ngày cho xạ khuẩn phát triển, cất giữ trong tủ lạnh (2-4oC) Định kỳ cấy truyền sau 3-6 tháng

Đ nh gi hoạt t nh h ng sinh ng phương ph p huếch t n

 Nguyên tắc:Kháng sinh từ mẫu thử khuếch tán vào MT thạch dinh dư ng đã

cấy VSV kiểm định, ức chế sự phát triển của VSV tạo thành vòng vô khuẩn

Cấy hỗn dịch VSV vào MT thạch thường đã tiệt trùng và để nguội đến

45-50oC với tỷ lệ 2,5:100 (105 tế bào/1ml), lắc đều, đổ vào đĩa Petri vô trùng với thể tích 20ml/đĩa

Đưa mẫu thử vào MT kiểm định theo 1 trong 3 cách sau: phương pháp khối

thạch, phương pháp giếng thạch, phương pháp khoanh giấy lọc

Các đĩa Petri có mẫu thử được ủ trong tủ ấm 37oC trong 18-24h (đối với vi khuẩn) Mỗi mẫu được thử song song trên 3 đĩa với cùng một loại VSV kiểm định Đánh giá kết quả: đo đường kính vòng vô khuẩn b ng thước k p Palmer độ chính xác 0,02mm Đánh giá kết quả dựa trên đường kính vòng vô khuẩn xử lý theo công thức:

̅ = ∑ s = √∑ ̅

Trong đó:

̅ (mm): đường kính trung bình vòng vô khuẩn,

(mm): đường kính vòng vô khuẩn thứ i,

S: độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh,

N: số thực nghiệm tiến hành song song (thông thường n = 3)

Phương ph p ch n môi trường nuôi cấ th ch h p

 Mục đích Tìm môi trường nuôi cấy và bảo quản chủng xạ khuẩn ổn định,

giữđược hoạt tính kháng sinh tốt nhất

 Tiến hành Chủng được cấy lên 5 môi trường (MT1, MT2, MT5, MT6,

MT7)trong đĩa Petri, ủ ở 28oC trong 6 ngày, sau đó thử HTKS b ng phương pháp khốithạch Tiến hành thử song song trên 3 mẫu, chọn môi trường có HTKS mạnh nhấtđể tiến hành nuôi cấy và nghiên cứu tiếp

2.3.4 Phương ph p c i tạo v ch n giống

2.3.4.1 Phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên

 Mục đích: Chọn lọc ngẫu nhiên những cá thể cho hoạt tính kháng sinh

caonhất so với các cá thể khác từ các giống thuần khiết

 Tiến hành:

Cân pha MT2 (môi trường phân lập), hấp tiệt trùng, đổ môi trường ra đĩaPetri

vô trùng (20ml/đĩa)

Chuẩn bị hỗn hợp dịch bào tử,lấy 1 vòng que cấy bào tử xạ khuẩn

Streptomyces 184.225từ ống giống r i hòa vào ống nghiệm chứa 10ml nước vô

trùng, lắc cho bào tử phân tán đều thu được hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1

(định ước) Tiếp tục pha loãng hỗn dịch này b ng nước vô trùng đến n ng độ 10-6

Cấy bào tử: dùng pipet vô trùng h t chính xác 0,1ml hỗn dịch bào tử ở các độ pha loãng 10-5 -10-6, nhỏ lên bề mặt của MT2 trong đĩa Petri, nuôi xạ khuẩn trong tủ

ấm ở 28o

C trong 6 ngày để khuẩn lạc phát triển

Sàng lọc: Sau 6 ngày nuôi, chọn ngẫu nhiên các khuẩn lạc phát triển đa dạng mọc riêng rẽ, cấy zigzac lên bề mặt MT2 trong đĩa Petri (chọn 32 - 33 khuẩn lạc) sau đó nuôi ở 28o

C trong 6 ngày

Thử HTKS của các biến chủng b ng phương pháp khối thạch, đánh giá kết quả Căn cứ kết quả vòng vô khuẩn, lựa chọn và giữ lại 3 chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo

2.3.4.2 Đột biến cải tạo giống bằng ánh sáng UV

 Mục đích Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau sàng lọc ngẫu nhiên

nh m nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

 Tiến hành

Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất của sàng lọc ngẫu nhiên cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ pha loãng 10-1 (định ước) ấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến n ng độ 10-6 làm mẫu chứng, 9ml còn lại được pha vào đĩa Petri vô trùng và được đem đột biến dưới tác dụng ánh sáng UV với = 254 nm, khoảng cách chiếu 60cm, thời gian chiếu 5

ph t Hỗn dịch bào tử sau khi được chiếu UV được đưa vào chỗ tối 2h, sau đó dùng pipet vô trùng pha loãng đến n ng độ 10-4– 10-5

n ng độ pha loãng tiến hành trên 3 đĩa Petri song song, sau đó nuôi cấyở 28oC cho

khuẩn lạc phát triển Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót

Tỷ lệ phần trăm xạ khuẩn sống sót được tính theo công thức:

độ sống sót = x 10-6 + k × 100%

Trong đó:

Nm: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu có n ng độ bào tử 10-k

No: trung bình số khuẩn lạc trong mẫu chứng

k : n ng độ pha loãng của hỗn dịch bào tử đã sử dụng

Tiến hành sàng lọc với các khuẩn lạc sau khi đột biến tương tự như phần SLNN àm song song mẫu chứng Phần trăm biến đổi hoạt tính được xác định theo công thức:

biến đổi hoạt tính = ̅̅ x 100%

o Trong đó:

o ̅: đường kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau đột biến

o ̅ : đường kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng

Sau đột biến, lựa chọn ra các biến chủng (3-5 biến chủng) có tỉ lệ biến đổi hoạt tính dương cao nhất dùng cho các nghiên cứu tiếp theo

2.3.4.3 Đột biến cải tạo giống bằng tác nhân hóa học HNO 2

 Mục đích: Cải tạo những chủng có hoạt tính cao sau đột biến UV nh m nângcao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh

 Tiến hành

Pha hỗn dịch bào tử: lấy 1 vòng que cấy bào tử biến chủng tốt nhất củađột biến UV2 cho vào 10ml nước vô trùng lắc đều tạo hỗn dịch bào tử ở độ phaloãng

10-1(định ước) ấy 1ml hỗn dịch bào tử này pha loãng đến n ng độ 10-6 làmmẫu

chứng, 9ml còn lại được pha vào ống nghiệm

Đột biến b ng H O2 : 9ml hỗn dịch bào tử ở n ng độ 10-1, cho 0,07g NaNO2vào ống hòa tan (n ng độ H O2 : 0,1M) Sau đó, nhỏ HCl 0,1 vào ống nghiệm đó đến khi pH = 4,5 để 2-3 ph t, r i nâng đến pH = 7,5-8,0 b ng aOH 0,1 dùng pipet vô trùng pha loãng đến 10-5 b ng nước cất vô trùng

Cấy các bào tử sau đột biến: dùng pipet vô trùng h t chính xác 0,1ml mẫu chứng ở n ng độ 10-6

và 0,1ml hỗn dịch bào tử đã đột biến ở n ng độ 10-4, 10-5 cho vào đĩa Petri chứa MT2, sau đó dùng que chang vô trùng dàn đều giọt hỗn dịch bào

tử trên bề mặt thạch, mỗi độ pha loãng làm 3 đĩa song song Sau đó nuôi cấy ở 28oC cho khuẩn lạc phát triển Sau 6 ngày, đếm số khuẩn lạc sống sót.Sau đó tính tỷ lệ

phần trăm sống sót và thử HTKS tương tự như đột biến UV

2.3.5 Phương ph p ên en ch tổng h p h ng sinh

 Mục đích: Chọn ra được chủng tốt nhất để định hướng cho phát triển sản

xuất công nghiệp

 Tiến hành:

Tạo giống cấp 1: chủng giống Streptomyces 184.225sau khi nuôi cấy trên

MT2 thạch nghiêng đủ 6 ngày được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể b ng 10ml nước vô trùng, đem lắc trên máy lắc ở nhiệt độ 28oC, tốc

độ quay 140 vòng/ph t trong 48h

ên men: sau 48h nhân giống, giống cấp 1 được cấy vô trùng sang bình nón 500ml chứa 100ml MT2 dịch thể với tỷ lệ Vgiống: V môi trường = 1:10 Các bình lên men được lắc 28oC, tốc độ quay 140 vòng/ph t trong 120h Sau 120h, lấy ra lọc

hoặc ly tâm dịch lên men r i thử HTKS b ng phương pháp giếng thạch

Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men

Xác định độ bền nhiệt: lấy khoảng 5-7ml dịch lọc dịch lên men vào 3 ống nghiệm Ống thứ 1 để ở nhiệt độ thường, ống thứ 2 đun cách thủy 30 ph t, ống thứ

3 đun sôi trực tiếp 10 ph t Đem thử HTKS b ng phương pháp giếng thạch, tiến hành trên 3 mẫu song song Đánh giá kết quả

2.3.7 Các phương ph p chiết t ch h ng sinh

2.3.7.1 Phương pháp chiết kháng sinh từ dịch lọc bằng dung môi hữu cơ

 Mục đích: Xác định pH và dung môi thích hợp để tách hoạt chất kháng sinh

ra khỏi hỗn dịch dịch lọc lên men

 Tiến hành

Dùng phương pháp chiết 1 lần

Dịch lọc lên men sau khi đã được loai bỏ sinh khối được điều chỉnh về các mức pH=3, pH=5, pH=7, pH=9, pH=11 b ng dung dịch aOH 0,1 hoặc HCl 0,1 Cho dung môi hữu cơ và dịch lên men vào bình gạn với tỷ lệ Vdung môi: Vdịch lọc = 1:5 ắc đều, để 1h cho phân lớp Tách riêng lớp dung môi và dịch lọc Sau đó thử HTKS của lớp dung môi hữu cơ và lớp nước b ng phương pháp khoanh

giấy lọc Căn cứ kết quả thu được chọn lấy dung môi hữu cơ và pH tối ưu để chiết

50oC.Đặt bản mỏng vàobình sắc ký khi dung môi chạy đến ¾ bản mỏng thì lấy ra,

đánh dấu đường dungmôi chạy.Sấy bản mỏng

Xác định vết theo các phương pháp sau: nhìn b ng mắt thường (những vết có màu), soi đ n tử ngoại (UV), phương pháp hiện màu hóa học, hiện hình VSV

Tính hệ số Rf : Rf =

Trong đó: a: khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết

b: khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi

b Sắc ký cột

 Mục đích Tinh chế và tách riêng các thành phần trong bột kháng sinh

 Tiến hành

Cột: Φ =1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, sấy khô

Chất nh i: Silicagell 60 Merck c hạt 0,040 - 0,063 mm được hoạt hóa ở110ó

C trong 30 ph t Hòa thành hỗn dịch với hệ DMHC chạy đưa lên cột

Mẫu thử: bột kháng sinh thu được (sau khi cất quay chân không dịch chiết DMHC) hòa tan với 1lượng nhỏ dung môi r i trộn với 1 lượng nhỏ Silicagel đã hoạt hóa Sấy khô, r icho lên cột, để ổn định trong 30 ph t

Chạy cột: cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,3-0,5ml/ph t ấy các phân đoạn đã chạy qua cột vào ống nghiệm sạch, mỗi ống 3-5ml Thử HTKS của các phân đoạn b ng phương pháp khoanh giấy lọc.Các phân đoạn có HTKS được tiến hành SK M với hệ dung môi tách tốt nhất.Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại đem cất quay tinh chế tiếp

2.3.8 Phương ph p thu tinh thể h ng sinh tinh hiết

Các phân đoạn chính tinh khiết sau khi tách (chạy cột) được gộp vào => cất quaychân không đến khô => cạo thu bột kháng sinh tinh khiết => cho vào ống nghiệm sạch (đã rửa sạch tráng c n, methanol) với tỉ lệ dung môi chạy sắc ký : n-hexan (1:5) =>Để kết tinh trong tủ lạnh 1-2 ngày => tinh thể kháng sinh sẽ kết tinh trên thành và trong lòng ống nghiệm =>Gạn, lọc và rửa kháng sinh b ng n-hexan lạnh, sấy khô (<60oC) thu được kháng sinh tinh khiết

2.3.9 Sơ x c định cấu tr c h ng sinh tinh hiết thu đư c

Xác định các đặc điểm vật lý: màu sắc, hình dạng tinh thể

Bột kháng sinh tinh khiết đem đi đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ IR, phổ tử ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân để sơ bộ dự đoán cấu

tr c kháng sinh thu được

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên

Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên chủng Sreptomyces 184.225 trên môi trường

MT2.Sau 6 ngày nuôi cấy, thử HTKS của 33 chủng chọn lọc b ng phương pháp

khối thạch Bảng kết quả chi tiết xem phụ lụcBảngP.10 Kết quả chính được trình bày ở Bảng 3.1 sau:

Nhận xét: Sau khi sàng lọc ngẫu nhiên, nhận thấy 3 chủng SLNN.2, SLNN.3,

SLNN.5cho hoạt tính kháng sinh tốt nhất trên cả 2 VSV kiểm định =>Được giữ lại

cho nghiên cứu đột biến cải tạo giống tiếp theo

3.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 1

Tiến hành đột biến các bào tử của dạng chủng số SLNN.5 b ng ánh sáng UV

( = 254nm), khoảng cách chiếu 60cm, thời gian 5 ph t Sau khi đột biến, đánh giá HTKS của các chủng b ng phương pháp khối thạch thu được 34 biến chủng với 10

biến chủng cho HTKS tốt nhất được trình bày ở Bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 1

Nhận xét: Sau ĐBUV1, các chủng có tỉ lệ sống sót là 2,76 , trong đó 3 biến

chủng ĐBUV1.4, ĐBUV1.22, ĐBUV1.28 có HTKS cao nhất, được chọn giữ lại để nghiên cứu tiếp theo.Riêng biến chủng ĐBUV1.28 cho HTKS cao hơn cả được tiến

hành ĐBUV lần 2

3.3.Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 2

Đem biến chủng ĐBUV1.28 đột biến b ng ánh sáng UV, thời gian 4 ph t 30

giây Tỷ lệ sống sót là 0,92%

Thử HTKS của 32 biến chủng sau đột biến b ng phương pháp khối thạch Kết

quả chính thể hiện trong Bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả thử HTKS sau ĐBUV lần 2

Nhận xét: Hoạt tính kháng sinh của biến chủng ĐBUV1.28 tăng trên cả

B.subtilis(110,38%) và P.mirabilis (106,29%) Các biến chủng ĐBUV2.6,

ĐBUV2.14, ĐBUV2.15 có hoạt tính kháng sinh cao nhất được chọn giữ lại để

nghiên cứu tiếp theo

3.4 Kết quả đột biến hóa học

Tiến hành đột biến hóa học b ng H O2 đối với biến chủng ĐBUV2.14thu

được 34 biến chủng mới, tỷ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là: 0,75 Kết quả chính

Nhận xét: Hoạt tính kháng sinh của biến chủng ĐBUV2.14 tăng trên cả

B.subtilis(118,15%) và P.mirabilis (116,35%) Các biến chủng:ĐBHH.13,

ĐBHH.20, ĐBHH.29 có HTKS cao nhất được chọn giữ lại để nghiên cứu tiếp theo

D

D

3.5 Kết quả chọn môi trường lên men chìm tốt nhất

- ọc, loại bỏsinh khối trong dịch lên men => Thu lấy dịch lọc

- Thử HTKS b ng phương pháp giếng thạch với dịch lọc thu được

 Các kết quả được trình bày trong Bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả chọn môi trường lên men

Nhận xét: Kết quả lên men chìmStreptomyces184.225 trên MT2dt cho hoạt

tính kháng sinh mạnh nhất nên chọn MT2dt là môi trường lên men chìm cho những nghiên cứu tiếp theo

3.6 Chọn dạng chủng, biến chủng lên men tốt nhất

Bảng 3.6 Kết quả lên men chìm của các dạng và biến chủng trên MT2dt Dạng -

Nhận xét: Từ kết quả trên cho thấy, biến chủng ĐBHH.13 là biến chủng nổi

trội nhất, sinh kháng sinh có HTKS cao nhất => Biến chủng ĐBHH.13 được chọn

làm chủng lên men chìm lấy dịch lọc cho những nghiên cứu tiếp theo

3.7 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc

 Mục đích:

Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men dưới tác động của nhiệt độ

và pH khác nhau nh m xác định điều kiện bảo quản, chiết tách, tinh chế kháng sinh tốt nhất

Nhận xét: Hoạt tính kháng sinh bền ở pH trung tính và khoảng gần trung tính,

nhưng ở pH = 7 kháng sinh có hoạt tính mạnh nhất và bền hơn sau 5 ngày Vì vậy, cầnđưa dịch lọc chứa kháng sinh về pH = 7 để thu được kháng sinh có hoạt tính cao nhất và ổn định nhất

Bảng 3.7b.Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ tới độ bền của kháng sinh trong

Nhận xét: Kháng sinh bền ở nhiệt độ thường, không bền với nhiệt độ cao,

hoạt tính kháng sinh giảm mạnh khi chịu tác động của nhiệt độ cao

3.8 Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết xuất kháng sinh

 Mục đích

Xác định dung môi và pH chiết tối ưu cho hoạt tính kháng sinh cao nhất

 Tiến hành: