Tổng hợp và thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư của 5benzyliden2thiohydrantoin và một số dẫn chất base mannich

Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh h

fgh

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THU HƯƠNG

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THU HƯƠNG

cơ, các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban - Trường Đại học Dược Hà Nội

Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhưng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng như tài liệu tham khảo nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên Hoàng Thu Hương

MỤC LỤC

TrangDANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin 3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

19

2.3 Nội dung nghiên cứu 20

2.4.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin,

5-benzyliden-2-thiohydantoin và dẫn chất base Mannich

21

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư 21

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin 27 3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich của 5-benzyliden-2-

3.4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 40 3.4.1.2 Về phản ứng ngưng tụ tạo 5-benzyliden-2-thiohydantoin 42

3.4.2 Về xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 44

3.4.2.2 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 45 3.4.2.3 Về xác định đồng phân hình học của dẫn chất 5-benzyliden-2-

thiohydantoin và các base Mannich dựa trên phổ 1H-NMR

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13

(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance)

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance)

Ac2O : Anhydrid acetic

AcOH : Acid acetic

DMF : Dimethylformamid

ESI : Phương pháp phun mù điện tử

(Electron Spray Ionization)

3.7 Kết quả thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư trên dòng tế bào

ung thư gan người Hep-G2 của các chất tổng hợp được (theo

phương pháp SRB)

46

ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc luôn đóng vai trò to lớn trong công tác bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng đối với Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung Với vai trò quan trọng đó, việc nghiên cứu và phát triển các dược chất mới hoàn thiện hơn, hiệu quả hơn luôn được đề lên hàng đầu Nguồn gốc của dược chất vô cùng đa dạng: chiết xuất từ thiên nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp; trong đó tổng hợp hóa dược là con đường quan trọng đã giúp tìm ra nhiều hoạt chất mới được ứng dụng rộng rãi và mang lại lợi ích to lớn trong phòng bệnh và chữa bệnh Một trong những vấn đề về sức khỏe hiện nay trên toàn thế giới là ung thư - tác nhân gây chết người hàng đầu Tại hội thảo “Tiếp cận điều trị ung thư hiệu quả và đáp ứng khả năng chi trả” do Bộ Y tế tổ chức ngày 12/4/2016 tại Hà Nội, Thứ trưởng Bộ Y tế Phạm Lê Tuấn cho biết mỗi năm cả nước có khoảng 150.000 ca ung thư mới, trong đó có 75.000 ca tử vong khiến Việt Nam trở thành quốc gia có tỷ lệ ung thư ở mức báo động Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển các hoạt chất mới có khả năng kháng tế bào ung thư với mục tiêu hiệu quả hơn, ít tác dụng phụ hơn là nhu cầu cấp thiết

Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, để nhanh chóng tạo ra các thuốc mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo ra các chất mới dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc tính hơn và có hiệu quả hơn trong điều trị

Trên thế giới, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc của các dẫn chất 2-thiohydantoin [9], [14], [29], [35]… Trong đó nhiều dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng

virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [1], [4], [6], [16], [20], [22], [36], [37]

Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính sinh học, đặc biệt có tác dụng trên tế bào ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau:

5-aryliden-2-1 Tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich

2 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin

2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng được tạo thành nhờ phản ứng ngưng

tụ giữa một amino acid với một dẫn chất của thiocyanat Bản thân thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng sinh học đã được biết đến trong thời gian dài Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng như: kháng tế bào ung thư [8], [9], kháng đột biến gen [29], kháng virus [14], kháng virus HIV [20], kháng khuẩn [17], [21], [22], ức chế enzyme aldose reductase [33]… Ngoài ra 2-thiohydantoin còn được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác như sản xuất thuốc trừ sâu [34], thuốc nhuộm [34]…

2-1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư

Merbaron là một dẫn chất của 2-thiobarbituric, có tác dụng gây độc tế bào với tế bào ung thư máu và một số tế bào ung thư khác

HN N H

H N O

N

S O

Năm 2010, một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8) đã được tác giả Al-Obaid và các cộng sự [9] nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng invitro về tác dụng chống ung thư trên 60 dòng tế bào người ở 5 nồng độ khác nhau Kết quả thu được đáng chú ý là chất 2, 7 có tác dụng kháng tế bào ung thư trên dòng tế bào ung thư bạch cầu, các chất 3, 4, 5, 6, 8 có tác dụng ngăn cản sự phân bào và kìm hãm sự phát triển tế bào thử nghiệm

CH

N H NH O

CH

N H NH O

S

3

Acid 4-ylidenemethyl)-thiophen-2-ylsulfanyl]-benzoic

O

CH

N H NH O

S 4

cyclopenta[b]naphthalen-2-ylmethylen)-2-thioxo-imidazolidin-4-on

N H N O

S

S

Br

O N

5

morpholin-4-ylmethyl-2-thioxo-

5-(5-bromo-thiophen-2-ylmethylen)-3-imidazolidin-4-on

O OAc OAc

AcO

CH

N NH O

3-acetoxy-6-acetoxymethyl-2-[4-(5-O OAc OAc

AcO H AcO

CH

N N O

S Ph

7

Acid triacetoxy-6-acetoxymethyl-tetrahydro-pyran-2-ylsulfanyl)-1,5-dihydro-

2-{5-[5-oxo-1-phenyl-2-(3,4,5-ylsulfanyl}-benzoic

imidazol-4-ylidenemethyl]-thiophen-2-CH

N N O

S

S

Br

O N

O OAc OAc

AcO H AcO

8

2-ylmethylene)-1-morpholin-4-ylmethyl-5-oxo-4,5-dihydro-1H-imidazol-2-

3,4,5-triacetoxy-6-[4-(5-bromo-thiophen-ylsulfanyl]-tetrahydro-pyran-2-ylmethyl acetat

Nguyên nhân chính của ung thư kháng thuốc là do nồng độ quá cao của bơm tống thuốc phụ thuộc ATP khiến cho giảm nồng độ thuốc, trong đó có

Nhiều nhóm chức hóa học có khả năng ức chế loại bơm tống thuốc (loại có chứa P-gp), bao gồm 3 thế hệ điều biến P-gp Các nghiên cứu cho thấy chất 5-(3-methoxy-benzyliden)-3-{3-[4-(2-methoxy-phenyl)-piperazin-1-yl]-

N N

O O

H N

N H

H N

N H

H N S O

Ar

ArOH

N

H N SCH3O

Ar

CH3I

N HN

HO

N

H N O Ar

N N

HO

Các tác giả đã thử tác dụng ức chế bơm tống thuốc của các dẫn chất đã tổng hợp được trên các tế bào lympho T đã kháng thuốc của chuột có gen vận chuyển thuốc ABCB1 Kết quả cho thấy một số dẫn chất có tác dụng yếu trên bơm tống thuốc ở tế bào ung thư thử nghiệm, tác dụng yếu hơn chất 4 Hợp chất có tác dụng mạnh nhất có 2 nhân thơm

Theo các tác giả này, phần nhân thơm không phân cực là yếu tố thuận lợi cho tác dụng ức chế bơm tống thuốc trên tế bào ung thư, còn nhóm hydroxyl

là nhóm thế gây giảm tác dụng

Đặc biệt, những nghiên cứu gần đây cho thấy khung benzyl của (thio)hydantoin có khả năng gắn lên các chất vận chuyển protein Các công trình nghiên cứu của một số tác giả cho thấy tác dụng chống ung thư của các dẫn chất (thio)hydantoin rất đáng quan tâm [11], [16], [35] Dẫn chất (thio)hydantoin có tác dụng ức chế quá trình phosphoryl hóa tự động và biệt hóa một số tế bào ung thư do yếu tố EGFR (receptor của yếu tố tăng trưởng biểu mô) [11], [35]

Một số nghiên cứu của tác giả Tô Ái An [1], tác giả Trần Đức Lai [6], tác giả Mai Công Hưng [4] gần đây cho thấy một số dẫn chất của 5-aryliden-

11

clorobenzyliden)-2-thiohydantoin (IC50= 4,66 µg/ml), 3-(N-methylpiperazino)methyl-2-thiohydantoin (IC50= 4,95 µg/ml), 5-(2’- hydroxybenzyliden)-2-thiohydantoin (IC50= 4,72 µg/ml)…; và tế bào ung thư đại tràng HTC116 ( 5-(2’-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin (IC50= 24,40

5-(4’-clorobenzyliden)-µg/ml), 5-(4’-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin (IC50= 27,08 µg/ml)…), chất 5-(3’-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin (IC50= 3,22 µg/ml); chất 5-(3’- bromobenzyliden)-3-morpholinomethyl-2-thiohydantoin (IC50= 3,33 µg/ml);

chất 5-(3’-bromobenzyliden)-3-piperidinomethyl-2-thiohydantoin (IC50= 3,16 µg/ml); chất 5-(3’-bromobenzyliden)-3-(N-methylpiperazino)methyl-2- thiohydantoin (IC50= 4,65 µg/ml)

tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm Chất thioxo-1-(2-p-tolyl-ethylideneamino)-imidazolidin-4-yl acetat (12) có tác dụng tốt nhất trên chủng vi khuẩn và nấm thử nghiệm Chất 1-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (13) và chất 5-thiophen-2-yliden-3-[(p-tolylethyliden)amino]-2-thiohydantoin (14) có tác dụng trung bình Chất 1-

5-oxo-2-acetyl-3-[(p-tolylethyliden)amino]-5-thiophen-2-yliden-2-thihydantoin (15)

có tác dụng tốt trên chủng vi khuẩn và tác dụng trung bình trên chủng nấm thử nghiệm

N H

N S O

N

CH3

N H

N S O

N

CH3

S

O 15

Năm 2010, tác giả Abd El Fattah [8] đã tổng hợp một số dẫn chất của

thiohydantoin và thử hoạt tính trên 4 dòng vi khuẩn là: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas species và 1 dòng vi nấm là Candida albicans Kết quả thu được cho thấy các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng tốt trên dòng vi khuẩn Pseudomonas sp; các hợp chất 16, 17, 18 tác dụng yếu trên dòng Escherichia coli; 18, 19 tác dụng rất tốt trên vi khuẩn Staphylococcus aureus; 16, 17, 19, 20 tác dụng rất tốt trên dòng vi nấm Candida albicans

N N N

2-[(3-acetyl-5-oxo-2-thioxo-NH N

N Br

5-acetyl-3-[(5-bromo-2-hydroxy-N N N

oxo-2-thioxo-imidazolidin-1-

4-bromo-2-[(3,4-diacetyl-4-bromo-5-ylimino)-methyl]-phenyl acetat

NH N

N H Br

OH H2NHN

H2NHN

19

imidazolidin-1-ylamino)-methyl]-phenol

4-bromo-2-[(2,5-dihydrazino-NH N

N Br

3-[(5-bromo-2-hydroxy-benzyliden)-Tác giả Trần Đức Lai [6] đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất của 5-aryliden-2-thiohydantoin, kết

quả cho thấy có một số chất có tác dụng kháng chủng vi khuẩn B.Subtilis (MIC=25-50µg/ml), đó là các chất (5-(2’-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin, 5-(3’-clorobenzyliden)-2-thiohydantoin,5-(4’-clorobenzyliden)-2-

thiohydantoin,…)

1.1.3 Các tác dụng khác

Trong US patent 6.826.924 tác giả Pfahl [26] đã tổng hợp các dẫn chất của 2-thioxo-4-imidazolidindion có tác dụng trong điều trị các bệnh liên quan

đến chuyển hóa lipid và carbonhydrat như đái tháo đường typ 2, biệt hóa tế bào mô mỡ, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến…

có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus Herpes typ 1 Tác giả El-Barbary [14] đã sử dụng 5-methylen-2-thiohydantoin là dị vòng 5 cạnh để tiến hành phản ứng với 2’-deoxyuridin nhằm tạo ra các chất mới để nghiên cứu tác dụng kháng virus theo sơ đồ sau:

OTol

HN N

N HN O

O

O

O TolO

OTol

HN N

O

O

CHO 1.(Me3Si)2NH/(NH4)2SO4

R

O OH

1.2.1.2 Phản ứng của các α-amino acid với amonium thiocyanat

Năm 1913, Treat Johson và Water Scott [19] tìm ra phản ứng giữa amino acids với amonium thiocyanat trong môi trường anhydrid acetic khan Sản phẩm trung gian thu được là acylthiohydantoin, sản phẩm trung gian này

α-bị thủy phân trong môi trường acid ở nhiệt độ cao sẽ sinh ra 2-thiohydantoin

N H

H N S O

CH3O

Trong bài báo này, tác giả đã thực hiện phản ứng tổng hợp thiohydantoin

và dẫn chất từ 7 acid khác nhau là: acid aceticphtalamic, acid

p-methoxyhippuric, acid carbethoxyaminoacetic, acid m-nitrohippuric,

acetyldibromphenylalanin, benzoylalanin, acid phenylsulfonaminoacetic Năm 2006, Samuel Reyes và cộng sự [27] đã tiến hành tổng theo phương pháp trên và thu được kết 2-thiohydantoin Năm 2011, Sandrine Gosling và cộng sự [15] cũng đã xây dựng qui trình tổng hợp 2-thiohydantoin theo sơ đồ

như trên và chúng tôi lựa chọn thực hiện tổng hợp 2-thiohydantoin theo qui trình này

1.2.1.3 Phản ứng của glycin ethyl ester thiocyanat với acid amin

Glycin ethyl ester thiocyanat kết hợp với acid amin, đun hồi lưu trong cloroform trong 4 giờ được dẫn chất thế ở vị trí 3 của uredoacetic ethyl ester, sau đó đun hồi lưu trong ethanol/acid hydrochloric (nồng độ 10N, tỷ lệ 1:1) thu được 2-thiohydantoin có nhóm thế ở vị trí 3 như mong muốn [34]

S

R O

H N

O

H N R S

Từ cấu trúc phân tử 2-thiohydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của 2-thiohydantoin [12], [22], [34]… Các phản ứng thực hiện theo hướng chính sau:

H R OH

S

O C

H R

Phản ứng ngưng tụ có thể thực hiện ở các điều kiện khác nhau: dưới điều kiện phản ứng với aldehyd thơm, xúc tác natri acetat, acid acetic băng [20], [33]; ngưng tụ với các aldehyd thơm, xúc tác ethanolamin/EtOH [22], [24], xúc tác piperidin/EtOH [14], dưới điều kiện vi sóng [25]…

Về cơ chế phản ứng Knoevenagel [23]

Phản ứng ngưng tụ các aldehyd thơm và một số hợp chất dị vòng chứa nhóm aldehyd với 2-thiohydantoin xảy ra theo cơ chế phản ứng Knoevenagel tương tự như với các hợp chất có nhóm methylen hoạt động khác

Với xúc tác ethanolamin là amin bậc 1, có thể trình bày cơ chế phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với 2-thiohydantoin theo cơ chế Knoevenagel theo các bước sau:

- Aldehyd thơm ngưng tụ với ethanolamin tạo arylidenimin:

Ar C

H O H2N CH2CH2OH Ar

H C OH

N H

O H

NH3+

-H 2 O

HO-(CH2)2-NH2

Ar CH

N CH2CH2OH

HN NHS

O H

HN NHS

O H

C Ar N

H

NH S

O H

C Ar NH

O H

C Ar NH

H

HO(H2C)2

H2N CH2CH2OH

HN NHS

O C

Nhóm methylen ở vị trí 5 của 2-thiohydantoin rất hoạt động, nguyên tử

H ở đây dễ dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là một tác nhân ái nhân mạnh:

N H

NH S

O

N H

NH S

O

+ BH

(II)Anion (II) tấn công vào carbon mang điện tích dương phần Cδ(+) của nhóm carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):

HC N H

NH S

O H CH Ar O

Ion alcolat (IV) tạo thành lại lấy một proton của BH, trả lại xúc tác B(-) :

-2HO(CH 2 ) 2 NH 2

NH S

O H HC Ar

O (IV)

H

NH S

O H HC Ar OH (V)

+

- Giai đoạn ngưng tụ loại nước:

N H

NH S

NH CH

Ar

O

S (V)

NH C

H Ar

NH

NH

O

O

1 23 4 5 Ar-CHO

AcOH, AcONa -H2O

+

N H

N H

O

O Ar

1 2 3 4 5

Phương pháp của Wheeler và Hoffman được sử dụng để tổng hợp nhiều dẫn chất thế ở C-5 của hydantoin Một nhược điểm của phương pháp trên là phải sử dụng một lượng lớn acid acetic và natri acetat

Năm 1992, Chazeau V., và cộng sự [37] đã xây dựng qui trình tổng hợp một số dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin dựa trên nghiên cứu của Wheeler

và Hoffman

Năm 1993, János Marton [22] sử dụng xúc tác có tính base mạnh là ethanolamin để tiến hành phản ứng ngưng tụ aldehyd thơm với hydantoin trong dung môi là hỗn hợp nước:ethanol (1:1), phản ứng tiến hành ở nhiệt độ hồi lưu trong 4 giờ Tác giả đã sử dụng một số aldehyd thơm (p-

clorobenzaldehyd, p-nitrobenzaldehyd, p-hydroxybenzaldehyd, ), hiệu suất phản ứng 44-89%

N H O O

NH

O O

R = Alkyl, alkoxy (-OR), -NR, -OH, -X, -CN, -CF3, -NO2

Chúng tôi sử dụng xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic để tổng hợp 5-arylidene-2-thiohydantoin (5-benzylidene-2-thiohydantoin ) đi từ

benzaldehyd

1.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất base Mannich

Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd khác) và các amin bậc 1, amin bậc 2 hoặc amoniac [23], [31]

Phản ứng Mannich thường được tiến hành trong môi trường acid nhưng cũng có thể xảy ra trong môi trường base trung bình [23], [31]

Trong môi trường acid, phản ứng xảy ra qua hai bước theo cơ chế sau:

- Bước 1: Amin phản ứng với formaldehyd tạo dẫn chất hydroxymethyl, dẫn xuất này gắn proton và loại một phân tử nước để tạo ra cation aminomethyl:

- H+

+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng enol hóa (như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở liên kết C-H ở nhân indol, pyrol…) thì cation aminomethyl phản ứng với nguyên tử mang H linh động tạo ra sản phẩm base Mannich:

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi

2.2 Thiết bị thí nghiệm

16 Ethanol tuyệt đối Đức Giang (VN) ≥ 99,5%

19 Bản mỏng silicagel Merck Silicagel 60 F254

- Dụng cụ thủy tinh (bình cầu 3 cổ dung tích 100ml, sinh hàn, ống đong, cốc có mỏ các loại, bình lọc hút… )

- Dụng cụ sứ (phễu buchner)

- Cân kỹ thuật điện tử Shimadzu (Nhật)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Bơm hút chân không VRL mode 200-7.0 (Mỹ)

- Máy cất quay Büchi R-210 (Thụy sỹ)

- Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ sấy chân không Shellab (Đức)

- Máy khuấy từ và bếp đun IKA-RCT (Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ)

- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy FTIR Afinity-1S, tại Phòng Thử nghiệm vô cơ, và máy Gx-PerkinElmer tại Bộ môn Hóa vật liệu, Khoa hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC) ghi trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (LC/MS) ghi trên máy LTQ Orbitrap XL™ Hybrid Ion Trap tại Phòng Hóa vật liệu, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp tổng hợp 5-benzyliden-2-thiohydantoin và dẫn chất base Mannich

- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các chất dự kiến

- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được

- Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết

2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ (IR, 1H-NMR, 13C-NMR, MS) được sử dụng để khẳng định cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp được Các số liệu phổ của các chất tổng hợp được đối chiếu với tài liệu

2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của các chất tổng hợp được theo phương pháp SRB [10], [18], [28]

Nguyên tắc

Đây là phương pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sót

của tế bào Tế bào ung thư được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng

Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin có màu hồng, được các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều Các tế bào sống, sau đó được cố định Định lượng các chất màu được tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 495-515 nm Từ đó tính được số lượng tế bào sống sót Phương pháp này hiện đang được áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National Cancer Institution - NCI)

Dòng tế bào thử nghiệm

- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan)

Chất chuẩn dương tính

Tiến hành thử hoạt tính

a/ Chuẩn bị tế bào

- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến

vi lượng 96 giếng đối với phương pháp SRB

- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử được ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển

- Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ-72 giờ (37oC, 5% CO2)cho phép chất thử phát huy tác dụng

b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [28]

- Tế bào sau khi được ủ từ 48-72 giờ được cố định bằng TCA ở 40C trong 1 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước và để khô tự nhiên

- Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodamin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

- Rửa sạch dung dịch sulphorhodamin B (SRB) dư bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần

- Hoàn trả sulphorhodamin B đã được nhuộm vào tế bào Lắc kỹ để hòa tan hoàn toàn

- Đọc mật độ quang ở bước sóng 492-515 nm Mật độ quang sẽ phản ánh

(%) theo công thức sau:

Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên được đưa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình  độ lệch tiêu chuẩn của phép thử được lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan như sau

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Tổng hợp hóa học

Trong khóa luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp

5-benzyliden-2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich của nó bao gồm các công

việc sau:

- Tổng hợp 2-thiohydantoin bằng phản ứng giữa glycin và

amonithiocyanat trong anhydrid acetic theo quy trình của Sandrine Gosling

O

- Tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin (I) bằng phản ứng ngưng tụ 2-thiohydantoin (BT) với benzaldehyd theo sơ đồ phản ứng sau:

O

+

N H NH O

S

NH NH O

HCHO, NHR1R2EtOH, håi lưu

HCHO, NHR1R2Isopropanol, håi lưu

NH NH O

S (I)

N

R2

R1

O N

N

(Ic)

(Id)

thúc phản ứng, hỗn hợp được rót vào 500 ml nước đá, để lạnh trong 4 giờ Chất rắn màu vàng xuất hiện được lọc, rửa bằng nước lạnh 3 lần, mỗi lần 150ml

Khối lượng sản phẩm: 59,27g Hiệu suất: 61,1%

Nhiệt độ nóng chảy: 172-1730C (tài liệu [27], t0C=173-1740C)

Rf = 0,31 (TLC, silicagel 60 F254, dung môi khai triển Hexan/EtOAc (7:3)) (phù hợp với tài liệu tham khảo [15])

H 1

4 5

O S

CTPT: C3H4N2OS, KLPT: 116,14

Tiến hành:

59,27g (0,375mol) chất A được phân tán trong 294ml HCl 10% Đun hồi lưu trong vòng 1 giờ Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển là CH2Cl2/MeOH (14:1) Kết thúc phản ứng cho than hoạt vào hỗn hợp phản ứng và lọc nóng Dịch lọc được để lạnh qua đêm, thu được kết tủa, lọc tủa, rửa nước đến hết acid (thử bằng giấy quỳ) Sấy khô tủa thu được Kết tinh lại trong nước

Khối lượng sản phẩm: 19,12g chất rắn màu cam Hiệu suất: 44,0%

Nhiệt độ nóng chảy: 229-2300C (tài liệu [22], t0C= 230-2320C; Catalogue Sigma Aldrich, t0C= 229-2310C)

Rf = 0,68 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2/MeOH (14:1))

5'

NH O

S

1 2 3 4 5

CTPT: C10H8N2OS, KLPT: 204,25

Dựa trên những tài liệu tham khảo, chúng tôi tổng hợp thiohydantoin (I) theo phương pháp dùng xúc tác natri acetat trong dung môi acid acetic theo qui trình tác giả Chazeau V., và cộng sự [37]

5-benzyliden-2-Tiến hành

Cho vào bình cầu phản ứng 4,64g (0,040mol) chất (BT), 4,24g (0,040mol) benzaldehyd, 15,09g (0,184mol) natri acetat khan và 88ml acid acetic băng Khuấy đều cho hỗn hợp tan hoàn toàn và đun nóng hỗn hợp, đun hồi lưu ở khoảng 130 -1350C Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2 : MeOH (28:1) Xác định thời gian phản ứng là 2 giờ

Để nguội, đổ hỗn hợp ra cốc có mỏ, ngâm lạnh 15 phút sau đó để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 30 phút Lọc hút kiệt, rửa tủa nhiều lần bằng nước cất cho đến khi hết acid acetic (thử bằng giấy quỳ) Rửa tiếp vài lần bằng cồn lạnh, hút kiệt, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1h để bốc hơi dung môi, sau đó sấy khô sản phẩm thô thu được Kết tinh lại sản phẩm thô bằng EtOH/DMF (17:1)

Khối lượng sản phẩm: 5,7g chất rắn kết tinh hình kim, màu vàng cam, có ánh

Nhiệt độ nóng chảy: 266,4-267,00C (phù hợp tài liệu [22])

Rf = 0,69 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (28:1))

5-benzyliden-2-Trong phần tổng quan, chúng tôi đã trình bày về phản ứng Mannich Căn

cứ trên các kết quả nghiên cứu đã công bố, chúng tôi chọn điều kiện tiến hành phản ứng Mannich của 5-benzyliden-2-thiohydantoin (I) là nhiệt độ 850C với

tỷ lệ số mol dẫn chất 2-thiohydantoin : formaldehyd : amin là 1:1:1 Chúng tôi tiến hành tổng hợp một số dẫn chất Mannich của chất (I) bằng cách cho chất (I) tác dụng với formaldehyd và 4 amin (morpholin, piperidin, N-methylpiperazin, pyrolidin)

Theo tài liệu tham khảo [1], [2], [3], chúng tôi tiến hành phản ứng tổng hợp các base Mannich trong điều kiện dung môi EtOH, kết quả thu được chất (Ia) và (Ib) có kết tinh sau khi phản ứng, hiệu suất khoảng 65%; các chất (Ic)

và (Id) không kết tinh, sau cất quay hiệu suất thấp, sản phẩm bị keo, dễ chảy lỏng Kết quả trên là do độ tan của các amin khác nhau, dẫn đến sự khác nhau giữa độ tan của các base Mannich tổng hợp được Vì vậy, dựa vào tài liệu [5] chúng tôi tiến hành khảo sát phản ứng ứng điều chế (Ic) và (Id) với dung môi isopropanol, thu được sản phẩm kết tinh với hiệu suất khoảng 60% Do đó, chúng tôi chia làm 2 quy trình riêng: sử dụng dung môi ethanol với phản ứng điều chế (Ia), (Ib) và sử dụng dung môi isopropanol cho phản ứng điều chế (Ic), (Id)

Quy trình sử dụng dung môi etanol tổng hợp (Ia) và (Ib):

Cho vào bình phản ứng 0,005mol chất (I), thêm 10ml EtOH, khuấy ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để (I) phân tán đều Cho vào cốc cỏ mỏ 0,005mol formaldehyd (0,44ml formol) và 0,005 mol amin, 6 giọt CH3COOH băng, lắc đều Phối hợp từ từ hỗn hợp ở cốc có mỏ vào bình phản ứng, tráng cốc bằng 5ml EtOH Đun cách thủy bình phản ứng, nâng dần nhiệt độ tới

800C Sau đó, tiếp tục khuấy và giữ nhiệt độ hồi lưu Theo dõi SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (28:1) với chất (Ia) và (Ib) trên bản mỏng silicagel

60 GF254, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Sau 4 giờ phản ứng đạt tối ưu Đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, để nguội đến nhiệt

độ phòng, làm lạnh trong 24 giờ Lọc hút, rửa tủa bằng EtOH lạnh thu được sản phẩm thô Kết tinh lại trong dung môi thích hợp, sấy khô ở 600C trong tủ sấy chân không trong 3h thu được sản phẩm

Quy trình sử dụng dung môi isopropanol tổng hợp (Ic) và (Id):

Cho vào bình cầu phản ứng 0,005mol amin, 5ml isopropanol, khuấy 5 phút ở 0-50C Thêm 0,005mol formaldehyd vào bình cầu đã chứa sẵn amin, khuấy 30 phút ở 0-50C thu được hỗn hợp (a) Cho 0,005mol chất (I) vào cốc

có mỏ, thêm 10ml isopropanol phân tán đều trong 15 phút ở nhiệt độ phòng thu được hỗn hợp (b) Sau đó, phối hợp từ từ hỗn hợp (b) vào bình cầu phản ứng chứa hỗn hợp (a), tráng cốc bằng 5ml isopropanol, khuấy hỗn hợp phản ứng 15 phút ở nhiệt độ phòng Đun cách thủy nâng dần nhiệt độ tới nhiệt độ 60-700C để hỗn hợp tan hoàn toàn Sau đó, tiếp tục khuấy và giữ nhiệt độ 60-

700C Theo dõi SKLM với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH (28:1) trên bản mỏng silicagel 60 GF254, phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Sau khi phản ứng đạt tối ưu, đổ hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, để ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ Lọc hút, rửa tủa bằng isopropanol thu được sản phẩm thô Kết tinh lại trong dung môi isopropanol, sấy khô ở 600C trong tủ sấy chân

Sau đây là các trường hợp cụ thể:

1) 5-benzyliden-3-morpholinomethyl-2-thiohydantoin (Ia) (sử dụng dung môi EtOH)

Công thức:

1' 6' 2'

5'

3' 4'

O

S

N

4'' 3'' 5''

2'' 6''

lưu trong vòng 4 giờ, kết tinh lại trong 8 ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,91g chất kết tinh vô định hình, màu vàng nhạt Hiệu suất 60,0%

6' 2'

5'

3'

4'

5 4

NH

1

N

3 2

O

S

N

1'' 6''

hồi lưu trong vòng 4 giờ, kết tinh lại trong 8 ml EtOH

Sản phẩm thu được là 0,90g chất rắn kết tinh có tinh thể hình kim, màu vàng tươi, có ánh kim Hiệu suất 59,7%

Công thức:

1' 6' 2'

5'

3' 4'

O

S

N

1'' 6'' 2''

5'' 3''

N

4''

CH3

CTPT: C16H20N4OS; KLPT: 316,42

1,02g (0,005mol) chất (I), 0,44ml formol (0,005mol formaldehyd), 0,50g (0,005mol) N-methylpiperazin, 20ml isopropanol Theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi khai triển CH2Cl2/MeOH (28:1) Đun hồi lưu trong vòng 2 giờ, kết tinh lại trong 8ml Isopropanol

Sản phẩm thu được là 1,15g chất kết tinh vô định hình, màu nâu đất Hiệu suất 72,7%

5'

3'

4'

5 4

NH

1

N

3 2

N

1'' 5''