Tối ưu hóa công thức bao chitosan tiểu phân nano glipizid poly(acid lactic co glycolic)

Các thế hệ tiểu phân nano polyme [8] Thế hệ 1 Nano cổ điển Thế hệ 2 Nano ổn định Thế hệ 3 Nano thông minh Cấu -Tăng độ ổn định -Lẩn tránh thực bào, tăng thời gian tuần hoàn -Hướng đí

GLYCOLIC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ AN HÒA

Mã sinh viên: 1101212

TỐI ƯU HÓA CÔNG THỨC BAO

CHITOSAN TIỂU PHÂN NANO

GLIPIZID – POLY(ACID

LACTIC-CO-GLYCOLIC) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

ThS Trần Ngọc Bảo

Nơi thực hiện:

1 Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

2 Bộ môn Công nghiệp Dược

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến ThS Trần Ngọc

Bảo, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện

khóa luận này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến, người thầy đã

định hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn các thầy cô, các anh chị cán bộ và kỹ thuật viên Viện Công

nghệ Dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Công nghiệp Dược, Bộ môn Bào chế đã nhiệt

tình chỉ bảo và tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm

Tôi xin phép cảm ơn Ban Giám hiệu Nhà trường, các thầy cô và cán bộ nhân

viên trong trường đã đào tạo và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa học tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến gia đình và bạn bè, những người

luôn ủng hộ và động viên tôi trong suốt quãng thời gian học tập và nghiên cứu vừa

qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Vũ Thị An Hòa

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về tiểu phân nano polyme 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Các thế hệ nano polyme 3

1.1.3 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme 4

1.1.4 Cải biến bề mặt tiểu phân nano polyme 5

1.1.5 Một số phương pháp đưa hệ tiểu phân nano vào dạng bào chế 5

1.2 Tổng quan về polyme poly(acid lactic-co-glycolic) (PLGA) 7

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 7

1.2.2 Nhược điểm của PLGA khi dùng làm polyme bào chế tiểu phân nano 8 1.3 Tổng quan về chitosan 9

1.3.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 9

1.3.2 Phương pháp bao chitosan lên tiểu phân nano PLGA 9

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bao chitosan tiểu phân nano PLGA……… 10

1.4 Tổng quan về glipizid 12

1.4.1 Cấu trúc hóa học 12

1.4.2 Tính chất lý hóa 12

1.4.3 Dược động học 12

1.4.4 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng 13

1.4.5 Chỉ định, liều dùng, cách dùng 13

1.4.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano và micro glipizid 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp bào chế 18

2.3.2 Phương pháp đánh giá 19

2.3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm và tối ưu hóa công thức 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ glipizid 23

3.2 Kết quả bào chế tiểu phân nano glipizid  PLGA bao chitosan 24

3.2.1 Khảo sát sơ bộ quá trình bao chitosan tiểu phân nano GLP  PLGA 24

3.2.2 Tối ưu hóa công thức bao chitosan tiểu phân nano GLP  PLGA 27

3.2.3 Đánh giá khả năng nạp thuốc và khả năng giải phóng in vitro của tiểu phân nano glipizid – PLGA bao chitosan tối ưu 32

3.3 Kết quả đông khô tiểu phân nano glipizid – PLGA bao chitosan 35

3.3.1 Khảo sát loại tá dược bảo vệ 35

3.3.2 Khảo sát tỷ lệ tá dược bảo vệ 36

3.3.3 Khảo sát môi trường phân tán 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography) HPMC Hydroxy propyl methyl cellulose

MPS Hệ thống thực bào đơn nhân

(Mononuclear Phagocyte System) NaCMC Natri carboxy methyl cellulose

PACA Poly(alkylcyanoacrylat)

PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)

PEG Polyethylen glycol

PGA Poly(acid glycolic)

PhEur Dược điển châu Âu (Pharmacopoeia Europaea) PLA Poly(acid lactic)

PLGA Poly(acid lactic-co-glycolic)

PNPs Tiểu phân nano polyme (Polymeric nanoparticles) PVA Polyvinyl alcol

RES Hệ thống lưới nội mô

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thế hệ tiểu phân nano polyme 2 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong quá trình thực nghiệm 16 Bảng 3.1 Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ GLP 23 Bảng 3.2 Ảnh hưởng của khối lượng CS phối hợp đến đặc tính tiểu phân

nano GLP

24

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ PVA đến đặc tính tiểu phân nano GLP 26 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thể tích pha nước đến đặc tính tiểu phân GLP 27 Bảng 3.5 Các biến độc lập và biến phụ thuộc 28 Bảng 3.6 Thiết kế thí nghiệm và đánh giá các đặc tính của tiểu phân nano

Bảng 3.11 KT và phân bố KTTP của các mẫu trước và sau đông khô với

các nồng độ tá dược bảo vệ saccarose khác nhau

36

tiểu phân nano

34

Hình 3.6 KT và phân bố KTTP của các mẫu sau đông khô trong các

môi trường phân tán khác nhau

37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Năm 2014, theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 422 triệu người trưởng thành bị đái tháo đường (ĐTĐ), trong đó chủ yếu là ĐTĐ typ 2 (ĐTĐ không phụ thuộc insulin) [59] Tác động của ĐTĐ làm gia tăng tỷ

lệ tử vong, giảm chất lượng cuộc sống, đồng thời bệnh ĐTĐ và biến chứng ĐTĐ tạo ra gánh nặng kinh tế cho bản thân người bệnh, gia đình và xã hội Việc gia tăng

tỷ lệ ĐTĐ và các hậu quả của nó đặt ra yêu cầu tiếp tục nghiên cứu các dạng bào chế mới với mục đích cải thiện hiệu quả điều trị và nâng cao chất lượng cuộc sống của bệnh nhân

Glipizid (GLP) là thuốc hạ đường huyết sulfonylure thế hệ II, sử dụng trong điều trị ĐTĐ typ 2 Theo phân loại sinh dược học, glipizid thuộc nhóm II – khó tan nhưng dễ hấp thu Thuốc có thời gian bán thải ngắn (3,4  0,7 giờ), do đó phải sử dụng 2 – 3 lần mỗi ngày Các công thức giải phóng kéo dài giúp giải phóng dược chất từ từ và duy trì tác dụng trong một khoảng thời gian dài, từ đó cải thiện hiệu quả điều trị, sinh khả dụng và tuân thủ của bệnh nhân

Trên thực tế đã có nhiều dạng bào chế của glipizid được nghiên cứu như viên giải phóng kéo dài, vi nang, vi cầu, nano lipid rắn,… với các mục đích khác nhau Bào chế glipizid dưới dạng nano sử dụng polyme poly(acid lactic-co-glycolic) (PLGA) cải biến bề mặt bằng chitosan (CS) có ưu điểm kéo dài thời gian giải phóng dược chất và tăng thời gian tuần hoàn trong máu, từ đó kéo dài thời gian duy trì tác dụng của GLP, giảm số lần đưa liều và kiểm soát đường huyết của bệnh nhân tốt hơn

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài ―Tối ưu hóa công thức bao chitosan tiểu phân nano glipizid – Poly(acid lactic-co-glycolic)‖ với các mục

1.1.2 Các thế hệ nano polyme

Bảng 1.1 Các thế hệ tiểu phân nano polyme [8]

Thế hệ 1 Nano cổ điển

Thế hệ 2 Nano ổn định

Thế hệ 3 Nano thông minh Cấu

-Tăng độ ổn định -Lẩn tránh thực bào, tăng thời gian tuần hoàn

-Hướng đích chủ động

Sử dụng các tín hiệu sinh học, vật lý, hóa học (pH, O2, enzym…) hoặc nhân tạo (bức xạ hồng ngoại gần) trong môi trường đích để kích hoạt giải phóng DC

Chưa rõ

1.1.3 Phương pháp bào chế tiểu phân nano polyme

Có hai nhóm phương pháp chính được sử dụng để bào chế tiểu phân nano polyme: polyme hóa từ monome và sử dụng polyme có sẵn [45] Các polyme tạo thành từ phản ứng polyme hóa thường ít phân hủy sinh học, monome tồn dư và chất diện hoạt dùng với lượng lớn có thể gây độc và đòi hỏi quá trình tinh chế phức tạp [57] Do đó, các nghiên cứu hiện nay hướng tới sử dụng các polyme tự nhiên hoặc tổng hợp có sẵn, đặc biệt là các polyme phân hủy sinh học Các phương pháp chủ yếu để bào chế tiểu phân nano từ các polyme này gồm [5], [57]:

- Phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương

Nguyên tắc: tạo ra nhũ tương nano (thường là dầu/nước), sau đó bốc hơi dung môi hữu cơ tạo tiểu phân nano (thường là siêu vi cầu)

Cách làm như sau: hòa tan chất mang (PLA, PLGA, Eudragit…) và dược chất vào dung môi hữu cơ (dicloromethan, cyclohexan…) rồi nhũ hóa vào pha nước chứa chất nhũ hóa (PVA, Tween, poloxame…) Tiến hành đồng nhất hóa rồi bốc hơi dung môi hữu cơ, lọc và rửa tiểu phân nano Các yếu tố ảnh hưởng đến KTTP là cường độ và thời gian đồng nhất hóa, loại và lượng chất nhũ hóa, polyme, dược chất (DC) và cách bốc hơi dung môi

- Phương pháp thay đổi dung môi/kết lắng bề mặt

Polyme và DC được hòa tan trong một dung môi đồng tan với nước (aceton), sau đó pha dung môi hữu cơ được chia thành từng giọt và phối hợp với pha ngoại chứa chất ổn định Polyme sẽ kết lắng trên bề mặt phân cách pha do sự khuếch tán nhanh của dung môi Phương pháp này thường áp dụng cho DC thân dầu vì hệ nano tạo ra có hiệu suất bao gói DC thân nước thấp

- Phương pháp nhũ hóa/khuếch tán dung môi

Pha dung môi hữu cơ (dung dịch DC và polyme trong dung môi hữu cơ tan một phần trong nước (ethyl acetat, alcol benzylic) bão hòa nước) được nhũ hóa vào pha nước (dung dịch chất ổn định trong nước bão hòa dung môi hữu cơ) Sau đó nhũ tương tạo thành được phối hợp với 1 thể tích nước lớn, dung môi sẽ khuếch tán từ giọt pha dầu vào pha nước, hình thành các tiểu phân nano polyme

- Phương pháp hóa muối

Dung dịch polyme và DC trong dung môi đồng tan với nước (aceton) được nhũ hóa vào pha ngoại chứa nồng độ cao chất hóa muối (MgCl2, CaCl2, Mg acetat) Hiệu ứng hóa muối giúp ổn định giọt pha dầu khi tác động lực cơ học Nhũ tương được phối hợp với một lượng nước đủ lớn, khi đó nồng độ chất hóa muối giảm, dung môi khuếch tán vào môi trường và hình thành tiểu phân nano

1.1.4 Cải biến bề mặt tiểu phân nano polyme

Sau khi tiêm tĩnh mạch, hệ thống thực bào đơn nhân (MPS) trong tuần hoàn coi tiểu phân như một vật thể lạ và tiến hành thanh thải Để lưu giữ tiểu phân trong tuần hoàn lâu hơn, giúp tăng khả năng phân bố tiểu phân đến đích tác dụng, cần phải có các giải pháp để tránh thực bào như [5]:

+ ―Ngụy trang‖ tiểu phân nhằm tránh sự nhận biết của tế bào lympho: bao bên ngoài với các polyme thân nước và tương thích sinh học như PEG, poloxame và poloxamin, chitosan…[27], [44] giúp bảo vệ tiểu phân nano khỏi sự bắt giữ của MPS và tăng độ ổn định

+ Biến tính bề mặt tiểu phân để ngăn cản quá trình thực bào: tiểu phân bao polyethylen oxyd tạo ra cấu trúc không gian cồng kềnh, ngăn cản sự định vị protein opsonin hóa trên bề mặt, làm giảm thực bào Tiểu phân bao chất diện hoạt cũng hạn chế tỷ lệ thực bào

+ Bao tiểu phân bằng tác nhân phân giải màng lysosom

Ngoài ra, để tăng nồng độ DC tại đích tác dụng, có thể gắn lên bề mặt tiểu phân các phân tử hướng đích Biến đổi bề mặt tiểu phân cũng ảnh hưởng đến sự giải phóng dược chất

1.1.5 Một số phương pháp đưa hệ tiểu phân nano vào dạng bào chế

1.1.5.1 Đông khô

Khái niệm: Đông khô (lyophilization) là quá trình làm khô dung dịch nước đã

được đông lạnh ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp từ pha rắn không qua pha lỏng dưới áp suất giảm (thường dưới 100 mmHg), thu được sản phẩm khô [4]

Có ba nhóm yếu tố chính ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm: i) công thức, ii) quy trình đông khô và iii) điều kiện bảo quản Phần tổng quan này chỉ trình bày ảnh hưởng các tá dược bảo vệ

Trong quá trình đông lạnh, pha lỏng trở nên đặc hơn khi nước đóng băng Trong trường hợp của hỗn dịch nano, pha lỏng đậm đặc chứa hỗn hợp gồm các tiểu phân nano và các thành phần khác trong công thức như chất diện hoạt dư, đệm và dược chất tự do Hệ tiểu phân nồng độ cao có thể gây ra sự kết tụ và hợp nhất bền vững các tiểu phân nano Mặt khác, sự hình thành các tinh thể băng gây giãn nở thể tích

và tạo áp lực phá vỡ cấu trúc tiểu phân Vì vậy, phải thêm vào các tá dược đặc biệt

để ổn định hệ nano

- Cryoprotectant: Các tá dược bảo vệ cryo phổ biến nhất trong đông khô nano là

các loại đường: trehalose, saccarose, glucose và manitol Chúng chuyển thành trạng thái thủy tinh vô định hình tại nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Tg’) xác định [32], cấu trúc thủy tinh hóa có độ nhớt rất cao và tính di động thấp sẽ ngăn cản sự kết tụ các tiểu phân và bảo vệ chúng khỏi bị hư hại bởi các tinh thể băng Quá trình đông lạnh cần được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ Tg’ của tá dược bảo vệ [53] Ngoài ra, các phân tử đường cô lập riêng rẽ các tiểu phân nano trong pha lỏng, do

đó ngăn cản sự kết tụ tiểu phân [9] Để đảm bảo độ ổn định tốt nhất của tiểu phân nano, cần khảo sát lựa chọn loại tá dược bảo vệ cũng như nồng độ tối ưu của chúng

- Lyoprotectant: Quá trình loại bỏ phần nước không đóng băng hấp phụ trong

khối bột có thể ảnh hưởng đến độ bền của tiểu phân nano, do đó trong các công thức đông khô có thể thêm tá dược lyoprotectant (như các đường đơn/đôi/đa, polyalcol ) Do có nhiều nhóm hydroxy trong phân tử, các tá dược bảo vệ lyo hình thành liên kết hydro với các nhóm phân cực trên bề mặt tiểu phân nano, từ đó làm giảm tương tác giữa nước và tiểu phân rồi sau đó thay thế nước và giúp giữ nguyên cấu trúc ban đầu của tiểu phân nano trong quá trình làm khô [18]

Trong một số công thức nano, có thể đông khô mà không cần thêm tá dược bảo

vệ cryo và lyo khi sử dụng PVA làm chất nhũ hóa với nồng độ 2,5 đến 5% [7], [40], [42] Trong trường hợp này, PVA sẽ đóng vai trò là tá dược ổn định đông khô PVA

gắn khá chắc trên bề mặt tiểu phân nano và tạo lớp màng polyme, qua đó có thể ổn định cấu trúc nano trong quá trình đông lạnh Mặt khác, PVA tự do không hấp phụ trên bề mặt tiểu phân sẽ tạo thành dạng thủy tinh hóa bao quanh các tiểu phân và bảo vệ chúng trong quá trình đông lạnh

1.1.5.2 Phun sấy

Nguyên tắc: dưới áp lực cao của vòi phun, dung dịch sẽ chuyển thành dạng khí dung, khi tiếp xúc trực tiếp với luồng không khí nóng thổi cùng chiều, dung môi từ các giọt khí dung sẽ bay hơi rất nhanh do có diện tích tiếp xúc lớn và để lại bột thuốc khô

So với đông khô, phun sấy có ưu điểm như thao tác nhanh, chi phí thấp hơn, phù hợp với quy mô công nghiệp, bột phun sấy có thể dùng dưới dạng hỗn dịch hoặc đưa vào viên nén, viên nang

Nhược điểm của phun sấy là cần gia nhiệt, có thể tác động lên tính toàn vẹn của tiểu phân nano polyme và dược chất, hiệu suất thu hồi sản phẩm thấp và khó đảm bảo vô khuẩn cho bột phun sấy

1.2 Tổng quan về polyme poly(acid lactic-co-glycolic) (PLGA)

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Cấu trúc hóa học của PLGA:

HO

OO

O

OH

PLGA là một trong những polyme phân hủy sinh học được sử dụng thành công nhất để bào chế PNPs Sản phẩm thủy phân của nó là acid lactic và acid glycolic, cả hai monome này dễ dàng chuyển hóa thông qua chu trình Krebs, do đó các hệ đưa thuốc sử dụng PLGA có độc tính hệ thống tối thiểu [31] PLGA đã được FDA và EMA cho phép sử dụng trong nhiều dạng bào chế dược phẩm PLGA thương mại có nhiều loại khác nhau về trọng lượng phân tử và tỷ lệ thành phần các monome Acid lactic thân dầu hơn acid glycolic, do đó các PLGA giàu thành phần acid lactic kém

thân nước hơn và phân hủy chậm hơn Ngoài ra, sự phân hủy sinh học của PLGA còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố như trạng thái kết tinh, hình dạng bề mặt và kích thước, pH, khối lượng phân tử trung bình, hàm lượng dược chất, loại dược chất [36]

Một số loại PLGA hay được sử dụng trong bào chế: PLGA 50:50, PLGA 65:35, PLGA 75:25 và PLGA 85:25 NC sử dụng PLGA 50:50 là loại có tỷ lệ 2 monome acid lactic:acid glycolic = 50:50

1.2.2 Nhược điểm của PLGA khi dùng làm polyme bào chế tiểu phân nano

- Dễ bị nhận diện và tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch: Các tiểu phân nano PLGA

có bề mặt sơ nước, do đó bị hệ miễn dịch nhận định là chất ngoại lai, hệ thống lưới nội mô (RES) sẽ đào thải chúng ra khỏi máu để đưa đến gan và lách Sau khi được tiêm vào cơ thể, các tiểu phân nano PLGA sẽ gắn với các protein opsonin tồn tại trong huyết tương và các tiểu phân opsonin hóa dễ dàng bị bắt giữ bởi đại thực bào [10] Quá trình này là một trong những rào cản sinh học lớn nhất đối với hệ tiểu phân nano [31]

- Các tiểu phân nano PLGA có động học giải phóng gồm 2 pha, trong đó pha I thường là pha giải phóng ồ ạt (burst release), pha II là pha giải phóng chậm [19] Sự giải phóng dược chất ồ ạt ở giai đoạn đầu có thể làm cho dược chất không đến hết được mô hoặc tế bào đích, dẫn đến giảm hiệu quả điều trị lâu dài [19], [24] Mặt khác, với dược chất có tác dụng mạnh như GLP, sự giải phóng ồ ạt có thể tiềm ẩn nguy cơ hạ đường huyết nghiêm trọng cho bệnh nhân

Hai nhược điểm trên có thể khắc phục bằng cách cải biến bề mặt tiểu phân

- Giá thành sản phẩm cuối cùng cao: PLGA dùng trong dược phẩm có giá khá đắt, mặt khác khả năng nạp thuốc thường thấp (khoảng dưới 20%) mặc dù hiệu suất mang thuốc thân dầu cao Do đó việc nâng cấp quy mô sản xuất để đưa ra sản phẩm cuối cùng cho bệnh nhân còn gặp nhiều khó khăn, cần có sự nghiên cứu và tính toán chi phí kỹ lưỡng

1.3 Tổng quan về chitosan

1.3.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

Chitosan (CS) (poly 1,4--D-glucosamin) là một polysaccarid tự nhiên, gồm nhiều polyme khác nhau về khối lượng phân tử (50 – 2000 kDa) và mức độ acetyl hóa (40 – 98%) CS được sản xuất bằng cách N-deacetyl hóa chitin lấy từ vỏ của động vật giáp xác như tôm, cua…

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitin và chitosan

CS có pKa khoảng 6,2 – 7, không tan trong các dung dịch pH trung tính và kiềm Trong môi trường acid, nhóm amin của CS nhận proton, làm cho phân tử tích điện dương với mật độ điện tích cao Các muối của CS đều tan trong nước, độ tan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa và pH của dung dịch Sự có mặt của các muối trong dung dịch cũng ảnh hưởng đến độ tan của CS Lực ion càng lớn, độ tan càng giảm do các ion cạnh tranh độ tan dẫn đến sự kết tủa CS trong dung dịch [48]

CS là một polyme phân hủy sinh học và tương thích sinh học, dễ dàng biến đổi hóa học để tạo thành các dẫn chất khác nhau Ngoài ra, nó còn có nhiều tác dụng sinh học như ức chế vi khuẩn và vi nấm, giảm lipid máu, kháng ung thư và kích thích miễn dịch [60]

1.3.2 Phương pháp bao chitosan lên tiểu phân nano PLGA

- Phương pháp hấp phụ vật lý: Trong môi trường có pH thích hợp, nhóm NH2của CS và COOH của PLGA điện ly thành các ion trái dấu –NH3+

và –COO Lực tương tác tĩnh điện giữa chúng làm cho CS được hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano PLGA Màng bao CS tạo thành tương đối ổn định, phụ thuộc vào độ bền của tương tác tĩnh điện [16] CS có thể được phối hợp ngay trong quá trình bào chế tiểu phân

nano PLGA hoặc được hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano PLGA đã hình thành từ trước

- Phương pháp liên kết hóa học: Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo liên kết

carbodiimid giữa nhóm –NH2 của CS và nhóm –COOH của PLGA Liên kết hóa học giữa CS và PLGA bền vững hơn lực tương tác tĩnh điện, tuy nhiên quy trình phản ứng rất phức tạp và thời gian phản ứng kéo dài có thể ảnh hưởng đến cấu trúc

và hiệu suất mang thuốc của tiểu phân nano PLGA [58]

Sau khi bao với CS, các tiểu phân nano PLGA có kích thước tăng và thế Zeta chuyển từ âm sang dương [37], [38]

1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bao chitosan tiểu phân nano PLGA

1.3.3.1 Ảnh hưởng của pH và lực ion

Nhiều NC về ảnh hưởng của pH đến sự hấp phụ đa lớp cho thấy pH ảnh hưởng đến độ dày của lớp Với màng film đa lớp chứa CS và NaCMC, khi tăng pH của NaCMC từ 4 đến 5,5 thì độ dày của màng giảm [43] Điều này cũng xảy ra trong trường hợp của CS và heparin [11] Trong môi trường acid, nhóm amin của CS nhận proton để chuyển thành –NH3+, pH càng giảm càng có nhiều nhóm –NH2chuyển thành –NH3+, khi đó lực đẩy tĩnh điện lớn làm cho phân tử CS tồn tại ở dạng chuỗi mở rộng, ngược lại pH tăng, lực đẩy nhỏ, phân tử có xu hướng cuộn lại thành dạng cầu [22], [48] Sự khác nhau về cấu trúc không gian của CS trong các môi trường pH khác nhau ảnh hưởng đến kích thước tiểu phân (KTTP) sau khi bao CS Khi tăng pH, thế zeta của dung dịch CS giảm do nồng độ ion H+

giảm, hạn chế quá trình proton hóa nhóm –NH2 của CS dẫn đến giảm mật độ điện tích dương trên phân

tử CS [11], [14]

Sự có mặt của các ion cũng ảnh hưởng đến KTTP và thế Zeta của dung dịch

CS Khi tăng nồng độ ion, KTTP và thế Zeta giảm, có thể do tương tác của nhóm –NH3+ với các anion Do đó khi sử dụng đệm để điều chỉnh pH, các ion trong đệm

có thể ảnh hưởng đến KTTP và thế Zeta của tiểu phân nano

Như vậy pH là yếu tố có ảnh hưởng lớn đến sự hấp phụ CS lên tiểu phân nano PLGA, tuy nhiên để đánh giá chính xác ảnh hưởng của pH, cần lựa chọn loại và nồng độ đệm điều chỉnh pH, loại bỏ các ion dư trước khi đo thế Zeta, kiểm soát sự thay đổi pH theo thời gian,… vì vậy trong khuôn khổ khóa luận này sẽ không khảo sát ảnh hưởng của pH

1.3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ CS

Các polysaccarid trong đó có CS có xu hướng liên hợp cao do sự có mặt nhiều nhóm hydroxyl và amino trong phân tử dễ hình thành liên kết hydro Sự liên hợp xảy ra chủ yếu trong dung dịch nồng độ cao và biến mất khi dung dịch được pha loãng [13] Nồng độ dung dịch chất đa điện phân có thể ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ đa lớp và độ dày của các lớp Khi xây dựng các hệ đa lớp, nhiều NC sử dụng các nồng độ polysaccarid từ 0,1  0,5% [14], [25], [43], [46] Trong NC của Yang và cộng sự (2009), tiểu phân nano PLGA chứa palitaxel cải biến bề mặt bằng

CS được bào chế bằng cách phân tán tiểu phân nano paclitaxel – PLGA trong các dung dịch chitosan nồng độ 0,3%, 0,5% và 0,7% (kl/tt) nhờ siêu âm và khuấy từ qua đêm Kết quả, KTTP tăng khi tăng nồng độ dung dịch CS [62]

1.3.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/PLGA

Nhiều NC về bào chế tiểu phân nano PLGA cải biến bề mặt bằng CS đã đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ CS/PLGA tới đặc tính tiểu phân tạo thành Wang và cộng

sự (2013) đã bao thành công CS lên bề mặt tiểu phân nano PLGA theo 2 phương pháp vật lý và hóa học, chứng minh bởi thế Zeta, phổ FT-IR và phổ nhiễu xạ tia X Khi tăng tỷ lệ CS/PLGA, KTTP và thế Zeta tăng, tuy nhiên đến một giá trị tới hạn, tiếp tục tăng tỷ lệ CS/PLGA thì thế Zeta không thay đổi nhiều, do đó lượng CS có thể bao lên bề mặt PLGA có một giá trị bão hòa Tiểu phân nano PLGA/CS có hiệu suất mang thuốc thấp hơn tiểu phân PLGA, tỷ lệ CS/PLGA càng tăng, EE càng giảm [58] Trong NC của Hồ Hoàng Nhân và cộng sự (2015), khi tăng tỷ lệ CS/PLGA, KTTP, PDI và thế Zeta đều có xu hướng tăng, các mẫu bao CS đều có giá trị EE thấp hơn các mẫu chưa bao, tuy nhiên vẫn ở mức trên 70% [28]

1.4 Tổng quan về glipizid

1.4.1 Cấu trúc hóa học

GLP là hợp chất sulfonylure được tổng hợp ở Ý vào năm 1970 Ngoài khung cấu trúc cơ bản của sulfonylure, GLP có một nhóm cyclohexyl gắn với gốc ure và một nhóm cồng kềnh không phân cực gắn vào vị trí para của vòng thơm Nhóm không phân cực trong phân tử làm tăng hoạt tính hạ đường huyết gấp 100 lần so với các sulfonylure thế hệ I (tolbutamid, clopropamid, tolazamid, acetohexamid) [34]

S N

O O O

- Công thức phân tử: C21H27N5O4S

- Phân tử khối: 445,54 g/mol

- Tên khoa học: 1-cyclohexyl-3-[[p-[2-(5-methylpyrazincarboxamido)ethyl] phenyl]sulfonyl]ure [56]

1.4.2 Tính chất lý hóa

- Lý tính: bột kết tinh trắng hoặc gần trắng; thực tế không tan trong nước (độ tan

trong nước: 37,2 μg/mL), rất khó tan trong dicloromethan, aceton, methanol (1,9 mg/mL),…, tan tốt trong dung dịch kiềm và dimethyl formamid, độ tan thay đổi theo pH [12], [23]

- Hóa tính: có tính acid yếu, pKa = 5,9 [23]

1.4.3 Dược động học

GLP hấp thu nhanh và hầu như hoàn toàn từ đường tiêu hóa, đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 1  3 giờ sử dụng GLP liên kết cao với protein huyết tương (khoảng 98 – 99% sau khi dùng 1 giờ kể cả đường uống lẫn tiêm tĩnh mạch), không tích lũy trong huyết tương khi dùng liều nhắc lại Thể tích phân bố là 11 lít sau khi tiêm tĩnh mạch GLP chuyển hóa chủ yếu ở gan và thải trừ qua nước tiểu (khoảng

<10% dưới dạng không đổi) Thời gian bán thải (t1/2) ngắn, khoảng 2  4 giờ [1]

1.4.4 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

GLP là thuốc chống đái tháo đường thế hệ 2 loại sulfonylure dùng đường uống Tính theo khối lượng, GLP là một trong những thuốc chống đái tháo đường mạnh nhất, có thời gian bán thải ngắn so với các sulfonylure khác nên giảm nguy cơ gây hạ đường huyết trầm trọng Thuốc giảm nồng độ glucose huyết ở người bị và không bị đái tháo đường Thuốc không có tác dụng khi cơ thể không còn khả năng tiết insulin [1]

- Làm giảm lưu lượng glucose từ gan ra huyết thanh

- Ức chế nhẹ tác dụng của glucagon nên cũng gây hạ glucose máu

ăn theo lối thông thường Sử dụng quá 15 – 20 mg/ngày phải chia thành nhiều liều

nhỏ trước các bữa ăn Liều tối đa khuyến cáo là 15 mg/ngày [1]

- Cách dùng: GLP thường được uống một lần vào buổi sáng khoảng 30 phút trước bữa điểm tâm để giảm tối đa nồng độ glucose máu sau khi ăn

Như vậy, bào chế dạng nano polyme GLP thuận lợi hơn các thuốc chống ĐTĐ khác vì DC có liều dùng thấp, hiệu lực cao phù hợp với đặc điểm lượng DC nạp thấp của PNPs Mặt khác, do GLP chuyển hóa nhanh ở gan, thời gian bán thải ngắn, dạng nano polyme GLP sẽ giúp bảo vệ dược chất khỏi quá trình chuyển hóa thải trừ, tăng thời gian tuần hoàn trong cơ thể, tăng khả năng GLP đến được đích tác dụng

(tế bào beta đảo tụy), từ đó giảm số lần đưa liều trong ngày và giúp kiểm soát đường huyết trong thời gian dài

1.4.6 Một số nghiên cứu bào chế hệ tiểu phân nano và micro glipizid

1.4.6.1 Các nghiên cứu trong nước

- Đỗ Thanh Hà (2012) đã NC bào chế vi cầu GLP sử dụng Eudragit L100, S100

và E100 bằng phương pháp bay hơi dung môi từ hỗn nhũ tương với mục đích cải thiện độ tan Từ đó NC đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ DC:polyme, nồng độ chất nhũ hóa và tốc độ khuấy đến các đặc tính của vi cầu: hình dạng, phân bố KTTP, hiệu suất tạo vi cầu, hiệu suất vi cầu hóa DC và % giải phóng DC theo thời gian Kết quả, vi cầu Eudragit E100 và L100 có khả năng cải thiện độ tan của GLP [3]

- Nguyễn Thùy Trang (2013) đã bào chế thành công vi nang GLP kích thước khoảng 710 – 800 μm và có khả năng giải phóng kéo dài 7 tiếng bằng phương pháp đông tụ sử dụng natri alginat NC cũng đánh giá ảnh hưởng của các thông số công thức (tỷ lệ alginat – dược chất, nồng độ alginat, nồng độ CaCl2, loại dung môi ngâm trương nở alginat) và các thông số quy trình (thời gian ủ, nhiệt độ, tốc độ nhỏ giọt, tốc độ khuấy dung dịch CaCl2 trong quá trình nhỏ giọt) đến các đặc tính của vi nang: hình dạng, kích thước, hiệu suất bào chế, hiệu suất vi nang hóa, hàm lượng

DC trong vi nang và khả năng giải phóng DC [6]

Các dạng bào chế GLP kích thước nhỏ cỡ micro sử dụng chất mang polyme có diện tích tiếp xúc với môi trường hòa tan lớn, giúp tăng độ tan, cải thiện sinh khả dụng của GLP, đồng thời kiểm soát giải phóng trong thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho BN Tuy nhiên chưa có NC công bố trong nước về hệ tiểu phân nano GLP

1.4.6.2 Các nghiên cứu trên thế giới

- Lokhande và cộng sự (2013) đã bào chế tiểu phân nano GLP sử dụng polycaprolacton (PCL) bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương và làm giảm KTTP bằng đồng nhất hóa áp suất cao NC đã đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ DC:polyme, nồng độ chất diện hoạt đến KTTP và hiệu suất mang thuốc Tiểu phân nano GLP  PCL kéo dài giải phóng GLP đến 7 ngày và tuân theo động học giải

phóng bậc một Hệ nano bào chế được có khả năng kiểm soát ĐTĐ typ II trong khoảng thời gian một tuần, do đó làm giảm số lần đưa liều và tăng tuân thủ cho bệnh nhân [35]

- Naha và cộng sự (2013) đã tiến hành bào chế tiểu phân nano GLP sử dụng PLGA và Eudragit RS100 kết hợp với PEG, HPMC và Tween 20 bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương Ảnh hưởng của tỷ lệ thể tích pha nước và pha dung môi hữu cơ, tỷ lệ PLGA:Eudragit đến KTTP, thế Zeta và EE đã được đánh giá Hai dạng tiểu phân nano PLGA và Eudragit RS 100 đều có kích thước khoảng

200 nm và không thể hiện độc tính nghiêm trọng trên tế bào SW 480 ở nồng độ từ 12,5 – 500 μg/mL, cho thấy tính tương thích sinh học của chúng [41]

- Jain và Saraf (2009) tiến hành NC bào chế tiểu phân nano GLP bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương sử dụng PLGA làm chất mang kéo dài giải phóng NC đánh giá ảnh hưởng của nhiều thông số đầu vào như loại dung môi, tốc

độ khuấy (300  3000 vòng/phút) và tỷ lệ dược chất:polyme (GLP:PLGA) (1:4 đến 2:1) đến các thông số đầu ra: KTTP, Zeta và hiệu suất mang thuốc EE Từ đó chọn

ra tỷ lệ GLP:PLGA tối ưu là 1:2, dung môi là DCM Mô hình giải phóng thuốc gồm hai pha: pha giải phóng nhanh (khoảng 40%) trong 24 giờ đầu và pha giải phóng chậm (đến 90%) trong 48 giờ tiếp theo Dữ liệu giải phóng phù hợp với nhiều mô hình động học và cho thấy hệ nano tạo thành có khả năng kiểm soát giải phóng dược chất [30]

- Tran B và cộng sự (2015) đã NC bào chế tiểu phân nano GLP  PLGA bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương NC khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất nhũ hóa (PVA, Tween 80) và thể tích pha ngoại đến các đặc tính của tiểu phân nano như KT và phân bố KTTP, thế Zeta và hiệu suất mang thuốc Tiểu phân nano GLP tối ưu có KT 164,3  13,0 nm, phân bố KTTP tương đối đồng nhất (PDI 0,269

 0,03), hiệu suất mang thuốc cao 92,21 ± 5.8% và ổn định vật lý sau 7 ngày (bảo quản ở nhiệt độ 30  2C, độ ẩm 75  5%) Do đó công thức tối ưu này được sử dụng để bào chế tiểu phân nano GLP  PLGA cho quá trình bao CS [55]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

4 Dicloromethan Trung Quốc Tinh khiết hóa học

5 Methanol Trung Quốc Tinh khiết hóa học

6 Methanol Merk (Đức) Tinh khiết phân tích

7 Acetonitril Merk (Đức) Tinh khiết phân tích

9 Polyvinyl alcol (PVA) 205 Singapore USP 38

13 D(+) trehalose dihydrat Mỹ USP 38

14 Acid acetic Trung Quốc Tinh khiết hóa học

15 Kali dihydrophosphat Merk (Đức) Tinh khiết phân tích

16 Một số nguyên liệu khác

2.1.2 Thiết bị

- Máy đo thế Zeta và xác định phân bố KTTP Zetasizer NanoZS90 Malvern (Anh)

- Máy khuấy từ WiseStir (Hàn Quốc)

- Máy ly tâm lạnh HERMLE, Labortechnik GmbH – Z326k (Đức)

- Máy siêu âm VibraCell VC 505, Sonics & Materials Inc (Mỹ), công suất tối đa 500W, tần số 20 kHz, đầu dò hợp kim titan đường kính 13 mm

- Hệ thống HPLC Agilent 1260 (Mỹ)

- Máy đo pH FiveEasy FE20, Mettler Toledo (Thụy Sĩ)

- Máy lắc Vortex Mixer VM-300 (Đức)

- Máy lắc điều nhiệt Shaker Incubator, LSI-100B (Nhật Bản)

- Máy sấy chân không LVO-2050, Daihan Labtech Co Ltd (Hàn Quốc)

- Máy siêu âm WiseClean, Daihan Labtech Co Ltd (Hàn Quốc)

- Cân phân tích Sartorius (Đức)

- Cân kỹ thuật, các dụng cụ thủy tinh (cốc có mỏ, bình định mức, lọ thủy tinh…)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố về công thức như tỷ lệ CS/PLGA, thể tích, nồng độ PVA tới đặc tính tiểu phân nano GLP – PLGA/CS

- Sử dụng thuật toán để thiết kế thí nghiệm, phân tích sự ảnh hưởng của các thông số công thức, lựa chọn thông số tối ưu

- Đánh giá một số đặc tính của hệ tiểu phân nano GLP – PLGA/CS bào chế được

từ công thức tối ưu

- Bước đầu đông khô hệ tiểu phân nano GLP – PLGA/CS và đánh giá một số đặc tính của bột đông khô

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano GLP – PLGA

Qua tham khảo tài liệu [55], tiểu phân nano GLP – PLGA được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi từ nhũ tương D/N

- Chuẩn bị pha dầu: hòa tan 100 mg GLP và 200 mg PLGA (tỷ lệ GLP:PLGA là 1:2), dung môi DCM:MeOH 50:1 (tt/tt) trong bình định mức 50 mL

- Chuẩn bị pha nước: dung dịch Tween 80 nồng độ 1,5% trong nước cất

- Lượng pha dầu: 5 mL, lượng pha nước: 55 mL

- Giai đoạn nhũ hóa: Nhũ tương được tạo thành bằng cách thêm từng giọt pha dầu vào pha nước, đồng nhất hóa bằng đầu siêu âm (tần số 20 kHz, công suất 20% (100W)) và khuấy từ với tốc độ 1200 vòng/phút, duy trì nhiệt độ 5 – 10C trong quá trình bằng nước đá

- Bốc hơi dung môi: khuấy từ nhũ tương tạo thành với tốc độ 1200 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (25C) trong 3 giờ để loại DCM và MeOH

- Tinh chế sản phẩm: Ly tâm tốc độ 2000 vòng/phút trong 5 phút để loại các tiểu phân kích thước trên nano, loại bỏ cắn ly tâm thu hết phần dịch trong phía trên

2.3.1.2 Phương pháp bao CS tiểu phân nano GLP – PLGA

- Chuẩn bị dung dịch CS 0,2%: Hòa tan 100 mg CS trong dung dịch acid acetic 1% (tt/tt), siêu âm cho tan hết, bổ sung vừa đủ 50 mL

- Chuẩn bị dung dịch PVA 10%: Hòa tan 10 g PVA trong 100 mL nước cất được làm nóng đến khoảng 70C Sau đó để nguội dung dịch thu được về nhiệt độ phòng

- Hấp phụ CS lên tiểu phân nano:

 Các mẫu không chứa PVA: Khuấy từ 20 mL hỗn dịch nano GLP – PLGA (chứa khoảng 8 mg PLGA) với tốc độ 600 vòng/phút trong 30 phút để các tiểu phân phân tán đều Phối hợp dung dịch CS với thể tích khác nhau vào 20 mL hỗn dịch nano trên Bổ sung nước cất đến các thể tích khác nhau (30 mL đến 100 mL) Sau đó tiếp tục khuấy từ hỗn hợp với tốc độ 600 vòng/phút trong 2 giờ

 Các mẫu chứa PVA: Phối hợp dung dịch PVA với các thể tích khác nhau vào

20 mL hỗn dịch nano GLP – PLGA, khuấy từ với tốc độ 600 vòng/phút trong 30 phút để hỗn hợp đồng nhất Sau đó thêm dung dịch CS và bổ sung nước cất như với các mẫu không chứa PVA Tiếp tục khuấy từ tốc độ 600 vòng/phút trong 2 giờ

2.3.1.3 Phương pháp đông khô nano GLP – PLGA/CS

Hút chính xác 5 mL hỗn dịch nano, cho vào lọ thủy tinh 10 mL, thêm các tá dược thích hợp Mẫu được để đông lạnh trong tủ lạnh sâu 70C trong 8h Sau đó tiến hành đông khô ở nhiệt độ khoảng 50C, áp suất dưới 0,2 mbar trong 24h

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Đánh giá kích thước, phân bố kích thước tiểu phân và thế Zeta

- Kích thước và phân bố kích thước: Khoảng 1 mL hỗn dịch nano được pha loãng với thể tích nước cất thích hợp (khoảng 9 mL) sao cho count rate nằm trong khoảng

200  400 kcps Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer, sử dụng cuvet nhựa

- Thế Zeta: Chuẩn bị mẫu như phương pháp đánh giá KT và phân bố KTTP Tiến hành đo mẫu trên máy Zetasizer, sử dụng cuvet nhựa có 2 điện cực bằng đồng

2.3.2.2 Phương pháp định lượng glipizid và xác định hiệu suất mang thuốc, khả năng nạp thuốc

GLP trong các mẫu thử được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

 Điều kiện sắc ký:

- Pha động: ACN – đệm phosphat pH 3,5 (50:50, tt/tt) (hòa tan 1,20 g NaH2PO4trong 500 mL nước cất, thêm 2 mL triethylamin, điều chỉnh tới pH 3,5 bằng H3PO4đậm đặc) Lọc đệm qua màng lọc 0,45 μm

- Cột Zorbax Eclipse Plus C8 (kích thước cột 250  4,6 mm, đường kính hạt 5 μm)

- Thể tích tiêm mẫu: 20 μL, tiêm mẫu tự động

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Detector: UV 225 nm

 Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 50 mg nguyên liệu GLP, cho vào bình định mức 50 mL Thêm khoảng 30 mL MeOH, siêu âm trong 5 phút cho tan hết Bổ sung MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều Từ dung dịch chuẩn gốc này (nồng độ chính xác khoảng 1 mg/mL), pha loãng thành các dung dịch chuẩn có nồng độ nằm trong khoảng từ 8 đến 80 μg/mL, lọc dung dịch chuẩn qua màng lọc 0,45 μm

 Mẫu thử:

- Mẫu GLP tự do: Lấy 1 mL hỗn dịch nano cho vào ống ly tâm có màng siêu lọc

10000 Da Ly tâm 5000 vòng/phút trong 30 phút Dịch dưới màng lọc được tiêm sắc

ký để xác định nồng độ GLP tự do

- Mẫu GLP toàn phần: Lấy chính xác 2 mL hỗn dịch nano cho vào lọ thủy tinh, sấy chân không để loại hết nước Hòa tan cắn trong 10 mL methanol, pha loãng nếu cần, lọc qua màng 0,45 μm Dịch lọc được tiêm sắc ký để xác định nồng độ GLP toàn phần

 Tính toán kết quả

- Công thức tính lượng thuốc tự do:

GLP tự do (μg) = Trong đó:

S td , S c là diện tích pic của mẫu tự do và mẫu chuẩn (mAu.s)

C c là nồng độ của mẫu chuẩn (μg/mL)

V t là thể tích của mẫu thử (hỗn dịch nano) (mL)

- Công thức tính lượng thuốc toàn phần:

GLP toàn phần (μg) = Trong đó:

S tp , S c là diện tích pic của mẫu toàn phần và mẫu chuẩn (mAu.s)

C c là nồng độ của mẫu chuẩn (μg/mL)

D là hệ số pha loãng của mẫu toàn phần

V t là thể tích của mẫu thử (hỗn dịch nano) (mL)