NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI BỌT PHOSPHOLIPID DÙNG LÀM CHẤT TƢƠNG PHẢN TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN

Phương pháp siêu âm Trong các phương pháp được sử dụng để bào chế vi bọt thì siêu âm là phương pháp phổ biến và đơn giản nhất được sử dụng, vi bọt được tạo thành bằng cách phân tán pha

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ths Bùi Thị Vân, người chị đã hỗ trợ

hướng dẫn em trong quá trình làm thực nghiệm

Để có được những kết quả đúng thời hạn, có độ chính xác trong phạm vi khoá luận này, em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của:

Các cán bộ thuộc Viện công nghệ dược phẩm quốc gia

Các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của bộ môn Tổng hợp Hoá Dược, bộ môn Vật lý - Hoá lý - Trường Đại học Dược Hà Nội

Và toàn thể các thầy cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện của Trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn giúp đỡ và động viên

em trong suốt quá trình vừa qua

Hà Nội ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên Nguyễn Văn Thắng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về vi bọt 2

1.1.1 Định nghĩa vi bọt 2

1.1.2 Vỏ ngoài 2

1.1.3 Lõi khí 3

1.2 Ứng dụng của vi bọt 3

1.2.1 Tác nhân tương phản trong siêu âm 3

1.2.2 Tác nhân phân phối gen và thuốc 6

1.3 Dược động học của vi bọt 7

1.4 Phương pháp bào chế 8

1.4.1 Phương pháp siêu âm 8

1.4.2 Khuấy tốc độ cao 9

1.4.3 Bay hơi dung môi 9

1.4.4 Đẩy qua màng 9

1.4.5 Phun sấy kiểm soát bằng điện trường 10

1.4.6 Phun điện đồng trục (CEHDA) 10

1.5 Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới 11

1.6 Một số chế phẩm đã có trên thị trường 13

1.7 Cách sử dụng của một số chế phẩm trên thị trường 13

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị 15

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 Nguyên vật liệu 15

2.1.3 Thiết bị 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Phương pháp bào chế vi bọt 16

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt 17

2.3.3 Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J 19

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Kết quả xây dựng công thức tạo bọt tối ưu 20

3.1.1 Khảo sát khả năng tạo bọt ở các nồng độ khác nhau của HSPC 20

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của loại chất diện hoạt đến khả năng tạo bọt 21

3.1.3 Khảo sát khả năng tạo bọt ở các nồng độ khác nhau của Poloxamer 407 23

3.1.4 Khảo sát khả năng tạo bọt ở các nồng độ khác nhau của PEG 6000 24

3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của một số thông số quy trình bào chế 26

3.2.1 Khảo sát cường độ siêu âm 26

3.2.2 Khảo sát nhịp phát xung 27

3.2.3 Khảo sát thời gian siêu âm 29

3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo bọt 30

3.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo bọt 32

3.3 Kết quả đánh giá một số đặc tính lý hoá của vi bọt bào chế được 33

3.3.1 Đánh giá sức căng bề mặt của dịch trước khi tạo vi bọt 33

3.3.2 Đánh giá độ bền của vi bọt khi được giữ trong tiêu bản 34

3.3.3 Đánh giá số lượng vi bọt trong một ml dịch tạo bọt 35

3.3.4 Thử nghiệm phương pháp bào chế đơn giản từ công thức tạo bọt tốt nhất 36

3.4 Bàn luận 37

3.4.1 Về công thức tạo bọt tối ưu 37

3.4.2 Về thông số quy trình trong quá trình tạo bọt 38

3.4.3 Về đặc tính lý hoá của vi bọt bào chế được 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

HSPC Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine

PVA Poly vinyl ancol

PEG Polyethylene glycol

DNA Axit deoxyribo nucleic

PFC Perfluorocarbon

CT Công thức

DPPC 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DSPC 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine PEG40S Polyethylene glycol-40 stearate

PET Hình ảnh chụp positron cắt lớp

FDA Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ

GP IIb/IIIa Glycoprotein IIb/IIIa

kl/tt Khối lƣợng/thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số chế phẩm vi bọt trên thị trường 13

2 Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 15

3 Bảng 3.1 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

4 Bảng 3.2 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

5 Bảng 3.3 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

6 Bảng 3.4 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

7 Bảng 3.5 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

8 Bảng 3.6 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

9 Bảng 3.7 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

10 Bảng 3.8 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo

14 Bảng 3.12 Phân bố kích thước của vi bọt bằng cách lắc

6 Hình 3.5 Phân bố kích thước vi bọt ở các cường độ siêu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Siêu âm là phương pháp được sử dụng rộng rãi để chẩn đoán hình ảnh và hỗ trợ điều trị trong lĩnh vực y học hiện nay Siêu âm mang lại rất nhiều lợi ích như: không xâm lấn nên rủi ro thấp, chi phí thấp và thời gian phù hợp Tuy nhiên, gần đây siêu âm bị hạn chế do thiếu các tác nhân tương phản hình ảnh hiệu quả

Tác nhân tương phản siêu âm được định nghĩa là tác nhân có thể làm thay đổi

độ tương phản của hình ảnh siêu âm một cách có ý nghĩa giúp các chẩn đoán có thể phân biệt được điều kiện bình thường và bất thường [43]

Hiện nay, vi bọt đã được sử dụng phổ biến ở các nước phát triển làm tác nhân tương phản lý tưởng cho siêu âm và đang được nghiên cứu sử dụng làm tác nhân phân phối thuốc và gen Tuy nhiên, ở nước ta, vi bọt còn ít được biết đến, chưa được đầu tư nghiên cứu và ứng dụng trên lâm sàng còn hạn chế Từ những yêu cầu trên đặt ra bài toán cho các nhà bào chế là cần nghiên cứu và bào chế vi bọt trong

điều kiện Việt Nam Do vậy, đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi bọt phospholipid

dùng làm chất tương phản trong siêu âm chẩn đoán” được thực hiện nhằm mục

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vài nét về vi bọt

1.1.1 Định nghĩa vi bọt

Vi bọt là một hình cầu nhỏ có kích thước cỡ µm, bao gồm 2 phần cơ bản: lớp

vỏ ngoài và lõi khí phía trong Thực tế chúng có kích thước trong khoảng 1-100 µm, nhưng thường chỉ sử dụng những vi bọt có đường kính 1-10 µm do những vi bọt có đường kính lớn hơn thường không qua được các mao mạch

Hình 1.1 Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ khác nhau [46]

1.1.2 Vỏ ngoài

Là lớp vỏ bao bên ngoài lõi khí, ngăn cách phần khí bên trong với môi trường bên ngoài vi bọt Lớp vỏ có thể được tạo thành từ những thành phần khác nhau, tùy theo bản chất của các thành phần đó mà cơ chế tạo vỏ cũng khác nhau Thông thường, nguyên liệu để tạo vỏ là những chất có khả năng hoạt động bề mặt như: protein (vỏ dày 15-20 nm), lipid (vỏ dày ~ 3 nm), polymer (vỏ dày 100-200 nm), chất diện hoạt

Trong các nguyên liệu tạo vỏ được liệt kê ở trên thì vỏ vi bọt bằng lipid có nhiều ưu điểm nổi trội hơn cả: vi bọt tạo thành ổn định hơn, hạn chế khả năng thấm khí từ bên trong ra ngoài môi trường và đặc biệt là tính tương thích sinh học cao Lipid thường dùng là loại có cấu trúc lưỡng cực với một đầu thân dầu và một đầu thân nước, trong đó hay dùng nhất là phosphotidylethanolamine (PE) và phosphotidylcholine (PC), chúng được dùng đơn độc hay được gắn thêm PEG

Để tạo vỏ, các phân tử phospholipid tự sắp xếp thành một lớp bao xung quanh bọt khí, quay đầu ưa nước ra phía ngoài và đuôi thân dầu vào trong, các phân

tử liên kết với nhau rất chặt chẽ với nhau nhờ tính kị nước và lực Van der Waals giữa các chuỗi acyl, giúp vi bọt có sự đàn hồi tốt và giảm sự thoát khí ra bên ngoài [26] Vỏ lipid với nhóm acyl mạch dài có độ cứng cao thì sự thấm khí kém, lực cắt lớn và sự giãn nở tốt hơn so với lipid có nhóm acyl mạch ngắn [7], [8] Do vậy, vi bọt với lipid có nhóm acyl mạch dài có thời gian bán thải dài hơn Đầu thân nước của phospholipid có thể được gắn thêm DNA hoặc các poly ion tích điện trái dấu tạo thành cấu trúc đa lớp [6]

Lõi khí là phần quan trọng nhất của vi bọt vì nó quyết định mức độ phản xạ

âm Khi được siêu âm, vi bọt sẽ bị nén, dao động và sau đó phản xạ lại âm Điều này tạo ra một hình ảnh có độ tương phản cao hơn hẳn trong siêu âm Lõi khí có thể

là không khí, perfluorocarbon (PFC) hoặc nitơ [32] Các dẫn chất PFC được dùng rất phổ biến trong bào chế vi bọt do tính tan trong nước thấp và áp suất hơi cao, các khí này giúp vi bọt đạt được sự ổn định cần thiết khi làm tác nhân siêu âm tương phản Những khí kém tan trong nước sẽ khó thoát khỏi vi bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [35] Áp suất hơi cao sẽ làm khí chậm hoá lỏng hơn khi mà áp lực Laplace không ngừng tăng lên do vi bọt bị co nhỏ theo thời gian, mà khí hoá lỏng là nguyên nhân vi bọt bị méo mó, nhăn nhúm hoặc biến mất Do đó, độ tan thấp và áp suất hơi cao của khí sẽ kiểm soát chặt chẽ kích thước, sự phồng lên của

vi bọt và đặc biệt tạo vỏ có biến dạng đàn hồi cao tránh gây vỡ bọt khi siêu âm [43]

1.2 Ứng dụng của vi bọt

1.2.1 Tác nhân tương phản trong siêu âm

Vi bọt có khả năng phản âm cao do mức độ chịu nén ở các cường độ siêu âm khác nhau là lớn hơn nhiều so với bất kì chất lỏng hoặc chất rắn nào khác nên vi bọt

có thể cung cấp được cường độ tán xạ cao [37] Hơn nữa khi vi bọt chịu tác động của sóng âm tại một tần số phù hợp, chúng sẽ cộng hưởng âm Với các vi bọt có kích thước cỡ vài µm cộng hưởng với dải tần số thường dùng trong siêu âm chẩn đoán thông thường (1-3MHz)

Vi bọt có hai đặc tính độc đáo mà không có ở các tác nhân sử dụng trong kĩ thuật chụp X-quang hay chụp cộng hưởng từ Thứ nhất, vì vi bọt có kích thước lớn hơn 1µm nên chúng bị giới hạn phân bố bên trong không gian mạch máu và chỉ phân bố đúng trong không gian mạch máu nên khi có bất kì một tín hiệu nào nhận được thì chắc chắn đó là tín hiệu đến từ không gian mạch máu Thứ hai, vi bọt có thể bị phá hủy bởi chính sóng siêu âm [37]

 Những vi bọt lý tưởng làm chất tương phản trong siêu âm

Vi bọt khi sử dụng làm tác nhân tương phản siêu âm thì thứ nhất kích thước cần phải được kiểm soát trong giới hạn quy định (1- 10μm) và phân bố kích thước càng hẹp càng tốt Kích thước vi bọt quá nhỏ sẽ phản xạ âm kém và vi bọt không bền, kích thước quá lớn vi bọt sẽ không đi qua được lòng mao mạch và có thể gây tắc mạch Kích thước vi bọt cần phải được kiểm soát tại cả hai thời điểm trước khi tiêm và trong suốt thời gian lưu thông trong cơ thể, cần phải hạn chế việc tăng kích thước do hợp nhất các vi bọt Thứ hai, vi bọt cần phải ổn định trong thời gian của một cuộc siêu âm chẩn đoán Vì vậy, thời gian bán thải thích hợp của vi bọt trong

cơ thể là một yêu cầu quan trọng [46]

Trên thực tế, vi bọt giúp cải thiện đáng kể chất lượng hình ảnh trong các trường hợp sau đây:

 Hình ảnh buồng tim

Sử dụng các tác nhân tương phản vi bọt để lấp đầy buồng tim đã cho những tín hiệu nổi bật ở khoang thất trái giúp đánh giá chuyển động của nó trong quá trình tâm thu Phân định rõ được biên giới của tâm thất còn giúp đánh giá toàn bộ chức năng tim bằng cách đo phân suất tống máu (tỷ lệ máu trong tâm thất trái được đẩy

ra trong một nhịp tim) và theo dõi chuyển động của thành tim hay sự tưới máu của động mạch vành để phát hiện bệnh thiểu năng mạch vành

 Hình ảnh tưới máu mô

Khả năng nhận biết ra các mô được tưới máu và tình trạng tưới máu mô là vô cùng quan trọng để phát hiện ra các mô bệnh Siêu âm tuy có thể cho phép quan sát

mô cấu trúc của cơ tim và nội tạng nhưng không nhạy cảm với những mô thiếu máu cục bộ, chẳng hạn như trong trường hợp suy mạch vành hay thậm chí là những mô đang thay đổi trong giai đoạn đầu của tắc mạch cục bộ và nhồi máu mô [44] Sử dụng tác nhân tương phản để lấp đầy mạch máu trong các mô không chỉ giúp phát hiện tắc mạch ngay sau khi nó vừa xảy ra mà còn đánh giá được khả năng tưới máu

ở mô

Khối u sẽ được phát hiện dễ dàng hơn, đặc biệt là các khối u nhỏ khi có sự

hỗ trợ của tác nhân tương phản, do đó chúng ta có thể quan sát được các mạch máu nuôi mô ác tính, khác hẳn với mạch máu nuôi mô bình thường, chúng thường quanh

co và phân nhánh lộn xộn, tập trung nhiều ở ngoại vi khối u và lưu lượng máu ngoại

vi khối u tăng hoặc giảm hay không có máu nuôi khu vực trung tâm Phản xạ siêu

âm giúp xác định số lượng vi tuần hoàn của khối u qua đó đánh giá việc hình thành mạch máu để nuôi khối u [53]

 Hình ảnh mạch máu

Khi tiến hành chụp ảnh mạch máu, tác nhân tương phản siêu âm vi bọt giúp chúng ta dễ dàng đạt được các mục đích sau:

 Xác định được rằng các mạch máu có bị tắc hay không

 Đánh giá được những bất thường của thành mạch máu: phát hiện các mảng xơ vữa và đánh giá ảnh hưởng của chúng đến lưu lượng dòng máu

 Xác định hướng dòng chảy và vận tốc dòng máu thông qua chu kì tim

ở trạng thái bình thường

 Thu được những hình ảnh chụp X-quang mạch máu giống như cây mạch máu trong các cơ quan

Một cục máu đông thường rất khó phát hiện vì nó cũng tương tự như máu, điều này làm cho mạch máu nhìn rất bình thường trong khi nó có thể bị tắc hoàn toàn Sử dụng tác nhân tương phản siêu âm sẽ cho phép chúng ta quan sát rõ ràng vị trí các cục máu đông và thu được hình ảnh bên trong động mạch, giúp phát hiện mảng xơ vữa [28], [45]

1.2.2 Tác nhân phân phối gen và thuốc

Trong các nguyên liệu tạo vỏ vi bọt: lipid, protein, polymer thì vi bọt vỏ lipid được ứng dụng nhiều làm tác nhân phân phối gen và thuốc bởi chúng hạn chế khả năng thấm khí từ bên trong ra ngoài môi trường, phản âm tốt, sẵn có trong tự nhiên,

ổn định khi lưu thông trong cơ thể và tính tương thích sinh học cao [46]

Trong liệu pháp gen hạn chế lớn nhất là không có khả năng cung cấp acid nucleic nhắm tế bào đích do acid nucleic dễ bị enzyme nuclease phân giải khi được đưa vào trong máu Sử dụng kỹ thuật siêu âm kết hợp với vi bọt đã khắc phục tốt được hạn chế này Thông thường, acid nucleic sẽ gắn lên bề mặt của vi bọt theo cơ chế tĩnh điện Vi bọt đã được sử dụng làm chất mang để bảo vệ acid nucleic, tăng thời gian lưu thông trong mạch máu và giúp gen hướng đích Gen được hướng đích bằng cách tiêm đồng thời DNA plasmid và vi bọt [4]

Phân phối thuốc tới đích được thực hiện bằng cách kết hợp các phân tử thuốc với vỏ của vi bọt Khác với các acid nucleic, các phân tử thuốc hiếm khi liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, thay vào đó chúng kết hợp cùng với lớp vỏ hoặc ngay dưới bề mặt của lớp vỏ hoặc chúng được kết hợp với một số chất mang khác có thể liên kết với bề mặt vi bọt Sau khi vi bọt tới đích chúng sẽ bị phá vỡ bởi sóng siêu

âm và giải phóng thuốc Sử dụng vi bọt làm tác nhân phân phối thuốc sẽ mang lại nhiều lợi ích như: bảo vệ dược chất khỏi sự tác động của enzym phân hủy thuốc trong máu, tăng thời gian lưu thông của thuốc trong máu, giải phóng thuốc tại đích, hạn chế khả năng gây độc cho các mô lành Vi bọt bị phá vỡ bởi sóng siêu âm do đó

có thể kiểm soát được quá trình giải phóng thuốc

Quá trình gắn của thuốc và gen lên vỏ ngoài của vi bọt có thể thực hiện thông qua các liên kết phổ biến như avidin-biotin, maleimide-thiol hay acid carboxylic-amin [27] Ngoài ra, một phối tử nhỏ (có kích thước cỡ nm) có thể gắn lên vi bọt bằng cách tạo liên kết giữa phối tử với lipid trước Với các vi bọt có vỏ là phospholipid gắn PEG (chẳng hạn như DSPE-PEG2000) [51], phối tử sẽ tạo liên kết với PEG trước khi vi bọt hình thành

 Chuyển hóa

Khí trong lõi khí thường là khí trơ, hầu như không tan trong nước nên không được chuyển hóa Vỏ galactose thì nhanh chóng chuyển thành galatose dạng phân

tử và tham gia vào quá trình chuyển hoá glucose ở gan rồi được chuyển hoá thành glucose-1-phosphate và CO2 [17], [39] Vỏ phospholipid được chuyển hoá tương tự lipid trong cơ thể người [39]

 Thải trừ

Thông thường, khí trong lõi của vi bọt được thải trừ qua phổi còn các thành phần ổn định được lọc qua thận và loại bỏ bởi gan Perfluorocarbons và SF6 là khí trơ nên không được chuyển hoá và được thải trừ qua phổi sau một vài phút SF6được loại bỏ 40% -50% trong 2 phút sau khi tiêm tĩnh mạch trong khi 80% -90% được đào thải trong 11 phút [39]

1.4 Phương pháp bào chế

1.4.1 Phương pháp siêu âm

Trong các phương pháp được sử dụng để bào chế vi bọt thì siêu âm là phương pháp phổ biến và đơn giản nhất được sử dụng, vi bọt được tạo thành bằng cách phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào dung dịch chứa nguyên liệu tạo vỏ thích hợp với lực siêu âm ở cường độ cao [11], [50], [56] Người ta cho rằng có hai nguyên tắc cơ bản trong phương pháp này [48] Thứ nhất, các chất khí hoặc chất lỏng được phân tán để tạo thành một hệ vi giọt hoặc vi bọt, sau đó các vật liệu bao phủ như protein hoặc chất diện hoạt tự động hấp phụ lên bề mặt chúng Thứ hai, nhiệt độ và áp suất cao làm thay đổi cấu trúc hóa học của lớp vỏ bề mặt nên cải thiện độ ổn định của vi bọt và vi giọt Kích thước bọt và phân bố kích thước bọt tạo thành phụ thuộc vào tần số, năng lượng và xung của chế độ siêu âm [18] Nhìn chung phân bố kích thước bọt được tạo thành bằng phương pháp này thường tương đối rộng, vì thế trước khi đem sử dụng cần phải được phân loại để loại bỏ những bọt lớn vì các bọt này có nguy cơ gây tắc mạch [36]

Nguồn khí đưa vào dịch tạo bọt được lấy từ bề mặt phân cách pha nhờ lực chia cắt của siêu âm Do đó, tốc độ tạo vi bọt bị ảnh hưởng lớn bởi khoảng cách giữa đầu của thiết bị siêu âm và bề mặt dịch tạo bọt Theo đó, vi bọt nhanh chóng

được tạo thành nếu đầu siêu âm được đặt ở bề mặt dịch tạo bọt vì khi đó khả năng lấy khí tốt hơn, nếu đặt sâu bên trong dịch lỏng, tốc độ tạo bọt sẽ giảm đáng kể

1.4.2 Khuấy tốc độ cao

Vi bọt được bào chế bằng cách dùng lực khuấy đảo chia cắt của cánh khuấy

để phân tán pha khí hoặc pha lỏng vào một dung dịch của nguyên liệu tạo vỏ Các phân tử chất tạo vỏ sẽ tự động tìm đến và sắp xếp trên bề mặt mới trong dung dịch

và hình thành nên vi bọt Kích thước vi bọt có thể kiểm soát được nhờ tốc độ cánh khuấy hay tỉ lệ pha lỏng và pha khí Tương tự phương pháp siêu âm, phân bố kích thước vi bọt bào chế bằng phương pháp này khá lớn, cần phải được phân loại trước khi đem đi sử dụng

1.4.3 Bay hơi dung môi

Đây cũng là một phương pháp tương đối phổ biến đặc biệt hay áp dụng với các loại vi bọt sử dụng polymer làm lớp vỏ ngoài Tiến hành bằng cách nhũ hóa dung dịch polymer (được hòa tan trong một loại dung môi thích hợp thành nhũ tương bởi các lực cơ học như khuấy đảo, chia cắt mạnh [5], [21]; trong đó có sử dụng một chất không hòa tan polymer và không đồng tan với nước làm chất ổn định Dung môi hòa tan polymer phải là chất dễ bay hơi, khi bay hơi dung môi polymer sẽ kết tủa trên bề mặt các vi giọt nhũ tương tạo nên các vi cầu (microspheres) Vi cầu được rửa sạch để loại dung môi dư thừa sau đó đem đông khô để sản xuất vi bọt

Đối với phương pháp này, phân bố kích thước vi bọt chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của các hạt nhũ tương và bất kì sự chia cắt hay hợp nhất nào của vi cầu ở các giai đoạn tiếp theo

1.4.4 Đẩy qua màng

Vi bọt được tạo ra bằng cách đẩy hỗn hợp chứa nhiều thành phần đi qua một màng xốp một hoặc nhiều lần, tạo thành các giọt lỏng [22] Sau đó cũng tiến hành các bước tiếp theo như phương pháp bay hơi dung môi để tạo vi bọt, hoặc có thể tạo ngay vi bọt bằng cách sử dụng khí tạo lõi cho vi bọt như một pha phân tán [31]

Ưu điểm của phương pháp này đó là kiểm soát kích thước vi bọt tốt hơn, phân bố kích thước hẹp hơn rất nhiều so với phương pháp siêu âm hay bay hơi dung môi [30] Và quan trọng hơn là số lượng vi bọt tạo thành không bị giảm theo thời gian hay khối lượng của hỗn hợp các thành phần tạo vi bọt Kích thước cũng như phân bố kích thước của hệ vi bọt phụ thuộc nhiều đặc điểm của các lớp màng (phân

bố kích thước lỗ màng và độ xốp của màng) [24]

1.4.5 Phun sấy kiểm soát bằng điện trường

Đây là kĩ thuật được sử dụng nhằm cải thiện tính đồng nhất của vi bọt được tạo ra [31] Các vi bọt được tạo thành từ một vòi phun bằng thép không gỉ (đường kính đầu phun 20-50 µm được cung cấp dịch phun trong buồng phun có nhúng một điện cực Bằng cách thay đổi điện thế của điện cực, xung áp suất sẽ được tạo ra trong lòng dịch phun, với mỗi xung áp suất một giọt chất lỏng sẽ được đẩy ra khỏi vòi phun và dịch phun lại được tiếp tục hút vào buồng phun Để thu được các vi giọt, có thể phun trực tiếp không khí hoặc phun chìm vào trong môi trường lỏng

Phương pháp này có ưu điểm là có thể kiểm soát được kích thước giọt bằng cách thay đổi chế độ phun và không đòi hỏi áp suất cao để tạo giọt như đối với phương pháp đẩy qua màng [31]

Cho đến nay phương pháp này chỉ được sử dụng để tạo ra các hạt chứa chất lỏng, ví dụ như paclitaxel được bao bọc trong lớp vỏ polylactiddecolglycolide [40] hoặc vi cầu chứa dung môi dễ bay hơi có thể loại bỏ để tạo thành vi bọt

1.4.6 Phun điện đồng trục (CEHDA)

Đây là kĩ thuật gần đây mới được áp dụng để tạo vi bọt, trong đó một dòng dịch lỏng được đưa vào trong buồng phun dưới sự kiểm soát của một điện trường tương tự như kĩ thuật phun sấy Sau đó phun tạo thành các giọt nhỏ được giữ trong một hệ treo nhờ các kim phun đồng trục khác Để bào chế vi bọt, kim bên trong cung cấp khí còn kim bên ngoài cung cấp dịch có vật liệu bao ngoài mong muốn

Nhờ thay đổi tỉ lệ pha khí, pha lỏng hay điện áp cung cấp cho đầu kim phun

mà kích thước và độ đồng nhất của vi bọt tạo thành có thể được kiểm soát [13]

Đường kính vi bọt giảm bằng cách giảm tỉ lệ khí, tăng điện áp hay giảm đường kính của đầu kim phun [20]

Sử dụng phương pháp này đã bào chế được vi bọt có thành phần vỏ là phospholipid có kích thước 6,6 ± 2,5 µm [13] Vi bọt vỏ polymer chứa chất lỏng cũng đã được bào chế thành công [12], [38]

1.5 Một số nghiên cứu về vi bọt trên thế giới

Các sản phẩm thương mại về vi bọt xuất hiện đầu tiên trên thế giới vào những năm 1990 ở châu Âu và Hoa Kì đó là Echovist (Schering AG, Đức) và Albunex (Hoa Kì), Echovist có vỏ là galactose [52], còn Albunex gồm các vi bọt không khí có vỏ là protein biến tính của con người [14]

Hoàng Phương Hảo đã nghiên cứu bào chế vi bọt vỏ chất diện hoạt với các thành phần bao gồm: Cremophor A25, Poloxamer 188, Glycerol monostearat Vi bọt được bào chế bằng phương pháp siêu âm với các thông số kĩ thuật: cường độ siêu âm 40%, nhịp phát xung (02/01) và thời gian siêu âm tạo bọt là 3 phút Kết quả thu được vi bọt có đường kính trung bình khoảng 4,4 ± 2,4 µm với thời gian phân lớp của hệ bọt là 71 phút [1]

Trịnh Phương Thảo đã tìm được các thông số kỹ thuật tối ưu cho quá trình tạo bọt ở cả phương pháp siêu và khuấy cơ Khoá luận đã thực hiện so sánh khả năng tạo bọt của hai phương pháp siêu âm và khuấy cơ thông qua đánh giá một số đặc tính của vi bọt Kết quả cho thấy khả năng tạo bọt của phương pháp siêu âm tốt hơn so với phương pháp khuấy cơ học, vi bọt tạo thành bằng phương pháp siêu âm bền và ổn định hơn [2]

Bùi Thị Vân đã bào chế vi bọt phospholipid bằng phương pháp siêu âm Thành phần chính trong công thức dịch tạo bọt bao gồm HSPC, Poloxamer 407 Luận văn đã xây dựng được công thức và quy trình bào chế vi bọt vỏ phospholipid, đồng thời đánh giá một số đặc tính và độ ổn định của vi bọt bào chế được [3]

Cavalieri và cộng sự (2008) sử dụng lysozyme để tạo vi bọt cho kết quả là chúng khá ổn định và tác giả đã khẳng định vai trò của cầu nối disulfide trong việc hình thành lớp vỏ protein ổn định Dung dịch lysozyme 5% (kl/tt) được làm biến

tính ở 50mM trong đệm trishydroxymethylaminomethane-Tris-HCl pH 8,3 có chứa

200 mM DL-dithiothreitol trong thời gian 2, 5, 10 và 15 phút Tiến hành siêu âm bào chế vi bọt ở bề mặt phân cách pha bằng máy siêu âm ―Sonics and Materials‖ với các thông số thiết bị: tần số 20 kHz, công suất 200W Sau đó phần protein dư thừa được loại bỏ khỏi dịch tạo bọt [9]

Cavalieri và cộng sự (2005) mô tả một phương pháp để tạo ra vi bọt có vỏ là PVA [10] Vi bọt được tạo ra bằng cách khuấy dung dịch PVA 2% (kl/tt) có pH 2,5

đã được xử lý ở tốc độ cao (8000 vòng/ phút) trong 3 giờ Đường kính trung bình vi bọt là khoảng 6 ± 1µm Độ dày vỏ có thể được giảm từ 0,9 xuống 0,7µm khi giảm nhiệt độ tác động từ nhiệt độ phòng đến 4°C

Zhao và cộng sự (2008 đã bào chế vi bọt vỏ phospholipid với lõi khí là C3F8hoặc SF6 theo phương pháp ―siêu âm – đông khô‖ Công thức dịch tạo vỏ bao gồm hydrogenated phosphatidylcholine, Poloxamer 188, PEG 1500 được cân và hoà tan trong 5ml butanol ở 650C Tiến hành siêu âm ở 300C, tần số 40kHz, công suất 160W trong 3 phút để thu được vi hạt Sau đó, mẫu được đông khô ở áp suất 5 × 104

Pa trong 20 giờ Lọ chứa bọt đông khô được làm bão hoà với khí C3F8 hoặc SF6 Vi bọt tạo thành bằng cách thêm 2ml dung dịch NaCl 0.9% vào lọ bột đông khô rồi lắc nhẹ nhàng Quan sát dưới kính hiển vi, số lượng vi bọt trong các mẫu đều trên 2 ×

109 vi bọt/ml, với 95% vi bọt có đường kính nhỏ hơn 8 µm [57]

Swanson và cộng sự đã nghiên cứu bào chế vi bọt phospholipid làm thuốc tiêm để vận chuyển khí oxy Phospholipid sử dụng là DPPC và DSPC, được trộn đều với PEG40S (tỷ lệ mol 9:1 trong dung địch đệm pH 7,4 tới nồng độ 5 mg/ml Hỗn hợp được làm nóng trong bể điều nhiệt trên 500C so với nhiệt độ chuyển pha

và được phân tán bằng siêu âm đầu titan Branson 450A Sonifier 20-50% công suất, tới khi dịch trong suốt, sau đó được để chân không trong tủ lạnh Bọt được tạo thành trong một thiết bị gồm có đầu siêu âm bên trong và bên ngoài là hệ thống làm lạnh Oxy và dung dịch phospholipid được đưa vào thiết bị trên để tạo bọt và bọt tạo thành được chuyển qua một cột thủy tinh để phân đoạn kích thước bọt dựa vào sự nổi tự nhiên của bọt Độ dài mạch acyl của phospholipid không ảnh hưởng tới phân

bố kích thước của vi bọt nhưng ảnh hưởng độ bền vi bọt Vi bọt vỏ DPPC bị phân hủy sau hơn 3 tuần trong khi vi bọt vỏ DSPC vẫn còn một nửa số bọt [49]

Số lượng

vi bọt trong 1ml

Mức liều khuyến cáo

Đối với chế phẩm ―DEFINITY‖, chế phẩm này gồm một lọ bột đông khô và một lọ dung môi Trước khi tiêm phải trải qua các bước: hoàn nguyên dung môi, cho phép lọ được làm ấm về nhiệt độ phòng, tiến hành tạo bọt bằng cách lắc với thiết bị ―VIALMIX‖ trong thời gian 45 giây Chế phẩm này không được phép sử dụng nếu như nó không hoàn thành đủ 45 giây khi lắc với thiết bị ―VIALMIX‖ Ngay sau khi được kích hoạt với thiết bị ―VIALMIX‖, chế phẩm thu được có màu trắng sữa đục và nên được sử dụng ngay lập tức sau khi được kích hoạt Nếu chế phẩm không được sử dụng trong thời gian 5 phút sau khi kích hoạt thành công thì

tiến hành lắc lọ trong thời gian 10 giây bằng tay (khi lắc đảo ngược lọ trước khi được chuyển qua ống tiêm Chế phẩm có thể được sử dụng trong thời gian 12 giờ sau khi được kích hoạt thành công, trong thời gian này, lọ chế phẩm được bảo quản

ở điều kiện nhiệt độ phòng Thao tác hút dịch tạo bọt như sau: đảo ngược lọ và hút dịch theo liều đã định trước bằng cách sử dụng ―Intellipin™‖ (lưu ý tránh bơm khí vào trong lọ) Dịch ở trong ống tiêm nên được sử dụng ngay lập tức, tránh để quá lâu trong ống tiêm Vi bọt thu được có kích thước trung bình từ 1,1 – 3,3 µm và có tối đa 1,2 × 1010 vi bọt/ml

Chế phẩm ―OPTISON‖ có lõi khí là C3F8, lớp vỏ dày 15 nm có thành phần là albumin huyết thanh người Chế phẩm này được chuẩn bị bằng cách hoà tan trực tiếp Trước khi hút dịch trong lọ, lọ chế phẩm được kích hoạt bằng cách đảo ngược

lọ hoặc rung nhẹ, cuộn giữa lòng bàn tay Sau khi được lắc nhẹ nhàng thu được sản phẩm đồng nhất có màu trắng sữa với lớp chất lỏng ở phía dưới chứa vi bọt và lớp phía trên màu trắng Đường kính trung bình của vi bọt thu được là 1,0 – 2,25 µm với 93% có kích thước nhỏ hơn 10 µm và số lượng bọt là 5-8 × 108 vi bọt/ml [39]

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: Vi bọt

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

1 HSPC (Hydrogenated Soy

Phosphatidylcholine) Lipoid (Đức) NSX

2 Poloxamer 407 Sigmaaldric (Singapore) NSX

3 Tween 80 Trung Quốc TCCS

4 Cremophor A25 Công ty Sao Thái Dương

(Việt Nam) TCCS

5 PEG 6000 Trung Quốc TCCS

6 Na2HPO4 Trung Quốc TCCS

7 KH2PO4 Trung Quốc TCCS

8 NaOH Trung Quốc TCCS

9 Khí nitơ Việt Nam TCCS

10 Nước cất Việt Nam TCCS

2.1.3 Thiết bị

- Kính hiển vi gắn camera Nikon Eclipse Ci-L (Đức)

- Máy siêu âm Sonic & Material (Mỹ)

- Máy đo pH Eutech instrument pH 510

- Máy lắc Vortex Mixter VM 300 (Đức)

- Cân phân tích và các dụng cụ thuỷ tinh: ống đếm giọt, ống picnomet, cốc có

mỏ, bình định mức, lá kính, lam kính

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo vi bọt gồm: nồng độ HSPC, loại chất diện hoạt, nồng độ chất diện hoạt, nồng độ PEG 6000, cường độ siêu

âm, thời gian siêu âm và nhịp phát xung, nhiệt độ và pH

- Đánh giá một số đặc tính hoá lý và số lượng vi bọt tạo thành trong 1 ml dịch tạo

- Cân HSPC (không đun nóng HSPC sau đó thêm vào pha nước, tiến hành khuấy

từ và duy trì nhiệt độ từ 60-650C đến khi HSPC phân tán đều (khoảng 10 phút),

để nguội về nhiệt độ phòng rồi chuyển qua bình định mức 50ml rồi bổ sung đệm phosphat pH 7,4 đến vạch

2.3.1.2 Tạo vi bọt bằng máy siêu âm

- Chuyển dịch trên qua cốc có mỏ, đặt đầu titan chìm sâu trong lòng dịch rồi tiến hành siêu âm phân tán với cường độ 20% trong thời gian 5 phút

- Hút 20ml dịch tạo bọt cho chuyển qua cốc có mỏ 80ml Cố định cốc trên giá tại một vị trí Đuổi khí hoà tan bằng cách sục nitơtrong 1 phút, sau đó nâng đầu ống dẫn khí nitơ lên khỏi bề mặt dịch tạo bọt Dùng một tấm xốp mỏng (có đục

1 lỗ để đưa khí bịt kín miệng cốc, tấm xốp cách phần dịch 2cm

- Đưa khí nitơ lên bề mặt dịch trong 5 phút rồi đặt đầu titan của máy siêu âm tiếp xúc với bề mặt dịch tạo bọt Cài đặt thông số máy rồi tiến hành tạo bọt, trong quá trình tạo bọt liên tục đưa khí nitơ

- Sau khi tạo bọt xong, đổ dịch chứa vi bọt vào ống nghiệm để đánh giá

2.3.1.3 Thử nghiệm phương pháp bào chế đơn giản từ công thức tạo bọt tốt nhất

Chuẩn bị dịch tạo bọt, sục khí nitơ để đuổi khí hoà tan, dịch tạo bọt được hút chính xác 3ml cho vào lọ thuỷ tinh đựng thuốc tiêm, đậy nắp kín Siêu âm lọ chứa

dịch tạo bọt trong bể siêu âm với thời gian siêu âm là 5 phút Đưa khí nitơ lên bề mặt dịch tạo bọt trong thời gian 5 phút sau đó đậy nắp kín Tiến hành tạo bọt bằng cách lắc lọ thuỷ tinh với máy Vortex Mixter VM300 trong thời gian 45s

Tiến hành chụp ảnh và xử lý ảnh thu được bằng phần mềm Image J

2.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của hệ vi bọt

2.3.2.1 Hình thức vi bọt: Quan sát vi bọt trong tiêu bản qua kính hiển vi, đánh giá

sơ bộ hình thái của vi bọt: hình dạng, quan sát sự co nhỏ hay bóp méo của vi bọt

2.3.2.2 Kích thước và phân bố kích thước vi bọt

- Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo vi bọt, tại thời điểm t=20 phút, hút dịch chứa vi bọt tại một vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản, đem soi trên kính hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, chụp và lưu hình ảnh

- Xử lý hình ảnh: sử dụng phần mềm hỗ trợ Image J Thống kê dữ liệu về đường kính của vi bọt trong ảnh để đánh giá: kích thước: đường kính trung bình của vi bọt; phân bố kích thước: đường kính trung bình ± 2SD (độ lệch chuẩn , theo đó 95,45% vi bọt có kích thước nằm trong khoảng này

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá sức căng bề mặt của dịch trước khi tạo vi bọt

Chuẩn bị các dịch tạo bọt với các nồng độ khác nhau, làm nguội dịch tạo bọt

về 200C Sức căng bề mặt được xác định bằng phương pháp đếm giọt như sau:

 Tra bảng hệ số sức căng mặt ngoài và khối lượng riêng của nước ở 200C ta được các giá trị αo và Do

 Hút chất lỏng vào trong ống, xác định số vạch ứng với mỗi giọt chất lỏng

 Đếm số giọt (kể cả số giọt lẻ) ứng với thể tích V Ta được giá trị n giọt Tiến hành 3 lần, ta có ̅

 Hút nước cất vào trong ống trên, tiến hành tương tự như trên ta có n0 giọt Làm 3 lần, ta có ̅̅̅

 Khối lượng riêng của dịch tạo bọt được xác định bằng cách sử dụng ống picnomet Nguyên tắc: Xác định khối lượng của dịch chứa trong ống rồi đem chia cho thể tích của ống picnomet thu được giá trị khối lượng riêng

Sau khi có các giá trị αo,Do, ̅̅̅, D và ̅ (αo,Do tra từ bảng số liệu), ta tính hệ

số sức căng mặt ngoài theo công thức:

α = αo.

2.3.2.4 Phương pháp đánh giá độ bền của vi bọt khi được giữ trong tiêu bản

Cách tiến hành:

 Chuẩn bị mẫu: Sau khi tạo bọt, tại thời điểm t=20 phút, hút dịch chứa bọt tại

một vị trí cố định đã chọn trong ống nghiệm rồi nhỏ lên tiêu bản

 Đem soi trên kính hiển vi kết nối camera ở vật kính 40, giữ nguyên tại một vi

Sau khi chuyển vi bọt từ cốc sang ống nghiệm, tiến hành hút dịch tạo bọt ở 3

vị trí khác nhau: đáy, giữa (h/2 , đỉnh (h) Với h là chiều cao của dịch chứa vi bọt trong ống nghiệm Chụp ảnh vi trường tại 3 vị trí này và xử lý hình ảnh đã ghi bằng phần mềm Image J thu được 3 giá trị đường kính trung bình tại 3 vị trí Lấy trung bình cộng của 3 giá trị này ta được dTB (với dTB là kích thước trung bình của tất cả

vi bọt trong ống nghiệm) Tính VTB là thể tích trung bình của một vi bọt trong ống nghiệm

Cách đánh giá:

Số lượng vi bọt trong 1 ml dịch tạo bọt (SL được tính theo công thức sau:

SL = (V/VTB)/(20+V) Theo đó V là thể tích cột bọt tạo thành được tính theo công thức: V=V1-V0,

V1 là thể tích dịch sau khi mới tạo bọt xong (ml)

V0=20 ml là thể tích dịch ban đầu

2.3.2.6 Thời gian phân lớp của hệ bọt

Thời gian phân lớp của hệ bọt được tính kể từ khi đổ dịch vừa tạo bọt vào ống nghiệm thuỷ tinh sau đó đậy kín đến khi dịch này phân thành 2 lớp rõ rệt, phía trên là bọt trắng còn phía dưới là lớp dịch trong

2.3.2.7 Số lượng vi bọt trên một vi trường

Từ hình ảnh chụp được, phần mềm Image J cho phép đếm tất cả số lượng vi bọt trong một vi trường

2.3.2.8 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo bọt

Tiến hành siêu âm dịch tạo bọt trong các điều kiện như sau:

 “Không làm lạnh”: Tiến hành siêu âm trong điều kiện nhiệt độ phòng

(khoảng 250C), (nhiệt độ của dịch tạo bọt trong quá trình siêu âm là khoảng

450C), dịch tạo bọt được để nguội về nhiệt độ phòng (khoảng 250C)

 “Làm lạnh trong”: Tiến hành làm lạnh dịch tạo bọt trong quá trình siêu âm

(nhiệt độ của dịch tạo bọt được duy trì ở khoảng 200C trong và sau khi siêu âm)

 “Làm lạnh sau”: Không làm lạnh khi siêu âm (nhiệt độ của dịch tạo bọt

trong quá trình siêu âm là khoảng 450C), tiến hành làm lạnh sau khi siêu âm (nhiệt độ của dịch tạo bọt được duy trì khoảng 200C)

Tiến hành chụp ảnh và xử lý ảnh thu được bằng phần mềm Image J

2.3.3 Phương pháp xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image J

Phần mềm Image J có khả năng đếm tất cả số điểm ảnh trên hình ảnh và tính được diện tích mỗi điểm ảnh đó Với hình ảnh chụp được trên kính hiển vi, mỗi vi bọt là tập hợp của nhiều điểm ảnh Từ diện tích của mỗi vi bọt, sẽ tính ra đường kính của mỗi vi bọt theo công thức:

d = √ Trong đó: S là diện tích vi bọt (pixel)

d là đường kính vi bọt (µm)

0,17 là hệ số quy đổi của kính hiển vi gắn camera: 1pixel=0,17 µm

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả xây dựng công thức tạo bọt tối ưu

3.1.1 Khảo sát khả năng tạo bọt ở các nồng độ khác nhau của HSPC

HSPC là thành phần chính trong lớp vỏ vi bọt, để đánh giá khả năng tạo bọt

ở các nồng độ khác nhau của HSPC, chuẩn bị các dịch tạo bọt bằng cách thay đổi nồng độ HSPC giữa các công thức CT1 (0,1%), CT2 (0,2%), CT3 (0,3%), CT4 (0,4%), CT5 (0,5%) Tiến hành siêu âm tạo bọt với các thông số cường độ 40%, nhịp phát xung 03/01 (s/s) trong thời gian 2 phút theo mục 2.3.1 và tiến hành đánh giá theo mục 2.3.2 thu được kết quả trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Một số đặc tính lý hoá của vi bọt thay đổi theo nồng độ HSPC

Công thức CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Nồng độ HSPC (kl/tt) 0,1% 0,2% 0,3% 0,4% 0,5% Hình thức vi bọt Bọt hình cầu, không bị co nhỏ

Đường kính trung bình (µm) 4,7 4,8 4,6 4,5 4,5 Phân bố kích thước (µm) 2,9-6,5 3,0-6,6 2,8-6,4 2,5-6,5 2,5-6,5 Thời gian phân lớp (phút) 34 47 71 93 89

Đường kính µm