PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------- LƯU THỊ CƯ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE -FRUCTOFURANOSIDASE NHẰM TĂNG TRỮ LƯỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

LƯU THỊ CƯ

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN

MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE)

NHẰM TĂNG TRỮ LƯỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Thái Nguyên – 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-

LƯU THỊ CƯ

PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN

MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƯỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.70

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH LIÊN

Thái Nguyên – 2009

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số

liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng có ai công

bố trong bất kỳ một công trình nào khác

Tác giả

Lưu Thị Cư

Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Lê Trần Bình, TS Chu Hoàng Hà, KS Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những người đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận được sự

hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa KTNN và khoa Sau đại học, trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những người thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu

Sinh-Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009

Học viên

Lưu Thị Cư

Trang

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 3

1.1.1 Sơ lược về cây mía 3

1.1.2 Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam 4

1.2 SINH TỔNG HỢP SUCROSE 5

1.3 VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO 8

1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 10

1.5.1 Nguồn gốc RNAi 10

1.5.2 Cơ chế gây bất hoạt gen 10

1.6 KỸ THUẬT GATEWAY ® 12

1.7 NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA 14

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN LIỆU 16

2.1.1 Nguyên liệu thực vật 16

2.1.2 Các chủng plasmid và enzyme 16

2.1.3 Hóa chất khác 16

2.1.3 Các thiết bị máy móc 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP 17

2.2.1 Thiết kế mồi 17

2.2.2 Tách RNA tổng số 18

2.2.3 RT-PCR 18

2.2.4 Tách dòng và xác định trình tự gen 19

2.2.5 Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi 20

2.2.7 Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía 22

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 2

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 THIẾT KẾ MỒI 24

3.2 TÁCH RNA TỔNG SỐ 25

3.3 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE 27

3.4 TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 28

3.4.1 Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR 28

3.4.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 28

3.4.3 Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR 29

3.4.4 Kết quả xác định trình tự nucleotit 31

3.5 THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 31

3.5.1 Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway 31

3.5.2 Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli 32

3.6 BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. 34

3.7 TÁI SINH VÀ BƯỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 35

3.7.1 Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo 35

3.7.3 Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

AS Acetosyringone

khuôn mRNA

Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm 16

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước 18

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR 19

Bảng 2.4 Các môi trường tái sinh cây mía 21

Bảng 3.1 Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV 25

Bảng 3.2 Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI 25

Bảng 3.3 Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trường thử nghiệm M1 - M4. 36

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các

enzyme chính 6

Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi 11

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway 13

Hình 3.1 Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13

(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong

vector pENTR/D 30

Hình 3.4 Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập được

với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số

AY302083 31

Hình 3.5 Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 32

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với

HindIII và XbaI 34

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong

Hình 3.8 Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 37

Hình 3.9 Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông

qua trung gian A.tumefaciens 39

MỞ ĐẦU

Đường là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con người Theo thống

kê, nhu cầu tiêu thụ đường trên thế giới trung bình tính theo đầu người là 35 kg/1 người/1 năm Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 người/1 năm, hiện nay

là 15 kg/1 người/1 năm và dự kiến nhu cầu về đường còn tiếp tục tăng nữa Tại các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam, 75% sản lượng đường được sản xuất từ cây mía Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đường sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đường Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đường chỉ đạt mức trung bình của thế giới Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phương pháp lai tạo truyền thống chưa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lượng đường cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu của nước ta Chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đường mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đường tại Việt Nam

Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme

Invertase được xem như là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lượng

sucrose trong cây mía Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào Vì vậy, muốn tăng trữ lượng sucrose trong cây mía thì phải ức chế được sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31] Ở thực vật,

RNAi có thể được thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự

phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà

chứa trình tự tương đồng với gen đích

Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lượng đường cao,

chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã

hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose

ở cây mía”

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU:

Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lượng

sucrose ở cây mía

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

1 Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro

ROC1

2 Thiết kế được vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase

(β-fructofuranosidase) ở cây mía

3 Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển

gen tiếp theo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA

1.1.1 Sơ lược về cây mía

Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae) Chúng là

những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m Các loại thực vật trong chi này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2] Cây mía chứa hàm lượng đường rất cao chiếm khoảng 46% khối lượng khô, trong đó sucrose chiếm tới 80% Chính vì thế, mía trở thành một trong những cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đường Ngoài ra, cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo (lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lượng và các chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một

số bệnh như ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai… Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói mòn đất cho các vùng đồi trung du Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất Phần bã mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc Sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đường (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy phế phẩm còn lại dùng làm phân bón rất tốt Trong tương lai bã mía còn có thể nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay thế

các loại cây rừng bị giảm đi Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt

như hiện nay, một số nước phát triển trên thế giới như Mỹ, Brazil, Ấn Độ…

đã bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ cây mía để bổ sung và thay thế Như

vậy, cây mía có vai trò rất quan trọng trong đời sống kinh tế của con người

1.1.2 Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam

Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng

và sản xuất mía đường, sản lượng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp

6 lần so với củ cải đường) Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành

công nghiệp đường của cả nước Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía

nguyên liệu cả nước sẽ vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 ha so với vụ

trước, trong đó diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung của các nhà máy là

221.816 ha với năng suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha và sản lượng đạt 16

triệu tấn Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo ở vùng trung du, miền núi ở

nhiều tỉnh nước ta như: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình

Định, Quảng Ngãi [3] Nhà nước đã hỗ trợ một phần đầu tư phát triển cơ sở

hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển

giao khoa học kỹ thuật và công nghệ nhằm nâng cao năng suất, chất lượng,

hiệu quả sản xuất mía đường [1]

Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày một gia tăng cùng với sự

biến đổi môi trường khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hướng ngày một

thu hẹp Hơn nữa, ở nước ta hiện nay có tới trên 60% các giống mía là những

giống cũ như: ROC1, ROC10, F156, F127… hoặc các dạng lai ghép nội chi

phức tạp Các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều

vùng sinh thái của Việt Nam, nhưng trữ lượng đường rất thấp Còn lại các

giống mía nhập nội tuy có trữ lượng đường cao song không phù hợp với khí

hậu Việt Nam nên năng suất thấp Chính vì thế, Quyết định số

26/2007/QĐ-TTg của Phó thủ tướng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020” được phê duyệt đã đưa quan điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ đường cao được đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị

và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lượng đường cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1]

1.2 SINH TỔNG HỢP SUCROSE

Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat-cacboxilase hoạt

động rất mạnh Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử,

là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của

suất sinh học rất cao

Sucrose là một disaccharide của glucose (α-D-glucopyranoside) và

phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lượng cho quá trình sinh trưởng phát triển của thực vật cũng như các sinh vật sống khác Trong cơ thể động vật, sucrose là nguyên liệu tổng hợp glucogen, khi thừa

sẽ chuyển sang dạng mỡ dự trữ Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô của thực vật, giúp cho thực vật có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện bất lợi của môi trường như: hạn, lạnh, mặn và cường độ ánh sáng mạnh [7, 12,

17, 23, 26, 30] Nó được tích trữ chủ yếu ở cây mía, củ cải đường và có ở

trong nhiều loại cây khác như dứa, chuối, mơ, mận, dưa hấu, táo, cà rốt…

đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên, rất dễ trồng với số lượng lớn và giá rẻ

Sucrose rất dễ hòa tan trong nước, khi bị thủy phân tạo thành glucose và

fructose

Sinh tổng hợp sucrose là một chu trình phức tạp diễn ra ở cytosol (tế

bào chất) trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau,

trong đó một số enzyme chính (key enzyme) có ảnh hưởng lớn tới lượng

sucrose được tổng hợp Các enzyme này xúc tác cho các dạng phản ứng:

(1) Tổng hợp sucrose như sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc

sucrosesynthase (SS)

(2) Thủy phân sucrose như β-fructofuranosidase (Invertase)

(3) Vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose

như pyrophosphate fructose 6-phosphat 1 phosphostransferase (PFP) [6]

Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các

Pi

Pi

Invertase SPS

trong các mô dự trữ của khoai tây, ngô, cải bó xôi [30] Ở ngô, hoạt tính SPS

tỉ lệ thuận với tốc độ tổng hợp và vận chuyển sucrose [16] Cây cà chua chuyển gen tăng cường biểu hiện SPS thì lượng sucrose tăng còn lượng tinh bột giảm trong quá trình quang hợp [33] Tương tự, cây bông mang gen SPS

của rau bi-na (spinacia oleracea) cũng có tốc độ tổng hợp sucrose cao hơn so

với đối chứng [13] Ngược lại, khi làm bất hoạt SPS, các dòng cây khoai tây chuyển gen sẽ giảm trữ lượng sucrose [10] Gen mã hóa cho SPS đã được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau và cho tới nay ngân hàng gen NCBI

đã có thông tin về vài trăm trình tự SPS của các loài thực vật hai lá mầm như khoai tây, thuốc lá, rau bi-na, củ cải đường; cây một lá mầm như lúa, ngô, mía

và cả tảo lam [9, 10, 13, 14, 21, 27, 31, 33] Liên quan chặt chẽ với SPS trong

chu trình sinh tổng hợp sucrose là enzyme thủy phân sucrose - Invertase

(β-fructofuranosidase) Khi hoạt tính của Invertase cao thì lượng đường tích lũy trong các mô tế bào giảm và ngược lại Hoạt tính của enzyme pyrophosphate fructose 6-phosphotransferase (PFP) cũng tỉ lệ nghịch với lượng sucrose trong

tế bào thực vật [11] PFP xúc tác chuyển hóa fructose 6-phosphate thành fructose 1,6-biphosphate Do vậy, nếu hoạt tính của PFP giảm, lượng cơ chất cho phản ứng tổng hợp sucrose sẽ tăng, dẫn tới lượng sucrose cũng tăng tương ứng Ảnh hưởng này đã được chứng minh trên các dòng mía có mang

cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP Lượng sucrose trên các cây mía chuyển

gen còn non tăng khoảng 50% Tuy nhiên, khi phân tích trên các cây trưởng

thành, tổng lượng sucrose tăng, nhưng chưa đáng kể so với đối chứng [11]

Những nghiên cứu trên đã chứng tỏ được vai trò quan trọng của các enzyme

SPS, PFP, Invetase trong việc tổng hợp và tích lũy sucrose ở thực vật

1.3 VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO

Theo thuyết vận chuyển đường (hay thuyết Turgeon), đường sucrose

được tổng hợp ở tế bào chất của các tế bào thịt lá trong quang hợp sẽ được

vận chuyển ra không bào, sau đó nhờ hệ thống cấu trúc liên kết giữa các tế

bào (sợi liên bào và cầu sinh chất hay plasmodesmata) nó sẽ được chuyển từ

tế bào này sang tế bào khác và nhờ ống dẫn phloem mà sucrose đi tới khắp

các cơ quan của thực vật bằng con đường khuyếch tán Các phân tử nhỏ

sucrose trong ống dẫn phloem sẽ được polyme hóa thành những phân tử

đường lớn và phức tạp hơn, lúc này các phân tử đường được đẩy ra xa khỏi lá

đến những phần khác của cây, nơi mà nó được sử dụng hay tích trữ lại, và do

kích thước của nó quá lớn nên nó không thể chuyển ngược trở về lá Chính cơ

chế khuếch tán này đã tạo nên sự vận chuyển liên tục sucrose từ các cơ quan

quang hợp (source tissue) tới các cơ quan dự trữ (sink tissue) Bên cạnh đó,

sucrose còn được vận chuyển và tích trữ tại không bào làm nguyên liệu cho

chu trình sinh tổng hợp tinh bột Ngoài lượng sucrose được vận chuyển liên

tục, một phần sucrose sẽ được phân hủy nhằm cung cấp năng lượng cho quá

trình sinh trưởng và phát triển, đồng thời tái tạo các cơ chất khác

1.4 ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE)

Invertase (β-fructofuranosidase) được mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy

thuộc từng loài thực vật khác nhau Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5

đồng phân Invertase, trong khi ở cà chua hiện nay đã phân lập được 8 đồng

phân Hiện nay, trên ngân hàng gen đã có trình tự EST (Expressed Sequenced

Tags) của enzyme Invertase phân lập từ một số giống mía [35] Invertase trung tính (có trong tế bào chất) đã được tinh sạch từ thân mía trưởng thành Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme này vẫn chưa được công bố trên GenBank

Invertase có mặt ở hầu hết các mô thực vật tích trữ đường và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều trong không bào (dịch tế bào); dạng liên kết với màng (cell wall Invertase) có trong thành tế bào; dạng độc lập (neutral Invertase) có chủ yếu trong hạt Nó là một

enzyme xúc tác quá trình thủy phân sucrose trong không bào thành hai đường đơn là glucose (Aldohexose) và fructose (Ketohexose) [6]

Vì thế, mức độ biểu hiện của nó có nhiều ảnh hưởng lên sự sinh trưởng

phát triển của thực vật [6] Cụ thể, khi Invertase có hoạt tính cao nó sẽ làm

giảm một lượng sucrose đáng kể trong thân cây mía Nghiên cứu cho thấy những dòng mía có sản lượng đường cao thường là các dòng có hoạt tính Invertase thấp và ngược lại [35] Tương tự, một số dòng cà chua ngọt có tích

lũy nhiều đường là do hoạt tính của Invertase thấp Invertase có hoạt tính cao

trong không bào của tế bào thuốc lá và đậu tương cũng đã làm giảm lượng sucrose trong các cơ quan này [6] Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ sucrose trong cây cà chua chuyển gen ở lá và quả, đồng thời cũng làm thay đổi tỉ lệ đường đơn (hexose) trong các dòng cây này [18, 24] Lá của các dòng khoai tây biểu hiện gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ yếu glucose và fructose hơn là sucrose Hơn nữa, những dòng này hình thành

ít củ và nhỏ hơn các dòng đối chứng, nhưng chứa nhiều đường hơn là tinh bột Điều này chứng tỏ rằng Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lượng và vận chuyển của sucrose ở thực vật

Như vậy, Invertase được xem như là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự

tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase

có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía

1.5 ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƯƠNG PHÁP RNAi (RNA

INTERFERENCE)

1.5.1 Nguồn gốc RNAi

RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay

cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew

Z Fire và Craig C Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào

ngày 19/12/1998 [4] Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều

khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi

mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại

thành những mRNA sợi kép Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình

bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy

định nhiều protein khác của giun tròn Kết quả đều thu được protein được mã

hóa bởi các gen đó không được tổng hợp Qua đó Fire và Mello đã rút ra được

kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt Công

trình được công bố và được trao giải Nobel Y học năm 2006

1.5.2 Cơ chế gây bất hoạt gen

RNAi (RNA interference) được coi như một phương thức miễn dịch tự

nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân

huỷ các trình tự nucleotide tương đồng của chúng [8] Nó làm trung gian

kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng như điều khiển sự biểu

hiện gen mã hóa protein Nó được thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử

RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một

loại trình tự đặc hiệu

Hình 1.2 Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi

Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi được bắt đầu bằng việc phân cắt phân

tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc

họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thước khoảng 21 - 26 nucleotide [4] Các siRNA này được giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng

sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex) Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động như một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một

có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất được chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tương đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo

nguyên tắc bổ sung Khi đã được nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt

ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA

nuclease (Helicase) có trong RISC Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành

các siRNA Quá trình tiếp diễn liên tục như vậy sẽ phân hủy các bản mã sao

hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4]

Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và

đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông

nghiệp và y dược học Nó được biết đến như một kỹ thuật sinh học hiện đại

có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay

làm tăng cường, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật

Phương pháp này đã được ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất

béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lượng lysine trong ngô

hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25] RNAi là một

hướng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong

các liệu pháp trị bệnh cho con người trong tương lai cũng như phân tích

chức năng hệ gen cây trồng v.v

1.6 KỸ THUẬT GATEWAY

Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó

mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện

protein và dòng hóa đoạn DNA Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA

giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hướng chính và cấu

trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu

quả trong thời gian ngắn Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc

tách dòng có định hướng của các sản phẩm PCR Hơn nữa các phản ứng đơn

giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động Đây là kỹ thuật hữu ích cho

những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản

ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả

và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway

- Kỹ thuật Gateway được thực hiện bởi hai bước chính:

+ Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện (expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D)

+ Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa

“entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự

attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB

Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1

và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2

để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2 Mặt khác, đoạn gen quan tâm được

gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì

thế thu được trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn

1.7 NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA

Tái sinh cây được xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công

của các thí nghiệm chuyển gen Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật

thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian

ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn Ở

mía đã chuyển gen thành công với hai phương pháp là súng bắn gen và thông

qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là

hiệu quả hơn hẳn

Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía

bằng phương pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29] Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt

những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trường

cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D

bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo được đặt lên môi trường có bổ sung

thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol Sau chuyển gen các mô sẹo được đồng

nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày Tiếp theo mô sẹo được chuyển sang môi trường

chọn lọc và thu được cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trường có bổ

sung 45 mg/l geneticin

Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía

thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đường tạo đa

chồi với hiệu quả thu được là 49,6% cây chuyển gen [22] Lây nhiễm

A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thương của mía trong 10 phút Sau

đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trường MS trong 3 ngày Các mô

được diệt khuẩn bằng nước cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime

Ông tạo được các cây chuyển gen trên các môi trường chọn lọc tái sinh có bổ sung 5 mg/l ppt

Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông

qua A.tumefaciens GV2260 Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng

có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34] Mô sẹo được tạo

từ đoạn thân non trên môi trường [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3 mg/l 2,4D + 100 ml nước dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1

NZ-tháng Trước 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống ôxyhóa vào dịch khuẩn A.tumefaciens được hòa tan với môi trường cảm ứng

nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút Diệt khuẩn và

60 vòng/2 ngày Cây chuyển gen được tạo thành với các môi trường chọn lọc

có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin

Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua

sinh chọn lọc 500 mg/l carbenicillin và 1 mg/l ppt [28]

Như vậy, các tác giả đã tái sinh và chuyển gen thành công chủ yếu từ mô

sẹo và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens Để thành công việc chuyển gen vào

thực vật nói chung cũng như ở mía thì nhất thiết phải có một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm và cải biến hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen của các nghiên cứu thành công về mía ở trên

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Nguyên liệu thực vật

Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang được giữ

tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

- Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng

CV58C1 mang plasmid pGV2260

- Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs

2.1.3 Hóa chất khác

cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách

Bioneer (Hàn Quốc)

- Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ)

- Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction)

- Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN)

- Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng như Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs

2.1.3 Các thiết bị máy móc

Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy biến nạp bằng xung điện, máy đo OD, máy vortex, máy xác định trình tự nucleotid tự động của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Thiết kế mồi

Khai thác dữ liệu trong GenBank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá Invertase của cây mía (Bảng 3.2) Sử dụng phần mềm chuyên dụng DNAstar so sánh độ tương đồng giữa các trình tự Invertase thu được và thiết

kế cặp mồi đặc hiệu tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất

2.2.2 Tách RNA tổng số

Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA

tổng số từ các mẫu lá và bẹ thân non của 2 giống mía in vitro ROC1 và

ROC10 theo hướng dẫn kèm theo

2.2.3 RT-PCR

Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase ở mía bằng kỹ thuật RT-PCR

một bước (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau:

Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước

effendorf 0,5 ml đã được xử lý DEPC theo hướng dẫn của nhà sản xuất

(Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; 1 µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6

mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT Mix mẫu nhẹ nhàng và

thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt như bảng 2.2

Sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8

- 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và nhuộm bản gel trong ethidium

bromide (EtBr) Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction Kit

2.2.4 Tách dòng và xác định trình tự gen

Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ được gắn vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn (INV_pENTR) Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR được biến nạp

vào tế bào khả biến E.coli Top 10 và nhân nuôi lượng lớn trong môi trường

LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin Plasmid tái tổ hợp

C INV_pENTR được kiểm tra bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM

Chu kỳ của phản ứng như sau:

Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR