Khảo sát thành phần hóa học cây cỏ the centipeda minima (l)

Vì vậy, từ ngàn xưa, con người đã biết dùng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, ban đầu chỉ là các loại thuốc đơn giản chữa trị ngoài da, mẫn ngứa, hay dùng để băng bó các vết thương rồi phát

MSSV: K38.201.035

L ỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến với thầy Bùi Xuân Hào

và thầy Dương Thúc Huy và các thầy cô trong phòng hợp chất thiên nhiên Những người thầy, người cô đầy tâm huyết, đã thổi vào tâm hồn em niềm đam mê nghiên cứu khoa học và truyền dạy lại cho em những kinh nghiệm quý báu Những bước đầu còn gặp nhiều khó khăn, kiến thức còn chưa vững nhưng dưới sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cô, em đã hoàn thành tốt được công việc

Bên cạnh đó, cũng phải kể đến sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn sinh viên nghiên cứu K38 và K39 trong suốt thời gian qua Và cuối cùng em xin gửi lời cảm

ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh động viên, khích lệ tinh thần giúp em hoàn thành tốt khóa luận

i

M ỤC LỤC

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC - ASTERACEAE 1

1.2 CÁC CHI TRONG HỌ CÚC – ASTERACEAE 2

1.3 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE 2

1.3.1 Mô tả thực vật của cây cỏ the 3

1.3.2 Công dụng của cây cỏ the 3

1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE 4

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ 9

2.1.1 Hóa chất 9

2.1.2 Thiết bị 9

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 10

2.2.1 Thu hái nguyên liệu 10

2.2.2 Điều chế các loại cao 10

2.2.3 Cô lập các chất trong cao Ethyl acetate 12

2.2.4 Khảo sát phân đoạn A1 13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 14

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A 14

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1B 16

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

PH Ụ LỤC

ii

DANH M ỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

ddd Double of doublet of doublet Mũi đôi đôi đôi

Butanol Nước

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

 HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cây cỏ the 3

Hình 1.2 Hoa cỏ the 3

Hình 3.1 Cấu trúc hợp chất 1A 15

Hình 3.2 Tương quan HMBC của hợp chất 1A 15

Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất 1B 17

 SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế các loại cao 10

Sơ đồ 2.2 Quy trình sắc ký cột silica gel cao ethyl acetate 12

Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel cao phân đoạn A1 13

 BẢNG BIỂU B ảng 2.1 Khối lượng của các loại cao và hiệu suất so với bột mẫu nguyên liệu ban đầu

B ảng 2.2 Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the 11

B ảng 3.1 So sánh phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 1A và 3-methoxyquercetin 15

Bảng 3.2 So sánh phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của hợp chất 1B và quercetin 17

iv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Ph ụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1A…………

Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1A

Ph ụ lục 3 Phổ HMBC của hợp chất 1A

Ph ụ lục 4 Khối phổ phân giải cao của hợp chất 1B

Ph ụ lục 5 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1B

Ph ụ lục 6 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1B ………

v

LỜI MỞ ĐẦU

Thiên nhiên luôn huyền bí và diệu kì, nó không những là nơi sinh sống của mỗi con người mà còn là nguồn thực phẩm, là kho tàng thuốc vô cùng quý giá Vì vậy, từ ngàn xưa, con người đã biết dùng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, ban đầu chỉ là các loại thuốc đơn giản chữa trị ngoài da, mẫn ngứa, hay dùng để băng bó các vết thương rồi phát triển lên thành các phương thuốc quý giá chữa được các bệnh nan y Cùng với sự phát triển của khoa học, con người đã chiết suất được nhiều hợp chất hóa học được dùng để chữa trị nhiều căn bệnh hiểm nghèo, như hợp chất taxol được cô lập từ cây thông đỏ, hợp chất vinblastin từ cây dừa cạn, dùng điều trị ung thư vú ở phụ nữ Từ đó ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên ra đời và phát triển mạnh mẽ, kết hợp với y dược và sinh học ngày càng cho ra đời nhiều hợp chất có giá trị cao, nâng cao giá trị của thực vật và cuộc sống con người

Trong y học cổ truyền Việt Nam, có rất nhiều loại cây cỏ được sử dụng làm thuốc như: chùm ruột, cỏ sữa, cành giao, me rừng…trong đó có cây cỏ the hay còn gọi là cóc mẳn được sử dụng rộng rãi với nhiều công dụng như: điều trị viêm mũi dị ứng, viêm xoang, viêm họng, ung thư biểu mô Những năm gần đây trên thế giới đã

có nhiều nghiên cứu sinh học và y dược về cỏ the và đã cô lập được một số hợp chất

có khung sườn sesquiterpen lacton có khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư…Dựa trên những tiền đề nghiên cứu đã có, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học trên cao Ethyl acetat của cây cỏ the với mong muốn đóng góp vào việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 VÀI NÉT VỀ HỌ CÚC – ASTERACEAE [2]

Họ Cúc (Asteraceae) còn được gọi là họ Hướng dương hay họ Cúc tây, là một

họ thực vật có hai lá mầm Họ Cúc là họ lớn nhất trong ngành thực vật có hoa, với khoảng 25.000 loài, gồm 2 phân họ:

- Phân họ hoa ống (Tubuliforae hay Asteroideae): trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu

- Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguiiflorae hay Cichorioideae): tất cả các hoa trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không bao giờ có hoa ống Cây có nhựa mủ

Họ Cúc phân bố rộng khắp thế giới, nhưng phổ biến nhất là tại các khu vực ôn đới và miền núi nhiệt đới

Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trên 350 loài, chủ yếu là cỏ dại, một

số được trồng làm cảnh (các loại hoa cúc), rau ăn (ngải cứu, cải cúc, rau diếp), gia

vị (cúc tần)… Họ Cúc là họ có số loài được dùng làm thuốc lớn nhất trong giới thực vật Có khoảng 51 loài của họ Cúc được dùng làm thuốc, trong đó có 18 loài được dùng trong công nghiệp dược như các loài: atisô, bạch truật, cỏ nhọ nồi, cỏ ngọt, cúc hoa, cúc tần, hồng hoa, hy thiêm, ké đầu ngựa, khoản đông hoa, mần tưới, mộc hương, ngải cứu, ngưu bàng, sài đất, thương truật, thanh hao hoa vàng, tử uyển

• M ột số đặc điểm thực vật của họ Cúc:

Thân cỏ hay bụi, sống một năm hay nhiều năm, ít khi là dây leo hay cây gỗ

Rễ có thể phù lên thành củ, nhưng chất dự trữ ở đây không phải là tinh bột mà

là inulin (ví dụ như cây thược dược)

Lá có hình dạng biến thiên, không có lá kèm, thường mọc đối hoặc tụ thành hình hoa ở gốc, có những loại lá có gai Thông thường phiến lá nguyên, xẻ sâu, hình dạng lá kép hình lông chim

Cụm hoa: đầu, có thể mang nhiều hoa hay ít hoa Đầu có thể đứng riêng lẻ hay

tụ thành chùm, gié, xim, nhưng thông thường nhất là tụ thành ngù

2

Hoa: lưỡng tính, mẫu năm, bầu dưới, không có lá bắc con Các hoa trên một đầu có thể giống nhau, có cùng cách cấu tạo, cùng chức năng

Bao hoa: lá đài thường giảm vì nhiệm vụ bảo vệ đã được đảm nhiệm bởi các lá bắc của tổng bao Đài có thể biến mất, đôi khi chỉ còn một gờ nhỏ, nguyên hay có thùy, gờ có thể mang những vẩy hoặc một vòng lông tơ Sau khi thụ tinh, đài có thể phát triển thành một mào lông, có thể láng hay có gai, có nhiệm vụ trong sự phát tán của quả

Bộ nhị: năm nhị bằng nhau, đính trên ống tràng và xen kẽ với cánh hoa Bao phấn mở dọc, hướng trong, dính nhau thành một ống bao quanh vòi

Bộ nhụy: hai lá noãn ở vị trí trước và sau, tạo thành bầu dưới một ô, đựng một noãn, đính đáy Đĩa mật ở trên bầu Ở hoa lưỡng tính và hoa cái, vòi xuyên qua đĩa

mật và chia thành hai nhánh đầu nhụy Các nhánh đầu nhụy mang ở mặt dưới những lông để quét hạt phấn khi vòi mọc xuyên qua ống cấu tạo bởi các bao phấn Sự thụ phấn nhờ côn trùng

Quả bế, thường mang một mào lông do đài biến đổi, có khi mào lông được mang bởi một cuống dài hay ngắn Đôi khi quả trần hoặc có móc hay có gai Hạt không có nội nhũ, lá mầm to, nhiều khi chứa đầy dầu

1.2 CÁC CHI TRONG HỌ CÚC

Ở Việt Nam, họ Cúc có khoảng 125 chi, trong đó có một số chi tiêu biểu,

thường gặp như chi Gerbera, chi Helianthus L, chi Cynara Cây cỏ the là một loài

thuộc chi Centipeda

1.3 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CỎ THE [3]

Cây cỏ the thuộc họ Cúc, chi Centipeda

Tên khoa học: Centipeda minima (L)

Tên thông thường: nga bất thực thảo, địa hồ tiêu, cầu tử thảo, cóc mẳn, cúc mẩn, thạch hồ tuy.[3]

1.3.1 Mô tả thực vật cây cỏ the

Cỏ the là loại cỏ mềm, mọc bò lan trên mặt đất ẩm, thân rất nhiều cành, ở ngọn có lông mịn trắng, nhưng toàn thân trông nhẵn bóng Lá đơn, mọc so le, hình

3

ba lá cạnh, đầu tù, phía cuống hẹp lại, mép có một, hai hoặc ba răng cưa Lá dài khoảng 10-18 mm, rộng khoảng 6-10 mm, gân chính hơi nổi ở mặt dưới lá, gân phụ không rõ, không có cuống Cụm hoa hình đầu mọc ở nách lá, hoa cái gồm nhiều lớp, cánh hoa hình ống màu trắng, trên có răng cưa Tràng hoa hình chuông, có bốn răng, hình trứng rộng, màu hơi tím Quả bế bốn cạnh, trên cạnh có lông mịn nhỏ Mùa ra hoa khoảng tháng 2 - 5, mùa quả khoảng tháng 4 - 7

Để dùng làm thuốc, thường hái toàn cây, gồm cả rễ, dùng tươi hay phơi hoặc sấy khô Cây mọc hoang khắp nơi ở vùng đồng ruộng ẩm thấp, ruộng bỏ hoang, bờ rãnh, ven đường…

Hình 1.1 Cây c ỏ the Hình 1.2 Hoa c ỏ the

1.3.2 Công dụng của cây cỏ the

Cây cỏ the có vị cay, mùi hắc, tính ấm, có tác dụng tiêu thũng, tiêu viêm, tiêu sưng, giải độc Cỏ the còn được dùng làm thuốc chữa ho, viêm phế quản, mắt đau

đỏ sưng, chảy nước dãi, đau màng mộng mắt, viêm mũi dị ứng, hay dùng ngoài để chữa bệnh mẫn ngứa (eczema), trị rắn cắn, đắp bó gãy xương.[2]

Phần thân, lá và hoa của cây cỏ the còn được sử dụng phổ biến trong các bài thuốc dân gian Ví dụ như trong các bài thuốc dân gian của Trung Quốc, cây cỏ the được dùng để chữa bệnh đau đầu, cảm lạnh, viêm kết mạc và bệnh sốt rét Ở Đài

4

Loan, cỏ the được nấu lấy nước để tắm cho trẻ em bị bệnh ghẻ lở, hay uống để trị các bệnh về hệ tiêu hóa.[9]

• M ột số bài thuốc dân gian sử dụng cây cỏ the:

Chữa mẩn ngứa (eczema): cỏ the hai phần, đậu xanh một phần, muối vài hạt

Cả ba thứ giã nhỏ đắp lên nơi bị mẩn ngứa đã được rửa sạch

Chữa ho: cỏ the khô 20 g hoặc tươi 30 g, nước 500 ml sắc còn 100 ml chia ba lần uống trong ngày

Chữa viêm mũi, nghẹt mũi: dùng cỏ the, hoa mộc lan (mỗi vị 6 g), ké đầu ngựa (10 g), sắc lấy nước uống Nếu dùng ngoài, nghiền cỏ the, tế tân và bạch chỉ rồi đặt mỗi lần một ít vào trong mũi

1.4 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÓ TRONG CÂY CỎ THE

Năm 1989, Dipti Gupta và J Singh công bố bốn triterpenoid saponin từ cây cỏ

the là acid lα,3β,19α,23-tetrahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (1),

acid lβ,2α,3β,19α,23-pentahydroxyurs-12-en-28-oic-28-O-β-d-xylopyranosid (2),

3α,2lα,22α,28-tetrahydroxyolean-l2-en-28-O-β-d-xylopyranosid (3),

3

α,l6α,2lα,22α,28-pentahydroxyolean-l2-en-3-O-β-d-xylopyranosyl-28-O-β-d-xylopyranosid(4).[4]

Năm 1990, cũng Dipti Gupta và Singh J đã nghiên cứu và tìm ra một số chất

trong cây cỏ the, gồm: tetratriacontanyl nonadecanoat (5), sitosterol (6),

3,3′,5,5′-tetramethoxy stilben (7), 2-isopropyl-5-methylhydroquinon-4-O- β-d-xylopyranosid

hydroxy-1βH-guaia-9,11(13)-dien-12,8α-olid (16), 2β-(isobutyryloxy)florilenalin

(17), pulchellin-2α-O-tiglat (18), florilenalin-2α-O-tiglat (19).[4]

5

Năm 2012, Peng Wu và các cộng sự đã cô lập được các chất sau: 4-oxo-2βhydroxy-6α-angeloyloxy-pesudoguaia-8β,12-olid (20), 4-oxo-2β-ethoxy-6α-angeloyloxy-pesudoguaia-8β, 12-olid (21), 4,6α-dihydroxy-2α -angeloyloxy-pesudoguaia-11(13)-en-8α,12-olid (22), 4-hydroxy-2α-angeloyloxy-pesudoguaia-11(13)-en-8α,12-olid (23), 4,5-epoxy-2α-angeloyloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid

-(24), 4,5-epoxy-2α-isobutyryloxy-guaia-11(13)-en-8β,12-olid (25), plenolin (26),

arnicolid D (27), pulchellin-2a-O-isovalerat (28), florilenalin-2a-O-isovalerat (29), florilenalin-2a-O-isobutyrat (30), florilenalin-2a-O-angelat (31) và helenalin (32).[8]

OH

O

OH HO

O

OH HO

OH

6

(6)

O Me

MeO

MeO

OMe OMe

(8)

HO

C HO

OH

O O

(9)

O

OH HO OH

HO

OH

OH O

(10)

HO

OH

OH O OH

(11)

O

OH HO

OH

O

OH HO OH

7

O O O

O

H

H

H O

H

HO

O O H

H O

HO

O O H

O

H O

HO

O O H

O

O O

HO

O O H

H

HO

O O H

H

O

H O O

HO

O O

O

O O H

H

O

H O O

O O H

H

O

8

O O H

O

H OH

H

O O H

H

O

H O O

HO

O O H

H

H O O

HO

O O H

H

H O O

HO

O

O H

H

O O H

O OHH

H

9

Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

2.2 NGUYÊN LIỆU VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

2.2.1 Thu hái nguyên li ệu

Cây cỏ the được thu hái ở tỉnh Vĩnh Long vào tháng 07 năm 2013 Cây tươi được rửa sạch và để khô tự nhiên trong mát Sau đó, sấy khô ở 50 – 60oC và được xay nghiền thành bột mịn thu được 3,2 kg bột thô

10

2.2.2 Điều chế các loại cao

Đun hoàn lưu 3,2 kg bột thô với dung môi methanol (3 lần x 3 giờ), lọc nóng,

cô quay ở áp suất thấp, thu hồi dung môi được cao methanol Chiết phân bố lỏng - lỏng cao methanol lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa,

ethyl acetate và n-butanol Cô quay các dịch chiết, thu được các loại cao tương ứng:

cao eter dầu hỏa (320,2 gam), cao ethyl acetate (36,5 gam), cao butanol (13,6 gam) Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 Hiệu suất điều chế các loại cao được trình bày trong bảng 2.1

11

Bảng 2.1 Khối lượng của các loại cao và hiệu suất so với bột mẫu nguyên

liệu ban đầu

2.2.3 Cô lập các chất trong cao Ethyl acetate

Thực hiện sắc ký cột silica gel trên cao ethyl acetate, hệ dung môi giải ly hexane – ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ hệ hexane – ethyl acetate 9:1; 8:2 (tỷ lệ thể tích) đến ethyl acetate – methanol 1:1 Sau khi cô quay thu hồi dung môi thu được năm phân đoạn tương ứng, được ký hiệu từ A1 đến A9 Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng, với thuốc thử hiện hình là Vanilin, dung dịch acid sulfuric 20% (phun đều lên bản mỏng silica gel và sấy nóng), hoặc phát hiện vết bằng đèn UV Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate được trình bày trong bảng 2.2

n-B ảng 2.2 Kết quả sắc ký cột trên cao ethyl acetate (36,5 g) của cây cỏ the

2.2.4 Khảo sát phân đoạn A1

Thực hiện sắc ký cột phân đoạn A1 (8,60 g) trên silica gel pha thường, hệ dung môi giải ly chloroform-methanol, với độ phân cực tăng dần, dựa trên kết quả sắc ký bản mỏng, gộp được năm phân đoạn và kí hiệu: CT-I, CT-II, CT-III, CT-IV

đã cô lập được hai hợp chất, ký hiệu 1A; 1B

Sơ đồ 2.3 Quy trình sắc ký cột silica gel phân đoạn A1

CT-I

(2,56 g)

CT-III (1,79 g)

CT-IV (1,38 g)

CT-V (1,49 g) C-M (99:1) C-M (98:2) C-M (19:1) C-M (9:1) C-M (8:2)

13

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT 1A

Hợp chất 1A thu được được từ phân đoạn A1 của cao ethyl acetate với các

đặc điểm như sau:

Phổ 1H-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của năm proton nhân

thơm trong khoảng 6-8 ppm, trong đó proton nhân thơm ở δH 6,18 (1H; d; J 2,0;

H-6) ghép cặp meta với proton ở δH 6,39 (1H; d; J 2,0; H-8) xác nhận hợp chất có

vòng benzene với bốn nhóm thế; proton nhân thơm ở δH 7,44 (1H; dd; J 8,0; 2,5;

H-6′) ghép cặp ortho với proton nhân thơm ở δH 6,90 (1H; d; J 8,5; H-5′) và ghép cặp

meta với proton nhân thơm ở δH 7,54 (1H; d; J 2,0; H-2′) chứng tỏ ba proton này ở

các vị trí 1,2,4 trên nhân thơm B Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện

của một proton nhóm hydroxyl kiềm nối tại δH 12,7 và proton của nhóm methoxyl

tại δH 3,77

Phổ 13C-NMR của hợp chất 1A cho thấy có sự hiện diện của mười sáu carbon,

trong đó carbon carbonyl cộng hưởng tại δC 177,4 (C-4), năm carbon methine thơm

cộng hưởng tại δC 115,3 (C-2’); δC 115,7 5’); 120,5 6’); 98,6 6); 93,6

(C-8)

Ngoài ra, phổ 13C-NMR còn cho thấy sự hiện diện của tín hiệu Csp3 gắn

oxygen cộng hưởng tại δC 59,6

14