Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin

Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã được thực hiện .... Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gâ

CURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

CURCUMIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Văn Hải

2 Th.S Ngô Quang Trung

Nơi thực hiện:

Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội

1 Bộ môn Công nghiệp Dược

2 Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI - 2016

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc

biệt là PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, TS Nguyễn Văn Hải, Th.S Nguyễn Văn Giang, và CN Phan Tiến Thành của tổ môn Tổng hợp Hóa dược đã nhiệt tình

giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu nhà trường cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ Khoa Hóa học trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, cùng toàn thể các thầy cô trong trường, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội, tôi xin chân thành cảm ơn!

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình và bạn bè - những người luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập!

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn hạn chế, nên khóa luận không tránh khỏi nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Đình Quý

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNGQUANVỀCURCUMIN 3

1.1.1 Cấu trúc phân tử curcumin 3

1.1.2 Tính chất hóa lý 4

1.1.3 Phương pháp điều chế 6

1.1.4 Độ ổn định 7

1.1.5 Tác dụng sinh học của curcumin 8

1.2 TRIỂNVỌNGPHÁTTRIỂNCÁCDƯỢCCHẤTMỚITHÔNGQUA VIỆCBIẾNĐỔICẤUTRÚCPHÂNTỬCURCUMIN 10

1.2.1 Thay đổi nhóm chức diceton 10

1.2.2 Thay đổi tại nhóm methylen 11

1.2.3 Thay đổi chuỗi gắn với aryl 11

1.3 CÁCPHẢNỨNGALKYLHÓACURCUMIN 12

1.3.1 Phương pháp alkyl hóa 12

1.3.2 Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã được thực hiện 13

1.4 LỰACHỌNHƯỚNGNGHIÊNCỨUBÁNTỔNGHỢPVÀTHỬTÁC DỤNGSINHHỌC 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊNLIỆU–HÓACHẤT 15

2.2 DỤNGCỤ-THIẾTBỊ 15

2.3 NỘIDUNGNGHIÊNCỨU 16

2.4 PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 16

2.4.1 Tổng hợp hóa học 17

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 17

2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học 17

2.4.4 Thử hoạt tính sinh học 18

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21

3.1 TỔNGHỢPHÓAHỌC 21

3.1.1 Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-cloroethyl)-curcumin (SP1) 22

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin (SP2) 24

3.2 XÁCĐỊNHCẤUTRÚC 25

3.2.1 Xác định cấu trúc sản phẩm SP1 25

3.2.2 Xác định cấu trúc sản phẩm SP2 27

3.3 THỬHOẠTTÍNHGÂYĐỘCTẾBÀO 28

3.4 BÀNLUẬN 29

3.4.1 Về tổng hợp hóa học 29

3.4.2 Về xác định cấu trúc 32

3.4.3 Về thử hoạt tính sinh học 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton)

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon)

(Phổ hồng ngoại)

(Dòng tế bào ung thư phổi)

(Dòng tế bào ung thư vú)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục các nguyên liệu - hóa chất 15

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ thiết bị 15

Bảng 3.1 Khảo sát thời gian phản ứng của phản ứng (1) 23

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của SP1 25

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của SP1 26

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của SP1 26

Bảng 3.6 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) của SP1 26

Bảng 3.7 Kết quả phân tích phổ IR (KBr) của SP2 27

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phổ ESI-MS (MeOH) của SP2 27

Bảng 3.9 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) của SP2 28

Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR 125 MHz, CDCl3) của SP2 28

Bảng 3.11 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào MCF-7 và LU-1 29

Bảng 3.13 Kết quả phân tích phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) của curcumin 34

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của curcumin 3

Hình 1.2 Các đồng phân enol - ceton của curcumin 3

Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceton-enol của curcumin trong dung dịch 3

Hình 1.4 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch 4

Hình 1.5 Phản ứng của curcumin với gốc tự do 5

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin 6

Hình 1.7 Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin 6

Hình 1.8 Phức của curcumin và dẫn chất với kim loại 6

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B), bisdemethoxycurcumin (C) 7

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp curcumin 7

Hình 1.11 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm 8

Hình 1.12 Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng khi không có mặt O28 Hình 1.14 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin: sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene (D), tạo phức hợp kim loại - curcumin (E) 10

Hình 1.15 Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin 11

Hình 1.16 Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin 11

Hình 1.17 Dẫn chất thay đổi tại nhóm methylen hoạt động của curcumin 11

Hình 1.18 Một số dẫn chất thay đổi chuỗi gắn với aryl của curcumin 12

Hình 1.19 Sơ đồ tổng hợp diethyl-curcumin của Hemanta Chowdhury và cộng sự 13

Hình 1.20 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất methoxycarbonylmethyl-curcumin của Hironori Ohtsu và cộng sự 13

Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin 13

Hình 1.22 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin 14

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn halogenoethyl của curcumin 17

Hình 3.1 Sơ đồ quá trình bán tổng hợp dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin

21

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất di-O-(2-cloroethyl)-curcumin 22

Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin 24

Hình 3.4 Cơ chế phản ứng SN2 30

ĐẶT VẤN ĐỀ

Từ xa xưa, củ Nghệ đã được sử dụng phổ biến ở một số nước châu Á như một thứ gia vị chính giúp điều hương, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm Không những thế, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thương… và đặc biệt dùng để chữa các bệnh có liên quan đến dạ dày Ngày nay, người ta đã phát hiện ra nhóm chất màu curcuminoid - nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ

Curcuminoid là tên gọi chung của các chất mang khung diarylheptadien được

phân lập từ thân rễ cây Nghệ vàng (Curcuma longa, họ Gừng - Zingiberaceae), bao

gồm curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin và một số chất khác, trong đó curcumin là thành phần chủ yếu [12]

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh curcumin có tác dụng chống oxy hóa mạnh, kháng viêm, chống đái tháo đường, kháng virus, kháng khuẩn và ức chế phát triển khối u [3] Hiện nay, curcumin được sử dụng như dược chất trong nghiên cứu lâm sàng cho các bệnh nhân ung thư phổi, viêm khớp dạng thấp, bệnh Alzheimer, ung thư trực tràng, bệnh vảy nến [37]

Với nhiều ưu điểm; nguồn nguyên liệu dồi dào, sẵn có; và xu hướng ngày càng

ưa chuộng những sản phẩm nguồn gốc từ thiên nhiên thì việc phát triển những hoạt chất từ curcumin đang là hướng nghiên cứu rất có tiềm năng Nhiều tác giả trên thế giới đã nghiên cứu về việc biến đổi cấu trúc của curcumin và đã đạt được những thành công nhất định trong việc nâng cao hoạt tính sinh học hay sinh khả dụng của

nó Trong đó những nghiên cứu biến đổi chuỗi gắn với Aryl của curcumin đã thu được những dẫn chất có hoạt tính chống ung thư khá tốt [1] [15]

Hiện nay, curcumin đang được nghiên cứu và sử dụng phổ biến trong các chế phẩm ngăn chặn sự khởi phát, phát triển và di căn của khối u Curcumin có khả năng diệt các tế bào ác tính, ngăn chặn hình thành tế bào ung thư mới mà không làm ảnh hưởng đến các tế bào lành [29]

Bên cạnh đó, nhiều dẫn chất dạng alkyl-halogen có hoạt tính chống ung rất tốt điển hình là Melphalan, Clorambucil, Meclorethamin với các biệt dược nổi tiếng như Alkeran Sarcoclorin, Amboclorin, Mustargen [8]

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào một số dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin” với 2 mục tiêu là:

1 Tổng hợp một số dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin

2 Thử tác dụng gây độc tế bào của các dẫn chất tổng hợp được

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1.1 Cấu trúc phân tử curcumin

- Cấu trúc phân tử (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của curcumin

- Tên khoa học: dion [36]

(1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)hepta-1,6-dien-3,5 Tên khác: Diferuloylmethan, curcumin I [36]

- Công thức phân tử: C21H20O6

- Khối lượng phân tử: 368,39 đvC [36]

Hình 1.2 Các đồng phân enol - ceton của curcumin

Curcumin và dẫn chất tồn tại ở dạng đồng phân hỗ biến: cis-diceton hoặc

trans-diceton và dạng enol (cis-enol) [25] (Hình 1.2) Trong dung dịch, trạng thái cân bằng giữa dạng diceton và dạng enol được thiết lập (Hình 1.3) Tùy theo từng dung

môi khác nhau mà tỷ lệ giữa dạng diceton và dạng enol có thể khác nhau Trong một số dung môi, dạng enol có thể chiếm hơn 95% [23]

Hình 1.3 Dạng hỗ biến ceton-enol của curcumin trong dung dịch

dung dịch màu đỏ máu [27]

 Điểm chảy: 182-183oC [6]

 Sự hấp thụ ánh sáng:

Các phân tử curcuminoid có khả năng hấp thụ bức xạ khả kiến, tạo ra màu vàng Tính chất hấp thụ ánh sáng của chúng gần giống nhau với cực đại hấp thụ khác nhau rất ít: 429nm đối với curcumin, 424nm với demethoxycurcumin và 419nm với bisdemethoxycurcumin [20] Chúng có khả năng phát huỳnh quang (520nm) khi hấp thụ bức xạ tử ngoại có bước sóng 350nm [25]

1.1.2.2 Tính chất hóa học

 Sự điện ly theo pH:

Hình 1.4 Các dạng tồn tại của curcumin theo pH dung dịch

Sự điện ly của curcumin trong khoảng pH = 1-11 đã được nghiên cứu bằng phương pháp HPLC và cho kết quả như sau:

- Ở pH < 1, dung dịch nước của curcumin có màu đỏ và tồn tại ở dạng ion H4A+

- Ở khoảng pH = 1-7, curcumin rất ít tan trong nước Ở khoảng pH này, dung dịch nước của curcumin có màu vàng và tồn tại chủ yếu ở dạng trung tính H3A

- Ở pH > 7,5, dung dịch có màu đỏ, curcumin tồn tại ở các dạng ion H2A-, HA2- và

A3- lần lượt tương ứng với các giá trị pka là 7,8; 8,5 và 9,0 [23] (Hình 1.4)

 Phản ứng của nhóm hydroxyl trên vòng benzen

Các cặp electron chưa liên kết của oxy nhóm hydroxyl liên hợp mạnh với vòng benzen làm cho nguyên tử hydro của nhóm hydroxyl trở nên linh động hơn Vì vậy

mà curcumin có tính acid và có khả năng phản ứng với các gốc tự do Phản ứng với các gốc tự do của curcumin còn liên quan đến sự di chuyển hydro của nhóm methylen hoạt động (C-4) Nhờ 2 cơ chế trên mà curcumin có thể làm giảm hay làm

mất hoạt tính của các gốc này nên có tác dụng chống oxy hóa mạnh [34] (Hình 1.5)

Hình 1.5 Phản ứng của curcumin với gốc tự do

 Phản ứng hydro hóa

Trong công thức cấu tạo của curcumin có chứa các hydrocarbon chưa no, do đó

có khả năng tham gia phản ứng cộng hợp 1 hoặc nhiều phân tử hydro khi có mặt xúc tác kim loại hay oxyd kim loại (Ni, PtO2…) tạo các dẫn chất dihydrocurcumin, tetrahydrocurcumin, thậm chí khử ceton Các sản phẩm này cũng là các chất chống

oxy hóa (Hình 1.6)

Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng khử curcumin thành tetrahydrocurcumin

 Phản ứng imin hóa

Nhóm β-diceton của curcumin có thể phản ứng với các amin bậc nhất (Y-NH2) như hydroxylamin (Y = -OH), phenylhydrazin (Y = C6H5-NH-)… để tạo thành các dẫn chất imin tương ứng Các dẫn chất này đều có hoạt tính chống nấm và chống

oxy hóa tốt [4] (Hình 1.7)

Hình 1.7 Phản ứng imin hóa β-diceton của curcumin

 Phản ứng tạo phức

Hình 1.8 Phức của curcumin và dẫn chất với kim loại

Do cấu trúc β-diceton trong môi trường acid và trung tính nằm dưới dạng hỗ biến

ceton-enol đối xứng và ổn định nên curcuminoid có khả năng tạo phức với nhiều ion kim loại khác nhau: Mn2+, Fe2+, Cu2+…[11]

1.1.3 Phương pháp điều chế

1.1.3.1 Nguồn gốc Curcumin

Curcuminoid là tên gọi chung một nhóm dẫn xuất diarylheptan được phân lập từ

thân rễ cây Nghệ vàng Curcuma longa L., bao gồm curcumin, demethoxycurcumin,

bisdemethoxycurcumin và một ít cyclocurcumin Chúng là những hợp chất

phenolic, khác nhau ở nhóm thế trên gốc phenyl (Hình 1.9) [12]

Hình 1.9 Công thức cấu tạo của curcumin (A), demethoxycurcumin(B),

bisdemethoxycurcumin (C)

1.1.3.2 Chiết xuất Curcumin từ củ nghệ

Năm 1977, Nguyễn Khang (Đại học Dược Hà Nội) đã chiết bột củ nghệ sau khi

đã cất lấy hết tinh dầu với benzen, sau đó cất thu hồi dung môi và kết tinh lại trong ethanol đến khi thu được một vết trên sắc ký lớp mỏng và có nhiệt độ nóng chảy không đổi, thu được 0,76-1,1% curcumin I tinh khiết, độ chảy 182-183°C [6]

Một phương pháp khác để chiết tách curcumin là chiết bằng siêu âm Bột nghệ được chiết với dung môi thích hợp thu sản phẩm thô và tinh chế bằng sắc ký cột silicagel, thu được curcumin tinh khiết [10]

1.1.3.3 Tổng hợp toàn phần curcumin

Phương pháp thông thường sử dụng để tổng hợp curcumin là phương pháp đi từ

valinin và aceton [16] Sơ đồ phản ứng chung được trình bày trong Hình 1.10

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp curcumin

1.1.4 Độ ổn định

 Phân hủy trong môi trường kiềm:

Curcumin tương đối bền ở pH acid, nhưng nhanh chóng bị phân hủy ở pH > 7 Tonnesen và Karlsen (1985) đã nghiên cứu sự phân hủy của curcumin ở pH = 7-10

và xác định sản phẩm phân hủy bằng phương pháp HPLC Ban đầu sản phẩm phân hủy là acid ferulic và feruloylmethan; sau đó feruloylmethan tiếp tục phân hủy thành vanillin và aceton, acid ferulic phân hủy thành vinylguaiacol và CO2; ngoài ra

còn có các sản phẩm ngưng tụ [23] (Hình 1.11)

Sản phẩm ngưng tụ

Hình 1.11 Sự phân hủy curcumin trong môi trường kiềm

 Phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng:

Curcumin kém bền với ánh sáng ngay cả khi có và không có mặt của O2 Khi có mặt O2, curcumin bị phân hủy thành vanillin, acid vanillic, aldehyd ferulic và acid ferulic Trong điều kiện không có O2, curcumin có thể bị vòng hóa [23] (Hình 1.12)

Hình 1.12 Sự phân hủy curcumin dưới tác dụng của ánh sáng khi không có mặt O 2

1.1.5 Tác dụng sinh học của curcumin

Curcumin đã được chứng minh là có hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và ký sinh trùng, kháng viêm, chống viêm loét dạ dày-tá tràng, làm lành vết thương, liền sẹo, chống tăng sinh và ngăn ngừa ung thư [3] [14] [28] Nghiên cứu trên động vật cho thấy curcumin có hiệu quả với một số bệnh như tiểu đường, béo phì, rối loạn tâm thần [3] Dưới đây là một số tác dụng sinh học nổi bật của curcumin

 Tác dụng phòng và điều trị ung thư

Curcumin có tác dụng diệt tế bào ung thư theo cơ chế tự hủy diệt từng phần các

tế bào ác tính, kìm hãm tế bào ung thư ở cả ba giai đoạn khởi phát, tiến triển và giai đoạn cuối [32] Hiện nay có trên một nghìn công trình được tiến hành và kết quả bước đầu cho thấy [38]:

- Curcumin ngăn các các tế bào ung thư đi vào pha tổng hợp của chu kỳ tế bào

- Curcumin thúc đẩy các tế bào ung thư đi vào chết tế bào theo chương trình

- Curcumin là chất ức chế tạo mạch máu mới mạnh

 Tác dụng chống viêm

Curcumin có khả năng ức chế nhiều chất liên quan đến phản ứng viêm như phospholipase, LOX, COX-2, leukotrien, thromboxan, prostaglandin… Curcumin còn ức chế quá trình sản xuất các cytokin tiền viêm trong PMA hay bạch cầu đơn nhân ở máu ngoại vi và ở các đại thực bào phế nang Ngoài ra curcumin còn làm tăng và kéo dài tác dụng của cortisol, một chất chống viêm tự nhiên trong cơ thể Các thử nghiệm lâm sàng đã cho thấy hiệu quả của curcumin trong việc điều trị bệnh viêm khớp do gout, viêm xương khớp và viêm khớp dạng thấp [33]

 Tác dụng điều trị viêm loét dạ dày - tá tràng

Nghệ đã được chứng minh là có tác dụng làm giảm tiết dịch vị, làm tăng chất nhầy ở thành dạ dày, ức chế sự hình thành loét và chống lại tác động của các yếu tố gây loét như stress, rượu, thuốc reserpin Do đó Nghệ có tác dụng bảo vệ niêm mạc dạ dày - tá tràng Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng curcumin có tác dụng

ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn H pylori [14]

1.2 TRIỂN VỌNG PHÁT TRIỂN CÁC DƯỢC CHẤT MỚI THÔNG QUA

VIỆC BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC PHÂN TỬ CURCUMIN

Mặc dù có nhiều ưu điểm nổi bật về tác dụng sinh học cũng như độ an toàn cao nhưng việc sử dụng curcumin qua đường uống để điều trị gặp phải một số khó khăn như sinh khả dụng rất thấp, bị chuyển hóa nhanh khi vào cơ thể và một số hoạt tính chưa có ý nghĩa lâm sàng [15] Có nhiều nghiên cứu biến đổi cấu trúc của curcumin được tiến hành và đã đạt được những thành công nhất định với việc nâng cao hoạt tính sinh học hay sinh khả dụng của curcumin Việc biến đổi trong cấu trúc của curcumin bao gồm sửa đổi chuỗi bên aryl, chức diceton, các liên kết đôi, thay đổi chức methylen hoạt động, tạo phức kim loại của curcumin [13] (Hình 1.13) Sau đây là một số ví dụ cụ thể về các dẫn chất bán tổng hợp từ curcuminoid

Hình 1.13 Khả năng sửa đổi cấu trúc của curcumin: sửa đổi chuỗi bên aryl (A), sửa đổi chức diceton (B), sửa liên kết đôi (C), sửa chức hoạt động methylene (D),

tạo phức hợp kim loại - curcumin (E)

1.2.1 Thay đổi nhóm chức diceton

J.S.Shim và cộng sự đã tổng hợp được một vài dẫn xuất hydrazinocurcumin (HC)

và hydrazinobenzoylcurcumin (HBC) [35] Kết quả nghiên cứu cho thấy HC có hoạt tính ức chế tế bào BAOEC (Bovine aortic endothelial cells), ngăn chặn tiến trình angiogenesis (một trong các tiến trình phát triển của ung thư) cao hơn 30 lần

so với curcumin Ngoài ra HC còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào: HT29, NH3T3, Chang HBC thể hiện hoạt tính ức chế dòng tế bào BAOEC mạnh hơn curcumin nhưng kém hơn HC HBC có hoạt tính ức chế mạnh trên tế bào HCT15, ở nồng độ 40μM HBC thì hầu như toàn bộ tế bào HCT15 bị ức chế sau hơn 48h

Hình 1.14 Phản ứng tổng hợp hydrazinocurcumin

Hình 1.15 Phản ứng tổng hợp hydrazinobenzoylcurcumin

1.2.2 Thay đổi tại nhóm methylen

Hình 1.16 Dẫn chất thay đổi tại nhóm methylen hoạt động của curcumin

Dẫn chất trên đã được Ohtsu bán tổng hợp từ curcumin và được Ohtsu đánh giá như một chất có tiềm năng đối kháng với androgen receptor (AR), chống lại dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở người, PC-3 và DU Kết quả cho thấy hoạt động kháng androgen của dẫn chất trên vượt trội hơn so với hydroxyflutamide - một hợp chất kháng androgen tiêu chuẩn hiện có sẵn để điều trị ung thư tuyến tiền liệt [30]

1.2.3 Thay đổi chuỗi gắn với aryl

Fuchs và cộng sự đã thực hiện việc biến đổi trên chức –OH của chuỗi aryl thu

được dẫn chất (1) và (2) (Hình 1.17) đồng thời đánh giá tác dụng của chúng trên

dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt và dòng tế bào ung thư vú Kết quả cho thấy chúng có tác dụng chống lại tế bào ung thư tuyến tiền liệt mạnh thể phụ thuộc androgen cũng như thể không phụ thuộc androgen Các hợp chất này cũng ức chế dòng tế bào ung thư vú thể phụ thuộc estrogen và không phụ thuộc estrogen [18] Aggrwal và cộng sự đã tổng hợp phức [DLys6 ]-LHRH-curcumin (dẫn chất (3)

Hình 1.17) và nghiên cứu tác dụng chống ung thư tuyến tụy trên cả in vivo và in

vitro Kết quả cho thấy [DLys6 ]-LHRH-curcumin ức chế sự tăng sinh tế bào ung

thư trên in vitro Trên in vivo, [DLys6]-LHRH-curcumin ngăn chặn sự tăng sinh của tế bào ung thư tuyến tụy ở chuột, làm giảm trọng lượng và khối lượng khối u một một cách đáng kể so với curcumin [13]

Handler và cộng sự đã tổng hợp các chất tương tự curcumin trong đó hợp chất

(4), (5) (Hình 1.17) đã được chứng minh có khả năng ức chế mạnh enzym COX-1

và COX-2 [19]

Hình 1.17 Một số dẫn chất thay đổi chuỗi gắn với aryl của curcumin

1.3.1 Phương pháp alkyl hóa

1.3.1.1 O-alkyl hóa

Bao gồm các phản ứng alkyl hóa nhóm –OH alcol hoặc phenol (sản phẩm là ether), nhóm –OH của acid carboxylic (sản phẩm là ester) [7] Curcumin là một hợp chất diphenolic, để alkyl hóa curcumin cần sử dụng phản ứng tổng hợp ether (phản ứng Williamson) Đây là một phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2), trong đó một ion alkoxid thay thế một halogen, sulfonyl hoặc một nhóm sulfat tùy thuộc vào tác nhân alkyl hóa được sử dụng Alkyl halogenid được sử dụng nhiều nhất [31]

1.3.1.2 C-alkyl hóa

C-alkyl hóa thường là phản ứng alkyl hóa các hợp chất chứa nhóm methylen hoạt

động (là các hợp chất có nguyên tử hydro gần các nhóm hút điện tử mạnh) [7] Do

cấu trúc β-diceton nên 2 nguyên tử hydro ở vị trí C-4 của curcumin trở nên rất linh

động, liên kết C-H ở đây dễ dàng bị cắt đứt Chính vì vậy mà vị trí C-4 trong phân

tử curcumin có khả năng bị tấn công bởi các tác nhân alkyl hóa, tạo ra dẫn chất

C-alkyl hóa của curcumin

1.3.2 Một số nghiên cứu bán tổng hợp dẫn chất alkyl hóa của curcumin đã

được thực hiện

1.3.2.1 Phản ứng tổng hợp diethyl-curcumin [21]

Hình 1.18 Sơ đồ tổng hợp diethyl-curcumin của Hemanta Chowdhury và cộng sự

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3, sử dụng tác nhân ethylbromid, đun hồi lưu trong 24-48h Sau phản ứng, lọc và cất loại dung môi, chiết cắn bằng dung môi hữu cơ Pha hữu cơ được rửa sạch bằng nước Làm khan và bốc hơi dung môi thu được sản phẩm Hiệu suất phản ứng đạt 86,0%

bằng sắc ký cột, thu được mono-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin và

di-O-methoxycarbonylmethyl-curcumin với hiệu suất đều là 20%

1.3.2.3 Phản ứng tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin [17]

Hình 1.20 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất hydroxyethyl curcumin

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3, sử dụng

tác nhân 2-bromoethanol, đun hồi lưu trong 5h Sản phẩm được tách ra bằng sắc ký

cột, thu được mono-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin và

di-O-(2-hydroxyethyl)-curcumin với hiệu suất lần lượt 47% là 32%

1.3.2.4 Phản ứng tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin [5]

Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất ethoxycarbonylmethyl-curcumin

Phản ứng được tiến hành trong môi trường aceton khan có mặt K2CO3 và KI, sử

dụng tác nhân ethyl cloroacetat, đun hồi lưu trong 14h Sản phẩm được tách bằng

cách chiết với ethyl acetat và acid HCl 1M, và được tinh chế bằng cách kết tinh lại

trong EtOH 70o, thu được sản phẩm với hiệu suất là 60,57%

DỤNG SINH HỌC

Như đã nói trong phần đặt vấn đề, có rất nhiều hợp chất alkyl-halogen có tác

dụng gây ức chế sự nhân lên và làm ngừng sự phát triển của tế bào ung thư Cơ chế

tác dụng của chúng là alkyl hóa đôi base nitơ của AND, làm rối loạn tổng hợp acid

nhân, dẫn đến làm ngừng sự phát triển và nhân lên của tế bào ung thư [8]

Bản thân curcumin cũng là một chất có tác dụng chống ung thư khá tốt và cũng

ko gây độc với tế bào lành Các kết quả nghiên cứu invitro cho thấy curcumin có tác

dụng khá tốt trên 2 dòng tế bào là MCF-7 và LU-1, với giá trị IC50 lần lượt là

9.815μM [26] và 18μM [24]

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu biến đổi chuỗi gắn aryl của curcumin đã đạt được

thành công nhất định với hoạt tính chống ung thư dẫn chất cao hơn so với curcumin

Với những lý do trên, chúng tôi dự kiến tổng hợp dẫn chất halogenoethyl hóa của

curcumin và thử tác dụng gây độc của chúng trên 2 dòng LU-1 và MCF-7

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT

Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột curcuminoid chiết xuất từ củ nghệ vàng tại Bộ môn Công nghiệp dược - Đại học Dược Hà Nội Các nguyên vật liệu và hóa

chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh mục các nguyên liệu - hóa chất

5 Bộ lọc hút chân không Trung Quốc

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Tổng hợp một số dẫn chất halogenoethyl của curcumin thiên nhiên chiết từ củ nghệ vàng bằng cách sử dụng tác nhân alkyl hóa

 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm bằng SKLM với hệ dung môi thích hợp và đo nhiệt độ nóng chảy

 Xác định cấu trúc các sản phẩm tổng hợp được bằng cách đo phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)

 Thử tác dụng gây độc tế bào các sản phẩm tổng hợp thu được

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Tổng hợp hóa học

Tổng hợp hóa học sử dụng phản ứng O-alkyl hóa với các alkyl halogenid trong

môi trường khan nước, cụ thể là 1,2-dicloroethan và 1,2-dibromoethan Sơ đồ phản

ứng được trình bày ở Hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp dẫn halogenoethyl của curcumin

2.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết

 Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng phương pháp SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy

 SKLM được thực hiện trên bản mỏng silica gel 60 F254 Merck với hệ dung môi thích hợp, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm

 Nhiệt độ nóng chảy được ghi trên máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Dựa vào khoảng nhiệt độ nóng chảy để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm

2.4.3 Xác định cấu trúc hóa học

Các trúc sản phẩm được xác định bằng các phương pháp phổ bao gồm phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)

 Phổ khối lượng (MS):

Được ghi tại phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Tương đương sinh học, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, trên máy LCMS/MS AGILENT 1290/6460 với

chế độ đo quét Scan 400-600 Da với dẫn chất SP1 và 500-700 Da với dẫn chất SP2

 Phổ hồng ngoại (IR):

Được ghi tại Bộ môn hóa học vô cơ, Khoa Hóa học Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Shimadzu với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng

4000-400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô, tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép thành film mỏng dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và 13 C-NMR:

Được ghi tại phòng thí nghiệm Hóa dược, Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, trên máy Brucker 500MHZ Ascend, sử dụng dung môi CDCl3, chất chuẩn nội là tetramethylsilan

 Thiết bị nghiên cứu

Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad)

 Hoá chất

- FBS của GIBCO, Invitrogen

- Chất tham khảo: Ellipticine (Sigma, USA)

- Các hóa chất thông thường khác

 Các dòng tế bào

Các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và ung thư phổi (SK-LU-1) do GS TS J

M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks

(1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật

độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào

được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (10l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100g/ml; 20g/ml; 4g/ml; 0,8g/ml; 0,16g/ml

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190l môi trường)

và để chúng phát triển trong vòng từ 2 ngày

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid - TCA

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC Đổ bỏ SRB

và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng

- Cuối cùng, sử dụng 10mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám

và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515nm Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve Chất thử nào có IC50 < 20g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  5M (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào tốt và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Trong khóa luận này, chúng tôi thực hiện phản ứng alkyl hóa curcumin với hai tác nhân là 1,2-dicloroethan và 1,2-dibromoethan Phản ứng được thực hiện theo phản ứng tổng hợp ether Williamson trong môi trường khan nước, dựa trên quy trình phản ứng alkyl curcumin bằng tác nhân 2-cloroethanol của nghiên cứu [5]

Hình 3.1 Sơ đồ quá trình bán tổng hợp dẫn chất halogenoethyl hóa của curcumin

30 phút trong bình cầu 2 cổ 250mL Thêm 9,7mL (0,12mol, 45eq.) 1,2-dicloroethan

và đun hồi lưu (khoảng 60oC) Theo dõi hỗn hợp phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH = 30:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp

 Tinh chế sản phẩm

 Cất loại aceton ra khỏi khối phản ứng bằng máy cất quay chân không ở 50°C

 Hỗn hợp sau khi cất được hòa tan lần lượt bằng 250mL CHCl3 và 50mL nước cất, và được chuyển vào bình chiết 500mL Điều chỉnh pH pha nước bằng 11 với NaOH 0,1M Lắc chiết thu lấy pha CHCl3 Kiểm tra pha CHCl3 bằng SKLM Thực hiện quá trình chiết với kiềm cho đến khi trên SKLM chỉ còn xuất hiện 1 vết với Rf = 0,88 (hệ CH2Cl2:MeOH = 30:1) Rửa lại pha hữu cơ bằng nước cất đến khi đạt pH trung tính Làm khan bằng natri sulfat khan Lọc qua giấy lọc

 Cất dịch dưới áp suất giảm (50°C) để loại toàn bộ dung môi CHCl3, cắn còn lại được hòa tan trong 5mL CHCl3, thêm từ từ diethyl ether thấy xuất hiện tủa, tiếp tục thêm diethyl ether cho đến khi lượng tủa không tăng thêm nữa Làm lạnh hỗn hợp (4-8oC) trong 12h, lọc lấy tủa và rửa lại tủa bằng diethyl ether

 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng

Chúng tôi đã tiến hành theo dõi phản ứng bằng SKLM với hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH = 30:1 để xác định thời gian phản ứng thích hợp

Trên SKLM quan sát được các vết sau:

- Vết nguyên liệu (curcumin): Rf = 0,57

- Vết sản phẩm monoalkyl curcumin: Rf = 0,76

- Vết sản phẩm dialkyl curcumin: Rf = 0,88

Kết quả khảo sát được trình bày trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Khảo sát thời gian phản ứng của phản ứng (1)

STT Thời gian

(giờ)

Vết các thành phần trên sắc ký lớp mỏng Nguyên liệu Sản phẩm monoalkyl Sản phẩm di alkyl

+ Đồng thời, tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm tổng hợp được Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy sản phẩm có khoảng nóng chảy hẹp 140,0-143,5°C

3.1.2 Tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin (SP2)

 Sơ đồ phản ứng (2)

Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp dẫn chất di-O-(2-bromoethyl)-curcumin

 Tiến hành phản ứng

Thực hiện với 0,50g (1,355mmol, 1eq.) curcumin; 0,85g (6,10mmol, 4,5eq.)

K2CO3 khan, 4mL 1,2-dibromoethan (46,418mmol, 34,3eq.) và 40mL aceton khan trong bình cầu 2 cổ 100mL với thời gian phản ứng là 24h tương tự quy trình tổng hợp SP1

 Xử lý phản ứng

 Cất loại aceton ra khỏi khối phản ứng bằng máy cất quay chân không (50°C)

 Hỗn hợp còn lại được hòa tan lần lượt bằng 200mL CHCl3 và 30mL nước cất và thực hiện chiết tương tự như với SP1 đến khi trên SKLM chỉ còn xuất hiện 1 vết với Rf = 0,86 (hệ CH2Cl2:MeOH = 30:1) Rửa lại pha hữu cơ bằng nước cất đến khi đạt pH trung tính Làm khan bằng natri sulfat khan Lọc qua giấy lọc

 Cất dịch lọc dưới áp suất giảm (50°C) để loại toàn bộ dung môi, cắn được hòa tan trong 5mL CHCl3 và làm tương tự quy trình xử lý SP1 để thu dược sản phẩm

 Kết quả

- Tính chất sản phẩm

+ Cảm quan: bột vô định hình màu vàng nâu