Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn một số dẫn chất mới của 2,3 dihydrobenzo 4,5imidazo2,1 bthiazol

Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy tác dụng sinh học đa dạng và rất triển vọng như kháng khuẩn, kháng nấm [11], [28], gây độc tế bào ung thư [2], [34], [35], chống viêm [15], [23],

NGUYỄN VĂN THẮNG

MÃ SINH VIÊN: 1101486

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN MỘT SỐ DẪN CHẤT MỚI CỦA

2,3-DIHYDROBENZO

[4,5]IMIDAZO[2,1-b]THIAZOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

1 Bộ môn Công nghiệp Dược

2 Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2016

Nguyễn Đình Luyện - người thầy đã nhiệt tình hướng dẫn, cho tôi những lờ i khuyên quý báu và ta ̣o mo ̣i điều kiê ̣n giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công Nghiệp Dược đặc biệt là TS Nguyễn Văn Hải, ThS Nguyễn Văn Giang và CN Phan Tiến Thành

thuộc phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược, bộ môn Công Nghiệp Dược, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Trong quá trình thực hiện khóa luận tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của các

cá nhân đơn vị trong và ngoài trường Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến bộ môn Vi

sinh – Sinh học, Trường Đại Học Dược Hà Nội, PGS.TS Nguyễn Ngọc Chiến, ThS

Phạm Thị Hiền, ThS Ngô Quang Trung – Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia,

TS Mạc Đình Hùng – Phòng thí nghiệm Hóa Dược, khoa Hóa Học, Đại học Khoa

Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Đồng thời tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy

cô trong trường Đa ̣i ho ̣c Dược Hà Nô ̣i

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè - những người luôn giúp đỡ, động viên, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quãng thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày 14 tháng 04 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Văn Thắng

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL 2

1.1.1 Cấu tạo của khung 2-mercaptobenzimidazol 2

1.1.2 Tính chất hóa lý của 2MBI 2

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2MBI 3

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 3

1.2.2 Các tác dụng khác của các dẫn chất 2MBI 7

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG 2MBI 11

1.3.1 Tổng hợp 2MBI và các dẫn chất N,S-alkyl hóa 11

1.3.2 Tổng hợp các dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol 14

1.3.2.1 Phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol 14

1.3.2.2 Phản ứng tạo dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol 16

1.4 LỰA CHỌN HƯỚNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CHO ĐỀ TÀI 16

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.3.1 Tổng hợp hóa học 20

2.3.2 Xác định độ tinh khiết 20

2.3.3 Xác định cấu trúc 20

2.3.4 Thử tác dụng kháng khuẩn 21

2.3.4.1 Giống vi sinh vật kiểm định 21

2.3.4.2 Môi trường thử nghiệm 21

2.3.4.3 Mẫu kháng sinh chuẩn 22

2.3.4.4 Phương pháp tiến hành 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 24

3.1.1 Tổng hợp các chất trung gian 24

3.1.1.1 Tổng hợp 2MBI (II) 24

3.1.1.2 Tổng hợp 2, 3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (III) 25

3.1.2 Tổng hợp các sản phẩm IV, V, VI 26

3.1.2.1 Tổng hợp 7-nitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (IV) 26 3.1.2.2 Tổng hợp 6,7-dinitro-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (V) 27

3.1.2.3 Tổng hợp 7-amino-2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol (VI) 28

3.2 KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 30

3.3 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP ĐƯỢC 31

3.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 31

3.3.2 Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) 32

3.3.3 Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 33

3.4 THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN 34

3.5 BÀN LUẬN 36

3.5.1 Về tổng hợp hóa học 36

3.5.1.1 Phản ứng tổng hợp 2MBI 36

3.5.1.2 Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol 36

3.5.1.3 Tổng hợp chất IV 38

3.5.1.4 Tổng hợp chất V 38

3.5.1.5 Tổng hợp chất VI 39

3.5.2 Về cấu trúc sản phẩm 39

3.5.3 Về thử tác dụng kháng khuẩn 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng

hưởng từ hạt nhân proton)

IC50 Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế 50%)

IR Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

m Khối lượng

MeOH Methanol

MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MS Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng phân tử)

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy (Phổ tương tác của các

proton gần nhau trong không gian)

Rf Retention factor (Hệ số lưu giữ)

Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất 1a-1j 5

Bảng 1.3 Đường kính vòng vô khuẩn của các hợp chất 2a-2h 6

Bảng 1.4 Kết quả thử hoạt tính chống kí sinh trùng của các dẫn chất 5a-f 9

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất 18

Bảng 2.2 Danh mục các dụng cụ, thiết bị 19

Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn 22

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp hóa học 30

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy (to nc) của các chất 30

Bảng 3.3 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) 31

Bảng 3.4 Kết quả phân tích phổ khối lượng của các sản phẩm 32

Bảng 3.5 Kết quả phân tích phổ 1H-NMR của các chất 33

Bảng 3.6 Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn 34

Bảng 3.7 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn chất III theo Nai SeangThaing 42

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol (2MBI) 2 Hình 1.2 Sự đồng phân hóa của 2MBI 2 Hình 1.3 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Krunal G Desai và cộng sự 3 Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất theo nghiên cứu của Sidram A Nevade và

các cộng sự 6

Hình 1.5 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của M S Vedula và cộng sự 7 Hình 1.6 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Pu Xiang và các cộng sự 8 Hình 1.7 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của TS Nguyễn Văn Hải và

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI của Allan và Deacon từ o-phenylendiamin,

kali hydroxyd và carbon disulfid 12

Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp 2MBI theo H Thakuria và cộng sự 12

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ o-phenylendiamin và thiophosgen hoặc thioure

Hình 1.17 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ benzimidazol và lưu huỳnh 14

Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol

14

Hình 1.19 Cơ chế phản ứng tạo ra dẫn chất chứa khung

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Ki-Whan Chi và cộng sự 15

Hình 1.20 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất chứa khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Anelia Ts Mavrova và cộng sự 15

Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Nai SeangThaing 16

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV, V, VI 24

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2MBI 25

Hình 3.3 Tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol 25

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất IV 26

Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất V 27

Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất VI 28

Hình 3.7 Kết quả đo phổ NOESY hợp chất IV 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Benzimidazol là một trong những khung hóa học với nhiều dẫn chất có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý Một trong những nhóm dẫn chất quan trọng của khung benzimidazol đó là 2-mercaptobenzimidazol Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy tác dụng sinh học đa dạng và rất triển vọng như kháng khuẩn, kháng nấm [11], [28], gây độc tế bào ung thư [2], [34], [35], chống viêm [15], [23], giảm đau [15], ức chế bơm H+/K+-ATPase [18], [19],… Trên lâm sàng, rất nhiều hợp chất đã được ứng dụng vào điều trị và đã cho thấy tác dụng tốt như: triclabendazol (trị sán), omeprazol (giảm acid dạ dày), lansoprazol (giảm acid dạ dày),…

Chính vì vậy việc tiếp tục nghiên cứu, tổng hợp các hợp chất mới của mercaptobenzimidazol là một hướng nghiên cứu có tiềm năng lớn trong việc tìm ra các phân tử có hoạt tính sinh học cao phát triển làm thuốc Mặt khác việc nghiên cứu

2-các hợp chất N,S dialkyl hóa mà tiêu biểu là

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol đã cho thấy nhiều kết quả triển vọng [3] Mặt khác chúng tôi nhận thấy các

dẫn chất nitro thường có hoạt tinh sinh học tốt như metronidazol, nitrofurantoin,…Trên cơ sở đó, để góp phần làm phong phú thêm các nghiên cứu về tổng hợp và thử tác dụng sinh học của nhóm dẫn chất quan trọng này, chúng tôi đã

thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn một số dẫn

chất mới của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol” với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp được một số dẫn chất mới của

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol;

2 Thử tác dụng kháng khuẩn của một số dẫn chất

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol tổng hợp được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ 2-MERCAPTOBENZIMIDAZOL

1.1.1 Cấu tạo của khung 2-mercaptobenzimidazol

Mercaptobenzimidazol (tên khoa học 1H-benzo[d]imidazol-thiol hoặc

2-sulfanylbenzimidazol) là dẫn chất của benzimidazol, cấu tạo bởi khung benzimidazol liên kết với nhóm thiol (SH) ở vị trí số 2 (xem hình 1.1)

Hình 1.1 CTCT của phân tử 2-mercaptobenzimidazol (2MBI)

Công thức phân tử: C7H6N2S

Khối lượng phân tử: 150,2 đvC [25]

1.1.2 Tính chất hóa lý của 2MBI

Trong phân tử có nhóm thioamid (-N-C=S), nên nó được xem như là một hợp chất thioamid, có khả năng phản ứng thế ở nguyên tử nitơ hoặc lưu huỳnh Nó được tồn tại ở 2 dạng đồng phân hỗ biến là thiol và thion, được biểu diễn dưới đây [7]:

Hình 1.2 Sự đồng phân hóa của 2MBI

Một số tính chất lý học của 2MBI:

- Độ tan [21]:

 Kém tan trong nước: S < 0,1 g/100 mL ở 23,5oC

 Tan tốt trong DMSO: S ≥ 10 g/100 mL ở 23,5oC

 Tan trong aceton: S=1-5 g/100 mL ở 23,5oC,

 Tan trong ethanol: S=0,1-1 g/100 mL ethanol 95% ở 23,5oC

- Nhiệt độ nóng chảy: 300-305oC [25]

- Cảm quan: Tinh thể hình phiến mỏng, có màu vàng nhạt hoặc màu trắng [25]

1.2 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 2MBI

1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm

Năm 2006, Krunal G Desai và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm một số dẫn chất của 2MBI với β-lactam thông qua cầu nối CO-NH có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.3 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của Krunal G Desai và cộng sự

Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn được trình bày trong bảng 1.1 Kết quả cho thấy rằng tất cả các hợp chất tổng hợp được thể hiện hoạt tính kháng khuẩn mạnh

Các hợp chất 1a, 1i và 1j cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tốt hơn rõ rệt so với các hợp chất 1b-h Trong đó, các hợp chất 1i và 1j thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đáng chú

ý trên Escherichia coli (ATCC 6538) khi so sánh với kháng sinh streptomycin

Bảng 1.1 Đường kính vòng vô khuẩn của các chất 1a– 1f

Hợp chất

Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-)

Mặt khác, các hợp chất 1a và 1i cho thấy hoạt tính mạnh trên Bacillus subtilis

(ATCC 6633) và Staphylococcus aureus (ATCC 6538) khi so sánh với streptomycin

Hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram dương của 1c, 1e và 1j yếu hơn

70% so với chất đối chiếu; tương tự với hoạt tính trên chủng vi khuẩn Gram âm của

1c và 1f Nhìn chung, các hợp chất 1b, 1d, 1e, 1g và 1h cho thấy hoạt tính kháng

khuẩn trung bình trên các vi sinh vật được thử nghiệm

Hoạt tính kháng nấm của các hợp chất đã tổng hợp được 1a-j được thử ở 4

nồng độ khác nhau (50, 100, 150, 200 µg/mL) Nồng độ ức chế tối thiểu của fluconazole là (+ + + +) ở ≤ 50 µg / mL đối với tất cả các vi nấm

Kết quả thử hoạt tính kháng nấm được trình bày ở bảng 1.2 Các hợp chất 1c

và 1f cho thấy hoạt tính tốt hơn các hợp chất còn lại khi thử trên Candida krusei (100 µg/mL) và Aspergillus niger (100 µg/mL) Các hợp chất 1e và 1j thể hiện hoạt tính

kháng nấm yếu khi thử trên Candida albicans và Aspergillus niger với MIC là 200

µg/mL Nhìn chung, các hợp chất 1b, 1d, 1g và 1h cho thấy hoạt tính kháng nấm trung bình trước tất cả các chủng vi nấm (150 µg/ml) Các hợp chất 1c, 1f và 1j cho

thấy hoạt tính trung bình trên Candida albicans (150 µg/mL), 1e, 1f và 1j cho thấy hoạt tính trung bình với Candida krusei (150 µg/mL) Hợp chất 1c và 1e có hoạt tính

kháng nấm trung bình trên Aspergillus niger (150 µg/mL) Từ dữ liệu thu được có

thể thấy rằng một số hợp chất có hoạt tính kháng nấm đáng chú ý, tuy nhiên không

có hợp chất nào vượt trội so với các chất chuẩn dùng để so sánh trong thử nghiệm

Bảng 1.2 Nồng độ ức chế tối thiểu của các hợp chất 1a-1j

Năm 2013, Sidram A Nevade và cộng sự đã tổng hợp và thử hoạt tính kháng khuẩn một số dẫn chất của 2MBI theo sơ đồ sau:

Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Sidram A

Nevade và cộng sự

Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm được thử nghiệm bằng phương pháp khuếch

tán trên thạch Kết quả (bảng 1.3) cho thấy các hợp chất 2a, 2c, 2e thể hiện hoạt tính

khá tốt trên S aureus và E coli, trong khi các hợp chất 2b, 2f, 2g chỉ có hoạt tính

trung bình trên các chủng sinh vật tương tự Các hợp chất đã tổng hợp cũng được thử

hoạt tính kháng nấm với Candida albicans, trong đó 2c, 2b, 2d cho thấy khả năng ức chế khá tốt, trong đó 2a thể hiện hoạt tính kháng nấm với C albicans tốt nhất khi so

sánh với ketoconazole [28]

Bảng 1.3 Đường kính vòng vô khuẩn của các hợp chất 2a-2h

Hợp chất Đường kính vòng vô khuẩn (mm)

E Coli S Aureus C Albicans

S – Ampicillin chuẩn; B – mẫu trắng (DMSO); K – Ketoconazole

Hoạt tính yếu: 6-8 mm; Hoạt tính trung bình: 9-11 mm; Hoạt tính tốt: 12-15 mm

1.2.2 Các tác dụng khác của các dẫn chất 2MBI

1.2.2.1 Tác dụng gây độc tế bào ung thư

Năm 2003, M S Vedula và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất

styrylsulfon của 2MBI Các dẫn chất tổng hợp được đem thử in-vitro trên các dòng

tế bào ung thư khác nhau

Hình 1.5 CTCT các dẫn chất theo nghiên cứu của M S Vedula và cộng sự

Kết quả cho thấy hoạt tính khá mạnh của các dẫn chất khi thế halogen ở vị trí

para trên nhân thơm Đặc biệt là dẫn chất 3d (R=R1= R3= H, R2= Br) với nhóm bromo

ở vị trí para trên nhân phenyl cho gía trị GI50 trung bình trên các dòng tế bào ung thư được thử nghiệm là 8,5 µM và có hoạt tính tốt trên các dòng tế bào ung thư vú (MCF-7), ung thư thần kinh (U-251), ung thư buồng trứng (PA1) và ung thư thận (A-498), với giá trị GI50 lần lượt là 2,0; 0,35; 5,0; 3,0 µM Hợp chất 3h cho giá trị GI50 < 5 µM đối với nhiều dòng tế bào ung thư và có cả tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư vú kháng doxorubicin (MCF7/ADR) [34]

Năm 2012, Pu Xiang và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu một số dẫn chất

có chứa khung benzothiazole, benzimidazole và benzoxazole trong đó có dẫn chất của 2MBI như hình 1.6 Chất này có khả năng ức chế tốt sự phát triển của tế bào ung thư đại tràng HCT-116 với giá trị IC50 là 3,69 µM [35]

Hình 1.6 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Pu Xiang và các cộng sự

Năm 2014, TS Nguyễn Văn Hải và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng gây độc tế bào ung thư của 2 dẫn chất 2MBI (xem hình 1.7)

Hình 1.7 CTCT dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của TS Nguyễn Văn Hải và

cộng sự

Các chất thử (20 µL) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay

96 giếng để có nồng độ: 100; 20; 4 và 0,8 µg/mL Chất đối chứng là ellipticin, sử

dụng ở các nồng độ: 10; 2; 0,4 và 0,08 µg/mL Kết quả cho thấy 2 mẫu nghiên cứu

4a, 4b có hoạt tính khá mạnh trên dòng tế bào ung thư phổi (LU-1) với giá trị IC50

lần lượt là 10,80 và 10,65 µg/mL và dòng tế bào ung thư vú (MCF7) với giá trị IC50lần lượt là 9,11 và 7,59 µg/mL [2]

1.2.2.2 Tác dụng chống ký sinh trùng

Trong lâm sàng, triclabendazol là dẫn chất của 2MBI đã được sử dụng rộng

rãi để làm thuốc điều trị sán lá gan, sán lá phổi [31]

Ngoài ra, nhiều công trình nghiên cứu khác vẫn tiếp tục tìm kiếm các dẫn chất 2MBI có tác dụng chống ký sinh trùng Năm 2002, J Valder, R Cedillo và cộng sự

đã tổng hợp và nghiên cứu tác dụng chống lại các sinh vật đơn bào Giardia lamblia, Entamoeba histolytica và sán Trichinella spiralis của 18 dẫn chất benzimidazol, trong

Kết quả đã cho thấy rằng tất cả 6 chất này đều có hoạt tính tốt hơn metronidazol

khi thử trên sinh vật đơn bào trong thử nghiệm Khi thử trên G lamblia, chất 5d có

tác dụng tốt hơn metronidazol 244 lần và albendazol 7,4 lần Kết quả thử các chất 5a,

5b cho thấy tác dụng tương đương với albendazol Điều này đã lưu ý về ảnh hưởng

của nhóm 2-mercapto trong các chất 5a, 5c và 5e, cho thấy rằng mức độ tác dụng như

nhau khi thế ở vị trí 5 và 6 Đối với E histolytica, chất 5e có tác dụng hơn

metronidazol 70 lần Ngược lại với tác dụng chống đơn bào, tác dụng chống giun sán

của các chất này chỉ ở mức trung bình, không có chất nào có tác dụng chống lại T spiralis tương đương albendazol Tuy nhiên không có chất nào có tác dụng ức chế sự

Bên cạnh đó, nhiều công trình nghiên cứu khác vẫn tiếp tục tìm kiếm các dẫn chất của 2MBI có tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase, chống bài tiết dịch vị

và chống viêm loét dạ dày Năm 1981, Ulf K Junggren và các cộng sự đã tổng hợp một số dẫn chất 2MBI có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.8 CTCT các dẫn chất của 2MBI theo nghiên cứu của Ulf K Junggren và

cộng sự

Tất cả các dẫn chất này đều có tác dụng chống bài tiết dịch vị, trong đó có một

số dẫn chất nêu trên là có tác dụng khá mạnh (hiệu lực ức chế 95-100%) [19]

Năm 2001, Y C Sung và cộng sự đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế bơm proton H+/K+-ATPase của các hợp chất có chứa khung benzimidazol trong đó có một

số dẫn chất của 2MBI có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.9 CTCT của các dẫn chất 2MBI theo nghiên cứu của Y C Sung và cộng sự

Các hợp chất tổng hợp được thử nghiệm lâm sàng trên chuột để xác định tác dụng của chúng đối với sự tiết acid dạ dày Kết quả của thử nghiệm này cho thấy các hợp chất này có tác dụng gần như tương đương với omeprazole [18]

Ngoài ra, trong nhiều năm gần đây, có rất nhiều các nghiên cứu đã cho thấy tác dụng sinh học đa dạng của các dẫn chất 2MBI như điều trị rối loạn hệ thần kinh trung ương (trầm cảm) [4], kháng histamin [26], chống dị ứng [17], [27], chống oxy hóa [6], [9], chống viêm [15], [23], giảm đau [15] Điều này cho thấy, dẫn chất của 2MBI là một nhóm chất có tác dụng sinh học đa dạng, cần được tiếp tục đi sâu nghiên cứu để tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ứng dụng làm thuốc

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT KHUNG 2MBI

1.3.1 Tổng hợp 2MBI và các dẫn chất N,S-alkyl hóa

1.3.1.1 Tổng hợp khung 2MBI

1.3.1.1.1 Tổng hợp từ o-phenylendiamin

Năm 1950, J A VanAllan và B D Deacon đã nghiên cứu tổng hợp 2MBI từ

o-phenylendiamin và kali ethylxantat trong hỗn hợp dung môi ethanol – nước:

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI theo Allan và Deacon từ o-phenylendiamin

và kali ethylxantat

Hiệu suất phản ứng khoảng 84-86,5%, kali ethylxantat có thể được thay bằng hỗn hợp kali hydroxyd và carbon disulfid với hiệu suất đạt được tương đương Sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol 95% thu được khoảng 90% sản phẩm với nhiệt

độ nóng chảy không đổi [33]

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp khung 2MBI của Allan và Deacon từ o-phenylendiamin,

kali hydroxyd và carbon disulfid

Năm 2008, H Thakuria và cộng sự nghiên cứu tổng hợp 2MBI và dẫn chất

thông qua phản ứng giữa o-phenylendiamin hoặc dẫn chất với amoni thiocyanat, xúc

tác là amoni clorid Các chất phản ứng và xúc tác được nghiền ở nhiệt độ phòng cho đến khi đồng nhất, sau đó hỗn hợp được nung nóng ở 140oC trong 1-3 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng được rửa với nước lạnh và sản phẩm được kết tinh lại trong ethanol [32]

Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp 2MBI theo H Thakuria và cộng sự

Khung 2MBI còn có thể được tổng hợp từ o-phenylendiamin bằng phản ứng

với thiophosgen trong dung môi cloroform [30] hoặc bằng phản ứng đun chảy với thioure [13]

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ o-phenylendiamin và thiophosgen hoặc thioure

1.3.1.1.2 Tổng hợp từ các dẫn chất khác của benzimidazol

Năm 1965, D Harrison và J T Ralph đưa ra quy trình tổng hợp 2MBI bằng phản ứng giữa 2-clorobenzimidazol và thioure, tiến hành hồi lưu trong dung môi ethanol [16]

Hình 1.14 Cơ chế phản ứng tổng hợp 2MBI theo D Harrison và cộng sự

Năm 2013, S.S Rao và cộng sự nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất của 2MBI, theo đó, khung 2MBI có thể được tạo thành theo sơ đồ sau [29]:

Hình 1.15 Sơ đồ tổng hợp 2MBI và dẫn chất theo S S Rao và cộng sự

Khung 2MBI cũng có thể tạo ra từ phản ứng giữa o-phenylendiamin và dẫn

chất arylcarbamothiol cyanid trong dung môi DMF/TEA hoặc EtOH/TEA hoặc thu được từ phản ứng đi từ nguyên liệu ban đầu là dẫn chất arylcarbamothioyl cyanid và

o-cloroanilin trong dioxan/TEA [12]

Hình 1.16 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2MBI từ arylcarbamothioyl cyanid và

o-cloroanilin

1.3.1.1.3 Tổng hợp từ benzimidazol và lưu huỳnh

Khung 2MBI có thể được tổng hợp bằng cách đun chảy benzimidazol với lưu huỳnh [14]

Hình 1.17 Sơ đồ tổng hợp 2MBI từ benzimidazol và lưu huỳnh

1.3.2 Tổng hợp các dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol

1.3.2.1 Phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol

Phản ứng được tiến hành dựa trên phản ứng N,S-dialkyl hóa giữa mercaptobenzimidazol và dẫn xuất 1,2-dihaloethyl Phản ứng xảy ra theo cơ chế ái nhân lưỡng phân tử SN2 trong đó có khả năng ái nhân của –SH lớn hơn –NH [5]

2-Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng tạo khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol

Năm 2002, Ki-Whan Chi và cộng sự đã nghiên cứu một số phản ứng giữa perfluoro-2-methyl-2-pentene với tác nhân 1,3-binucleophilic Trong đó đã tạo ra một

số dẫn chất chứa khung 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol [10]

Hình 1.19 Cơ chế phản ứng tạo ra dẫn chất chứa khung

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Ki-Whan Chi và cộng sự

Ngoài ra, năm 2005, Anelia Ts Mavrova và cộng sự đã nghiên cứu phản ứng

giữa dẫn chất của o-phenylendiamin với acid cloroacetic Phản ứng xảy ra theo cơ

chế giai đoạn N-alkyl hóa trước rồi giai đoạn S-acyl hóa sau tạo ra sản phẩm [24]

Hình 1.20 Sơ đồ phản ứng tổng hợp dẫn chất chứa khung

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Anelia Ts Mavrova và cộng sự

Năm 2015, tác giả Nai SeangThaing đã nghiên cứu phản ứng giữa 2MBI với 1,2-dicloroethan trong dung môi isopropanol Sản phẩm thu được có cảm quan là tinh thể màu trắng hoặc hơi vàng với hiệu suất 30,51% [3]

Hình 1.21 Sơ đồ tổng hợp 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo Nai

SeangThaing

1.3.2.2 Phản ứng tạo dẫn chất 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol Phản ứng nitro hóa

Nitro hóa là quá trình thế H của hợp chất hữu cơ bằng nhóm nitro (-NO2) Phản ứng có thể chạy theo các cơ chế như thế ái điện tử (SE) hay thế gốc tác nhân (SR), phụ thuộc vào bản chất các chất được nitro hóa và điều kiện phản ứng Có nhiều tác nhân

có thể được sử dụng như dung dịch acid nitric, hỗn hợp sulfonitric, acylnitrat,…[1]

Phản ứng khử hóa

Tùy vào khả năng phản ứng của hợp chất đem khử, có thể sử dụng nhiều tác nhân khử hóa khác nhau có thể được sử dụng như kim loại trong môi trường acid, kiềm, hỗn hống kim loại, kim loại kiềm trong alcol,…[1]

Phản ứng khử hóa được sử dụng trong thực nghiệm

Tác nhân được sử dụng là Na2S2, với sơ đồ phản ứng như sau [8]:

1.4 LỰA CHỌN HƯỚNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CHO ĐỀ TÀI

Theo tài liệu tham khảo [3], chúng tôi nhận thấy một số dẫn chất

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol có tác dụng sinh học khá triển vọng như

kháng khuẩn, kháng nấm Mặc dù vậy, các dẫn chất khung

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol chưa được nghiên cứu sâu Bên cạnh đó,

chúng tôi thấy rằng các dẫn chất có chứa nhóm nitro trong phân tử thường có tác dụng sinh học tốt Hơn thế chúng tôi chưa tìm thấy bấy kỳ nghiên cứu nào thực hiện nitro

hóa 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol, đây là một hướng biến đổi mới trên

khung dẫn chất này Để tiếp nối các nghiên cứu đó, chúng tôi dự kiến tổng hợp một

số dẫn chất nitro hóa mới của 2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol và thử

hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất này

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

Để thực hiện khóa luận này chúng tôi đã sử dụng một số hóa chất, thiết bị và dụng cụ của Phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa dược, Bộ môn Công nghiệp Dược, Trường Đại học Dược Hà Nội (xem bảng 2.1, bảng 2.2)

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất

1 Acid hydrocloric đặc (37%) Trung Quốc

2 Acid sulfuric đặc (98%) Trung Quốc

3 Acid nitric đặc (68-70%) Trung Quốc

4 Natri sulfid Trung Quốc

6 Carbon disulfid Trung Quốc

7 Dicloroethan Trung Quốc

10 Isopropanol Trung Quốc

11 Kali carbonat Trung Quốc

12 Kali hydroxyd Trung Quốc

14 Natri hydrocarbonat Trung Quốc

15 Natri sulfat Trung Quốc

6 Hệ thống lọc hút chân không Trung Quốc

7 Đèn tử ngoại (soi ban mỏng sắc ký) bước sóng 254 nm &

8 Hệ thống sinh hàn hồi lưu Đức

9 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ

10 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

11 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker

12 Máy đo phổ hồng ngoại Jasco FT/IR-6700 Nhật

13 Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS - Agilent 1290/6460 Mỹ

14 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Mỹ

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu tổng hợp một số dẫn chất mới của

2,3-dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol theo sơ đồ 3.1

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Xác định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất IV, V, VI

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tổng hợp hóa học

 Sử dụng các phương pháp thực nghiệm cơ bản trong hóa học hữu cơ để tổng hợp

các chất dự kiến: phản ứng ngưng tụ, S-alkyl hóa, N-alkyl hóa, phản ứng nitro

hóa, phản ứng khử hóa (xem hình 3.1)

 Sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) với bản mỏng silicagel 60 F254Merck 70-230 mesh và hệ dung môi thích hợp; quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm để theo dõi tiến triển của phản ứng

 Sử dụng phương pháp chiết, kết tinh, kết tủa để xử lý phản ứng, tinh chế sản phẩm

2.3.3 Xác định cấu trúc

Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

 Phổ hồng ngoại (IR)

Được ghi tại phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Đánh giá tương đương sinh học – Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia, trên máy Jasco FT/IR-6700 với kỹ thuật viên nén KBr trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với

tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

 Phổ khối lượng phân tử (MS)

Được ghi theo phương pháp ESI trên máy sắc ký lỏng khối phổ Agilent 1290/6460 tại Phòng Phân tích, Kiểm nghiệm và Đánh giá tương đương sinh học – Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia

- Chế độ đo: ESI-MS dương và ESI-MS âm

- Dung môi: methanol

2.3.4.1 Giống vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng khuẩn được thực hiện với 5 vi khuẩn Gram (+) và 4 vi khuẩn Gram (-) sau:

+ Vi khuẩn Gram (+):

- Staphylococcus aureus ATCC 1128 (S aureu)

- Bacillus pumilus ATCC 10241 (B pumilus)

- Bacillus subtilis ATCC 6633 (B subtilis)

- Bacillus cereus ATCC 9946 (B cereus)

- Sarcina lutea ATCC 9341 (S lutea)

+ Vi khuẩn Gram (-):

- Escherichia coli ATCC 25922 (E coli)

- Proteus mirabilis BV 108 (P mirabilis)

- Shigella flexneri DT 112 (S flexneri)

- Salmonella typhi DT 220 (S typhi)

2.3.4.2 Môi trường thử nghiệm

Bảng 2.3 Môi trường thử nghiệm kháng khuẩn

Canh thang Thạch thường

2.3.4.3 Mẫu kháng sinh chuẩn

- Benzathin penicillin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (+)

- Streptomycin: 20 IU/mL đối với vi khuẩn Gram (-)

- Mẫu thử được pha vào dung môi thích hợp (methanol, H2O) với nồng độ cho

các mẫu như sau: IV: 100 g/mL, V: 100 g/mL, VI: 100 g/mL Các khoanh giấy lọc vô trùng và đã được sấy khô được tẩm với 3 lần với dung dịch mẫu thử, sau mỗi lần tẩm các khoanh giấy lọc có chứa mẫu thử đều được sấy <

60oC đến khô hết dung môi

- Chuẩn bị môi trường cà cấy VSV kiểm định

Vi khuẩn kiểm định được cấy vào môi trường canh thang, rồi nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 37oC trong thời gian 18-24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/mL (kiểm tra bằng pha loãng và dãy dung dịch chuẩn) Môi trường thạch thường vô trùng (tiệt trùng 118oC/30 phút) được làm lạnh về 45-50oC và được

cấy giống VSV kiểm định vào với tỷ lệ 2,5mL/100mL Lắc tròn để VSV kiểm định phân tán đều trong môi trường thạch thường, rồi đổ vào đĩa petri vô trùng với thể tích 20mL/đĩa và để cho thạch đông lại

- Đặt mẫu thử và chứng: Khoanh giấy lọc đã được tẩm chất thử và xử lý như trên được đặt lên bề mặt môi trường thạch thường chứa VSV kiểm định theo

sơ đồ định sẵn

- Ủ các đĩa petri có mẫu thử được đặt như trên trong tủ ấm ở 37oC trong 18-24h, rồi sau đó lấy ra đọc kết quả, đo đường kính vòng vô khuẩn nếu có (thước kẹp Panmer độ chính xác 0,02mm)

- Đánh giá kết quả: Dựa trên đường kính vòng vô khuẩn và được đánh vòng vô khuẩn được đánh giá theo công thức:

2

( ) 1

D: Đường kính trung bình vòng vô khuẩn

Di : Đường kính vòng vô khuẩn thứ i

s: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu chỉnh n: Số thí nghiệm làm song song (n= 3)

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC

Thông qua các tài liệu tham khảo và dựa vào điều kiện của phòng thí nghiệm, các hóa chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2,3-

dihydrobenzo[4,5]imidazo[2,1-b]thiazol đi từ nguyên liệu ban đầu là

o-phenylendiamin theo sơ đồ như sau:

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp của các chất IV, V, VI

3.1.1 Tổng hợp các chất trung gian

3.1.1.1 Tổng hợp 2MBI (II)

Sơ đồ phản ứng

Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp 2MBI Tiến hành phản ứng [33]

Cho vào bình cầu hỗn hợp gồm có: 9,72g (0,09 mol) o-phenylendiamin và

5,04g (0,09 mol) KOH, 98 mL ethanol, 17 mL nước cất Sau đó nhỏ từ từ 5,55 mL (0,09 mol) carbon disulfid vào bình cầu Tiến hành đun hồi lưu trong khoảng thời gian 3 giờ

Phản ứng kết thúc, thêm vào hỗn hợp phản ứng 1,2g than hoạt, tiếp tục đun trong 10 phút, lọc nóng và nhanh hỗn hợp bằng phễu lọc Buchner, rửa lại 2 lần bằng ethanol nóng Thêm 65 mL nước nóng (60- 70oC), acid hóa bằng HCl 5M đến pH 6-

7 để xuất hiện tủa, tiếp tục khuấy 1 giờ Lọc lấy tủa, rửa lại 3 lần bằng nước cất, kết tinh lại trong ethanol 50% Lọc tủa, sấy sản phẩm khô ở 70- 80 oC

Tiến hành phản ứng [3]:

Cho 6,8g (0,08 mol) NaHCO3 và 50 mL isopropanol vào bình cầu 100 mL, thêm 9,4g (0,1 mol) của 1,2-dicloroethan, đun sôi hồi lưu khoảng 1 giờ Hòa tan trong

cốc có mỏ hỗn hợp gồm: 2,5g (0,016mol) II trong 45 mL isopropanol và 8 mL KOH

20% Chuyển hỗn hợp vào bình nhỏ giọt và nhỏ rất từ từ vào hỗn hợp phản ứng ở

trên Thời gian đun sôi thêm khoảng 5 giờ

Khi phản ứng kết thúc, đổ hỗn hợp phản ứng vào bình một cổ và cất gần kiệt dung môi isopropanol Hòa tan hỗn hợp còn lại trong 200 mL cloroform Rửa lại 3 lần bằng KOH 15% và kiểm tra pH dịch rửa để đạt khoảng 10-11, sau đó rửa thêm

3 lần bằng nước cất 50 mL/lần, kiểm tra pH nước rửa đạt khoảng 6-7 Làm khan dịch chiết bằng Na2SO4 khan, rồi lọc lấy dịch và cất quay chân không đến khô, thu hồi dung môi

Kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp methanol : nước (tỷ lệ thể tích 1:1) Lọc lấy tinh thể và sấy khô trong tủ sấy nhiệt độ 70- 80 oC

Tiến hành phản ứng

Hòa tan 1,00g (5,7 mmol) III với 5 mL H2SO4 đặc trong bình cầu dung tích 50

mL Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá Sau khi hòa tan và làm lạnh 5-10 phút, tiến hành nhỏ giọt rất từ từ 1,5 mL dung dịch HNO3 40% (11,9 mmol) và kiểm soát nhiệt độ khối phản ứng 0-3oC

Kết thúc phản ứng, đổ hỗn hợp phản ứng vào cốc có mỏ chứa 10mL nước cất lạnh, tiếp làm lạnh bên ngoài cốc có mỏ bằng nước đá, khuấy đều và thêm từ từ dung dịch Na2CO3 bão hòa tới pH 8-9, xuất hiện kết tủa vàng nhạt Để yên khoảng 30 phút Lọc lấy tủa, kết tinh lại trong methanol 50% Lọc thu lấy sản phẩm, sấy khô sản phẩm

Hòa tan 1,00g (5,7 mmol) III với 5 mL H2SO4 đặc trong bình cầu dung tích 50

mL Làm lạnh bên ngoài bình cầu bằng nước đá Sau khi hòa tan và làm lạnh 5-10