BCTT TÌM HIỂU MỘT SỐ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨM TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN THỰC PHẨM SẠCH FRESH GREEN (FAG CORG)

Trong thời đại công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, cùng với sự phát triển của các ngành kinh tế khác, ngành công nghệ chế biến lương thực, thực phẩm cũng phát triển rất vượt bậc. Hàng loạt sản phẩm mới, hàng hoạt quy trình công nghệ, hàng loạt công ty, xí nghiệp, vùng sản xuất lương thực phẩm ra đời. Gần đây, trên các phương tiện thông tin truyền thông, có rất nhiều vụ phát hiện thực phẩm bẩn, thực phẩm không rõ nguồn gốc, thực phẩm ôi bẩn, đặc biệt là bị nhiễm các vi sinh vật, độc tố vi sinh vật,….Những con số báo động về số ca, số người bị tử vong do ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng là hồi chuông báo động cho mọi người trong thói quen sản xuất và tiêu dùng thực phẩm. Làm thế nào để đảm bảo thực phẩm an toàn, kiểm soát các chỉ tiêu chất lượng về vi sinh, hóa sinh luôn đảm bảo ngưỡng giới hạn cho phép,…luôn là vấn đề không chỉ các nhà sản xuất mà người tiêu dùng luôn quan tâm hàng đầu. Việc kiểm soát chất lượng thực phẩm theo các tiêu chuẩn Việt Nam và Quốc tế ban hành là quyền và nghĩa vụ cấp bách đối với nhà sản xuất thực phẩm. Bởi lẽ, thực phẩm sạch, đạt tiêu chuẩn thì khả năng cạnh tranh trên thị trường sẽ cao. Ngược lại, thực phẩm không đạt chất lượng thì sẽ không được người tiêu dùng chấp nhận. Có rất nhiều phương pháp để kiểm tra một số loại vi sinh vật cơ bản trong thực phẩm, tùy theo yêu cầu và tình hình của mỗi công ty, mỗi ngành hàng mà áp dụng các phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, nhìn chung, các nhà sản xuất sẽ áp dụng theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO) để định lượng cũng như định tính chất lượng thực phẩm của đơn vị mình.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KĨ THUẬT MÔI TRƯỜNG

BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TÌM HIỂU MỘT SỐ QUY TRÌNH PHÂN TÍCH VI SINH TRONG THỰC PHẨM TẠI CÔNG TY CỔ PHẦN THỰC PHẨM SẠCH

FRESH & GREEN (FAG CORG)

NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

LỜI CẢM ƠN

Sau 2 tháng đến công ty Cổ phần Thực phẩm Sạch Fresh & Green (FAG CORG) để tham gia khóa thực tập tốt nghiệp Đến nay thời gian thực tập cơ bản đã hoàn thành Chuyến đi này đã giúp em có điều kiện tiếp cận môi trường làm việc thực tế, cũng cố

và vận dụng những kiến thức đã học từ giảng đường vào công việc cụ thể Tuy thời gian không nhiều, nhưng đã giúp em thay đổi cách nhìn nhận vấn đề, so sánh giữa lý thuyết và thực tiễn, biết mình đã tiếp nhận được gì, còn thiếu những gì để chủ động bổ sung kiến thức, làm hành trang sẵn sàng sau khi tốt nghiệp

Để hoàn thành đề tài “Tìm hiểu một số quy trình phân tích vi sinh vật trong thực

phẩm tại Công ty Cổ phần Thực phẩm Sạch Fresh & Green (FAG CORG)”

Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn BGH Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TPHCM, BCN Khoa CNSH & KTMT, đặc biệt là TS Phạm Minh Tuấn,…đã tạo điều kiện để sinh viên có cơ hội tiếp cận các doanh nghiệp và công ty

Cảm ơn giảng viên hướng dẫn là ThS Đào Thị Mỹ Linh đã luôn quan tâm, theo dõi, chỉ dẫn nhiệt tình Sự động viên, khích lệ của Cô trong thời gian qua giúp em có thêm động lực để vượt qua những khó khăn, hoàn thành kế hoạch

Cảm ơn gia đình, anh chị và các bạn Hoàng, Tuyền, Hoàng Nhật, Linh Cường, Thiên Phương, Thanh Phương, đã luôn bên cạnh, góp ý, tiếp thêm động lực cho mình

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo FAG CORG đã cho em cơ hội đến công ty để học hỏi và làm việc thực tế Cảm ơn các anh chị phòng kĩ thuật, phòng

vi sinh, đặc biệt là KS Nguyễn Trọng Lễ (Trưởng phòng kĩ thuật) và KS Nguyễn Thị Ngọc Thắm đã dành thời gian quý báu, trực tiếp theo sát, hướng dẫn em nhiệt tình, giải thích những thắc mắc trong những ngày em thực tập tại công ty

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 03 năm 2016

TRẦN HOÀI TÂM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan kết quả bài báo cáo này là do chính tôi thực hiện Tất cả các quy trình công nghệ, các số liệu phân tích có được, là do chính tôi tìm hiểu và thu thập được trong quá trình thực tập tại Fresh & Green Bài báo cáo này trung thực, không qua sao chép từ bất cứ công trình nghiên cứu nào

Tp Hồ Chí Minh, ngày 28 tháng 03 năm 2016

Người thực hiện

Trần Hoài Tâm

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii

1 LỜI MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích 1

1.3 Kết quả đạt được 2

2 GIỚI THIỆU 3

2.1 Giới thiệu về đơn vị thực tập 3

2.1.1 Thông tin công ty 3

2.1.3 Sứ mệnh tồn tại 4

2.1.4 Giá trị cốt lõi 4

2.1.5 Tôn chỉ hoạt động 4

2.1.6 Lĩnh vực kinh doanh 5

2.2 Cơ cấu tổ chức công ty FAG CORG 5

2.3 Tình hình sản xuất, nghiên cứu, kinh doanh 5

2.4 Giới thiệu về đơn vị trực tiếp thực tập – Phòng thí nghiệm vi sinh 6

2.4.1 Chức năng – nhiệm vụ 6

2.4.2 Quy định của phòng thí nghiệm vi sinh 7

2.5 Một số hình ảnh về công ty FAG CORG 7

3 NỘI DUNG THỰC TẬP 9

3.1 Phương pháp phân tích tổng Clostridium perfringens trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (ISO 7937:2004) 9

3.1.1 Clostridium và C perfringens 10

3.1.2 Nguyên tắc 11

3.1.3 Vật liệu 11

3.1.4 Quy trình thực hiện 11

3.1.5 Biểu diễn kết quả 14

3.2 Phương pháp phân tích tổng Coliforms trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

(ISO 4832:2006) 15

3.2.1 Coliforms 15

3.2.2 Nguyên tắc 16

3.2.3 Vật liệu 16

3.2.4 Quy trình thực hiện 16

3.2.5 Thử nghiệm khẳng định 18

3.3 Tổng vi khuẩn hiếu khí trong nước, nguyên liệu, sản phẩm - TPC (TCVN 4884:2005) 18

3.3.1 Tổng vi khuẩn hiếu khí 18

3.3.2 Nguyên tắc 18

3.3.3 Vật liệu……… ……… 18

3.3.4 Quy trình 19

3.4 Staphylococcus aureus trong nguyên liệu và sản phẩm (TCVN 4830:2005) 20

3.4.1 Staphylococcus aureus 20

3.4.2 Nguyên tắc 21

3.4.3 Vật liệu 21

3.4.4 Quy trình 22

3.4.5 Biểu diễn kết quả 23

3.5 Tổng nấm men – nấm mốc trong nguyên liệu và sản phẩm (FDA BAM – Chapter 18) 24

3.5.1 Nấm men – nấm mốc 24

3.5.2 Nguyên tắc 24

3.5.3 Vật liệu 25

3.5.5 Biểu diễn kết quả 26

4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28

4.1 Kết luận 28

4.2 Kiến nghị 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC 30

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công ty cổ phần thực phẩm sạch Fresh & Green (FAG CORG)……… ….3

Hình 2.2 Một số hình ảnh tại vườn trồng công ty……… 7

Hình 2.3 Một số sản phẩm được bán tại chuỗi cửa hàng, siêu thị FAG CORG….… 8

Hình 3.1 Vi khuẩn Clostridium perfrigens……….……….……… … 11

Hình 3.2 Vi khuẩn Coliforms bacteria 15

Hình 3.3 Vi khuẩn Staphylococcus aureus……… …… 20

Hình 3.4 Nấm men……… 24

Hình 3.5 Nấm mốc……… ……… ……….24

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Cơ cấu tổ chức công ty FAGCORG… ……… ………… 5

Sơ đồ 2.2 Cơ cấu tổ chức phòng kĩ thuật… ……… ….…… …… 6

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng thể nội dung thực tập……… ….… ……9

Sơ đồ 3.2 Quy trình chung phân tích vi sinh vật………… ……….9

Sơ đồ 3.3 Quy trình phân tích Clostridium perfringens…… ………12

Sơ đồ 3.4 Quy trình phân tích Coliforms………17

Sơ đồ 3.5 Quy trình phân tích tổng vi sinh vật hiếu khí……… …19

Sơ đồ 3.6 Quy trình phân tích Staphylococcus aureus………… ……… 22

Sơ đồ 3.7 Quy trình phân tích tổng nấm men – nấm mốc…… ……….25

1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong thời đại công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, cùng với sự phát triển của các ngành kinh tế khác, ngành công nghệ chế biến lương thực, thực phẩm cũng phát triển rất vượt bậc Hàng loạt sản phẩm mới, hàng hoạt quy trình công nghệ, hàng loạt công ty, xí nghiệp, vùng sản xuất lương thực phẩm ra đời

Gần đây, trên các phương tiện thông tin truyền thông, có rất nhiều vụ phát hiện thực phẩm bẩn, thực phẩm không rõ nguồn gốc, thực phẩm ôi bẩn, đặc biệt là bị nhiễm các

vi sinh vật, độc tố vi sinh vật,….Những con số báo động về số ca, số người bị tử vong

do ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng là hồi chuông báo động cho mọi người trong thói quen sản xuất và tiêu dùng thực phẩm Làm thế nào để đảm bảo thực phẩm an toàn, kiểm soát các chỉ tiêu chất lượng về vi sinh, hóa sinh luôn đảm bảo ngưỡng giới hạn cho phép,…luôn là vấn đề không chỉ các nhà sản xuất mà người tiêu dùng luôn quan tâm hàng đầu

Việc kiểm soát chất lượng thực phẩm theo các tiêu chuẩn Việt Nam và Quốc tế ban hành là quyền và nghĩa vụ cấp bách đối với nhà sản xuất thực phẩm Bởi lẽ, thực phẩm sạch, đạt tiêu chuẩn thì khả năng cạnh tranh trên thị trường sẽ cao Ngược lại, thực phẩm không đạt chất lượng thì sẽ không được người tiêu dùng chấp nhận Có rất nhiều phương pháp để kiểm tra một số loại vi sinh vật cơ bản trong thực phẩm, tùy theo yêu cầu và tình hình của mỗi công ty, mỗi ngành hàng mà áp dụng các phương pháp khác nhau Tuy nhiên, nhìn chung, các nhà sản xuất sẽ áp dụng theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) và tiêu chuẩn quốc tế (ISO) để định lượng cũng như định tính chất lượng thực phẩm của đơn vị mình

1.2 Mục đích

Thông qua quá trình phân tích các mẫu thực phẩm theo các tiêu chuẩn quy định, trên một số môi trường chọn lọc cơ bản tương ứng, giúp phát hiện sự tồn tại của các nhóm vi sinh vật có trong các mặt hàng lương thực – thực phẩm được bày bán tại hệ thống siêu thị của công ty

Quá trình phân tích này có thể định tính và định lượng sự có mặt của các loại vi sinh vật trong thực phẩm đó Qua đó, xác định, thực phẩm nào đạt ngưỡng cho phép, thực

phẩm nào vượt ngưỡng cho phép để tiến hành xử lý kịp thời, đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm theo tiêu chuẩn quy định

Ngoài ra, thông qua việc phân tích các chỉ tiêu, giúp nhà sản xuất nắm bắt và kiểm soát được mối nguy vi sinh vật tốt hơn, hướng tới giảm thiểu nguy cơ ngộ độc thực

phẩm và đảm bảo uy tín, khẳng định thương hiệu công ty

1.3 Kết quả đạt được

- Nắm được môi trường chọn lọc cơ bản các loại vi sinh vật theo TCVN và ISO

- Biết cách pha môi trường và một số loại hóa chất dùng trong phân tích

- Biết cách sử dụng và vận hành một số máy móc, thiết bị trong phòng thí nghiệm

vi sinh

- Biết cách lấy mẫu ngẫu nhiên, xử lý và bảo quản mẫu

- Thực hiện được 07 quy trình phân tích vi sinh theo TCVN, 01 quy trình theo FDA, 2 quy trình theo ISO (Trong giới hạn báo cáo này chỉ trình bày 5 quy trình đại diện)

2 GIỚI THIỆU

Hình 2.1 Công ty cổ phần thực phẩm sạch Fresh & Green (FAG CORG)

2.1 Giới thiệu về đơn vị thực tập

2.1.1 Thông tin công ty

- Tên công ty: Công ty cổ phần thực phẩm sạch Fresh & Green

- Tên giao dịch: FAG CORG

- Mã số thuế: 1402018721 – ngày cấp: 07/08/2015

- Người đại diện pháp luật: Thái Thanh Phong – Chức vụ: Giám đốc

- Địa chỉ trụ sở chính: số 17, Nguyễn Văn Biểu, Phường Mỹ Phú, Thành phố Cao Lãnh, Tỉnh Đồng Tháp

- Điện thoại: 067.3979171 – Fax: 067.3979171 – Hotline: 093.9999.171

- Website: freshgreen.vn

- Lĩnh vực kinh doanh được cấp phép:

+ Bán buôn thực phẩm (Mã 4632)

+ Bán buôn đồ uống (Mã 4633)

+ Bán lẻ thực phẩm trong các cửa hàng chuyên doanh (Mã 4722)

+ Trồng rau, đậu các loại và trồng hoa, cây cảnh (Mã 0118

2.1.2 Lịch sử hình thành, phát triển

Tọa lạc tại thành phố Cao Lãnh – Tỉnh Đồng Tháp, FAG CORG được biết đến là hệ thống siêu thị, chuỗi cửa hàng thực phẩm sạch và an toàn

FAG CORG được ra đời từ sự kết hợp của một nhóm người có cùng tâm huyết đang công tác tại công ty TNHH MTV dịch vụ phát triển nông nghiệp Đồng Tháp (DASCO) Sau thời gian dài chuẩn bị ý tưởng, lập kế hoạch, đầu tư cơ sở vật chất, giấy phép,…cho đến tháng 8/ 2015, công ty chính thức được thành lập, trên cơ sở nâng cấp về quy mô số lượng và chất lượng các cửa hàng thực phẩm tiện lợi đã có, cũng như mở rộng thêm một số cửa hàng, siêu thị mới Đến nay FAG CORG đã có 1 trụ sở chính và 05 cửa hàng/ siêu thị tiện lợi

Là một doanh nghiệp khá trẻ về sự ra đời, tuy nhiên, nói về kinh nghiệm hoạt động – kinh doanh, thì những thành viên sáng lập nên FAG CORG là những người có rất nhiều kinh nghiệm trên thị trường, họ là những nhân viên giỏi, giữ nhiều vị trí chủ chốt tại công ty DASCO Đồng Tháp Chính vì thế, FAG CORG từng bước khẳng định thương hiệu của mình với người tiêu dùng trên địa bàn thành phố Cao Lãnh trong một thời gian ngắn

Với hệ thông cửa hàng phủ sóng rộng khắp trong thành phố Cao Lãnh, các cửa hàng của FAG CORG luôn sẵn sàng cung cấp các loại thực phẩm sạch tươi xanh nhập về hàng ngày và được xác định nguồn gốc hẳn hoi, và đặc biệt là chất lượng thực phẩm

luôn được kiểm soát về an toàn thực phẩm theo quy định

2.1.3 Sứ mệnh tồn tại

Với sứ mệnh quan trọng từ khi thành lập, FAG CORG luôn hy vọng có thể giúp bà con nông dân giải quyết khó khăn trong việc tiêu thụ nông sản do mình trồng ra, giúp người nông dân làm giàu chân chính bằng những sản phẩm nông nghiệp sạch, giúp người tiêu dùng được yên tâm tiêu dùng nguồn thực phẩm sạch và có nguồn gốc

- Tôn trọng và bảo vệ thương hiệu F&G như danh dự của bản thân

- Kinh doanh bằng cả trái tim góp phần đưa thực phẩm sạch trở nên phổ biến

2.1.6 Lĩnh vực kinh doanh

- Bán lẻ các loại thực phẩm sạch: Bán lẻ các loại rau củ quả sạch, rau hữu cơ, rau

an toàn, trái cây đặc sản, thịt sạch, cá sông, cá đồng và gia vị các loại

- Bán buôn các loại nông sản thương hiệu F&G: Cung cấp các loại thực phẩm

tươi sống cho các cửa hàng bán lẻ, khách sạn, nhà hàng, bếp ăn cơ quan, công ty, bệnh viện, trường học mua với số lượng nhiều và thường xuyên Giao hàng tận nhà cho người tiêu dùng trong phạm vi Thành phố Cao Lãnh

- Liên kết sản xuất: Liên kết với nông dân trồng rau củ quả an toàn, sử dụng phân

hữu cơ và kiểm soát an toàn thực phẩm

2.2 Cơ cấu tổ chức công ty FAG CORG

2.3 Tình hình sản xuất, nghiên cứu, kinh doanh

Hiện nay FAG CORG có 1 trụ sở chính và 5 cửa hàng trên địa bàn thành phố Cao Lãnh, các cửa hàng này thu mua và cung ứng các sản phẩm thực phẩm xanh – sạch – tươi cho bà con lân cận Trong chiến lược kinh doanh đặt ra, công ty đang phấn đấu đến cuối năm 2016 sẽ mở rộng phạm vi hoạt động trên khắp tỉnh Đồng Tháp với số

GIÁM ĐỐC

PHÓ GIÁM ĐỐC

Phụ trách kĩ thuật

PHÓ GIÁM ĐỐC Phụ trách Kinh doanh

PHÓ GIÁM ĐỐC Phụ trách quản lý

BỊ, HC

PHÒNG

R & D

PHÒNG KINH

DOANH

PHÒNG

KẾ TOÁN TÀI VỤ

PHÒNG

HC NHÂN

lượng của hàng dự định là 10 Tiến tới phát triển sang các tỉnh lân cận trong những năm sau đó

Song song đó, công ty còn đầu tư trồng một số vườn rau xanh, nông sản, hoa kiểng, một số trang trại trồng nấm linh chi, bào ngư,…là nguồn nguyên liệu cung cứng cho

hệ thống cửa hàng và một số đơn vị khác

Ngoài ra, công ty hướng đến việc kí hợp tác với bà con nông dân, theo đó, công ty

sẽ hỗ trợ về kĩ thuật, giống cây trồng, vật nuôi,…đồng thời nhận bao tiêu sản phẩm đáp ứng được cam kết đã kí Đây là mô hình cộng sinh khá phổ biến mà Bảo vệ thực vật An Giang, DASCO Đồng Tháp đã làm, nhằm kiểm soát được chất lượng lương thực thực phẩm được tốt hơn

2.4 Giới thiệu về đơn vị trực tiếp thực tập – Phòng thí nghiệm vi sinh

Sơ đồ 2.2 Cơ cấu tổ chức phòng kĩ thuật FAG CORG

Phòng vi sinh là đơn vị trực thuộc của phòng kĩ thuật FAG CORG, chịu sự quản lý, chỉ đạo từ Giám đốc Thái Thanh Phong và Trưởng phòng kĩ thuật Nguyễn Trọng Lễ

2.4.1 Chức năng – nhiệm vụ

- Thực hiện các test phân tích chỉ tiêu vi sinh trong các mẫu thực phẩm theo các

tiêu chuẩn mà công ty yêu cầu

- Lưu giữ các mẫu thí nghiệm theo yêu cầu

- Xây dựng các quy trình phân tích mới theo yêu cầu

- Cập nhật và cung cấp các số liệu về quy định an toàn thực phẩm, dự báo và đề

xuất những biện pháp kiểm soát chất lượng thực phẩm cho ban giám đốc công ty

Phòng kĩ thuật

Phòng hóa sinh Phòng vi sinh

Phòng KHCN Phòng sơ chế

- Phối hợp cùng phòng R&D, hóa sinh,… thực hiện các nghiên cứu, khảo sát nhằm phát triển sản phẩm mới

- Thực hiện các công việc theo sự chỉ đạo của trưởng phòng kĩ thuật

2.4.2 Quy định của phòng thí nghiệm vi sinh

- Người không phận sự, không được phép vào phòng khi chưa được cho phép

- Không tự ý cung cấp tài liệu nội bộ của phòng khi chưa được sự cho phép của cấp trên

- Không mang đồ dùng cá nhân, tư trang khi vào phòng thí nghiệm

- Không sử dụng điện thoại, máy ảnh, camera,…cũng như không được phép chụp hình quay phim khi làm việc trong phòng nhằm đảm bảo tính bảo mật thông tin

- Khi vào phòng, phải tuân thủ quy định về trang phục bảo hộ (găng tay, khẩu trang, áo blouse,…)

- Không được phép ăn uống, hút thuốc, nói chuyện ồn ào trong phòng thí nghiệm

- Không được tự ý dịch chuyển, thay đổi vị trí của máy móc, thiết bị khi không được sự cho phép của cấp trên

- Tuyệt đối không vận hành, sử dụng thiết bị khi chưa nắm rõ thao tác sử dụng

- Có ý thức giữ gìn vệ sinh chung, sử dụng tiết kiệm điện nước và tài sản của phòng vi sinh

- Kiểm tra lại máy móc, thiết bị,…trước khi rời khỏi phòng

2.5 Một số hình ảnh về công ty FAG CORG

Hình 2.2 Một số hình ảnh tại vườn trồng của công ty

Hình 2.3 Một số sản phẩm được bán tại chuỗi cửa hàng, siêu thị FAG CORG

3 NỘI DUNG THỰC TẬP

- Thời gian thực tập: Từ 15/01/2016 – 30/03/2016

- Nơi thực tập: Phòng thí nghiệm vi sinh FAG CORG

- Cán bộ hướng dẫn: Trưởng phòng kĩ thuật (kiêm trưởng phòng vi sinh) KS Nguyễn Trọng Lễ, chuyên viên phòng vi sinh KS Nguyễn Thị Ngọc Thắm

- Nội dung: Tìm hiểu một số quy trình phân tích vi sinh vật trong thực phẩm (trong báo cáo này chỉ trình bày 05 quy trình đại diện)

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng thể nội dung thực tập

Sơ đồ 3.2 Quy trình chung phân tích vi sinh vật

3.1 Phương pháp phân tích tổng Clostridium perfringens trong thực

phẩm và thức ăn chăn nuôi (ISO 7937:2004)

Nội dung

thực tập

Tổng Coliforms ISO 4832:2006 Tổng Clostridium perfringens ISO 7937:2004

Tổng nấm men – nấm mốc FDA Chapter 18

Biểu diễn kết quả Quy trình thực hiện Vật liệu

(ISO 7937:2004: Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens – Colony count technique)

3.1.1 Clostridium và C perfringens

- Clostridium là vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di

động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng Những loài thủy giải saccharide có thể lên men tạo thành acetic acid, butyric và rượu Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm

- Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số loài

thuộc nhóm ưa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ưa lạnh

- Các loài Clostridium hiện diện trong đất, một số loài trong nhóm gây bệnh cho

người và động vật, một số loài khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo ra màu đen và gây mùi khó chịu

- Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là C botulinum và C perfringens

- C perfingens là loài kỵ khí không bắt buộc, rất ít khi tạo bào tử trong các môi

trường nuôi cấy nhân tạo, nhưng có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi Ellner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinolone Loài này có 6 kiểu kháng nguyên được kí hiệu từ A – F Kiểu kháng nguyên A thường gây hoại tử cho các vết thương và gây ngộ độc thực phẩm

- C perfringens được tìm thấy trong đất, trong phân người Các triệu chứng ngộ

độc độc tố do VSV này gây ra là đau thắt vùng bụng, tiêu chảy Thời gian ủ bệnh từ 12 – 24 giờ Nguồn thực phẩm có thể chứa các VSV này thường là thịt gia cầm, nhất là gia cầm đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa và các loại thực phẩm khác Bào tử của

C perfringen có tính bền với nhiệt nên chúng có thể sống sót qua quá trình nấu chín,

đặc biệt là khi đung nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn Các bào tử sống sót này khi gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm, tăng trưởng

Hình 3.1 Vi khuẩn Clostridium perfringens

3.1.2 Nguyên tắc

- Mật độ vi khuẩn Clostridium được xác định bằng cách sử dụng môi trường có chứa

ferri ammonium citrate và disodium sulphite, ủ ở 370C trong 1 – 2 ngày Nếu nghi ngờ có

Clostridium ưa nhiệt, có thể ủ thêm ở 500C Trên môi trường này các khuẩn lạc Clostridium

có màu đen do phản ứng giữa ion sulphite (S2-) và ion sắt (Fe2+) có trong môi trường

3.1.3 Vật liệu

- Môi trường chọn lọc: Trytese Sulfit Cyloserin Agar (TSC agar)

- Môi trường tăng sinh: Thicglycolat Broth

- Môi trường khằng định: Lactoza - Gelatin, Buffered motility - nitrate

- Dung dịch pha loãng: Bufferfield’s buffered phosphate (BBP)

3.1.4 Quy trình thực hiện

Sơ đồ 3.3 Quy trình phân tích Clostridium perfringens

Motility

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường Lactose gelatine Ủ trong điều kiện kị khí 370C trong 18-24h

Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào

môi trường Motility Nitrate Ủ trong

điều kiện kị khí 370C trong 18-24h

Pha loãng mẫu Mẫu

Bổ sung 10ml TSC

Đổ 10 – 15ml TSC agar (44 – 47oC) lên đĩa petri

Đồng nhất mẫu

Cấy mẫu: hút 1ml mẫu trải

lên đĩa petri

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

- Cân 10g mẫu vào túi dập mẫu, rót vào 90 ml dung dịch BBP

- Sử dụng máy dập mẫu để đồng nhất mẫu trong thời gian tối đa 2,5 phút (thường là 1

phút) để được dung dịch có độ pha loãng 10-1

- Pha loãng tiếp các nồng độ 10-2, 10-3,…

Bước 2: Đổ đĩa và ủ

- Hút 1 ml dung dịch mẫu ở nồng độ xác định, trải đều lên đĩa petri

- Đổ vào đĩa petri 10 – 15 ml môi trường chọn lọc TSC agar (44 - 470C), để môi

+ Nếu chữ số thứ 3 là 6 trở lên, sẽ làm tròn lên số trên (vd: 456  460)

+ Nếu chữ số thứ 3 là 4 trở xuống, sẽ làm tròn xuống số dưới (vd: 454  450)

+ Nếu chữ số thứ 3 là 5, sẽ căn cứ thêm chữ số thứ 2 (vd: 445  440, 455  460)

Lưu ý: Để khẳng định khuẩn lạc là Clostridium cần thực hiện thêm 1 số quy trình

cấy khẳng định tiêu chuẩn để giúp khẳng định kết quả

Một số quy trình cấy khẳng định

a Nhuộm Gram

- Nhỏ 1 giọt nước cất lên phiến kính sạch;

- Dùng que cấy vòng lấy 1 ít sinh khối vi khuẩn chuyển vào giọt nước trên phiến

kính, khuấy nhẹ Cố định vệt bôi trên phiến kính bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhỏ vài giọt methyl violet lên vệt bôi, giữ yên 20 giây

- Rửa sạch phẩm nhuộm bằng nước

- Nhỏ vài giọt dung dịch KI/ I2 lên vệt bôi, để yên 1 phút

- Rửa bằng cồn 95% đến vừa mất màu

- Rửa lại bằng nước

- Nhuộm bằng dung dịch safranin 30 giây

- Rửa sạch bằng nước

- Thấm nước dư bằng giấy lọc

- Quan sát vi khuẩn bằng vật kính 100X nhúng trong dầu

 Quan sát Gram dương có màu xanh tía

b Cấy đâm sâu khuẩn lạc sang môi trường nitrate ủ ở 37oC trong 24h Thử tính di động trên môi trường nitrate, phát triển rộng vào môi trường cách xa đường cấy

c Cấy khuẩn lạc vào môi trường lactoza – gelatin ủ kị khí ở 37oC trong vòng 24h Thử khả năng sinh khí từ lactoza và hóa lỏng gelatin: sinh khí có xuất hiện màu vàng

do hình thành axit do lên men lactoza, hóa lỏng làm lạnh các ống ở 5oC

3.1.5 Biểu diễn kết quả

- Trong trường hợp 2 đĩa (mẫu kiểm tra hoặc huyền phù ban đầu) không có khuẩn

lạc, tính theo công thức:

Với: d là độ pha loãng của dịch huyền phù ban đầu

hay độ pha loãng đầu tiên

- Trong trường hợp 2 đĩa có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính theo công thức: