Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ trên ng ời tình nguyện

Những chữ viết tắt AUC - Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian Area Under the Curve of Concentration versus Time ATS - Hội lồng ngực Mỹ American Thoracic Society CDC - Trung

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của

rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ

Bộ Y tế

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ

trên người tình nguyện

Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Kim Huyền Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội Cấp quản lý: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2003 đến tháng 12/2005 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 300 triệu đồng

Trong đó: kinh phí sự nghiệp khoa học 300 triệu đồng

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

1 Tên đề tài:

Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng của rifampicin từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ trên người tình nguyện

2 Chủ nhiệm đề tài: PGS TS Hoàng Thị Kim Huyền

3 Đơn vị chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội

4 Cấp quản lý: Bộ Y tế

5 Danh sách những người thực hiện chính

- PGS.TS Hoàng Thị Kim Huyền, Bộ môn Dược lâm sàng, trường ĐHDHN

Những chữ viết tắt

AUC - Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian

(Area Under the Curve of Concentration versus Time)

ATS - Hội lồng ngực Mỹ (American Thoracic Society)

CDC - Trung tâm phòng chống bệnh tật Mỹ

(Center for Diseases Control and Prevention)

Cmax - Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tương

CTCLQG - Chương trình chống lao quốc gia

DOTS - Hoá trị liệu ngắn ngày có giám sát trực tiếp

(Directly Observed Therapy Short course)

E, EMB - Ethambutol

FDA - Cơ quan quản lý Thực phẩm – Dược phẩm Mỹ

(Food And Drug Administration)

FDC - Thuốc viên hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination)

IDSA - Hội bệnh nhiễm trùng Mỹ (Infectious Diseases Society of America)

H, INH - Isoniazid

HPLC - Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

IUATLD - Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế

(International Union Against Tuberculosis and Lung Disease)

R, RMP - Rifampicin

S, SM - Streptomycin

T1/2 - Thời gian bán thải của thuốc

Tmax - Thời gian thuốc đạt nồng độ cực đại trong huyết tương kể từ khi đưa

thuốc WHO - Tổ chức y tế thế giới

(World Health Organization)

Z, PZA - Pyrazinamide

Mục lục

Trang

2 áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội 4

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê

2.1 Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều 7

2.2 Sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều 8

2.3 Phương pháp định lượng RMP trong huyết tương bằng HPLC 9

3.2 Vật liệu và phương tiện nghiên cứu 13

4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng RMP trong huyết tương 21

4.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng RMP trong huyết tương 21

4.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng 22 4.2 Sinh khả dụng của RMP trên người tình nguyện 27

4.2.1 Đặc điểm của nhóm người tình nguyện 27

4.2.2 Nồng độ RMP trong huyết tương và các thông số dược động học của

5.2.1 Một số thông số dược động học của RMP khi uống RMP đơn độc 38

5.1.2 Những thay đổi chỉ số Cmax và AUC khi uống RMP – INH – PZA đồng

thời

39

6 Kết luận và đề xuất 45

Phụ lục

Phụ lục 1 - Phiếu thu thập số liệu người tình nguyện

Phụ lục 2 - Phiếu theo dõi sức khoẻ người tình nguyện

Phụ lục 3 - Bảng theo dõi thời điểm lấy mẫu máu người tình nguyện

Phụ lục 4 - Đơn tình nguyện tham gia nghiên cứu

Phụ lục 5 - Sắc ký đồ của rifampicin

Phần A Tóm tắt các kết quả nổi bật của đề tài

1 Kết quả nổi bật của đề tài

a/ Đóng góp mới của đề tài

- Xây dựng và hoàn chỉnh được quy trình định lượng rifampicin trong huyết tương người từ hỗn hợp 3 thuốc chống lao RHZ, làm tiền đề cho việc kiểm tra chất

lượng thuốc có chứa rifampicin Điều này còn giúp cho việc theo dõi nồng độ một thuốc chống lao hàng đầu (rifampicin) trong điều trị khi cần thiết

Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị (máy HPLC) cùng với chuyên gia có kinh nghiệm về kiểm nghiệm; nhưng định lượng nồng độ rifampicin trong huyết tương còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết tương để định lượng rifampicin luôn có nhiều thuốc chống lao khác cùng được uống đồng thời Với nhiều khó khăn trên, ở thời điểm hiện nay tại Việt nam, người nghiên cứu phải có nhiều nỗ lực để vượt qua Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP nói riêng và thuốc chống lao trong viên FDC nói chung sẽ giúp ích cho chương trình chống lao quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao FDC đảm bảo chất lượng Đồng thời giúp các nhà sản xuất thuốc trong nước trong việc sản xuất chống lao FDC đảm bảo sinh khả dụng của RMP cũng như các thành phần khác Ngoài ra, đối với cộng

đồng, việc đảm bảo chất lượng thuốc chống lao góp phần điều trị bệnh lao thành công và giảm nguy cơ xuất hiện kháng thuốc, điều đó có ý nghĩa lớn trong thực tiễn Việt nam hiện nay

- Đã đánh giá được tương đương sinh học (Bioequivalance) của rifampicin từ

viên FDC hiện chương trình chống lao Quốc gia đang sử dụng (Combikits) so với viên rifampicin khi dùng đơn độc và rifampicin trong phối hợp 3 viên riêng rẽ RHZ Nhờ nghiên cứu này chúng tôi phát hiện được sự giảm sinh khả dụng của rifampicin trong chế phẩm thuốc chống lao dưới dạng viên hỗn hợp cố định liều (Fixed dose combination - FDC) - dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng

1 chế phẩm, đúng như nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới, từ đó có được

đề xuất về việc đưa tiêu chuẩn đánh giá sinh khả dụng in vivo rifampicin của các dạng viên FDC khi kiểm tra chất lượng thuốc điều trị lao

Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng FDC có độ hoà tan của RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn

về sinh khả dụng.[13, 15], có thể chế phẩm này đảm bảo sinh khả dụng nhưng chế phẩm khác thì sinh khả dụng kém.[20]

Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhưng cho đến nay, những thông tin nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của RMP và những thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP được công bố rất ít Những thông tin đầy đủ về việc sử dụng tá dược, thay đổi quy trình bào chế… vẫn được giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công

bố Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đưa ra giải pháp đảm bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm FDC

Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc chống lao dạng FDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên

sử dụng để điều trị bệnh lao

Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao dạng FDC bắt buộc phải được đánh giá sinh khả dụng của RMP trước khi sử dụng

điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế phẩm này dường như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong nước [14, 31]

Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) ở nước ta cũng đã sử dụng các thuốc chống lao dạng viên hỗn hợp trong điều trị bệnh lao từ nhiều năm nay và các chuyên gia đầu ngành lao cũng rất quan tâm đến chất lượng thuốc chống lao của những dạng bào chế này Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt nam chưa có 1 nghiên cứu nào tiến hành đánh giá sinh khả dụng của rifampicin (RMP) trong các chế phẩm hỗn hợp, vì vậy, nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên hỗn hợp là cần thiết

Phương pháp chiết RMP có hiệu suất xấp xỉ 100% với độ lệch chuẩn tương đối

< 3,5% chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao, có thể áp dụng trong thực nghiệm xác định nồng độ rifampicin trong huyết tương Phương pháp có độ chính xác cao với RSD < 1% Pic rifampicin ở nồng độ 0,2 àg/ml xác định, không trùng với pic khác, tái hiện, sai khác trung bình khi nghiên cứu độ chính xác là 7,71% (không quá 20% theo quy định của FDA) Kết quả thực nghiệm cho thấy trong huyết tương người, rifampicin ổn định sau 3 tháng bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ - 40OC

2 Về nồng độ RMP trong máu của các dạng chế phẩm nghiên cứu:

Cmax của RMP đạt được trong huyết tương bị giảm đi 31,24% và AUC giảm 25,94% khi uống RMP-INH-PZA đồng thời so với uống RMP đơn độc

Nồng độ RMP cao nhất đạt được trong huyết tương người tình nguyện khi uống viên hỗn hợp Combikits là 6,52 ± 1,84 àg/ml, thấp hơn so với uống viên đơn lẻ

đối chiếu (10,44 ± 2,01àg/ml) và thấp hơn phạm vi điều trị

Thời gian đạt nồng độ Cmax của rifampicin trong huyết tương khi uống viên hỗn hợp Combikits lớn hơn so với viên đơn lẻ, ở phần lớn cá thể đạt Tmax ở 3h, trong khi ở viên đơn lẻ là 1h

3 Sinh khả dụng tương đối của RMP trong viên hỗn hợp Combikits đang sử dụng hiện nay thấp, chỉ đạt 64,95% so với viên đơn lẻ (46% – 77% với khoảng tin cậy 90%)

c/ Hiệu quả về đào tạo

- Đã đào tạo được 1 nghiên cứu sinh, 1 thạc sĩ và 2 dược sĩ đại học

- Đã nâng cao được năng lực nghiên cứu, đặc biệt trong lĩnh vực đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học cho đội ngũ cán bộ giảng dạy của Bộ môn Dược lâm sàng

- Đã tạo được sự hợp tác trong đào tạo và nghiên cứu khoa học với Viện Lao và Bệnh phổi Trung ương, Bệnh viện Lao Hà nội và gây được sự chú ý của các giáo sư

đầu ngành Lao

d/ Hiệu quả về kinh tế

- Đề xuất với Bộ Y tế đưa tiêu chuẩn về đánh giá sinh khả dụng của RMP trong các dạng chế phẩm FDC khi cho phép chế phẩm lưu hành hoặc đấu thầu, tránh tình trạng đấu thầu phải những sản phẩm kém chất lượng như hiện nay gây lãng phí

e/ Hiệu quả về Xã hội:

- Việc phát hiện giảm sinh khả dụng RMP của thuốc Combikits từ đề tài này

đã đem lại lợi ích cho xã hội, tránh tình trạng điều trị kém hiệu quả Đặc biệt nếu sử dụng những dạng chế phẩm có nồng độ thấp sẽ dẫn đến tình trạng tạo ra các chủng

vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt nguy hiểm là kháng RMP

f/ Các hiệu quả khác

- Giúp cho các cơ sở kiểm nghiệm một phương pháp định lượng RMP từ huyết tương người có độ ổn định và độ chính xác cao; một quy trình đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của RMP

2 áp dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội

- Giúp cho các nhà bào chế trong nước rút kinh nghiệm nhằm cải tiến quy trình bào chế thuốc chống lao dạng viên FDC

- Giúp cho các nhà điều trị thấy rõ vai trò của đánh giá sinh khả dụng của thuốc

3 Đánh giá thực hiện đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu đã được phê duyệt

a/ Luôn hoàn thành đúng tiến độ

b/ Đã đạt được mục tiêu nghiên cứu đề ra

+ Đánh giá tương đương sinh học của rifampicin trong viên hỗn hợp cố

định liều (FDC) hiện được CTCLQG đang sử dụng

+ Rút ra kết luận về chất lượng của rifampicin trong viên FDC để đóng góp ý kiến cho CTCLQG trong lựa chọn thuốc điều trị

c/ Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến:

- Phương pháp chiết xuất và định lượng RMP từ huyết tương người

- Chất lượng của sản phẩm thử: Combikits

d/ Đánh giá việc sử dụng kinh phí:

- Sử dụng hợp lý, tiết kiệm

2 Có thể sử dụng phương pháp định lượng RMP huyết tương để giám sát nồng

độ điều trị những trường hợp bệnh nhân lao tái trị do đặc điểm giao động giữa các cá thể về nồng độ RMP trong huyết tương

Phần B Nội dung báo cáo chi tiết kết quả nghiên cứu

1 Đặt vấn đề

Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều (Fixed dose combination - FDC) là dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng 1 chế phẩm Sử dụng thuốc chống lao dạng FDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và cho thầy thuốc:

đảm bảo vấn đề tuân thủ điều trị của bệnh nhân dễ dàng hơn, thày thuốc kê đơn đơn giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị đơn trị liệu dẫn tới tình

trạng kháng thuốc Vì những lợi ích trên WHO/IUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc

chống lao dạng FDC trong chương trình chống lao của tất cả các quốc gia Thuốc chống lao hỗn hợp RMP - INH và RMP - INH- PZA đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới

Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy thuốc chống lao dạng FDC có độ hoà tan của RMP tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn

về sinh khả dụng.[21], [23], có thể chế phẩm này đảm bảo sinh khả dụng nhưng chế phẩm khác thì sinh khả dụng kém.[33] Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng FDC có sinh khả dụng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém, nguy cơ thất bại

điều trị và sẽ gia tăng các chủng vi khuẩn lao kháng RMP (không còn lợi ích ngăn chặn tình trạng kháng thuốc). [45]

Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc chống lao dạng FDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên

sử dụng để điều trị bệnh lao

Năm 1999 WHO đã ban hành quy định tất cả các chế phẩm thuốc chống lao dạng FDC bắt buộc phải được đánh giá sinh khả dụng của RMP trước khi sử dụng

điều trị cho bệnh nhân, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế phẩm này dường như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong nước [22], [45]

Chương trình chống lao quốc gia CTCLQG ở nước ta cũng đã sử dụng các thuốc chống lao dạng viên hỗn hợp trong điều trị bệnh lao từ nhiều năm nay và các chuyên gia đầu ngành lao cũng rất quan tâm đến chất lượng thuốc chống lao của những dạng bào chế này Tuy nhiên, cho đến nay ở Việt nam chưa có 1 nghiên cứu nào tiến hành đánh giá sinh khả dụng của rifampicin (RMP) trong các chế phẩm hỗn

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Đánh giá tương đương sinh học của rifampicin trong viên hỗn hợp cố định liều (FDC) hiện đang được CTCLQG sử dụng

2 Rút ra kết luận về chất lượng của rifampicin trong viên FDC để đóng góp ý kiến cho CTCLQG trong lựa chọn thuốc điều trị

2 Tổng quan

2.1 thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều

2.1.1 Sự ra đời của thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều

Thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination - FDC) là dạng thuốc chứa nhiều thành phần thuốc chống lao trong cùng 1 chế phẩm Những chế phẩm hỗn hợp đầu tiên gồm 2 thành phần (2-FDC) trong đó có isoniazid (INH) là: INH - PAS, INH- thiacetazon, ra đời ngay sau khi có isoniazid (năm 1952) Khi

có sự ra đời của ethambutol (EMB) và rifampicin (RMP) thì có dạng hỗn hợp INH - EMB, INH - RMP, trong các chế phẩm phối hợp 2 thuốc (2-FDC) được sử dụng rộng rãi nhất từ khi ra đời đến nay là hỗn hợp RMP-INH Hãng Hoechs Marion Rousel đã đưa ra thị trường chế phẩm hỗn hợp có chứa 3 thuốc RMP- INH- PZA (3-FDC) đầu tiên năm 1988, dạng viên hỗn hợp 4 thuốc RMP - INH- PZA- EMB (4-FDC) đầu tiên vào năm 1997, cùng thời điểm đó Novatis đưa ra viên hỗn hợp 3 thuốc RMP - INH- PZA dành cho trẻ em. [44]

Thuốc chống lao hỗn hợp RMP - INH và RMP - INH- PZA đã được sử dụng rộng rãi từ những năm 80 của thế kỷ XX ở hơn 40 quốc gia trên thế giới Đến nay, các chế phẩm hỗn hợp chứa 2, 3, hoặc 4 thành phần được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới

2.1.2 Lợi ích của việc sử dụng thuốc chống lao dạng FDC

Sử dụng thuốc chống lao dạng FDC mang lại nhiều lợi ích cho bệnh nhân và cho thầy thuốc: đảm bảo vấn đề tuân thủ điều trị của bệnh nhân dễ dàng hơn, thày thuốc kê đơn đơn giản hơn, tránh nguy cơ bệnh nhân bỏ sót thuốc và điều trị đơn trị liệu dẫn tới tình trạng kháng thuốc, ngoài ra còn có những lợi ích khác trong thực tiễn Đối với thầy thuốc, phác đồ điều trị lao cũng trở nên đơn giản hơn, việc kê đơn thuốc dễ dàng hơn, giảm những sai sót về tính liều thuốc và tên thuốc khi kê đơn, việc hướng dẫn bệnh nhân dùng thuốc cũng thuận tiện hơn

Bệnh nhân dễ tuân thủ điều trị hơn vì số viên thuốc cần phải uống cho một ngày giảm đi Chính điều này đã dẫn tới WHO/IUATLD khuyến cáo sử dụng thuốc chống lao dạng FDC trong chương trình chống lao của tất cả các quốc gia

2.1.3 Chất lượng của thuốc chống lao dạng FDC

Vấn đề lớn nhất gặp phải trong sử dụng thuốc chống lao dạng FDC là phải đảm bảo rằng viên FDC phải có chất lượng tốt Chất lượng của thuốc chống lao phụ thuộc

đặc biệt là dù độ hoà tan của RMP trong viên FDC tốt cũng không đảm bảo rằng RMP trong viên FDC sẽ đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng.[21], [23] Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng trong thuốc chống lao dạng FDC, có thể chế phẩm này

đảm bảo sinh khả dụng tốt nhưng chế phẩm khác lại có sinh khả dụng kém.[33]Những yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của RMP cho đến nay đã được biết đến nhưng cũng chưa thật đầy đủ Hậu quả của sử dụng thuốc chống lao dạng FDC có chất lượng không đảm bảo dẫn tới kết quả điều trị kém và sẽ tạo ra tình trạng kháng thuốc (không còn lợi ích ngăn chặn tình trạng kháng thuốc). [45]

2.2 Sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống lao hỗn hợp cố định liều

2.2.1 Lý do cần nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên FDC

Ngay từ thời kỳ đầu mới ra đời của các chế phẩm hỗn hợp RMP - INH, Acocella và cộng sự đã nghiên cứu so sánh nồng độ các thuốc chống lao đạt được trong huyết tương người tình nguyện sau khi uống viên hỗn hợp và riêng lẻ[6] Năm

1988, trong hội thảo của IUATLD tại Dubrovnik, tiến sĩ Acocella G (Trường Đại học Pavia, Italy) đã báo cáo kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP trong viên FDC cho thấy sinh khả dụng của RMP đặc biệt là dạng 3-FDC rất kém Những nghiên cứu khác cũng cho thấy rằng cùng là dạng thuốc chống lao FDC nhưng một

số chế phẩm đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng còn chế phẩm khác thì không. [21]

Năm 1989, Acocella đã công bố trên tạp chí của Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế về kết quả nghiên cứu về sinh khả dụng của RMP trong một số chế phẩm thuốc chống lao (4 chế phẩm RMP đơn lẻ, 4 chế phẩm hỗn hợp RMP - INH, 4 chế phẩm hỗn hợp RMP - INH- PZA) so sánh với các chế phẩm chuẩn đơn lẻ RMP, INH, PZA Chỉ có 1 chế phẩm RMP đơn lẻ được sản xuất ở châu âu, còn lại các chế phẩm thử nghiệm trong nghiên cứu này được sản xuất và sử dụng ở các nước châu

á Kết quả nghiên cứu đã cho thấy: 4 chế phẩm RMP đơn lẻ đều đạt tiêu chuẩn về sinh khả dụng, trong khi đó 3 chế phẩm hỗn hợp RMP - INH có 1 chế phẩm nồng

độ RMP trong huyết tương đạt được sau khi uống là rất thấp (giảm 50% so với chế phẩm chuẩn), 4 chế phẩm FDC 3 thành phần RMP - INH - PZA đều có sinh khả dụng thấp. [6]

Năm 1994, IUATLD và WHO đã ban hành khuyến cáo rằng chỉ những thuốc chống lao dạng FDC có chất lượng tốt và đảm bảo sinh khả dụng của RMP mới nên

sử dụng để điều trị bệnh lao Sau khuyến cáo trên 5 năm, Pillai và cộng sự (1999) đã trình bày kết quả nghiên cứu cho thấy sinh khả dụng của RMP trong thuốc chống

phẩm hỗn hợp thuốc chống lao FDC lưu hành trên thị trường thế giới có 7 chế phẩm FDC có sinh khả dụng của RMP kém so với chế phẩm RMP chuẩn đơn lẻ. [33] Năm 1999, trong Hội thảo của WHO tổ chức tại Geneva, G Ellard và B Fourie đã trình bày những thông tin nghiên cứu về chất lượng của thuốc chống lao dạng FDC của nhiều tác giả khác và cũng cho thấy sinh khả dụng của RMP ở những chế phẩm khác nhau có mặt trên thị trường thế giới trong nhiều năm qua có những chế phẩm đạt sinh khả dụng, những chế phẩm khác lại rất kém.[21]

Đứng trước thực trạng trên, năm 1999, WHO đã quy định sinh khả dụng của RMP trong tất cả các chế phẩm thuốc chống lao dạng FDC bắt buộc phải được đánh giá, trong khi sinh khả dụng của INH, PZA, EMB trong các chế phẩm này dường như ít phải quan tâm hơn do những hoạt chất này dễ tan trong nước [22], [45]

Mặc dù việc tìm ra RMP đã trải qua 4 thập kỷ nhưng cho đến nay, những thông tin nghiên cứu về yếu tố ảnh hưởng đến sinh khả dụng của RMP và những thay đổi của quá trình sản xuất chế phẩm để đảm bảo sinh khả dụng của RMP được công bố rất ít Những thông tin đầy đủ về việc sử dụng tá dược, thay đổi quy trình bào chế… vẫn được giữ kín trong các tài liệu của các nhà sản xuất mà không công

bố Chính những điều này làm chậm trễ cho việc hiểu biết và đưa ra giải pháp đảm bảo sinh khả dụng của RMP trong các chế phẩm FDC

2.2.2 Vấn đề đánh giá sinh khả dụng của RMP trong viên FDC tại Việt Nam

Thực hiện quy trình đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của một chế phẩm thuốc nói chung, đặc biệt là thuốc chống lao dạng FDC ở Việt Nam hiện nay cũng gặp khó khăn ở nhiều khía cạnh Về mặt tài chính, cần có kinh phí không nhỏ chi phí cho người tình nguyện khoẻ mạnh tham gia thử nghiệm và cho quy trình

định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương Về mặt kỹ thuật, xây dựng quy trình

định lượng nồng độ thuốc trong huyết tương vốn đã khó khăn, cần có trạng thiết bị (máy HPLC) cùng với chuyên gia có kinh nghiệm về kiểm nghiệm; nhưng định lượng nồng độ rifampicin trong huyết tương còn khó khăn hơn vì trong mẫu huyết tương để định lượng rifampicin luôn có nhiều thuốc chống lao khác cùng được uống

đồng thời Về mặt thủ tục: do tiến hành nghiên cứu thử nghiệm trên người tình nguyện khoẻ mạnh nên phải được Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học thông qua và cho phép thực hiện

Với nhiều khó khăn trên, ở thời điểm hiện nay tại Việt nam, người nghiên cứu phải có nhiều nỗ lực để vượt qua Xét về mặt lợi ích, những kết quả nghiên cứu sinh khả dụng của RMP nói riêng và thuốc chống lao trong viên FDC nói chung sẽ giúp ích cho chương trình chống lao quốc gia trong lựa chọn chế phẩm thuốc chống lao

việc sản xuất chống lao FDC đảm bảo sinh khả dụng của RMP cũng như các thành phần khác Ngoài ra, đối với cộng đồng, việc đảm bảo chất lượng thuốc chống lao góp phần điều trị bệnh lao thành công và giảm nguy cơ xuất hiện kháng thuốc, điều

đó có ý nghĩa lớn trong thực tiễn Việt nam hiện nay

2.3 Phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương bằng HPLC

Để đánh giá sinh khả dụng của RMP, cần xây dựng được phương pháp định lượng RMP huyết tương Có nhiều phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương như phương pháp đo quang, phương pháp sinh học, phương pháp sắc ký, trong

đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phổ biến hơn cả

do có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận

được

2.3.1 Phương pháp chiết rifampicin từ huyết tương

Để chiết hoạt chất từ huyết tương phục vụ cho định lượng thuốc trong huyết tương bằng HPCL thường sử dụng các phương pháp sau:

- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi Một số hỗn hợp dung môi đã được nghiên cứu để chiết rifampicin bao gồm dichloromethan - diethylether, tỉ lệ 2:3 (v/v) [46], diethylether: diclomethane, tỉ lệ 2:1 (v/v) [41], hỗn hợp butanol - chloroform, tỉ lệ 3:7 (v:v) [17]

- Phương pháp chiết lỏng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt chất Mẫu được bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó được rửa giải bằng hệ dung môi thích hợp để tách hoạt chất [39]

- Tủa protein Phương pháp tủa protein huyết tương là phương pháp đơn giản hơn cả Một số dung môi để tủa protein huyết tương đã được nghiên cứu bao gồm acetonitril [17], [24] (tỉ lệ huyết tương: acetonitril = 1:1,5 hoặc 1:1); methanol [30]

Trên thế giới, có nhiều chương trình sắc ký được sử dụng để tách rifampicin ra khỏi huyết tương

Bảng 2.1: Một số chương trình HPLC định lượng rifampicin trong huyết tương

Thời gian lưu (phút)

B: Acetonitril / đệm phosphat (2:3)

[30] Nova Pack C18 (250

mm x 4 mm, 4 àm)

Methanol- dung dịch 0,01 M Natri

phosphat pH 5,2 (65:35)

2.3.3 Độ ổn định của rifampicin trong huyết tương

Rifampicin dễ bị phân huỷ ở nhiệt độ thường Le Guellec và cộng sự [17] tại

phòng thí nghiệm dược lý và độc tính lâm sàng, CHU Bretonneau, Tours, Pháp tiến

hành nghiên cứu độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tương kết quả cho thấy

rifampicin bị phân huỷ nhanh chóng ở nhiệt độ thường (25OC) tới 54% trong vòng 8

giờ, thêm acid ascorbic có thể kéo dài độ ổn định của rifampicin tới 12 giờ

Rifampicin ở nồng độ thấp bị phân huỷ nhanh hơn Tuy nhiên, ở nhiệt độ -20OC,

rifampicin ổn định hơn Rifampicin trong huyết tương bệnh nhân uống rifampicin

thể hiện độ ổn định cao hơn, có thể do ở điều kiện in vivo, các phân tử rifampicin ổn

định hơn

Một số nghiên cứu về độ ổn định của rifampicin huyết tương được tóm tắt ở bảng 2.2

Bảng 2.2: Kết quả các nghiên cứu độ ổn định của rifampicin

[41] Mẫu rifampicin tự tạo

trong huyết tương

Bảo quản bằng acid ascorbic

2.3.4 Các chỉ tiêu thẩm định phương pháp định lượng

Thẩm định phương pháp phân tích là xác nhận độ tin cậy của phép đo hoạt chất trong môi trường đã cho bằng thực nghiệm

Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác, hàm

đáp ứng, giới hạn định lượng và độ ổn định của mẫu Thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của ASEAN, FDA-US về xây dựng các phương pháp phân tích sinh học [9], [11], [12], [40]

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Người tình nguyện khoẻ mạnh (12 người), lựa chọn theo các tiêu chuẩn sau:

3.1.1.Tiêu chuẩn lựa chọn

- Tuổi 18 - 55, không phân biệt giới

- Cân nặng 45 - 55 kg

- Được xác định là khoẻ mạnh dựa trên các dữ liệu lâm sàng và cận lâm sàng

- Chức năng gan, thận, huyết học bình thường; biểu hiện bằng các chỉ số xét

nghiệm sinh hoá máu (ASAT, ALAT, bilirubin toàn phần, ure, creatinin), các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, hemoglobin), xét nghiệm nước tiểu (protein, glucose, hồng cầu, bạch cầu) trong giới hạn bình thường

- Có cam kết tình nguyện tham gia nghiên cứu

3.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ:

- Phụ nữ có thai hoặc đang cho con bú

- Tiền sử dị ứng với các thuốc thử nghiệm

3.2 vật liệu và phương tiện nghiên cứu

3.2.1 Thuốc nghiên cứu

- Thuốc viên hỗn hợp đang sử dụng trong CTCLQG: biệt dược Combikit bao

gồm 1 viên 2-FDC (rifampicin-isoniazid) + 1 viên pyrazinamid trong cùng 1 vỉ (RH+Z), hạn sử dụng 01/ 06 của hãng Lyka labs /ấn độ

- Thuốc chuẩn đối chiếu: rifampicin (R), isoniazid (H), pyrazinamid (Z) đều ở dạng viên nén Hàm lượng, tên thương mại, nguồn gốc, hạn sử dụng, số viên uống cho mỗi liều đơn như trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Thuốc sử dụng trong nghiên cứu

Thuốc Tên hoạt chất/

Hàm lượng

Biệt dược Hãng SX/

Nước SX

Số lô/ Hạn sử dụng

Rifampicin 150 mg Eremfat 150 Fatol Arneimittel/

Đức

001051 Exp 05/2005

Isoniazid 100 mg Rimifonđ Lafal

laboratoires/ Pháp

C 122 Exp 04/2008

* Đặc điểm của chế phẩm chứa RMP nghiên cứu

Các thuốc sử dụng trong nghiên cứu này không phải là những chế phẩm mới,

đây là những thuốc đang sử dụng điều trị cho bệnh nhân Đặc điểm về hàm lượng và

độ hoà tan của chế phẩm chứa RMP đơn lẻ và hỗn hợp đã được thu thập trước khi tiến hành thử nghiệm Dựa trên phiếu kiểm nghiệm lô hàng khi nhập khẩu của Trung tâm kiểm định quốc gia (VINACONTROL) cho thấy chế phẩm hỗn hợp chứa RMP trong thử nghiệm đạt các tiêu chuẩn về hàm lượng (99,7% so với trên nhãn),

độ hoà tan đã được đánh giá đạt Riêng chế phẩm đối chiếu (RMP đơn lẻ) được đặt mua từ nước ngoài và đã được nhà sản xuất kiểm nghiệm lô hàng (hàm lượng RMP trong chế phẩm 101,7% so với trên nhãn)

Sự khác biệt về hàm lượng RMP của các chế phẩm chứa RMP là không đáng

kể (2%) so với hàm lượng thực ghi trên nhãn

Những chế phẩm chứa RMP trong nghiên cứu này đạt tiêu chuẩn về hàm lượng và độ hoà tan

3.2.2 Máy móc thiết bị

- Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Spectra System Thermo Finigan

- Máy li tâm: Hermle Z200A (Đức)

- Máy lắc siêu âm

- Cân phân tích: Presia XB220A (Thuỵ Sỹ) với độ chính xác 0,1mg

- Tủ lạnh sâu - 40OC

- Máy lọc

- Các dụng cụ thí nghiệm khác: pipet tự động, pipet thuỷ tinh chính xác, các dụng cụ thủy tinh thí nghiệm

3.2.3 Hoá chất thí nghiệm

- Rifampicin, Isoniazid, Pyrazinamid chuẩn quốc tế

3.3.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương

Có nhiều phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương, chúng tôi chọn phương pháp sác ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do phương pháp này có độ chính xác cao, thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận được Phương pháp chiết rifampicin và chương trình sắc ký được nghiên cứu như sau:

Phương pháp chiết: Mẫu rifampicin chuẩn trong huyết tương được nghiên cứu

chiết với các loại dung môi khác nhau để tìm ra dung môi có hiệu suất chiết cao

Tiến hành khảo sát nhiều hệ pha động khác nhau dựa vào các nghiên cứu trước

và độ tan của rifampicin trong dung môi với các tỉ lệ khác nhau để tìm ra hệ pha

động có khả năng tách rifampicin ra khỏi mẫu phân tích và có thời gian lưu hợp lý

Các mẫu được xử lý, chạy sắc ký, so sánh sắc đồ của mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn rifampicin trong huyết tương và mẫu huyết tương bệnh nhân uống hỗn hợp R-H-Z để xác định tính đặc hiệu của phương pháp

Giới hạn định lượng

Từ mẫu huyết tương có nồng độ 1àg/ml, pha loãng nhiều lần để được các nồng

- Đáp ứng pic tại giới hạn định lượng thấp nhất ≥ 5 lần so với đáp ứng pic tương ứng ở mẫu trắng (nếu có)

- Pic của chất phân tích tại giới hạn định lượng thấp nhất có tính xác định, phân biệt, tái hiện với độ chính xác có hệ số biến thiên không quá 20%

Độ ổn định của mẫu phân tích

Mẫu huyết tương bệnh nhân uống rifampicin được bảo quản trong ống nghiệm nhựa, nút kín, ở nhiệt độ - 40OC trong khoảng thời gian 3 tháng Tại thời điểm một tháng, hai tháng, ba tháng, mẫu được lấy ra phân tích tìm hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản để xác định độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tương

3.3.2 Nghiên cứu sinh khả dụng của RMP

3.3.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu ngẫu nhiên, liều đơn, so sánh chéo ba, ba giai đoạn trên người tình

nguyện

Thiết kế nghiên cứu ngẫu nhiên:

Người tình nguyện được bố trí ngẫu nhiên thành 3 nhóm thử nghiệm như

sau:

- 12 người tình nguyện được mã hoá từ A đến M

- Chuẩn bị 12 phiếu bốc thăm: 4 phiếu đề “nhóm 1”, 4 phiếu đề “nhóm 2”, 4 phiếu

Thiết kế nghiên cứu chéo ba, ba giai đoạn:

Mỗi người tình nguyện đều trải qua 3 giai đoạn, mỗi giai đoạn uống một trong các thuốc sau:

- Rifampicin đơn độc (R)

- Rifampicin- isoniazid- pyrazinamid 3 loại riêng rẽ (R-H-Z)

- Viên Combikit (RH+Z)

Trình tự các giai đoạn thử nghiệm của các nhóm như sau:

Bảng 3.2 Bố trí các giai đoạn thử nghiệm theo từng nhóm

Giai đoạn Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III

Trước khi tiến hành nghiên cứu, đề cương chi tiết đã được thông qua tại Hội

đồng Đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học của Trường Đại học Dược Hà Nội xem

xét, chấp thuận và cho phép tiến hành (Phụ lục 7)

Các dữ liệu thu được trên người tình nguyện được ghi vào 1 phiếu theo mẫu

(Phụ lục 1)

Lựa chọn người tình nguyện:

- Người khoẻ mạnh tình nguyện tham gia thử nghiệm được thăm khám lâm sàng,

làm xét nghiệm cần thiết (sinh hoá, huyết học, nước tiểu, HIV, HBV) để lựa

chọn đối tượng đủ tiêu chuẩn nghiên cứu Những đối tượng đủ tiêu chuẩn có ký

cam kết tình nguyện mới thu nhận vào nghiên cứu

Địa điểm khám lâm sàng, uống thuốc và lấy mẫu máu:

- Địa điểm khám lâm sàng, làm xét nghiệm, uống thuốc, lấy máu và theo dõi

trong quá trình thử nghiệm tại Bệnh viện Việt Nam - Cuba

- Theo dõi, lấy máu và xử trí cấp cứu các tình huống bất thường trong quá trình

thử nghiệm do bác sĩ và y tá đảm nhận

Cho người tình nguyện uống thuốc:

- Cho uống thuốc là người của nhóm nghiên cứu

- Ngày trước khi uống thuốc, ăn tối muộn nhất vào lúc 18h Sáng hôm sau nhịn ăn

sáng Thuốc được uống lúc 7h với 200 ml nước (nước tinh khiết đóng chai)

Được ăn nhẹ lúc 9h ăn trưa vào lúc 11h sau khi lấy mẫu máu giờ thứ 4

Tiến hành lấy mẫu máu:

ư Mẫu được lấy như sau: 0h (trước khi uống thuốc), 30', 45’, 60', 90', 2h, 2h30, 3h, 4h, 8h, 12h, 24h

- Số lượng máu của mỗi mẫu là 5 ml, máu tĩnh mạch, chống đông bằng heparin; trong vòng 15 phút sau khi lấy máu, ly tâm để tách huyết tương Mỗi mẫu máu tách thành 2 mẫu huyết tương (1ml/mẫu), 1 mẫu để phân tích nồng độ rifampicin, mẫu còn lại để dự trữ sau khi phân tích số liệu, nếu nghi ngờ có thể phân tích lại

- Huyết tương tách ra cho vào ống nghiệm bằng nhựa, nút kín, dán nhãn có mã

hoá mẫu, bảo quản trong tủ lạnh sâu - 40oC cho đến khi định lượng Thời gian bảo quản mẫu tối đa 1 tháng

Phân tích định lượng nồng độ RMP bằng phương pháp HPLC

Sử dụng phương pháp định lượng RMP huyết tương đã được xây dựng và thẩm

định phương pháp để định lượng RMP trong các mẫu huyết tương

Đánh giá tương đương sinh học của RMP từ viên Combikit:

Từ nồng độ đo được, xây dựng đường cong nồng độ - thời gian của mỗi dạng chế phẩm

Tính các thông số dược động học của mỗi dạng chế phẩm (AUCt, AUC0-∞, Cmax, Tmax, T1/2 )

So sánh AUCt, AUC0-∞, Cmax, Tmax, T1/2 của RMP từ viên Combikit với dạng uống đơn lẻ và uống 3 viên phối hợp R-H-Z

- Tmax - Thời gian đạt Cmax.

Hai thông số Cmax, Tmax lấy trực tiếp từ số liệu của thực nghiệm

- AUCt - diện tích dưới đường cong nồng độ thời gian từ thời điểm 0 đến t giờ, theo qui tắc hình thang

t

i

i i i

C t

C

2

1 1 1

1

2

)).(

(2

i

i i i

C t

1 1 1

1

2

)).(

(2

3.3.3.2 Đánh giá sinh khả dụng của RMP trong chế phẩm:

Một số thông số dược động học chính cần so sánh là AUCt, AUC0-∞, Cmax, tmax,

T1/2 Sử dụng phương pháp two one-side tests hay gọi là phương pháp khoảng tin cậy

90% Các thông số trên được chuyển logarith tự nhiên và phân tích phương sai Khoảng tin cậy 90% của tỷ lệ giá trị trung bình thông số dược động học giữa RMP

đơn độc và R-H-Z (viên đơn lẻ); giữa viên hỗn hợp RH+Z và R-H-Z đơn lẻ theo công thức sau:

) 2 (

) / (

2 )

; 1 , 0 (

RMP Z H

R

n RMP Z H Re CI

) /

(

2 )

; 1 , 0 (

Z H R Z RH

n Z H R Z RH

e

Với: à là giá trị trung bình của thông số đã chuyển logarith

t(0,1; n) – tra từ bảng Student t-test với bậc tự do n và mức ý nghĩa 0,1

S – Căn bậc 2 của bình phương sai số trung bình thu được từ kết quả phân tích phương sai của thiết kế chéo 3, đơn liều

N – số người tình nguyện

4 kết quả nghiên cứu

4.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương

4.1.1 Xây dựng phương pháp định lượng rifampicin trong huyết tương

Phương pháp chiết :

- Lựa chọn xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein huyết tương Các dung môi

được nghiên cứu để tủa protein bao gồm:

+ Methanol tinh khiết, tiêu chuẩn HPLC

+ Acid trichloroacetic 5%

+ Acetonitril tinh khiết, tiêu chuẩn HPLC

Nghiên cứu trên các dung môi thấy, acetonitril có khả năng kết tủa protein dưới dạng tủa bông, khi li tâm dễ dàng tách được dịch chiết

- Lấy 1 ml huyết tương, thêm 1,5 ml acetonitril, lắc bằng máy lắc trong 1 phút Tiếp tục li tâm trong 25 phút, tốc độ 3500 vòng/phút Dịch li tâm được lọc qua giấy lọc

Xác định pha động:

Có nhiều hệ pha động được nghiên cứu:

- Đệm phosphat pH 4,5: Methanol

- Acetonitril: 0.1% trifluoroacetic

Các hệ pha động trên được nghiên cứu với tỉ lệ khác nhau, chúng tôi xác định

hệ dung môi đệm phosphat pH 4,5: Methanol với tỉ lệ 35: 65 là hệ dung môi phù hợp, đảm bảo tách tốt rifampicin có thời gian lưu hợp lý (8,5 phút)

Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện sắc

ký như sau:

- Pha tĩnh: Cột Alltech Appolo C18 (250 mm x 4,6mm, kích thước hạt 5 àm)

- Bảo vệ cột: Alltech Appolo (7,5 x 4,6 àm)

- Dung dịch đệm: Dung dịch kali dihydrophosphat 0,02M, điều chỉnh pH về 4,5

bằng dung dịch acid phosphoric 1%

- Pha động: methanol: dung dịch đệm = 65%:35%

4.1.2.1 Độ chọn lọc của phương pháp

Chuẩn bị các mẫu sau:

- Mẫu 1: Mẫu huyết tương trắng

- Mẫu 2: Mẫu rifampicin trong huyết tương với nồng độ 10 àg/ml

- Mẫu 3: Mẫu rifampicin trong huyết tương với nồng độ 10 àg/ml với sự có

mặt của INH (nồng độ 10 àg/ml) và PZA (nồng độ 30 àg/ml)

Ba mẫu trên được xử lý và tiến hành định lượng như mục3.3.1 Sắc đồ được thể hiện trong phụ lục

Qua sắc đồ ta thấy:

- Thời gian lưu của rifampicin là 8,5 phút

- Trên sắc đồ của huyết tương trắng không có pic tại vị trí pic của rifampicin

Trên sắc đồ của mẫu có thêm rifampicin có pic của rifampicin, gọn, rõ, cân

đối

- Trên sắc đồ của mẫu có thêm rifampicin, INH và PZA, tại vị trí pic của

rifampicin không có pic của các chất khác, chứng tỏ phương pháp có khả năng tách tốt rifampicin khỏi INH và PZA

4.1.2.2 Xây dựng đường chuẩn

Đường chuẩn của rifampicin trong huyết tương được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 0,2 - 30 àg/ml, tiến hành xử lý mẫu và chạy sắc ký như phần 4.1.1 Kết quả được thể hiện ở bảng 4.1 và hình 4.1

Bảng 4.1: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ

0 4 8 12 16 20 24 28

Nồng độ ( àg/ml)

Hình 4.1 Tương quan nồng độ – diện tích pic

Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic và nồng độ rifampicin trong khoảng khảo sát ( R= 0,999)

Bảng 4.2: Xác định độ đúng của phương pháp

Lượng thêm

(àg)

Tìm lại (àg)

% tìm lại (%)

Lượng thêm (àg)

Tìm lại (àg)

% tìm lại (%)

4.1.2.4 Độ chính xác

Tiến hành pha mẫu rifampicin trong huyết tương có nồng độ khoảng 8,0 àg/ml Tiến hành xử lý mẫu và đo như mục 4.1.1 Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.3:

Qua kết quả ở bảng 4.3 ta thấy, phương pháp có độ chính xác cao với RSD < 1%

4.1.2.5 Giới hạn định lượng

Xác định giới hạn định lượng dựa trên khảo sát các mẫu huyết tương có nồng

độ 0,5àg/ml, 0,2àg/ml, 0,1àg/ml ở cả 3 nồng độ này vẫn phát hiện được pic của rifampicin trên sắc đồ, trong khi ở các mẫu huyết tương trắng không có pic Tuy nhiên, dựa vào tiêu chuẩn xác định giới hạn định lượng (trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu-3.3.1.2), chúng tôi xác định nồng độ 0,2àg/ml là giới hạn

định lượng thấp nhất (Kết quả trình bày trong bảng 4.4.)

4.1.2.6 Độ ổn định của mẫu trong điều kiện bảo quản

Nghiên cứu độ ổn định của rifampicin trong mẫu huyết tương tự tạo và trong mẫu huyết tương người tình nguyện trong thời gian 3 tháng

* Mẫu tự tạo của RMP trong huyết tương

Rifampicin chuẩn được pha trong huyết tương trắng với nồng độ từ 0,6 àg/ml

đến 19,2 àg/ml Mẫu huyết tương được bảo quản trong ống nghiệm propylen có nắp, bọc giấy bạc và bảo quản ở nhiệt độ - 40OC trong tủ lạnh sâu trong 3 tháng Tại thời

điểm ngay sau khi chuẩn bị mẫu, sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, mẫu huyết tương

được xử lý và định lượng

Bảng 4.5: Độ ổn định của mẫu rifampicin trong huyết tương trắng

Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng Nồng độ

ban đầu

(àg/ml)

Nồng độ (àg/ml)

% còn lại

Nồng độ (àg/ml)

% còn lại

Nồng độ (àg/ml)

% còn lại

* Mẫu huyết tương người tình nguyện

Mẫu huyết tương người tình nguyện uống hỗn hợp thuốc chống lao rifampicin-isoniazid-pyrazinamid được lấy, phân tích ngay để xác định nồng độ rifampicin và các mẫu còn lại được bảo quản trong ống nghiệm propylen, nắp kín, bọc giấy bạc và bảo quản trong tủ lạnh sâu nhiệt độ - 40OC trong 3 tháng Tại thời

điểm ngay sau khi chuẩn bị mẫu, sau 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng, mẫu huyết tương này được xử lý và định lượng rifampicin Kết quả được thể hiện ở bảng 4.6

Bảng 4.6: Độ ổn định của mẫu rifampicin huyết tương người tình nguyện

Sau 1 tháng Sau 2 tháng Sau 3 tháng Nồng độ

Nồng độ (àg/ml) % tìm lại

8,02 8,12 101,2 8,19 102,1 8,06 100,6 9,97 9,70 97,3 9,61 96,4 9,60 96,3 9,22 9,11 98,8 8,96 97,2 8,85 96,0 7,80 7,60 97,4 7,64 98,0 7,69 98,6 7,76 7,90 101,8 7,86 101,3 7,75 99,9 8,33 8,15 97,8 8,12 97,5 8,21 98,5

TB ± SD 99,07±1,98 TB ± SD 98,73±2,37 TB ± SD 98,31±1,85

Qua bảng 4.6 cho thấy, trong huyết tương người, rifampicin ổn định sau 3 tháng bảo quản tránh ánh sáng ở nhiệt độ - 40OC

4.2 Sinh khả dụng của RMP trên người tình nguyện

4.2.1 Đặc điểm của nhóm người tình nguyện

Người tình nguyện tham gia vào thử nghiệm bao gồm cả 2 giới (trong đó nam 8,

nữ 4), các chỉ số huyết học, sinh hoá và lâm sàng đều trong giới hạn bình thường Cân

nặng trung bình 51,21 ± 3,19 kg, chiều cao trung bình 1,63 ± 0,06 m; chỉ số BMI 18 -

21,5

4.2.2 Nồng độ RMP trong huyết tương và các thông số dược động học của RMP

trên người tình nguyện

Tiến hành định lượng nồng độ RMP trong huyết tương và xác định các thông số

dược động học của RMP trên 12 người tình nguyện khi uống RMP đơn độc, RMP -

INH - PZA đơn lẻ và viên hỗn hợp RH+PZA Tại thời điểm 24 giờ sau khi uống thuốc,

với phương pháp định lượng vừa xây dựng được có giới hạn định lượng là 0,2àg/ml, đa

số các mẫu không xác định được nồng độ RMP Do đó dể xác định AUCt, chúng tôi

không sử dụng thông số AUC0-24 mà tính AUC0-12

Các kết quả nồng độ RMP huyết tương khi uống từng chế phẩm và các thông số

dược động học thể hiện trong các bảng từ 4.8 đến 4.13

Bảng 4.8: Nồng độ Rifampicin trong huyết tương (àg/ml) người tình nguyện

khi uống rifampicin đơn độc(RMP)

Thời điểm lấy mẫu (h)