Hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản

Nội dung của Dự án - Hoàn thiện công nghệ sản xuất giống ổn định: Chọn giống có hoạt tính sinh học ổn định sinh enzym amylase, protease; đối kháng với vi sinh vật gây bệnh tôm cá, an toà

BO KHOA HOC & CONG NGHE

VIEN CONG NGHE SINH HOC

BAO CAO TONG KET KHOA HOC VA KY THUAT

Du án:

"HOAN THIEN VA TRIEN KHAI CONG NGHE SAN XUAT CHE PHAM

SINH HOC PHUC VU XU LY MOI TRUONG NUOI TRONG THUY SAN"

TS Võ Thị Thứ

Hà Nội, 3/2006 Bản thảo viết xong 3/2006

Tài liệu này chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Dự án cấp Nhà nước,

598A

A8( 3 106

DANH SACH CAC TAC GIA THAM GIA DU AN

SAN XUAT THU NGHIEM CAP NHA NUGC (Danh sách những cá nhân đã đóng góp chủ yếu cho đự án)

1 Tên dự án: “Hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục

vụ xử lý môi trường nuôi trồng thuỷ sản”

2 Thuộc chương trình: Khoa học và Công nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu Khoa

học và phát triển công nghệ sinh học, giai đoạn 2001-2005”, mã số: KC-04

3 Thời gian thực hiện: 2 năm từ 01/01/2004 đến 31/42/2005

4 Cơ quan chủ tr" Viện Công nghệ sinh học

5 Bộ chủ quản: Bộ Khoa học và Công nghệ

6 Danh sách các tác giả tham gia dự án

TT | Ho va tén, học hàm, học vi Cơ quan công tác Chữ ký

ï ]T§ Võ Thị Thứ Viện Công nghệ Sinh học | 7/2 „ ⁄

2 | TS Trân Văn Sỹ Viện Công nghệ Sinh học ABE

3 | CN Pham Thi Minh Ha Vién Cong nghé Sinh hoc =

4 | CN Dao Thi Thanh Xuan Vién Cong nghé Sinh hoc \ưx 0_—

53 | KS Trương Ba Hùng Viện Công nghệ Sinh học (P.17 8a mm

6 | KS Lê Thị Thu Hiển Viên Công nghệ Sinh học ÿhulưựn —

7 | KS Lê Danh Toại Viện Công nghệ Sinh học Ub

8 | KS Lé Tran Vinh Vién Cong nghé Sinh hoc durA—

9 | KS Nguyén Tréng Son Vién Cong nghé Sinh hoc _ Aide — |

10 | KS Trần Minh Đức Viện Công nghệ Sinh học AM —_

11 | KS Nguyễn Kim Mạnh Công ty TẮCN HaCo CAM H8

12 | KS Nguyễn Thị Hằng Vân Công ty TNHH TS Phúc Hà C —+

13 | KTV Bùi Thị Thu Viện Công nghệ sinh học Dhue ⁄

TRÍCH LƯỢC NHỮNG ĐIỂM CHÍNH CỦA THUYET MINH DU AN

THEO BIEU B1-2-TMDT

THUYET MINH DU AN

SAN XUAT THU NGHIEM CAP NHA NUGC

I THONG TIN CHUNG VE DU AN

Thuộc chương trình khoa học và công nghệ cấp nhà nước KC - 04

"Nghiên cứu khoa học và phát triển Công nghệ Sinh học"

Mã số: KC - 04 - DA08

Cấp quản lý: Bộ Khoa học và Công nghệ

Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ tháng 1/2004 đến tháng 12/2005

Kinh phí thực hiện : 5060 triệu đồng

Trong đó từ ngân sách sự nghiệp khoa học: 2160 triệu đồng

Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Địa chỉ: 18A Hoàng Quốc Việt, Câu Giấy, Hà Nội

Cá nhân đăng ký chủ nhiệm dự án:

Võ Thị Thứ

Học vị: Tiến sĩ

Địa chỉ: 15A Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Điện thoại cơ quan: 7564333 (1119) NR: 8460405

II MỤC TIÊU, NỘI DƯNG VA CAC SAN PHAM CUA DỰ ÁN

1 Mục tiêu của Dự án

" Sản xuất CP vi sinh cải thiện môi trường và hạn chế dịch bệnh cho tôm, cá với qui mô 30 tấn/năm

" Mỏïrộng phạm vi ứng dụng chế phẩm ra nhiều địa phương

2 Nội dung của Dự án

- Hoàn thiện công nghệ sản xuất giống ổn định: Chọn giống có hoạt tính sinh học ổn định (sinh enzym amylase, protease; đối kháng với vi sinh vật gây bệnh tôm

cá, an toàn với động vật nuôi), Hoàn thiện qui trình nhân giống cấp I, cấp II (ổn định các thông số kỹ thuật như: môi trường, nhiệt độ, tỷ lệ giống, thời gian )

- Hoàn thiện công nghệ lên men sản xuất chế phẩm: ổn định các thông số kỹ thuật: môi trường, nhiệt độ, pH, % tiếp giống, điều kiện lên men, thời gian lên men

- Hoàn thiện công nghệ thu hồi, tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm: thu hồi sinh khối và tạo chế phẩm Biochie: giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước nuôi; BioF: giảm thiểu dịch bệnh, tăng khả năng hấp thụ thức ăn, tăng trưởng nhanh

- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và qui trình kiểm nghiệm chế phẩm : Xác định

đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử; đạc điểm sinh hóa (catalase,

lên men đường sinh axit, lên men sữa sinh axit ), số lượng vi khuẩn/gam (ml) phải dat 10°

- Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm và triển khai áp dụng công nghệ: Ứng dụng chế phẩm tại 3 địa phương với qui mô 1-5 ha/mô hình, chuyển giao qui trình công nghệ sản xuất cho cơ sở

- Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm với qui mô 30 tấn/năm: bảo đảm độ tỉnh khiết và mật độ tế bào

- Qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm BioF: 3 tấn/ năm

- _ Quy trình kiểm nghiệm Biochie, Biof

- _ Mô hình ứng dụng với qui m6 1-1,5 ha: 3 mô hình

-_ Sản xuất chế phẩm Biochie, BioF tiêu chuẩn đạt 10° CFU/ gam (m]), số lượng: 60.000 kg (lit)

Thiết | Hoàn | Xây | Lương | Nguyên | Khấu | Công

bị | thiện | dựng | thuê | vật liệu hao tác phí,

máy | công | cơ | khoán năng | thiết bị, | quản lý

xưởng | kiểm

tra

nghiệm thu

và chỉ tiêu chất | vị đo | Cần đạt Mẫu tương tự

nước

LOI CAM ON

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban Chủ nhiệm chương trình KC-04 đã hướng dẫn, quản lý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho Dự án hoàn thành tốt các nội dung đã ký hợp đồng với Bộ Khoa học và Công nghệ, Ban Chủ nhiệm chương trình

Chúng tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện

Khoa hoc và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi tận tình vẻ

sử dụng trang thiết bị, về chỉ tiêu, thanh quyết toán tài chính và những thủ tục cần

thiết trong quá trình thực hiện dự án

Chúng tôi xin được cảm ơn sự tin tưởng và hợp tác của các công ty: Công ty Cổ

phần thức ăn chăn nuôi Haco, Nam Định; Công ty Công nghiệp tàu thuỷ Quảng Bình, Công ty TNHH Phúc Hà, Công ty TNHH Việt Tiến, Công ty kinh doanh tổng hợp Quảng Bình trong việc đưa sản phẩm của dự án ra thị trường

Chúng tôi cũng xin cảm ơn các công ty: Công ty Đức Thắng, Xí nghiệp nuôi trồng thủy sản xuất khẩu Bảo Ninh, Công ty TNHH Hoàng Gia, Doanh nghiệp tư nhân Trung Đức, Doanh nghiệp tư nhân Phương Anh, Công ty giống thủy sản Hải Phòng, Trung tâm khuyến Nông Hà Nội đã tin tưởng và sử dụng chế phẩm của dự án

: Nhu cầu oxy sinh hoá

: Nhu cầu oxy sinh hoá sau 5 ngày

: Bào tử

: Đơn vị tạo khuẩn lạc

: Nhu cầu oxy hoá học

: Môi trường nước bap cai

: Môi trường nước cà chua : Nhân giống

LOIMG DAU SH tre Tre 1

1.1 Tình hình phát triển nghề nuơi trồng thủy sẵn ở nước ta 2ccessiceecrre 3

1.1.1 Hiện trạng mơi trường và dịch bệnh trong hoạt động nuơi trồng thuỷ sẳn 4 1.12 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong mơi trường nuơi trắng thủy sản 5 1.2 Ché phd simh hoc (probiotics) .cscssssssssssssossessssesseesesssssescscsssssssessesnsssseseusenssessessessseseseessesseees 6

1.2.1 Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm probiotic 7 1.2.2 Những nhĩm vì sinh vật thường được sử dụng trong sẵn xuất chế phẩm sinh học § 1.2.2.1 Vi khudn Bacillus và quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của hệ

©nzym prOledse, aI'IyÌ(AS€, C€ÌÏỤ49€ c co Street rerkrrerrrerrr 10

1.2.2.2 Vị khuẩn Lactobacillus và tác dụng phịng ngừa bệnh co 11

1223 C ác yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phái triển của vì khuẩh -cceccceceee 13

1.3 Đặc điểm nước nuơi tơm, cá và những chỉ số cơ bản đánh giá nước nuơi 14

143.1 Đặc điểm nước nuơi fƠïH cá à cccccvevctrrrtrrtiiiererrrrrrrririirirrrrrrrrrrrriee 14

1.3.3 Yêu cầu VỀ THƯỚC MUG OMA CE osccescssssssssssssssssssssessessssnsssessesnssnsssennenneeneoneanneonnnnennienennennansennecnneenseett 17

1.4 Các bệnh thường xảy ra cho tơm khi ao nuơi bị nhiễm bẩn 18 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU s 2 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu và lập luận về việc chọn đối tượng nghiên cứu BÀI

2.2 Phương pháp nghiên cứu và lập luận về phương pháp nghiên cứu 2

2.2.1 Phương pháp nghiÌÊn CỨU .ecceHHe HH HH de 22

2.2.1.1 Phương pháp tuyển chọn vi khuẩn sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học 2 2.2.1.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống ii 23

2.2.1.3 Nghiên cứu một số yếu tố Gnh hung dén qua trinh 1EN MN vevsecccsccsssesssssvsvsssseesssssesessssssseess 23 2.2.1.4 Thu héi sinh khôi, tạo chế phẩm Biochie, BioF' và bảo quản chế phiẩm 24

2.2.1.5 Phương pháp định tính VK nghiÊH CÍM ccecei Hee 25

2.2.1.6 Phương pháp xác định độ tinh khiết của chế phẩm eeceereecerriiriiicecrre 26 3.2.1.7 Phương pháp định ÏƯỢNG, «Hee 26 2.2.1.8 Xây dựng mô hình ứng dụng sản phẩm

2.2.2 Lập luận về phương pháp nghiÊn CÍN .ecccccereiHeirriarrre 27

PHAN IIL KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2 2222222221e 29

3.1 Hoàn thiện công nghệ sản xuất giống ổn GiMW .eeseecsscsssssssssscsessssssecssssssseneisrsssssssecesenesetves 30

3.1.1 Chọn chủng có hoạt tình sinh học ổn định, an toàn với động vật nuôi 30

341 1 Thử an ÍOÀNH SH TH HH TH HH TH TT LL T.1A010-1111011.T1110711021.L 30

3.1.1.2 Đối kháng với vi khudin gay Dent 16M, CG srssessssssssssesssesessensessossssesssssensssesesssutssssssssnseseseesssvasssee 31 3.1.1.3 Hoat tinh phn hi} Witt CO ssicssseceeinmnneiieenenennnsneinnananeninnnmtnenenene 32

3.1.2.1 Hoàn thiện qui trình nhân giống BacilÏus «eecceceeeiHereiirie 34

3.1.2.2 Hoàn thiện qui trình nhân giống [actobdqcilÏus -ccxeceeerrrrirrrrrriirrree 35

3.2 Hoàn thiện công nghệ lên men sản xuất chế phẩm

“nan 37

3.2.2 Lén men Bacillus, Lactobacillus trén mOi truOng XOP seseescosonessssssessseccnnesssseseeseeseeneeceeassanaseess 40

3.2.2.1 Lên men Lactobacillus trên môi trường xốp " ,ÔỎ 40

3.2.2.2 Lên men Bacillus trên môi IFHÒNg XỐN) «« Hee 42 3.3 Hoàn thiện kỹ thuật thu hỏi sinh khối, tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm 46

3.3.1 Hoàn thiện kỹ thuật thu hôi sinh khiổi s cHEEErerrreerrrreree 46

3.3.2 Hoàn thiện kỹ thuật tạo chế phưổm eo 48 3.3.2.1 Tạo chế phẩm BiOF cssssssssesssssssssssssssssssssssvsssssssesevssussssssonssserssessesesssussuassaanssasensseseeseunasssssesesnies 48 3.3.2.2 Ta0 ChE Phd 7 .nn ÔỎ 50 3.3.3 Hoàn thiện kỹ thuật bảo quản chế phÁằ occceccecrrrrrriiiiiirrrrrrie 52

3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiếm nghiệm chế phẩm 53

3.4.1 Tiêu chuẩn cơ sở va qui trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie c.eecee 53

3.4.2 Tiêu chuẩn cơ sở và quả trình kiểm nghiệm chế phẩm BioF cecsieee 57 3.5 Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm và triển khai áp dựng công nghệ 59

3.5.1 Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm tại địa phương ceeeeriiieiiie 59

3.5.2 Triển khai áp dụng công nghệ

3.6 Xay dựng qui trình sản xuất chế phẩm . -5SSSssireerrirrirrriree 64 3.6.1 Qui trình sản xuấi chế phẩm Biochie (30 tấn! năm) ii 64

3.6.2 Qui trinh sin xudt chế phẩm BioF (3 tấn! năn, ii 69

3.7 Sản xuất chế phẩm, doanh thu sản phẩm và giá thành sản phẩm 72

3.8 Đào tạo cán bộ, công nhânn HH me 0e 74

PHẦẨN IV KẾT QUẢ NỔI BẬT 2 2 2tt11,221 111.2117.771 ce 7?

PHẦN V KẾT LUẬN -2 21 47.11.0.11.212.121 .-.-.1.1020007 20 xe 79

DANH MUC CAC BANG

Bảng 1.1 [ Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trường 10

Bảng 1.2 | Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của tôm cá 15

Bang 1.3 Một số chỉ tiêu của nước nuôi trồng thuỷ sản 17

Bang 1.4 | Cac thong số môi trường nuôi thích hợp cho tôm sú thâm canh 18 Bang 3.1 | Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm Biochie 30 Bang 3.2 | Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm BioF 31 Bang 3.3 | Kiém tra kha nang đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tôm cá 31 Bảng 34 _ | Khả năng sinh enzym phân huỷ hữu cơ của vi khuẩn 32 Bang 3.5 | Thành phân môi trường nhân giống Baciilzs thích hợp 34

Bang 3.8 | Thanh phan m6i tudng nhan giong Lactobacillus thich hop 36 Bang 3.9 | Nhiét do nhan giong Lactobacillus thich hop 36

Bang 3.10 ] pH môi trường nhân giống Ƒ acfobaciiius thích hop 36 Bảng3.1L | Tỷ lệ giéng Lactobacillus thich hop 37 Bảng3.12 | Xác định độ thông khí trong binh lén men Bacillus, Lactobacillus 38 Bảng 3.13 Lama chọn thành phần môi trường lên men Bac7is thích hợp 39

Bảng 3.14 | Thoi gian lén men Bacillus va Lactobacillus thích hợp 39

Bảng 3.16 | Nguồn cacbon thích hợp đối với lên men /zcfobacilis trên môi 4I

trường xốp Bảng 3.17 | Thời gian lên men thích hợp 4I

Bảng 2.18 | Kiểm tra sựổn định của lên men /acfobacillus trên môi trường xốp 42

Bảng 3.19 | Thành phân lên men Özciis trên môi trường xốp 4

Bang 3.20 Í Ảnh hưởng nguồn cacbon dén qué trinh lén men Bacillus én môi 43

Bang 3.21 | Nhiệt độ lên men Baciius trên môi trường xốp thích hợp 44

Bảng3.23 | Thdi gian lén men Bacillus trén môi trường xốp thích hợp 45 Bang 3.24 | Sưốn định của các mẻ lên men Bacillus trên môi trường xốp 45 Bang 3.25 | Kết quả thu hồi sinh khốt bằng ly tâm 46

Bang 3.28 | Ổn định kỹ thuat say d6i voi Lactobacillus 48

Bang 3.29 | Thành phân công thức tạo chế phẩm BioF đạng bột 49

Bảng 3.30 | Thành phần công thức tạo chế phẩm BioF dạng dịch 49 Bảng 3.3! | Nhiệt độ sấy thích hợp đối với chế phim lén men Bacillus 51

Bảng 3.32 | Thành phần công thức tạo chế phẩm Biochie dạng bột 51

Bảng 3.33 | Thành phần công thức tạo chế phẩm Biochie dạng dịch 51

Bang 3.38 | Tóm tất các tiêu chuẩn của chế phẩm Biochie 54

Bang 3.39 | Tiêu chuẩn định tính của chế phẩm Biochie 54

Bang 3.40 | Tóm tắt các tiêu chuẩn của chế phẩm BioF 57

Bang 3.41 | Tiêu chuẩn định tính của chế phẩm BioF 57 Bang 3.42 | Tác dụng của chế phẩm đối với việc cải thiện môi trường nuôi 60 Bang 3.43 | Tác dụng của chế phẩm đối với sự tăng trưởng của tôm 60 Bảng 3.44 | Đánh giá tác dụng của chế phẩm qua tính toán hiệu quả kinh tế 60

Bang 3.45 | Tác dụng của CP Biochie, BioF đối với mô hình nuôi tôm càng xanh 61

thâm canh tại xã Đông Mỹ, Thanh Trì

Bảng 346 | Tác dụng của CP Biochie, BioF đối với tôm sú tại xã Ham Ninh, 61

Quang Ninh, Quang Binh

Bang 3.47 | Kết quả phân tích chỉ số môi trường của ao cá 62

Bảng3.50 | Số lượng từng loại chế phẩm sản xuất được tại Công ty CN 63

DANH MUC CAC HINH

Hình 3.1 | Khả năng sinh protease cua B lichenifomis G1, B subtilis D2, B megateriumPA | 32

Hình 3.6 | Mô hình hệ thống lên men Bacillus 67

DANH MỤC CÁC QUY TRÌNH

3 Qui trình sản xuất chế phẩm Biochie (30 tấn/ năm) 65

4 Qui trình sản xuất chế phẩm BioF (3 tấn/ năm) 70

LOI MG DAU

Ngành nuôi trồng thuỷ sản đang thu hút nhiều người tham gia và cũng đã đóng

góp đáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế Tuy nhiên, NTTS cũng đang phải đối mặt với thực trạng hết sức khó khăn hiện nay là suy giảm môi trường và dịch bệnh, gây thiệt

hại kinh tế cho nhiều người Phần lớn các đầm tôm bị thất bại là do môi trường bị

nhiễm bẩn Thực trạng ô nhiễm hữu cơ của ao đầm là phổ biến Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào ao nuôi một lượng thức ăn tổng hợp mà trong đó chỉ có 17% lượng thức ăn được đồng hoá thành sinh khối tôm, còn lại là không ăn được đo bị hoà tan trong nước boặc bài tiết ra ngoài môi trường [5] Lượng thức ăn thừa cùng với uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tôm cùng với xác của

động vật thuỷ sinh phù du là những yếu tố làm cho ao nuôi bị nhiễm hữu cơ Ngoài sự

ð nhiễm hữu cơ, môi trường nuôi cũng thường bị nhiễm kháng sinh, hoá chất sử dụng

để xử lý và phòng chống bệnh Khi ao đầm bị nhiễm bẩn là cơ hội cho những nhóm

VSV có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi bị bệnh

Có khi bệnh phát thành dịch do lây lan Qua khảo sát cho thấy có hơn 50% số cơ sở nuôi tôm trong cả nước bị bệnh [10] Đặc biệt nhóm bệnh cơ hội do V?brïo gây ra như

bệnh phát sáng, bệnh đen mang, bệnh ăn mòn vỏ kitin, bệnh mòn đuôi, cụt râu chỉ phát sinh khi nước nuôi bị nhiễm bẩn Thực trạng vấn đề ô nhiễm môi trường nuôi ở

nước ta là rất nghiêm trọng Một số địa phương có phong trào nuôi tôm thâm canh sớm như Khánh Hoà, Phú Yên thời gian qua đã không còn khả năng nuôi nữa Bởi vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và

phòng ngừa dịch bệnh là cấp thiết

Trước đây, hoá chất, kháng sinh thường được sử dụng để xử lý môi trường nuôi

và phòng ngừa bệnh Tuy nhiên, ngoài những tác dụng mong muốn, kháng sinh và hoá chất gây ra nhiều ảnh hưởng đến môi trường và con người Trước hết, chúng tồn

lưu trong môi trường thủy sinh, ảnh hưởng đến sự cân bằng của hệ VSV trong ao

Nghiêm trọng hơn là dư lượng kháng sinh trong vật nuôi vi phạm vấn đề vệ sinh an

toàn thực phẩm, gây khó khăn trong việc xuất khẩu thuỷ sản trên thị trường thế giới, đặc biệt đối với thị trường EU và Mỹ

Phát triển NTTS bên vững đang là xu thế phát triển kinh tế đúng đắn của nước

ta hiện nay nhằm tạo ra sản phẩm sạch và sản xuất không làm ảnh hưởng đến môi

trường Vì vậy, chọn giải pháp thích hợp để xử lý môi trường nuôi là rất quan trọng

Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa các VSV mang những đặc tính hữu ích (phân huỷ hữu cơ, đối kháng với VK gây bệnh ) để xử lý môi trường, tăng khả

năng phòng bệnh của vật nuôi đã được những nước có sản lượng thủy sản xuất khẩu

cao trên thế giới áp dụng (Trung Quốc, Malayxia, Ấn Độ, Thái Lan ) Việt Nam

cũng là nước có sản lượng xuất khẩu thuỷ sản khá cao, vì vậy nhu cầu về chế phẩm

sinh học và thuốc thú y thuỷ sản rất lớn Tuy nhiên, phần lớn các đơn vị tham gia sản xuất, kinh doanh chế phẩm sinh học, thuốc thú y thuỷ sản đều nhập công nghệ hoặc

chế phẩm từ nước ngoài Do giá bán của nhiều chế phẩm khá cao, cách sử dụng phức tạp (thường phải hoạt boá trước khi sử dụng) nên gây tâm lý ngại sử dụng cho người dân Mặt khác, cũng cần phải quan tâm đến vấn đề an toàn sinh học vì không kiểm soát được VSV nhập ngoại và những tác hại sẽ xẩy ra

Để đáp ứng nhu cầu thực tiễn, chúng tôi đã tiến hành thực hiện dự án “Hoàn thiện

và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thuỷ sản” Dự án đã thực hiện những nội dung sau:

- _ Chọn giống phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm

- _ Hoàn thiện kỹ thuật nhân giống các cấp

- Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm xử lý môi trường NTTS Biochie (30 tấn/ năm)

- Hoan thiện quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm phòng ngừa bệnh BioF

(3 tấn/ năm)

- _ Xây dựng quy trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie, BioF

- _ Xây dựng mô hình ứng dụng chế phẩm tại địa phương

- _ Sản xuất thử nghiệm

- _ Đào tạo cán bộ

PHAN I: TONG QUAN

1.1 Tình hình phát triển nghề nuôi trồng thủy sản ở nước ta

Trong những năm qua, nuôi trồng thuỷ sản được phát triển mạnh, góp phần tích cực vào việc phát triển kinh tế, xã hội Nuôi cá nước ngọt, baba, ếch cũng có tốc

độ tăng nhanh tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho một bộ phận không nhỏ ở nông thôn Theo Lê Thành Lựu [4], đến năm 2010, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản sẽ đạt trên 2 triệu tấn, đóng góp tới 57% trong tổng sản lượng thuỷ sản, tạo việc làm và thu nhập cho khoảng 2 triệu người

Trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản, con tôm là đối tượng thu hút nhiều người tham gia Tôm cũng là mặt hàng xuất khẩu chiếm thị phần đáng kế trong kim ngạch

xuất khẩu thủy sản của nước ta Hàng năm, riêng tôm đã thu được hàng tỷ USD Tôm

sú và nghề nuôi tôm sú đã từng mang lại lợi nhuận cao, góp phần không nhỏ trong việc phát triển kinh tế của nhiều vùng Công nghệ nuôi tôm sú cũng từng bước được

hoàn thiện từ nuôi quảng canh ở những vùng có nhiều diện tích đến bán thâm canh và

thâm canh với mật độ cao (40-50 con/ m?) Trong thời gian qua, nuôi tôm bán thâm canh và thâm canh phát triển khá nhanh, tạo cơ hội du nhập công nghệ nuôi tiên tiến của các nước trong khu vực và trên thế giới vào Việt Nam, nhanh chóng thay thế cho nuôi quảng canh lạc hậu, kém hiệu quả và phá huỷ môi trường tự nhiên [10]

Một số cơ sở nuôi tôm thâm canh cũng bắt đầu đánh giá được vai trò quan trọng của việc quản lý môi trường nuôi nên đã chú ý đầu tư cơ sở hạ tầng đúng yêu cầu kỹ thuật Xây dựng đầm, ao nuôi, hệ thống cấp thoát nước tương xứng với yêu cầu Tuy vậy, phần lớn cơ sở nuôi chưa nhận thức được tầm quan trọng của việc bảo

vệ môi trường nhằm đảm bảo cho nghề nuôi phát triển bên vững

Mặc dù vậy, nuôi tôm thâm canh, đặc biệt là nuôi tôm sú chịu nhiều rủi ro về

khách quan như mưa, bão, lũ lụt, hạn hán và rủi ro về chủ quan như kỹ thuật lạc hậu, con giống, thức ăn, hoá chất, chế phẩm xử lý môi trường, thuốc trị bệnh kém chất lượng Ngay cả khi thu hoạch được sản phẩm thì người nuôi tôm cũng còn gánh chịu

thiệt hại nếu sản phẩm còn dư lượng kháng sinh Bởi vậy, rất nhiều cơ sở nuôi tôm bị

lỗ nặng

Để phần nào giảm bớt rủi ro cho người nuôi, Nhà nước cũng bắt đầu đầu tư để

đưa ra qui trình, giải pháp công nghệ nuôi tiên tiến Có thể kể đến giải pháp kỹ thuật nuôi tôm sú, cá tra, cá basa đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm của Bùi Quang Té va

cs [8], trong đó, nhóm tác giả đưa ra giải pháp quản lý môi trường nuôi và quản lý sức khoẻ tôm cá bằng sử dụng nhóm hoá được và chế phẩm sinh học an toàn Điều đặc biệt là 2 trong số 10 chế phẩm sinh học được chọn để sử dụng là sản phẩm của

du An KC-04-DA08 [8]

1.1.1 Hiện trạng môi trường và dịch bệnh trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản

Sự phát triển nhanh chóng của hoạt động nuôi trồng thủy sản kéo theo tình

trạng ô nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh Trong điều kiện nuôi tôm

hiện nay, môi trường ao nuôi rất phú dưỡng Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào ao

nuôi lượng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ có phần rất nhỏ (17%) lượng thức ăn được

đồng hoá thành sinh khối tôm, còn lại là không ăn được do bị hoà tan trong nước hoặc bài tiết ra ngoài môi trường Lượng thức ăn thừa, uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác

để duy trì hoạt động sống của tôm cùng với xác động vật thuỷ sinh phù du là những

yếu tố làm cho ao nuôi nhiễm bẩn Có thể nói đa số các đâm tôm hiện tại bị thất bại là

do môi trường bị nhiễm bần [1] Sự nhiễm bẩn của ao đầm ngoài ô nhiễm hữu cơ còn

nhiễm bẩn do dùng hoá chất, kháng sinh trong quá trình nuôi Khi tôm có hiện tượng kém ăn vì thay đổi thời tiết hay lột xác thì dân thường cho hoá chất, kháng sinh vào ao nuôi Hay việc sử dụng hoá chất khử trùng ao bên cạnh tác dụng mong muốn, các hoá chất gây ra những tác hại đối với môi trường như việc tôn lưu hoá chất trong môi trường thuỷ sinh, làm giảm số lượng vi sinh vật có lợi trong ao (vi khuẩn phân huỷ hữu cơ, vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh), làm cho quá trình phân hủy hữu

cơ bị đình trệ và hậu quả là môi trường bị phú dưỡng, kích thích sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tăng cơ hội bệnh Hay như việc sử dụng hoá chất, kháng sinh trong

nuôi trồng thuỷ sản cũng gây ra hiện tượng kháng thuốc, dư lượng kháng sinh trong thực phẩm hãi sản gây ra cho người tiêu dùng những rủi ro tiểm ẩn như tăng mẫn cảm

với dư lượng thuốc hoặc xuất hiện hệ vi khuẩn đường ruột kháng lại các chất kháng khuẩn

Người ta cho rằng, duy trì môi trường trong sạch là yếu tố cơ bản quyết định sự thành bại của nghề nuôi tôm [1] Tuy nhiên, không phải ai tham gia nuôi tôm cũng nhận thức được điều đó Nhiều cơ sở chưa có hệ thống cấp thoát nước đúng kỹ thuật Nước trước khi cấp vào đầm, ao và sau khi nuôi, xả ra môi trường chưa có biện pháp

xử lý Các ao hồ được bố trí dày đặc thiếu qui hoạch nên đôi khi nước xả của đầm này

là nguồn nước cấp của đầm khác và đó là cơ hội để các mầm bệnh lây lan, trở thành dịch Sự thiệt hại do dịch bệnh dẫn đến lỗ nặng trong nuôi tôm xảy ra hàng năm và khắp nơi trong cả nước Theo Lê Xuân Sinh và cs [7], ở đồng bằng sông Cửu Long, năm 2004 có đến 50% tổng số hộ nuôi bị lỗ nặng Ở khu vực miền Trung, tôm bị

bệnh còn nhiều hơn, đến 65% số cơ sở nuôi bị bệnh Có nhiều năm, nhiều cơ sở mất

toàn bộ sản lượng Ở miền Bắc, hơn 50% số cơ sở nuôi tôm bị bệnh và gây thiệt hại không nhỏ [10] Nhóm bệnh đốm trắng, đỏ thân, đen mang thường xuất hiện hơn cả Tiếp đó là bệnh nấm, ký sinh trùng, bệnh do vi khuẩn như phát sáng Một số bệnh do Vibrio gây ra như bệnh đen mang, bệnh phát sáng, bệnh mòn đuôi, cụt râu chỉ mang tính chất cơ hội khi nước bị ô nhiễm, đặc biệt ô nhiễm hữu cơ hoặc khi tôm cá bị stress đo thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày, sự thay đổi về độ mặn của nước [

4, 5, 9] thì nguy cơ bị bệnh là điều không tránh khỏi

1.1.2 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trông thủy sản

Để giảm thiểu những bất lợi của hoá chất trong nuôi trồng thủy sản, cần phải

hạn chế việc sử dụng Điều đó có nghĩa là phải thường xuyên đối mặt với hàng loạt

van dé 6 nhiễm môi trường và dịch bệnh Vì vậy, trong những năm gần đây, nghiên

cứu để tìm ra các yếu tố sinh học như probiotics, enzymes góp phần cải tạo môi trường, tăng sức để kháng cho các đối tượng nuôi được tiến hành mạnh mẽ [4] Tuy vây, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản hiện nay cũng là vấn

để cần bàn Bởi vì hầu hết các sản phẩm hiện nay đang lưu hành trên thị trường là sản phẩm nhập ngoại Theo công bố của Sinh và cs [7], thì hiện có 123 loại chế phẩm sinh

học được sử dụng bao gồm chế phẩm trộn vào thức ăn và chế phẩm xử lý nước Chủ

yếu do các công ty cung cấp, phân phối, đại lý cho nước ngoài hay sử dụng công nghệ

của nước ngoài để sản xuất và phân phối tại Việt Nam Bởi vậy, dù cho nhiều công ty

tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật đến với người nuôi thì trước hết vì

mục đích thương mại để có thể thu càng nhiều lợi nhuận càng tốt chứ không phảt vì quyền lợi của người sử dụng Chưa kể đến tác dụng của chế phẩm ra sao bởi vì những

chế phẩm nhập ngoại hay chủng nước ngoài đưa vào Việt Nam có phù hợp với điều kiện của Việt Nam hay không thì việc đưa lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt

Nam cũng là mối nguy hiểm tiểm tàng, xét về khía cạnh an toàn sinh học

Việc gia tăng mức độ thâm canh và diện tích nuôi trồng dẫn đến môi trường

càng có chiều hướng xấu đi và nhu cầu về chế phẩm sinh học càng cao Nhất là trong

tình hình thị trường Mỹ và Châu Âu thông báo cấm nhiều loại kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy sản

' Đối với hình thức nuôi tôm bán thâm canh hay nuôi thâm canh, việc sử dụng chế phẩm sinh học được nhìn nhận như biện pháp tích cực nhất Bởi vì chế phẩm sinh học có tác dụng giảm độc trong ao, chủ yếu là NH; và H;S; giảm mùi hôi; cải thiện

màu nước; ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao Chế phẩm sinh học cũng có

tác dụng phòng bệnh, giảm thiểu hiện tượng gây bệnh cho tôm Ngoài ra, việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản còn giúp đối tượng nuôi hấp thụ thức ăn tốt hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn, tăng năng suất thu hoạch từ 20-30% [22, 24] Bên cạnh đó, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hoá chất và kháng sinh, yếu tố gây ra hậu quả của việc nuôi trồng thủy

sản kém bền vững Thực tế cho thấy, những cơ sở sử dụng chế phẩm sinh học đã đạt

năng suất tôm khá cao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh

1⁄2 Chế phẩm sinh học (probiotics)

Thuật ngữ probiotic được Lilly và Stiwell để xuất năm 1965 để mô tả những

chất sinh ra từ vi sinh vật có tác dụng tăng trưởng vi sinh vật hoặc sinh vật khác Năm

1959, R Fuller định nghĩa rõ hơn Probiotics hay vi sinh vat probiotic 1a nhiing vi

sinh vật sống, bổ sung vào thức an có tác dụng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và có

tác dụng hữu ích cho động vật chủ [15, 23] Gần đây, định nghĩa này được mở rộng

6

hơn Probiotic bao gồm vi sinh vật sống có tác dụng hữu ích cho động vat và người khi sử dụng Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể, hay tăng lượng kháng thể kích thích hệ thống miễn dịch hoặc là cung cấp những enzym trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn [23]

Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật probiotic mới được quan tâm nhiều trong vòng 20 năm trở lại đây, mặc đù tác dụng của chúng đã được nhận thấy từ lâu Elie là

người đầu tiên để nghị sử dụng vi khuẩn Lactic (L debmeckii, L bulgaricus) để kéo đài tuổi thọ cho người

Ngày nay, probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phòng và trị bệnh cho người

và gia súc Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản mới chỉ bất đầu trong vòng 10 năm gần đây Chế phẩm có thành phần chính là những vi sinh vật sống có tác dụng tích cực đối với việc cải thiện môi trường ao nhờ khả năng sinh enzim phân huỷ hữu cơ hay có tác dụng phòng ngừa bệnh đường ruột, tăng khả năng tiêu hoá và hấp thụ thức ăn khi trộn chế phẩm vào thức ăn [24]

Quá trình làm sạch môi trường dựa trên hoạt động sống của nhóm vi sinh vat, chủ yếu nhóm vi khuẩn hoại sinh Baci1!us, thường xuất hiện trong nước bị nhiễm bẩn Trong quá trình hoạt động sống, các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn được khoáng hoá và

trở thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước Người ta cho rằng, vi sinh vật

có khả năng phân huỷ được tất cả các hợp chất hữu cơ tồn tại trong thiên nhiên và

nhiều hợp chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên, mức độ phân huỷ và thời gian

phân huỷ phụ thuộc trước hết vào cấu tạo của chất hữu cơ và một số chất khoáng làm nguồn dinh dưỡng và tạo ra năng lượng Nhờ đó mà chúng sinh trưởng, phát triển đồng thời làm sạch nước, loại bỏ các chất hữu cơ

12.1 Cơ sở khoa học của việc sử dụng vì khuẩn trong sản xuất chế phẩm

probiotic

Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là sinh trưởng nhanh Tuy nhiên, tốc độ sinh

trưởng của vi khuẩn phụ thuộc đáng kể vào điều kiện dinh dưỡng, nhiệt độ, mức độ

hiếu khí và nhiều yếu tố khác Trong điều kiện thuận lợi, tế bào có thể phân chia sau

20-30 phút Như vậy, sau 24 giờ có tới 48-72 vòng tăng đôi số lượng và từ l tế bào có

thể đạt được khối lượng hàng ngàn tấn Tuy nhiên, trong thực tế không thể có điều

kiện lý tưởng để tăng sinh khối như vậy Trong điều kiện nuôi cấy bình thường, vi

khuẩn cần có thời gian để làm quen với môi trường mà chưa thể sinh trưởng ngay Ở

giai đoạn này, thường được gọi pha lag Khi đã qua giai đoạn làm quen, thì vi khuẩn

bắt đầu sinh sản bằng cách nhân đôi theo cấp số nhân Ở giai đoạn này, sinh khối tăng

mạnh, các chất dinh dưỡng trong môi trường được sử dụng mạnh Khi môi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng, sự tăng trưởng dừng lại và cuối cùng tế bào già đi và chết Tuỳ

theo từng loài vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy mà có thể thu hồi lượng sinh khối tối đa

trong khoảng thời gian thích hợp

Một trong những đặc điểm thuận lợi cơ bản khi sử dụng vi khuẩn để sản xuất

chế phẩm sinh học là tốc độ sinh trưởng nhanh Có thể nuôi cấy vi khuẩn trên cơ chất

rẻ tiền và sinh ra lượng lớn sinh khối một cách ổn định Mặt khác, vi sinh vật cũng là

nguồn cung cấp những enzym cần thiết, thực hiện quá trình sinh học trong những điều

kiện đơn giản, không đòi hỏi phương pháp phức tạp Những vi sinh vật sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học phải được lựa chọn trên cơ sở bảo toàn những đặc tính sinh học theo thời gian, không có nguy cơ biến đổi về di truyền học

Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic hoàn toàn có cơ sở

khoa học và đáp ứng với nhu cầu thực tiễn bởi vi sinh vật probiotic có những ưu điểm

cơ bản Trước hết là diện tích nuôi cấy nhỏ, tốc độ sinh trưởng nhanh, có thể thu được

lượng sinh khối lớn trong vòng 20-30 giờ Mặt khác; các enzym sinh ra có hoạt lực

cao, nguồn nguyên liệu sử dụng dễ kiếm, phong phú và rẻ tiền Có thể thay đổi một

cách dễ đàng môi trường nuôi cấy để đạt hiệu quả như mong muốn Đặc biệt, việc sản

xuất không phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết vì điện tích nhỏ nên có thể không

chế được nhiệt độ cần thiết

1.2.2 Những nhóm vì sinh vật thường được sử dụng trong sản xuất chế

phẩm sinh học

Chế phẩm sinh học sử dụng trong nuôi trồng thủy sản được sản xuất từ một,

vài hay nhiều nhóm vi sinh vật, chủ yếu bao gồm các nhóm vi sinh vat sau:

Trước hết, phải kể đến nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: chủ yếu làm sạch môi trường nhờ khả năng sinh enzym phân huỷ hữu cơ: protease phân huỷ protein,

amylase phan huy tinh bot, cellulase phan hủy cellulose Ngoài chức năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ làm sạch môi trường thì chúng còn có tác dụng kiểm soát sự phát triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng giữ cho

môi trường luôn ở trạng thái cân bằng sinh học Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh

bao gồm một số loài thudc chi Bacillus (Bảng 1.1)

Nhóm vi khuẩn đóng vai trò tích cực trong việc kiểm soát vi sinh vật gây bệnh trong môi trường nhờ sinh chất đối kháng là nhóm vi khuẩn Lactic Nhóm này bao gồm một số loai thudc chi Lactobacillus va mot số trường hợp còn sử dụng ca Strepiococus Ngoài vai trò kiểm soát vĩ sinh vật gây bệnh trong môi trường thì chúng cũng có tác dụng làm giảm mùi hôi của ngư trường Quan trọng hơn cả, sử dụng nhóm vi khuẩn này có tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn

vệ sinh an toàn thực phẩm cho sản phẩm thủy sản Một số trường hợp, người ta sử dụng nhóm vi khuẩn này để sản xuất chế phẩm phòng trị một số bệnh do vi khuẩn gây

ra Nhóm vi khuẩn này khi sử dụng để bổ sung vào thức ăn tôm cá, ngoài mục đích

làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật có

hại, tăng khả năng phòng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng còn có tác dụng

tăng khả năng tiêu hoá và hấp thụ thức ăn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn giúp cho vật nuôi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [24]

Nhóm vi khuẩn khác cũng có vai trò quan trọng trong xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản là nhóm vi khuẩn tự dưỡng thuộc chỉ Nitrosomonas, Nitrobacter cé tác dụng chuyển hoá Nitơ hữu cơ thành Nitơ phân tử, giảm độc cho môi trường Một

số loài vi khuẩn được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học và chức năng của chúng

được trình bày trong bang 1.1

Bảng 1.1 Các loài vi khuẩn sử dụng để xử lý môi trường

Streptococus sp Vi khuẩn kị khí không bắt buộc, phân huỷ hữu cơ, cạnh

tranh sinh học, giảm sự phát trién cha Vibrio va vi khuan,

nguyên sinh động vật

1.2.2.1 Vi khudn Bacillus và quá trình phán giải các hợp chất hữu cơ dưới

tác dụng của hệ enzym protease, amylase, cellulase

Vị khuẩn BaciJ„s là những vi khuẩn Gram +, hình que, có bào tử, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, thuộc chỉ Bacillaceae Đặc điểm quan trong cia Bacillus là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện bất lợi như cạn

kiệt nguồn dinh dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ, hoá chất Bào tử Bacillus có thể tồn tại được vài trăm năm Khi gặp điều kiện thuận lợi có thể

nay mâm, phát triển thành tế bào đinh dưỡng Baciii„s tôn tại khắp nơi trong tự nhiên

Tính dễ sống, dễ tổn tại cũng là lợi thế để sử dụng Ö8aci!!s sản xuất chế phẩm sinh

học Trong quá trình hình thành bào tt, Bacillus thudng san sinh những chất có hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Một trong những đặc tính là sinh enzym phân huy hitu co nhu protease, amylase, cellulase

10

Protease là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân tử

protein và các chất tương tự Sản phẩm thuỷ phân là các axit amin, sản phẩm trung

gian là các peptit có mạch dài ngắn khác nhau Trong quá trình đó còn sản sinh peptone, san phdm thuy phân không hoàn toàn của protein Quá trình phân hủy không

hoàn toàn các hợp chất hữu cơ (protein) cũng sinh ra các khí độc như H;S, NH¿, gây

độc với tôm cá

Enyme œ-amylase có tác dụng thủy phân tính bột Quá trình xảy ra trải qua giai đoạn dextrin hoá, khi đó chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin và giai đoạn đường hoá Trong giai đoạn này, các dextrin

vừa được tạo thành bị phân huỷ tiếp thành dextrin có phân tử thấp hơn như maltose,

isomaltose, glucose

Enyme cellulase xúc tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm trung gian là

cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose

Các sản phẩm cuối cùng của sự phân huỷ hữu cơ nhờ hệ enzyme profease, amylase, cellulase là các acid amin và glucose Đó là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật có ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước 1.2.2.2 Vị khuẩn Lactobacillus và tác dụng phòng ngừa bệnh

Ngay từ năm 1901, Metchinikoff đã cho rằng: vi khuẩn Lactic cư trú trong đường ruột có thể ngăn ngừa bệnh nhiễm khuẩn đường ruột của người Tuy nhiên, những hiểu biết và tác dụng của vi khuẩn Lactic được để cập nhiều nhất trong những thập niên gần đây [15]; L acidophilus được cơi là thành phần quan trọng của khu hệ

vi khuẩn Latc đường ruột [21] Tác động hữu ích như giảm sự bài tiết cholesterol và estrogen, ức chế hoạt động của chất gây ung thư đường ruột và giảm ảnh hưởng phụ

do điều trị kháng sinh cũng được biết đến [21] Một trong những đặc điểm quan trọng

cha L acidophilus sit dung dé điều trị bệnh là khả năng bám dính tế bào vào niêm

mac rudt va vi vay L acidophilus cé thé tén tai và cư trú trong đường ruột, bảo vệ

đường ruột khỏi bị xâm nhập bởi vi sinh vật gây bệnh

Khu hệ vi sinh vật đường ruột của người cũng như động vật luôn giữ ở trạng

thái cân bằng tự nhiên Tuy nhiên, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự cân bằng đó Nhất là đối với con tôm, nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến sự cân bằng của khu hệ vi

sinh vật đường ruột như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, mưa nắng, hạn hán Các yếu tố

này đều có thể dẫn đến sự mất cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột Một

nguyên nhân nữa hay dẫn đến sự rối loạn khu hệ vi sinh vật đường ruột là do sử dụng kháng sinh, hoá chất Mỗi khi tôm cá có hiện tượng khác lạ, kém ăn mà đôi khi chỉ do

sự thay đổi thông thường của cá thể, người ta thường sử dụng kháng sinh, hóa chất và kết quả là tôm cá phát triển còi cọc, dễ mắc bệnh đường ruột như bệnh phân trắng

Bên cạnh đó, người ta còn cho rằng khi sử dụng vi khuẩn Lactic trộn vào thức

ăn của tôm, sẽ giúp cho tôm tăng trưởng nhanh vì vi khuẩn Lactic có tác dụng tăng khả năng tiêu hoá và hấp thụ thức ăn [25]

- Vi khuẩn Lactic có khả năng tạo axit lactic, chất kháng khuẩn kiểm soát một

số vi sinh vật gây bệnh: Vibzio, Pseudomonas, E.col, Aeromonas Tuy nhiên, các loài vi khuẩn Izactic khác nhau và vì vậy chúng cũng khác nhau về khả năng chịu axit

L acidophilus có thể chịu được trong môi trường axit (pH 2-3) Đa số vi khuẩn Lactic chỉ phát triển được trong môi trường giàu nguồn Nitơ, Cacbon, khoáng chất, một số

có nhu cầu về axit amin và vitamin Do vậy, môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactic khá

phức tạp Nguồn Cacbon thích hợp đối với vi khuẩn Lactic thường là đường disaccharit và monosaccharit Nhưng các loài khác nhau thì sử dụng nguồn Cacbon khác nhau Một số loài không sử dụng sucrose như nguồn cacbon và một số loài khác

không sử dụng lactose như nguồn cacbon

Bên cạnh nhóm vi khuẩn Lactic được xác định có khả năng phòng ngừa và chữa bệnh Một số vi khuẩn khác như Bacillus, Saccharomyces hay cả loài vi khuẩn Vibrio alginolyticus cũng có khả năng đó [14]

Sinrat Rengpirat và cs [24], cũng đã chứng minh được hiệu quả rất tốt của việc b6 sung ching Bacillus S 11 vao thitc an cia loài tôm hùm đen, chủng vi khuẩn này kháng lại loài vi khuẩn gây bénh: Vibrio harvegi va Vibrio parahaeemolyticus Khi

bổ sung vào thức ăn tôm hùm đen, nhận thấy tỷ lệ sống sót của tôm cao hơn rất nhiều

12

khi trong môi trường có vi khuẩn V¿brio Trọng lượng tôm cũng tăng lên nhiều so với mẫu đối chứng Nước trong mẫu thí nghiệm ổn định và đạt chỉ tiêu cho phép về oxi

hoa tan, pH, NH,, NH,, NO;

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vì khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn đều có nhu cầu về thành phần dinh dưỡng khác nhau Nguồn

dinh dưỡng đối với vi khuẩn thông thường là nguồn Cacbon, Nitơ và khoáng Ngoài

một số vi khuẩn có khả năng tự tổng hợp các chất cần thiết từ nguồn Cacbon vô cơ,

nước, muối khoáng (vi khuẩn tự dưỡng) thì đa số vi sinh vật đòi hỏi cung cấp nguồn Cacbon, Nitơ đưới dạng hợp chất hữu cơ hay vô cơ Vi sinh vật không có khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử Chỉ có các polypeptit chứa không quá 5 gốc

axit amin mới có thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật Nhiều

vi sinh vật sản sinh protease xúc tác việc thuỷ phân protein thành các hợp chất phân tử

thấp để có khả năng xâm nhập vào tế bào Ngoài nguồn N, C thường được cung cấp vào môi trường nuôi cấy như pep(on, cao thịt, cao men, vi sinh vật cũng cần nguồn

muối khoáng cho quá trình sinh trưởng và phát triển Những nguyên tố đa lượng cần

thiết cho vi khuẩn như K, P, Ca, Mg và những nguyên tố mà vi sinh vật sử dụng với lượng rất nhỏ (nguyên tố vi lượng) như Zn, Mn, Ni, Cu Các nguyên tố đa lượng và

vi lượng cho vi sinh vật cung cấp dưới dạng muối khoáng Tuy từng loài vi khuẩn mà chúng có nhu cầu về nguồn muối khoáng cung cấp Một số loài vi sinh vật ngoài thành phần cacbon, nitơ, khoáng còn có nhu cầu cung cấp vitamin như BI, B2, B5

-Nhu cầu dinh dưỡng Baciiius rất đơn giản, chỉ cần 1 nguồn Cacbon, l nguồn Nitơ và

1 nguồn muối khoáng Ngược lại vi khuẩn Lactic có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, ngoài nguồn cacbon, nitơ, khoáng đa lượng, vi lượng đôi khi còn cần các vitamin cho

sự sinh trưởng và phát triển

Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật không những chỉ phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mà còn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ oxi hoà tan .Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacilius lôi cuốn sự chú ý trong lĩnh vực công nghệ sinh học đó

là khả năng chịu nhiệt, chịu axit và chịu kiểm 8acilus có thể phát triển ở nhiệt độ

60°C hoặc cao hon (Bacillus chiu nhiét), cing cé loai Bacillus wa lanh thì có thể phát

triển ở nhiệt độ 0-15°C Thông thường Baciiius phát triển tốt ở nhiệt độ 28-370C,

nhưng nhìn chung khi nuôi cấy, lên men Bacillus, khong can phải khống chế nhiệt độ

gắt gao như những loài khác

pH cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển

của vi khuẩn bởi khi pH thay đổi, làm cho diện tích màng tế bào chất thay đổi vì thế

ảnh hưởng đến sự hấp thụ thức ăn và cũng làm thay đổi nhiều phản ứng sinh hoá xảy

ra trong tế bào pH tối thích cho vi khuẩn là 6,5-7,5 pH thích hợp đối với Bacillus thường trung tính (pH=7); đối với vi khuẩn Lactic, pH thấp hơn (6-6,5)

Tuỳ theo từng loại vi sinh vật ưa khí hay ky khí mà nhu cầu về nồng độ oxi hoà

tan cao hay thấp Đối với vi khuẩn Baciiius (vi khuẩn hiếu khí hoặc ky khí không bắt buộc), khi lượng oxi hoà tan thấp, chúng không thể sinh trưởng và phát triển được

Tuy nhién, d6i v6i loai vi khudn Lactobacillus (loài kị khí không bất buộc) thì lượng

oxi nhiều sẽ ức chế sự phát triển của chúng

1.3 Đặc điểm nước nuôi tôm, cá và những chỉ số cơ bản đánh giá nước nuôi 1.3.1 Đặc điểm nước nuôi tôm cá

Đặc điểm chung của nước nuôi tôm cá là hàm lượng hữu cơ cao nhưng tuỳ theo từng địa phương và tuỳ theo từng thời kỳ trong quá trình nuôi mà chất lượng nước nuôi bị biến đổi Trong thời gian đầu, khi mới thả tôm, nước chưa bị nhiễm hữu cơ vì

vậy tôm tăng trưởng tốt Từ tháng thứ 2, tôm lớn hơn, cho ăn nhiều hơn cũng đồng

nghĩa với lượng uế thải bài tiết nhiều hơn và lượng thức ăn thừa do tôm không sử dụng hết, tích tụ dần làm chất lượng nước bị suy giảm Sự suy giảm chất lượng nước tỷ lệ thuận với thời gian Lúc này, nếu không có biện pháp xử lý hữu cơ thích hợp thì sự phát triển của tôm bị chậm lại, thậm chí còn gây ra dịch bệnh, tôm chết hàng loạt gây

tổn thất cho người nuôi

Ngoài nguyên nhân ô nhiễm hữu cơ trong nước nuôi tôm do thức ăn thừa, do

bài tiết, do lột xác trong hoạt động sống còn nguyên nhân ô nhiễm phi hữu cơ do sử dụng hoá chất, kháng sinh để xử lý môi trường và trị bệnh Đứng trước thực trạng môi

14

trường bị ô nhiễm nặng, dịch bệnh luôn rình rập, người dân sẵn sàng sử dụng hoá chất

và kháng sinh Chính vì vậy, sự ô nhiễm lại càng trầm trọng hơn Sự ô nhiễm hữu cơ

và ô nhiễm phi hữu cơ là nguyên nhân dẫn đến thất bại cho nghề nuôi, một số địa

phương đã không thể tiếp tục nuôi tôm được nữa

1.3.2 Những chỉ số cơ bẩn đánh giá nước nuôi tôm, cá

Nhiệt độ là điều kiện để các quá trình sinh học, lý học, hoá học diễn ra trong nước Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình tự làm sạch nước Ngoài ra, nhiệt độ còn ảnh hưởng đến việc bắt mồi của tôm Nhiệt độ thích nghi cho tôm: 18-30°C, thích hợp: 23-

30C

Độ pH cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tôm vì nó ảnh hưởng đến tính độc của NH;, H,S trong môi trường Tính độc của NH¿, H;S phụ thuộc vào dạng tồn tại của chúng trong môi trường Khi pH cao, NH; tồn tại ở dạng khí nhiều (nồng độ NH; cao) va H,S tén tại ở dạng khí ít Ngược lại, khi pH thấp, H;S tồn

tại ở dạng khí nhiều và NH¿ tồn tại ở đạng khí ít NH¿, H;S ở dạng khí độc hơn ở dạng

ion vA pH=7,5-8,5 thi NH,, H;S tôn tại ở dang it độc nhất Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của tôm được thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2: Anh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của tôm cá

Đặc điểm môi trường Ảnh hưởng đối với tôm cá

Môi trường axit mạnh (pH=4) Điểm chết đối với tôm cá

Môi trường axit yếu (pH=5-6) Tôm cá không sinh sản hoặc khó sinh sản

Môi trường trung tính (pH=7) Tôm cá phát triển tốt

Môi trường kiềm yếu (pH=8) Tôm cá phát triển tốt

Môi trường kiểm (pH=9-10) Tôm cá chậm lớn

Môi trường kiểm mạnh (pH>10) Điểm chết đối với tôm cá

Độ mặn của môi trường tôm nuôi phụ thuộc vào từng loại tôm Đối với tôm càng xanh, từ tôm bột đến tôm trưởng thành đều nuôi ở nước ngọt, ấu trùng tôm nuôi trong môi trường có độ muối: 14% Đối với tôm sú, độ mặn thích hợp từ L5-35%o

Nồng độ oxi hoà tan cũng rất cần cho vi sinh vật hiếu khí hoạt động và tôm nuôi phát triển Lượng oxi hoà tan trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ

ô nhiễm của nước, hoạt động của vi sinh vật trong thế giới thuỷ sinh, quá trình sinh học, hóa học xảy ra trong nước, Oxi hoà tan được tôm cá sử dụng trong quá trình hô hấp Mặt khác, oxi hoà tan tham gia vào quá trình phân huỷ thức ăn thừa, chất thải, xác động vật trong nước Khi môi trường bị ô nhiễm nặng thì oxy được sử dụng nhiều cho quá trình sinh hóa dẫn đến hiện tượng thiếu oxy trong nước Trong trường hợp

này tôm cá hay bị nổi đầu Nước đủ tiêu chuẩn để nuôi tôm có hàm lượng oxy hoà

tan: 5-8 mg/ lit

_ Nhu cầu oxy sinh học (BOD) cũng là chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước BOD

là lượng oxy cần thiết để oxi hoá các chất hữu cơ có trong nước bằng vi sinh vật hoại

sinh hiếu khí Quá trình này được gọi quá trình oxy hoá sinh học BOD thường được dùng để đánh giá mức độ nhiễm hữu cơ của nước nuôi BOD càng cao thì mức độ ô

nhiễm càng lớn, BOD thích hợp cho nước muôi tôm cá: 5-10mg/ lít

Nhu cầu oxy hoá học (COD) cũng được dùng để đánh giá độ nhiễm bẩn của nước nhưng không có sự tham gia của vi sinh vật COD là lượng oxy cần thiết cho quá

trình oxy hoá toàn bộ các chất hữu cơ có trong nước thành CO; và H;O bằng một chất oxy hoá mạnh COD thích hợp: < 20mg/ lít

Trong ao nuôi, các chỉ số BOD, COD càng giảm càng tốt vì chứng tỏ nước ít ô nhiễm hữu cơ, không cần tiêu hao lượng oxy hoà tan trong nước để oxy hoá các chất

bẩn Vì vậy, khi BOD, COD giảm thì lượng oxy hoà tan trong nước tăng làm tăng chất lượng nước nuôi

Hàm lượng Nitơ trong nước cũng được xem là chất chỉ thị tình trạng ô nhiễm

nước Vì các dạng tồn tại của Nitơ trong nước là các khâu trong chuỗi phân huỷ các

hợp chất chứa Nitơ hữu cơ (protein) Nitơ có thể tồn tại ở các dạng chủ yếu sau: Nitơ

16

hitu co (N-CH); amoniac (NH;); Nitrit (NO,°) và Nitơ tự do Nếu nước chứa hầu hết các hợp chất Nitơ hữu cơ, amoniac hoặc NHẠOH, chứng tỏ nước mới bị ô nhiễm NHạ trong nước có thể gây ngộ độc cho tôm cá Nếu trong nước có hàm lượng NO, cao, chứng tỏ nước bị ô nhiễm trong thời gian dài Nếu nước chứa hàm lượng Nitơ chủ yếu

ở dạng Nitrat (NO;) chứng tỏ quá trình phân hủy đã kết thúc Hàm lượng nitrat cao

cũng có thể gây ngộ độc cho vật nuôi Mặt khác, khi hàm lượng Nitơ trong nước cao

là nước rất phú dưỡng và tạo cơ hội cho tảo phát triển mạnh, gây tình trạng thiếu oxi

trong nước làm tôm cá bị chết

Hàm lượng phospho cũng ảnh hưởng đến chất lượng nước vì phospho là nguồn dinh dưỡng cho thực vật dưới nước Khi hàm lượng phospho trong nước quá cao sé làm cho các loài tảo, các loài thực vật phát triển mạnh, gây tắc thuỷ vực và sau khi tảo

chết, bị thối rữa gây ô nhiễm thứ cấp dẫn đến thiếu oxi và ảnh hưởng đến tôm cá

1.3.3 Yêu cầu về nước nuôi tôm cá

Tôm thường sống ở vùng nước biển có độ mặn không cao hoặc vùng nước lợ

bãi bồi, cửa sông Vì vậy, nuôi tôm thâm canh và bán thâm canh thường ở các đầm ao được cấp nước từ biển và trộn với nước ngọt để đáp ứng yêu cầu của tôm Một số chỉ

tiêu của nước nuôi trồng thủy sản được trình bày ở bảng 1.3 và bảng 1.4

Bảng 1.3: Một số chỉ tiêu của nước nuôi trồng thuỷ sản [5]

Bảng 1.4: Các thông số môi trường nuôi thích hợp cho tôm sú thâm canh [2]

pH 7,5-8,5 Dao động hàng ngày <0,5

Độ mặn 15-30%o Đao động hàng ngày <5%

Oxy hoà tan 5-6 mg/ lit Không dưới 4 mg/lít

Độ kiểm 80-130 mg CaCO// lít | Phụ thuộc vào dao dộng của pH

HS < 0,03 mg/ lít Độc hơn khi pH giảm thấp

NH; <0,1mg/ lít Độc hơn khi pH và nhiệt độ lên cao

1.4 Các bệnh thường xảy ra cho tôm khi ao nuôi bị nhiễm bẩn

Khi ao bị nhiễm bẩn, một số loài vi khuẩn từ bên ngoài xâm nhập vào trong vỏ

tôm, gây bệnh cho tôm Bệnh thường gặp nhất trong trường hợp này là bệnh hoại tử

do vỏ bị tổn thương vì nhiễm khuẩn hay không cứng được Nhiều loài vi khuẩn có thể

ăn mòn lớp kin của vỏ, gây ra lở loét hay tạo ra các vết nhỏ làm cho vỏ bị nhãn nheo Ngoài vi khuẩn thì một số sinh vật khác cũng có thể xâm nhập qua vỏ như nấm hay động vật nguyên sinh Nấm có thể xâm nhập mang và vỏ, tạo nên những khối đen

trên bề mặt của tôm Động vật nguyên sinh xâm nhập qua vỏ không nhiều mà chỉ gây tổn thất cho mang, tạo ra những đốm đen nhỏ Có nhiều trường hợp, gây hiện tượng

đen hoá nghiêm trọng trên mang, người ta thường gọi là bệnh đen mang Bệnh đen mang thường do nhiễm khuẩn Vibr/o, nhiễm nấm Fusarium, dong vat nguyén sinh

18

Đôi khi cũng do nhiễm hoá chất như kim loại nặng, hàm lugng nitrat cao hay nước có tính axit [9, 16]

Nhóm vi khuẩn Vibrio là nhóm vi khuẩn gây bệnh cơ hội [26] Chúng tồn tại

trong môi trường nước nuôi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuôi Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi, chúng trở thành vi khuẩn có khả năng gây bệnh Khi bị nhiễm vi khuẩn này, tôm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỗ hoặc xanh Nếu môi trường tiếp tục xấu đi,

hay số lượng vi khuẩn gây bệnh phát triển mạnh, tôm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính Để ngăn ngừa

bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện môi trường ao nuôi

Ngoài bénh den mang, Vibrio ciing gay ra m6t s6 bệnh khác như bệnh phân trắng, bệnh phát sáng Các bệnh này cũng làm cho tôm chết hàng loạt

Một số loài Virut cũng là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho tôm Các bệnh

- truyền nhiễm do virut như WSSV (White Spot Syndrome Virut) hay YHD (Yellow Head Disease) là những bệnh điển hình gây thiệt hại nghiêm trọng [3] Bệnh đốm

trắng là một trong những bệnh gây nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi Bệnh có thể gây hậu quả nghiêm trọng, chết 100% tôm nuôi Bệnh đầu vàng cũng nguy hiểm cho tôm

nuôi, đặc biệt là giai đoạn 20 và 50-70 ngày tuổi, cũng gây thiệt hại nặng nề

Tuy nhiên, có nhiều dẫn chứng lại cho thấy tôm có dấu hiệu bệnh đầu vàng và đốm trắng nhưng lại không bị nhiễm Virut Khi có Virut trong ao nuôi và môi trường

xấu đi thì tôm bị chết hàng loạt và chết rất nhanh

Bệnh MBV (monodon Baculovirus) khá phổ biến ở tôm sú nuôi Tuy nhiên, chỉ tôm ở giai đoạn ấu trùng mới có tỷ lệ chết cao khi nhiễm Virut này Đối với tôm trưởng thành, không gây thiệt hại nghiêm trọng Nhiều dẫn chứng cho rằng MBV có

thể cảm nhiễm ở hầu hết các giai đoạn trong vòng đời của tôm sú và một số loài cùng

họ nhưng giai đoạn mẫn cảm nhất là giai đoạn larvae và postlarvae

Ngoài ra, khi môi trường ô nhiễm, tôm còn có thể mắc một số bệnh khác như bệnh đóng rong, bệnh phân trắng Trong nhiều trường hợp, do điều kiện môi trường

xấu, nồng độ các khí độc cao, gây stress cho tôm, gây cho tôm mẫn cảm với mầm bệnh

Vì vậy, vấn đề xử lý môi trường nuôi chính là vấn đề cốt lõi để hạn chế bệnh

20

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu và lập luận về việc chọn đối tượng nghiên cứu

Với mục đích tạo ra sản phẩm sử dụng có hiệu quả để xử lý môi trường nuôi

trồng thuỷ sản và phòng ngừa bệnh cho đối tượng nuôi thuỷ sản, chúng tôi đã chọn được 4 chủng vi khuẩn từ tập đoàn giống do chúng tôi phân lập và sưu tầm để nghiên cttu [12] Dé 1a nhing ching vi khudn thudc chi Bacillus va chi Lactobacillus [12] Những chủng vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh thuộc chỉ Bacillus có vai trò phân huỷ hữu

cơ nhờ kha năng sinh enzym protease phan huy protein, amylase phan huy tinh bot, cellulase phan huy cellulose Những chất hữu cơ tồn lưu trong môi trường nước nuôi

là do việc đưa quá nhiều thức ăn tổng hợp cũng như thức ăn tươi sống, do bài tiết hoặc

do lột xác trong quá trình sống, do xác động vật thuỷ sinh, thực vật thủy sinh chết,

thối rữa Những chất hữu cơ này nếu không được phân hủy triệt để gây nên ô nhiễm

nước nuôi, nguyên nhân quan trọng gây thất bại cho nghề nuôi tôm [13]

Ngoài khả năng phân hủy hữu cơ làm sạch môi trường, Bzciius cũng được

-_ chọn làm đối tượng nghiên cứu bởi chúng còn sinh ra một số chất kháng khuẩn, kiểm soát sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt nhóm vi khuẩn cơ hội do

cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho khu hệ vi sinh vật trong ao nuôi luôn ở

trạng thái cân bằng

Các chủng Öaciius được chọn thuộc loai B licheniformis, B subtilis,

B megaterium Cac chủng đều mang những đặc điểm cơ bản, cần thiết cho việc sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản: sinh enzym phân huỷ hữu cơ, chịu mặn và đặc biệt đảm bảo an toàn cho người và vật nuôi [11,12]

Đối tượng khác được lựa chọn trong nghiên cứu là nhóm vi khuẩn Latic Nhóm

vi khuẩn này rất quen thuộc đối với đời sống người và động vật Vi khuẩn Lactic rất

phổ biến trong các sản phẩm thực phẩm như dưa chua, nem chua, mắm chua, sữa

chua, rau quả ủ chua Trong hoạt động sống, vi khuẩn Lactic chuyển hoá đường thành axit lactic Chúng còn có thể sinh bacteriocin, mét hop chat có hoạt tính kháng

sinh và phổ ức chế các vi khuẩn khác khá rộng, đặc biệt đối với nhóm vi khuẩn Vibrio

gây một số bệnh nghiêm trọng cho tôm như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, bệnh phân trắng, bệnh mòn đuôi, cụt râu Loại chất kháng sinh này không gây ra tính

kháng ở các vi khuẩn gây bệnh và không nằm trong danh sách các kháng sinh cấm sử

dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản theo quy định SỐ 07/2005/QD-BTS ngay 24 thang 2 nam 2005

Axit lactic và bacterioxin có khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh phát triển

quá mức trong môi trường nuôi Do đó, chúng đóng vai trò kiểm soát vi sinh vật gây

bệnh trong môi trường, giữ khu hệ vi sinh vật môi trường nuôi ở trạng thái cân bằng

Vi khuẩn Lactic được chọn để kiểm soát vi sinh vật trong môi trường thuộc loài L

acidophilus Chúng là những trực khuẩn ky khí boặc ky khí tuỳ tiện có khả năng lên men lactic điển hình, có khả năng lên men sữa sinh axit lactic Đáng chú ý là loại vi

khuẩn này ức chế mạnh sự phát triển của loài Vibrio gây bệnh tôm

(V.parahaemolyticus, V fuonisi) L acidophilus cing c6 kha năng chịu mặn nên có

thể tồn tại trong môi trường nước nuôi

Việc ứng dung L acidophilus trong nuôi trồng thủy sản ngoài tác dụng kiểm soát vi sinh vật gây bệnh, ổn định môi trường nước, chúng còn được sử dụng để sản xuất chế phẩm phòng trị bệnh đường ruột cho người và vật nuôi Sự tồn tại của vi khuẩn này trong đường ruột tạo ra những thay đổi vẻ khu hệ vi sinh vật đường ruột

theo hướng cân bằng có lợi, trong đó các vị sinh vật có lợi tăng lên đáng kể, các vi sinh vật có khả năng gây bệnh (E.col, Aeromonas, Salmonella) giảm đáng kể [20]

Khả năng tăng cường miền dịch, điều chỉnh ngưỡng sai lệch bất lợi ở hệ vi sinh vật đường ruột do bệnh nhiễm khuẩn, virut, đị ứng thức ăn; tăng cường khả nãng tiêu hoá

và hấp thụ thức ăn cũng là cơ sở để lựa chọn /, acidophilus sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nuôi trồng thuỷ sản

2.2 Phương pháp nghiên cứu và lập luận về phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.1 Phương pháp chọn những chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học

- Khả năng chịu mặn: môi trường sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn là môi trường LB đối với VK Baciius và MRS đối với Lactobacilus, có bố sung NaC] với

nồng độ: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn sau 4§giờ thông

qua chỉ số mật độ quang (OD)

- Kha năng đối kháng: Kiểm tra với Vibrio parahaemolyticus (Vp), Vibrio fuonisi

(VÐ trên môi trường thạch đĩa NA (Baciliusỳy; MRS (Lactobacilius) Các chủng cần

22

kiểm tra cấy chấm điểm vào đĩa thạch đã bổ sung Vp, Vf Quan sát vòng kháng khuẩn

sau 24-48 giờ

- Khả năng sinh protease: Kiểm tra trên môi trường NA (Bacillus) va MRS

(Lactobacilius) có bỗ sung 10% sữa đã được tách béo và thanh trùng Cấy chủng và

quan sát vòng thuỷ phân xung quanh khuẩn lạc

- Kha nang sinh amylase: Cấy chủng Bacilius trên môi trường NA có bổ sung tỉnh bột và Lzctobacillus tren môi trường MRS bổ sung tỉnh bột Sau khi vi khuẩn phát triển, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vòng phân huỷ tỉnh bột xung quanh khuẩn lạc

- Kiểm tra độ an toàn của các chủng nghiên cứu: Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng được tiến hành trên 50 con chia làm 5 nhóm, nhóm đối chứng dùng nước cất và 4 nhóm thử mẫu với liều khác nhau Các mức liều cao uống 2-3 lần/ngày, cách

nhau 3 giờ Theo dõi chuột 5 ngày sau khi cho uống

2.2.1.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống

- Ảnh hưởng của thành phản môi trường: Nuôi cấy Bacillus, Lactobacillus trên

- môi trường có bổ sung thành phần khác nhau Khả năng sinh trưởng và phát triển

được theo dõi qua xác định pH môi trường sau khi nuôi cấy, ODazo„„, CEU/ m1

- Ảnh hưởng của tỷ lệ giống: Bồ sung giống với tỷ lệ 5%, 7,5%, 10%, theo dõi sự

sinh trưởng và phát triển qua xác định ODg90am, PH, CFU/ ml

- Ảnh hưởng của pH môi trường: Điều chỉnh pH MT đạt 5,5; 6; 6,5 đối với vi khuẩn

kactobacillus Xác định pH môi trường sau khi nuôi cấy, OD;;zoaạ, CFU/ ml

- Ảnh hưởng thời gian nhân giống: Khả năng sinh trưởng va phát triển cha Bacillus,

Lactobacillus sau 16, 20, 24, 36, 48 giờ được theo đõi qua xác định pH, ODazg,

CFU/ ml

2.2.1.3 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

- Lén men chim Bacillus thực hiện trong 5 bình inox với tổng thể tích 100 lít, được lắp đặt trong hệ thống lên men tự thiết kế; Lên men chìm Lactobacillus vao binh inox, thể tích 20 lít

- Độ thông khí thích hợp trong các bình lén men Bacillus, Lactobacillus được nghiên cứu qua việc bổ sung lượng MT: § lí, 8 lít; 10 lít, 12 lít vào các bình inox có thể tích 20 lít Xác định pH, ODaz„„, CEU/ ml

- Thành phần môi trường lén men chim Bacillus thich hop được lựa chọn trên cơ sở môi trường nhân giống Bacillus, có thay đổi một số thành phần phù hợp, dễ kiếm và

rẻ tiền Xác dinh CFU/ml dich Jén men

- Thời gian lên men chim Bacillus, Lactobacillus thích hợp được nghiên cứu qua theo

dõi pH, ODa;p„„, CFU/ ml dich LM

- Xác định thành phần lén men Lactobacillus trén méi trudng xốp thích hợp bằng

cách lên men trên cơ chất là nguồn cácbon (đường sucrose, lactose, glucose, maltose,

mannitol); chất mang: bột đậu tương, bột gạo, bột sắn, bột cám với tỷ lệ khác nhau

Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men

- Xác định thành phần lên men 8acửius trên môi trường xốp trên nguồn cơ chất bao

gồm: bột đậu tương, bột gạo, bột cám Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men

- Tỷ lệ giống thích hợp để lên men Bazcilus trên môi trường xốp được nghiên cứu:

20%, 25%, 30%, 35% Xác định CEFU/ gam chế phẩm lên men

- Nhiệt độ lên men Bacillus, Lactobacilius trên môi trường xốp thích hợp được

_ nghiên cứu: 280C, 30C, 34°C, 37°C Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men

- Xác dinh thoi gian lén men Bacillus, Lactobacillus trén m6i trudng xốp thích hợp bằng cách lên men 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 ngày, xác định CFU/gam CP lên men

- Độ ổn định của chế phẩm lên men Bacillus, Lactobacillus trên môi trường xốp được xác định bằng cách lên men liên tục 6 mẻ trong vòng 1 tuần với số lượng 15-40 kg/

mẻ Kiểm tra CFU của từng mẽ LM

2.2.1.4 Thu hồi sinh khối, tạo chế phẩm Biochie, BioFvà bảo quản chế phẩm

- Thu hồi sinh khối tế bào Bacilws, Lactobacillus: bằng phương pháp ly tâm lạnh

§.000 v/ phút trong 5 phút; sử dụng bentonit với tỷ lệ 2,5%, 12%, 25%; sử dụng

điatomit với tỷ lệ 2,5%, 12%, 25%; để lắng -4°C, 24-48 giờ

- Tạo chế phẩm BioF dạng bột: Sấy khô chế phẩm lén men Lactobacillus bang say nhiệt 40°C, 45°C, 50°C hoặc sấy hút chân không 40°C, 45°C, 50°C hay đông khô lạnh

ở nhiệt độ -50°C Nghiền thành bột, kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CEFU/gam chế phẩm : 10?) và đóng vào túi tráng kẽm, hàn kín

- Tạo chế phẩm BioF dạng lỏng: Dịch lên men L2ctobaciius đã được thu hồi, bổ sung chất bảo quản thích hợp Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ml chế phẩm : 10”) và đóng vào can, nút kín

24

- Tạo chế phẩm Biochie dang bot: ché ph4dm Ién men Bacillus da dugc s&y kho voi

nhiệt độ: 50, 60, 65, 70C, nghiền, bổ sung chế phẩm lên men Lactobacillus ciing

được sấy khô, nghiên nhỏ Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ gam chế phẩm:

10°)

- Tạo chế phẩm Biochie dạng lồng: địch lên men Baciilus đã được thư hồi, bổ sung Lactobacillus cũng được thu hồi và cho thêm chất bảo quản Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ ml chế phẩm: 10°)

- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm Biochie dạng lỏng gồm các thành

phan: Bacillus, Lactobacillus va mot trong số cdc chat bao quan sau: sucrose, lactose,

Na;S;O¿ Theo dõi độ ổn định của chế phẩm sau 1, 3, 6, 8, 10, 12 tháng

- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm Biochie dạng bột gồm: Bacillus, LactobaciHlus và một trong số thành phần sau: bột, sucrose, lactose, Na;CO; Theo dõi

độ ổn định của chế phẩm sau I, 3, 6, 9, 12 tháng

- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm BioE dạng lỏng với các thành phần:

sucrose, sucrose + NaOH; lactose, Na,S,O, + lactose Theo dõi độ ổn định của chế

phẩm sau I, 3, 6, 9 tháng

- Thành lập công thức bảo quản chế phẩm BioF dạng bột với các thành phần:

sucrose, bột, lactose, Na,S,O, + lactose Theo d6i d6 6n dinh ca ché phẩm sau I, 2,

5, 8, 10, 12 thang ,

2.2.1.5 Phương pháp định tính VK nghiên cứu

Định tinh VK Bacillus va Lactobacillus dua trén nghién cttu dac diém hình

thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, đặc điểm sinh hóa [12, 18, 19, 21]

- Xác định đặc điểm khuẩn lạc : Quan sát đặc điểm khudn lac cia B licheniformis,

B subilis, B megaterium trên môi trường NA; L acidophihus trên môi trường MRS

bổ sung agar Cấy các vi khuẩn trên môi trường thích hợp, nuôi 24-48 giờ Chọn những hộp lồng có khuẩn lạc mọc riêng rẽ để quan sát

- Xác định hình thái tế bào, bào tử: Có thể sử dụng môi trường lỏng hay môi trường

có thạch để quan sát đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Vi khuẩn sau khi được nuôi

cấy trên môi trường thích hợp, làm tiêu bản, nhuộm Gram hay nhuộm Carbofuchsine

Quan sát hình dạng tế bào, cách sắp xếp, bào tử trên kính hiển vi quang học có độ

phóng đại 1000 lần