Nghiên cứu tạo cây thuốc lá chuyển gen chống sau VIP3A

Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9 2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 222.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23 3..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

Mã số: 60.62.01

Người hướng dẫn: 1 TS CHU HOÀNG HÀ

2 GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

HÀ NỘI - 2009

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Hảo

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành chương trình học tập, thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh

luận văn tốt nghiêp, tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ vô cùng quý báu

của Ban giám hiệu, Khoa Sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội,

Ban lãnh ñạo Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội và tập thể Phòng Công

nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

Tôi xin trân trọng cảm ơn Tiến sĩ Chu Hoàng Hà - Phó trưởng phòng

Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học ñã giúp ñỡ và tạo ñiều

kiện cho tôi hoàn thành tốt quá trình học tập, thực hiện nghiên cứu ñề tài và

hoàn chỉnh luận văn

Tôi cũng xin ñược trân trọng cảm ơn và GS.TS Nguyễn Quang Thạch,

trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, người luôn theo dõi và hướng dẫn chu

ñáo ñể tôi hoàn thành bản luận văn này

Qua ñây, tôi cũng chân thành cảm ơn tập thể cán bộ bộ phòng Sinh học

Viện Kinh tế Kỹ thuật Thuốc lá Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ

Sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, những người thân trong gia

ñình và bạn bè ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi thực hiện ñề tài và hoàn thành bản

luận văn tốt nghiệp

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Hảo

MỤC LỤC

2.2 Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài 9

2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới 222.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước 23

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1.2 Hoá chất, thiết bị 25

3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens

3.3.3 Phương pháp chuyển gen vào thuốc lá thông qua A tumefaciens

4.1.2 PCR nhân ñoạn gen vip3A và tinh sạch sản phẩm PCR 39

4.1.4 Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α 40

4.2.1 Biến nạp vector mang gen vip3A vào tế bào A tumerfaciens

GM Kan 30 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 30mg/l

GM Kan 50 Môi trường tái sinh chồi chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l

GM Môi trường tái sinh chồi

gus β - Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase IBA Indole-3-butyric acid

LB Môi trường theo Luria và Bertani LSD Least significant difference = sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

OD Optical density = mật ñộ quang học PCR Polymerase Chain Reaction = phản ứng chuỗi polymerase

RM Kan 50 Môi trường ra rễ chứa kanamycin nồng ñộ 50mg/l

TAE Tris bazơ - Axit acetic – EDTA T-DNA Transfer - DNA = ñoạn DNA ñược chuyển

DANH MỤC BẢNG

2.1 Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới

2.2 Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008 9

4.1 Trình tự và những thông số liên quan của cặp mồi nhân gen vip3A 38

4.2 Tỷ lệ tái sinh/sống sót của các mẫu qua các giai ñoạn 49

DANH MỤC HÌNH

4.1 Kết quả ñiện di tinh sạch sản phẩm PCR nhân gen vip3A 39

4.2 Kết quả biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli

4.5 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR từ 14 dòng khuẩn lạc cặp mồi ñặc

4.6 Kết quả ñiện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ

4.7 Vi khuẩn A.tumerfaciens/ C58 /vip3A trên môi truờng LB ñặc

4.20 Cây trong bầu trấu cát 53

4.22a Kết quả ñiện di sản phẩm PCR của 16 dòng thuốc lá với cặp

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị

kinh tế cao Sản phẩm thu hoạch là lá tươi, phải thông qua giai ñoạn chế biến ñặc trưng (sấy, hong, phơi…) mới có thể dùng lá làm nguyên liệu sản xuất thuốc lá Ngoài ra cây thuốc lá cũng ñược sử dụng làm nguyên liệu sản xuất nicotin, dùng làm chế phẩm trừ sâu, axit hữu cơ, hạt dùng ñể chiết xuất dầu thực vật

Nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá theo các hướng khác nhau ñược quan tâm ở các quốc gia lớn như Mỹ, Brazil, Trung Quốc, Zimbawe…Một trong những hướng chọn tạo giống ñược quan tâm hiện nay là ứng dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại chính như kháng các bệnh virus khảm lá thuốc lá (TMV,CMV), virus xoăn lá thuốc lá (TLCV) hoặc kháng sâu (sâu xanh, sâu xám ) Ngoài khuynh hướng tạo tính kháng sâu của

cây bằng gen cry mã hóa cho sự tạo nội ñộc tố δ trong pha sinh bào tử của vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt), gần ñây các nhà khoa học ñã phát hiện các gen vip (vegetative insecticidal protein - các protein sinh dưỡng diệt côn trùng)

mã hóa cho các protein trong pha dinh dưỡng của chu trình phát triển vi khuẩn

Bt và Bacillus cereus (Bc), chiết tách, nhân bản, xác ñịnh trình tự và thử hoạt tính sinh học Kết quả cho thấy các protein Vip có hoạt lực và phổ tác dụng diệt côn trùng cao hơn rất nhiều lần các protein do gen cry mã hóa Gen vip3 tạo protein có hoạt tính kháng sâu xám cao gấp 260 lần so với protein cry IA và có

phổ hoạt ñộng rộng như diệt ñược sâu xanh hại ngô, sâu xanh hại thuốc lá [12]

Ở Việt Nam, cây thuốc lá là một trong những cây công nghiệp ngắn ngày

có giá trị kinh tế cao [7] Vấn ñề sâu bệnh hại trong sản xuất là một trong những nguyên nhân gây giảm năng suất và chất lượng của nguyên liệu, do vậy ứng

dụng công nghệ biến ñổi di truyền ñể chọn tạo giống kháng sâu bệnh hại là một

trong những hướng ñi ñể giải quyết vấn ñề ñó

Viện Công nghệ Sinh học ñã bước ñầu chuyển thành công gen kháng

bệnh vào cây thuốc lá (kháng bệnh khảm lá thuốc lá TMV, khảm lá dưa chuột

CMV)… [2] nhưng chưa có nghiên cứu nào ñược công bố về sử dụng gen vip3A

trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng sâu

Trên cơ sở ñó chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu tạo cây

thuốc lá chuyển gen kháng sâu vip3A”

1.2 Mục ñích và yêu cầu

1.2.1 Mục tiêu của ñề tài:

Tạo ra cây thuốc lá chuyển gen mang gen kháng sâu (vip3A)

1.2.2 Nội dung nghiên cứu:

- Thiết kế vector chuyển gen mang gen vip3A

- Chuyển gen vip3A vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn A tumerfaciens

- Theo dõi, kiểm tra và ñánh giá các dòng thuốc lá chuyển gen

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây thuốc lá

Thuốc lá (Nicotiana tabacum L) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có

tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trường thế giới không chỉ ñối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn ñiếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu ñến cả

hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tư nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá như phân bón, thuốc bảo vệ thực vật [16], [20] Với tổng diện tích trồng trọt khoảng 4,0 - 5,5 triệu ha trải khắp từ

60o vĩ Bắc ñến 40o vĩ Nam và tổng sản lượng nguyên liệu thu ñược khoảng 6,5 - 8,5 triệu tấn (trong ñó khoảng 3,5 - 4,5 triệu tấn thuốc lá vàng; khoảng 0,6 - 1,0 triệu tấn thuốc lá burley; trên 0,5 triệu tấn thuốc lá oriental; còn lại là các loại khác ñể sản xuất khoảng 6.000 tỷ ñiếu hàng năm [22], [47] Theo Reed S M [41] thì cây thuốc lá ñược phân loại thuộc giới thực vật, phụ giới có phôi, ngành có mạch dẫn, phụ ngành dương, lớp thực vật hạt kín, lớp phụ 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà Họ này có tới trên 85 chi với tổng số trên 1.800 loài Một số loài trong họ này ñược trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt, các loại cà và trong ñó có chi Nicotiana ðặc trưng của các loài trong họ này là trong thân và quả thường chứa alcaloid như solanin, atropin, scopalamin, nicotine

Chi Nicotiana ñược chia làm 3 chi phụ, 14 nhóm với tổng số tới 66

loài trong ñó 45 loài có nguồn gốc ở Bắc và Nam Mỹ, 20 loài ở Australia và 1

loài ở Châu Phi Phần lớn những loài này là cây thân bụi hàng năm, một số là cây lâu năm và 2 loài là cây bụi thân gỗ Trong số 66 loài thuốc lá, có 2 loài chưa tìm thấy ở dạng hoang dại nhưng lại ñược trồng phổ biến làm thuốc lá là

Nicotiana tabacum (N tabacum) và N rustica

Lồi N tabacum cĩ số lượng nhiễm sắc thể lưỡng lưỡng bội

(Dihaploid = 4n), cĩ biến động lớn về kích thước lá, dạng ngọn lá, gĩc đĩng

lá so với thân, kiểu tai cuống lá, mầu sắc lá Hoa tự chùm lưỡng tính mọc

trên đỉnh sinh trưởng, hoa dài khoảng 5 cm, cĩ 5 cánh với mầu từ hồng đến

đỏ (N tabacum) hay màu vàng đến vàng hơi xanh (N rustica) Hoa thường

tự thụ phấn trước khi nở và tỷ lệ tự thụ phấn đến 95% Mỗi cây cĩ thể cho

200 - 400 quả và mỗi quả cĩ khả năng cho khoảng 2000 - 4000 hạt Trong

hạt chứa 32 - 42% dầu (Chủ yếu là Linoleic acid và Oleic acid), 20 - 30%

protein Trong 1 gam hạt cĩ từ 10.000 - 15.000 hạt và hạt cĩ khả năng sống

rất lâu [16], [20], [22]

2.1.1 Lịch sử hình thành - phát triển thuốc lá

Trong lịch sử, cây thuốc lá được trồng đầu tiên ở châu Mỹ từ hơn

6000 năm trước cơng nguyên và được sử dụng trong các nghi lễ tơn giáo, làm

thuốc chữa bệnh [16], [22]

Thuốc lá là lồi cây trồng cĩ nguồn gốc Nhiệt đới và Á nhiệt đới,

hương vị đặc biệt của nĩ đã được biết đến ở vùng Trung Mỹ cĩ lẽ cách đây

trên hai nghìn năm và trở nên phổ biến từ thế kỷ 15 [16], [20]

Sử viết về cây thuốc lá bắt đầu vào ngày 12 tháng 10 năm 1492, khi

Christopher Columbus đặt chân lên bãi biển San Salvado ở Tây Ấn ðộ Dương

Các thổ dân ở đĩ đã mang tới hoa quả và cả những nắm lá khơ cho mùi thơm

quyến rũ khi chúng được châm hút để mời đồn thám hiểm [16], [20]

Người Tây Ban Nha bắt đầu trồng thuốc lá ở Haiti vào năm 1531 với

nguồn hạt giống từ Mexico và sau đĩ việc trồng thuốc lá lan rộng tới các hịn

đảo lân cận khác Trồng trọt thuốc lá bắt đầu ở Cu Ba vào năm 1580, sau đĩ

phát triển sang Guiana, Brazil [20] và dần dần phát triển trên các châu lục khác

Một số tài liệu đáng tin cậy cho rằng thuốc lá được trồng từ thời vua Lê

Thần Tơng (1660) bằng nguồn hạt giống của các thương nhân Tây Ban Nha

Năm 1876, nghề trồng thuốc lá ở Việt Nam chính thức khởi sự tại Gia ðịnh, tiếp theo là Tuyên Quang (1899) và thuốc lá điếu bắt đầu được sản xuất tại Hà Nội cùng thời gian này Năm 1935, giống thuốc lá vàng sấy Blond cash đầu tiên được du nhập và trồng thử ở An Khê, đến năm 1940 trồng thử ở Tuyên Quang, Ninh Bình [22]

2.1.2 Các đặc điểm thực vật học cây thuốc lá

2.1.2.1 Rễ thuốc lá

Rễ thuốc lá là một hệ thống bao gồm: rễ cái (rễ trụ), rễ nhánh (rễ bên)

và rễ hấp thu Ngồi ra, thuốc lá cịn cĩ rễ bất định mọc ở cổ rễ, phần trên sát mặt đất Rễ trụ được hình thành từ phơi rễ Rễ nhánh được phát sinh từ trục của rễ cái, thường cĩ độ xiên 30 - 40o Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh, cĩ nhiệm vụ cung cấp nước và dinh dưỡng cho cây Rễ bất định mọc

từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi độ ẩm khơng khí cao Rễ thuốc lá tập trung dày đặc ở lớp đất 0 - 30 cm, phát triển theo các hướng Rễ thuốc lá là cơ quan sinh tổng hợp nicotin Nicotin được vận chuyển từ rễ và tích tụ trên thân, lá thuốc lá

2.1.2.2 Thân cây

Các dạng thuốc lá trồng cĩ dạng thân đứng, tiết diện thân trịn, chiều cao thân cây cĩ thể đạt từ 1 - 3 m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá ðường kính thân đạt 2 - 4 cm, nách lá trên thân cĩ chồi sinh trưởng gọi là chồi nách Cĩ 2 loại chồi nách: chồi nách chính và chồi nách phụ

2.1.2.3 Lá thuốc lá

Trên thân chính của cây thuốc lá cĩ nhiều lá Số lượng lá trên cây thay đổi tuỳ theo giống Lá thuốc lá cĩ các hình dạng chủ yếu là: Hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác ðộ dày, màu sắc lá cĩ thể thay đổi

Lớp ngồi của biểu bì cĩ tầng cutin trong suốt và cĩ lớp phấn sáp khi lá bắt đầu chín kỹ thuật Lớp tế bào mơ dậu và tế bào mơ khuyết trong cấu trúc

lá quyết ñịnh ñộ dày mỏng, ñộ ñàn hồi của lá thuốc Ở trên mặt lá còn có

nhiều tuyến lông ña bào, có hình dạng và kích thước khác nhau Các tuyến

này chứa nhựa, hợp chất thơm tự nhiên và tích luỹ nhiều khi lá chín kỹ thuật

Trên mặt lá có gân chính và nhiều gân phụ

2.1.2.4 Hoa

Hoa thuốc lá là hoa ñơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung

quanh có 5 nhị ñực thường mọc cao hơn nhị cái, thuộc loại hoa tự hữu hạn,

ñược hình thành do sự phân hoá của ñỉnh sinh trưởng thân Chính giữa chùm

hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa

Phương thức thụ phấn của thuốc lá là tự phối (97 - 98%), còn lại có thể

do thụ phấn chéo do gió hoặc côn trùng,

2.1.2.5 Quả và hạt

Quả thuốc lá ñược hình thành trên ñài hoa Mỗi cây có 100 - 150 quả

trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 - 500 quả trên

chùm hoa Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra

Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng

sấy lò là 0,07 - 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10.000 ñến 15.000 hạt [14]

2.1.3 Tình hình sâu bệnh hại

Cây thuốc lá bị các loại bệnh hại chính là bệnh khảm lá thuốc lá do

virus (TMV,CMV), bệnh xoăn lá thuốc lá do virus (TLCV), bệnh héo rũ vi

khuẩn , ñen thân, héo ñốm cà chua

Các loại sâu chính gây hại trên thuốc lá là sâu xanh (Helicoverpa

assulta), sâu khoang (Prodenia litura ) , sâu xám (Agrotis ypsilon )

Ở Việt Nam, tuy chưa có số liệu chính xác nhưng nhiều chuyên gia cho

rằng thiệt hại do bệnh và sâu ñối với thuốc lá khoảng 25 - 30% Nếu sản

lượng hàng năm là 30.000 tấn với giá bình quân 12.000 ñ/kg thì sâu bệnh hại

ñã lấy ñi mất khoảng 100 tỷ ñồng/năm và mỗi phần trăm thu lại ñược từ phần

thiệt hại này trị giá hàng tỷ ñồng [9]

2.1.5 Giá trị của cây thuốc lá

Thuốc lá là cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao Sản phẩm chính là lá thuốc lá, sử dụng làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thuốc lá trên toàn thế giới Ngoài ra thuốc lá còn ñược sử dụng vào một số mục ñích khác như:

- Trồng nhóm Nicotiana rustica ñể chiết xuất từ lá hàm lượng nicotin từ

4 - 5 % ñể sản xuất thuốc trừ sâu Sulfat nicotin

- Từ thân và lá thuốc lá chiết xuất ñược sclareol và 13 epi - sclareol chống bệnh gỉ sắt cây họ ñậu

- Từ lá thuốc lá chiết xuất axit nicotineic dùng cho công nghiệp dược phẩm

- Hạt thuốc lá chiết xuất 34 - 40% dầu phục vụ trong công nghiệp, sử dụng trong thực phẩm

- Thân chế tạo các loại giấy có chất lượng cao

- Hoa chiết xuất tinh dầu sản xuất nước hoa thuốc lá

- Một số phát hiện mới hiện nay, các nhà nghiên cứu ñã kết luận thuốc

lá giàu protein, hydratcacbon, chất béo và vitamin

- Protit thuốc lá chứa nhiều axit amin quan trọng, tính chất bổ dưỡng vượt cả Phomat Protein trong sữa [5]

2.1.6 Tình hình sản xuất thuốc lá nguyên liệu 2.1.6.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá nguyên liệu của thế giới

Thuốc lá nguyên liệu tham gia thương mại trên thế giới chủ yếu ñược sản xuất ở các vùng từ 45o vĩ Bắc ñến 30o vĩ Nam Diện tích trồng thuốc lá trên thế giới trong những năm gần ñây luôn duy trì ở mức khoảng 3,5 triệu ha [55] Trong tổng sản lượng thuốc lá nguyên liệu trên 5 triệu tấn ñược sản xuất hàng năm, thuốc lá vàng sấy lò chiếm trên 60%, thuốc lá burley khoảng 15%, thuốc lá oriental gần 10% và một số chủng loại khác [48]

Bảng 2.1 Sản lượng các dạng thuốc lá nguyên liệu chủ yếu của thế giới

Nguồn: USDA (Tobacco World Markets and Trade june – 2008) [48]

Số liệu ở bảng 2.1 cho thấy sản lượng các dạng thuốc lá chính của thế

giới những năm qua tương ñối ổn ñịnh, mặc dù ngành công nghiệp thuốc lá ở

các nước chịu nhiều áp lực

2.1.6.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ thuốc lá lá ở Việt Nam

Hiện nay, thuốc lá ñược trồng ở nhiều ñịa phương trong cả nước (27/64

tỉnh, thành phố) [7] với 3 chủng loại thuốc lá vàng sấy, nâu và burley trong ñó

thuốc lá vàng sấy là loại nguyên liệu ñược trồng nhiều nhất ở nước ta hiện nay

chiếm tỷ trọng ñến 90% sản lượng thuốc lá nguyên liệu sản xuất nội ñịa

Các ñịa phương trồng thuốc lá vàng sấy chủ yếu hiện nay là Cao Bằng,

Lạng Sơn, BắcKạn, Gia Lai, ðắklăk, Tây Ninh, Ninh Thuận, Phú Yên Tổng

diện tích trồng thuốc lá vàng sấy trên cả nước hiện dao ñộng ở khoảng 14 - 16

ngàn ha với sản lượng hàng năm ước ñạt từ 22 - 26 ngàn tấn Tại khu vực

phía Bắc, năng suất ñạt 1,5 - 1,8 tấn/ha Năng suất bình quân tại các tỉnh phía

Nam hiện nay ñạt khoảng 1,8 - 2 tấn/ha [9], [15]

Bảng 2.2 Tình hình sản xuất TLNL vàng sấy của Việt Nam 2006 – 2008

I Phía Bắc 5.875 8.912 1,52 5.615 8.737 1,56 7.066 11.144 1,58

II Phía Nam 9.683 17.184 1,77 7.564 13.725 1,81 6.165 11.229 1,82 Tổng /TB 15.558 26.096 1,68 13.18 22.462 1,70 13.23 22.373 1,69

Nguồn tài liệu: Tổng công ty thuốc lá Việt Nam [15]

Ghi chú: DT: diện tích (ha); SL: sản lượng (tấn); NS: năng suất (tấn/ha)

Số liệu bảng trên cho thấy sản lượng thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước trong những năm qua tương ñối ổn ñịnh Theo ñánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy của nước ta hiện nay có chất lượng tương ñối tốt, có thể thay thế ñược nguyên liệu Trung Quốc Vì vậy việc phát triển sản xuất thuốc lá nguyên liệu vàng sấy trong nước phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng nội ñịa

là một việc làm cần thiết trong giai ñoạn hiện nay Nó vừa giúp cho ngành sản xuất thuốc lá trong nước chủ ñộng ñược nguồn nguyên liệu ñầu vào vừa tạo công

ăn việc làm cho một bộ phận ñông ñảo bà con nông dân, tăng nguồn thu ngân sách và tiết kiệm ñược nguồn ngoại tệ cho nhà nước

2.2 Chuyển gen ở thực vật - cơ sở khoa học của dề tài

2.2.1 Khái niệm chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa một hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết

kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật, ) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen [3], [12]

Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng ñịnh tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hoá cho các tính

trạng nhất ñịnh, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền Thông

qua chuyển gen, các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền có thể nghiên cứu các

quá trình ñiều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại

cảnh lên hoạt ñộng của gen

2.2.2 Các phương pháp chuyển gen cho cây trồng

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân loại

thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen gián tiếp và

phương pháp chuyển gen trực tiếp

2.2.2.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

- Phương pháp chuyển gen nhờ kỹ thuật xung ñiện

- Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm

- Phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn

- Chuyển gen nhờ súng bắn gen

- Chuyển gen nhờ silicon carbide

2.2.2.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ virus

- Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñược nghiên cứu từ những

năm 1960 - 1970 Việc phát kiến ra Agobacterium tumefaciens

(A.tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm

1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của

Công nghệ sinh học (CNSH) thực vật với những ưu ñiểm nổi trội: số bản sao

của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1 - 2 gen,

trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn), do vậy, giảm tối thiểu sự không

biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả

chuyển gen cao; tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm; kỹ

thuật ñơn giản, dễ thực hiện; không ñòi hỏi thiết bị ñắt tiền [13]

Phương pháp này ñã khắc phục ñược những hạn chế chủ yếu của các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: thường thu nhận ñược cây trồng có nhiều bản sao của một gen dẫn tới sự “nhiễu gen” và không bền vững của gen trong thực vật, tần số chuyển gen thấp, kết quả có thể thu ñược những cây mang thể khảm nghĩa là chỉ mang gen ở một số vị trí trên cây

ðặc biệt là khi nhược ñiểm của A tumerfaciens chỉ chuyển gen trên cây hai lá mầm ñược khắc phục, việc chuyển gen vào cây một lá mầm trở thành hiện thực và ñược ứng dụng thành công thì phương pháp chuyển gen nhờ vi

khuẩn Agrobacterium ngày càng gây ñược sự quan tâm và dần trở thành một

phương pháp chuyển gen ñược ưu tiên lựa chọn của các nhà khoa học và các nhà chọn tạo giống trên thế giới

* ðặc ñiểm chung của vi khuẩn A tumefaciens

Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương

Trong chi Agrobacterium thì A tumerfaciens ñược sử dụng nhiều nhất

cho việc chuyển gen

Phân loại khoa học:

(Smith & Townsend, 1907) [52]

A tumerfaciens có khả năng chèn gen của mình vào thực vật và sau ñó sử

dụng bộ máy thực vật ñể biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng

cho chúng A tumerfaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần ñiểm tiếp nối giữa

rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây - crown gall disease), khi

ñó các tế bào khối u ở thực vật có gắn một ñoạn DNA từ vi khuẩn Khi phân

tích khối u cho thấy trong khối u có sự hình thành một số vật chất mới như:

nopaline, octopine goi chung là opine Các chất này không hề có trước ñó và

không hề có ở cây trồng thông thường Như vậy vi khuẩn ñã truyền vào cây

qua vết thương một tác nhân gây bệnh cho cây và tác nhân này có bản chất là

vật chất di truyền

Hình 2.1 Cấu trúc Ti- Plasmit

(nguồn : http://www.biotech.ubc)

Qua nghiên cứu người ta kết luận rằng tác nhân gây u này chính là

Ti-plasmit có trong vi khuẩn A tumerfaciens Ti-Ti-plasmit này có ñặc ñiểm chung

như sau:

Ti-plasmit là một plasmit ñược cấu tạo bao gồm một phân tử DNA kép,

vòng tròn lớn có kích thước 200 kb, có khả năng tái bản ñộc lập với sự tái bản

của DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn

Trên Ti-plasmit có ñoạn T-DNA ñược giới hạn bằng bờ phải (right border ) và bờ trái (left border) có trình tự nucleotid tương tự nhau T-DNA là

ñoạn nucleotit có kích thước 25 kb và mang hai loại gen: loại gen gây ung thư (oncogenic gene), loại này mã hoá cho một enzyme liên quan tới tổng hợp các auxin, cytokinin và hình thành khối u; loại thứ hai liên quan tới tổng hợp opine ðoạn này ñược gọi là T-DNA (Tumor DNA) vì ñây là ñoạn sẽ ñược chuyển vào tế bào thực vật gắn vào bộ NST và gây ra bệnh u Trên Ti-plasmit

còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm hoạt ñộng lây nhiễm, chuyển

nạp và tiêu hoá opine [13]

Khi cây nhiễm bệnh, do T-DNA nạp vào trong bộ gen của cây chủ bắt ñầu hoạt ñộng và sản sinh ra auxin, cytokinin và opine, toàn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vô tổ chức và tạo ra các khối u Opine ñược vi khuẩn sử dụng như một loại thức ăn, nhờ gen chuyển hoá opine trên Ti-plasmit

Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn:

Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất ñộc vết thương có bản chất

phenol: acetosyringon và hydroxyacetosyringon Các chất này sẽ thu hút vi

khuẩn tập trung vào vùng bị thương ñồng thời chúng hoạt hoá các gen ở vùng

vir là E, D, C, G, B, A, F và tạo ra các protein tương ứng Các protein này có hai chức năng chính: cắt ñứt bờ phải và bờ trái ñể giải phóng ñoạn T-DNA, bao bọc và vận chuyển ñoạn T-DNA vào tế bào thực vật và tiếp cận với genom cây chủ

Quá trình chuyển T-DNA từ vi khuẩn A tumerfaciens sang tế bào cây chủ ñược thực hiện bởi hoạt ñộng của các gen vir A, B, C, D, E, G, F Các

gen này có vai trò quan trọng trong việc nhận diện ra vết thương của cây

thông qua tín hiệu hoá học acetosyringon (AS) Tín hiệu hoá học ñược nhận biết ñầu tiên bởi vir A Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong

màng tế bào ñể ñáp ứng sự trao ñổi chất của vết thương trên cây Protein Vir

A tự photphoryl hoá ñồng thời làm cho protein Vir G ñược photphoryl hoá

(Jin và CS 2001) và kích hoạt sao mã của các gen vir B, C, E, F, G, H

(Ziemienowcz 2001)

Hình 2.2 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium

(1) Agrobacterium nhận dạng và tấn công tế bào chủ;(2) Tổ hợp tín hiệu VirA/VirG của

Agrobacterium cảm nhận những tín hiệu thực vật ñặc trưng;(3) Sự hoạt hoá của vùng gen

phức hợp-T thành thục ñi xuyên qua nguyên sinh chất tế bào chủ; (7) Phức hợp-T thành

thục chủ ñộng ñi vào nhân tế bào chủ; (8) DNA bị hấp dẫn tới vị trí hợp nhất; (9)

T-DNA tách khỏi các protein bảo vệ; (10) T-T-DNA hợp nhất vào bộ gen chủ

Tiếp ñó các protein ñược mã hoá bởi vir D, vir E thực hiện chức năng

giải phóng sợi T-DNA Protein D2 cắt T-DNA tại vị trí 5’ của bờ phải và 3’

của bờ trái và giải phóng sợi T-DNA Protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân

giải của enzyme nuclease trong cây (Deng và cs 1998) ðồng thời thực hiện

chức năng này có các protein Vir C1, Vir C 2 có tác dụng tăng cường việc giải

phóng T-DNA

Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B ñảm nhiệm Vir B có

chức năng tạo kênh xuyên qua màng tế bào giúp chuyển sợi ñơn T-DNA vào

nhân tế bào ðồng thời protein Vir B4, Vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp

năng lượng cho vận chuyển T-DNA (Zhu và cs 2000)

Như vậy, thực chất ñã có một hệ thống chuyển gen của vi khuẩn ñất vào cây trồng tồn tại trong tự nhiên

Dựa vào cơ chế này con người lợi dụng vi khuẩn ñất ñể chuyển các gen mong muốn cho mình trên cơ sở thiết kế lại hệ thống Ti-plasmit của vi khuẩn sao cho vẫn ñảm bảo ñược chức năng chuyển gen nhưng không mang các gen gây ñộc cho cây

Người ta ñã tạo ra các dạng vector mới ñể chuyển gen là những vector liên hợp (co-intergrate vector) và vector nhị thể (binary vector) [3], [4]

Hệ thống vector liên hợp (co-integrate vector) là kết quả của sự liên hợp hai loại plasmit: Ti-plasmit ñã loại trừ vùng gen gây khối u và gen tạo các hợp chất

opine nhưng vẫn giữ lại vùng vir và vùng bờ trái, bờ phải Thay vào những gen

bị cắt bỏ là ñoạn tương ñồng với một ñoạn trên plasmit thứ hai (plasmit trung gian) ñể phục vụ cho việc liên hợp hai loại plasmit Plasmit trung gian là một

plasmit tách dòng từ vi khuẩn E.coli và có thể tái sinh ñược ở Agrobacterium

Plasmit này có chứa vùng gắn gen cần chuyển nạp, các gen chỉ thị phục vụ việc chọn lọc và có mặt ñoạn tương ñồng Khi cho tương tác hai loại plasmit này với nhau chúng sẽ liên hợp qua sự trao ñổi chéo giữa hai ñoạn tương ñồng và hình

thành nên vector liên hợp Vector liên hợp này nằm trong vi khuẩn A tumefaciens và hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen thông thường của vi khuẩn ñất Do tần số ñưa plasmit trung gian từ E.coli sang Agrobacterium rất thấp (10-

7-10-5) nên vector này ít ñược sử dụng (John Draper, 1882)

Hệ thống vector nhị thể khác với vector liên hợp là chúng có hai vector

(plasmit) cùng có mặt và hoạt ñộng trong Agrobacterium Một plasmit tách

dòng từ E.coli trong ñó có thiết kế vùng bờ trái và bờ phải, nằm giữa chúng là

các gen chỉ thị và vùng gắn gen cần chuyển Plasmit thứ hai là Ti-plasmit cải

tiến: toàn bộ vùng T-DNA và vùng bờ trái và bờ phải bị cắt bỏ chỉ giữ lại

vùng vir, plasmit này ñược gọi là plasmit hỗ trợ Hệ thống vector này cũng

hoạt ñộng theo cơ chế chuyển gen của vi khuẩn ñất Agrobacterium một cách

rất hữu hiệu (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005) [12]

Thiết kế vector

Các nghiên cứu về vi khuẩn Agrobacterium và khả năng tự nhiên của

chúng trong việc biến ñổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm

ñã giúp các nhà khoa học thiết kế ñược những phân tử giúp chuyển gen mong

muốn vào tế bào thực vật: T-DNA ñược giới hạn hai ñầu bởi vùng biên

(T-DNA borders), phần còn lại trong vùng biên sẽ không có chức năng gì trong

quá trình chuyển gen Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA

bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong hai ñầu vùng biên

bằng các gen mong muốn Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực

vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho

cây hữu thụ Quá trình tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây làm

ảnh hưởng ñến năng suất cuối cùng nên trong quá trình thiết kế cũng loại bỏ

các gen tổng hợp opine Ti-plasmit có kích thước lớn (200 - 800 kb) nên

những ñoạn DNA không cần thiết cũng phải ñược cắt bỏ ñể chèn vào ñoạn

DNA mục tiêu Ngoài ra, Ti-plasmit không tự tái bản trong E.coli nên cần

ñược bổ sung thêm gốc tái bản của E.coli Cuối cùng, cần bổ sung các gen chỉ

thị ñể chọn lọc cây và vi khuẩn

Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này ñược gọi chung là các vector

Như vậy, cấu trúc của một vector chuyển gen bao gồm:

* Có gốc tái bản (ORI) có nguồn gốc từ vi khuẩn

* Vùng khởi ñộng (promoter) có nguồn gốc từ thực vật

* Vùng kết thúc (terminator)

* Vùng gắn gen chuyển vào (MCS)

* Vùng chứa gen chọn lọc (ñể tách các tế bào chuyển gen)

* Vùng chứa các gen báo cáo ñể biết ñược các gen chuyển vào có thành

công không (gus, gfp - gen phát huỳnh quang)

Quy trình nghiên cứu tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens như sau:

Bước 1: Thiết kế vector mang gen

Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli

Bước 3: Chuyển vector tái tổ hợp vào A tumerfacien

Bước 4: Lây nhiễm A tumerfaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô

thực vật ñể tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào ñích

Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào ñược biến nạp thành công

Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh

Sau ñó, từ những cây chuyển gen thu ñược cần ñánh giá sự ổn ñịnh di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính ñể thu ñược con cái mang gen mong muốn ðồng thời ñánh giá tác ñộng của cây chuyển gen ñể ñưa ra sản xuất và cung cấp cho thị trường [13]

Sàng lọc cây sau chuyển gen:

ðể tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang gen ñược chuyển vào, thông thường trong các nghiên cứu ñều sử dụng môi trường nuôi cấy có bổ sung những chất mà chỉ có tế bào có tính trạng chọn lọc nhất ñịnh mới có thể sinh trưởng ñược, ñó là những gen kháng kháng sinh Các kháng sinh ñược sử dung phổ biến ñể chọn lọc các thể biến nạp plasmit tái tổ hợp là ampicilin, chloramphenicol, gentamixin, kanamycin, rifamicin, spectinomycin, tetracycline Ở hệ biêu hiện là nấm thì gen chỉ thị chọn lọc dựa vào nguồn dinh dưỡng là LEU2, TRP1, URA3, HIS3

2.2.2.3 Những thành tựu trong nghiên cứu tạo cây chuyển gen trên thế giới

Công nghệ sinh học phát triển ñã tạo ñiều kiện ñể các nhà khoa học tiếp

tục nghiên cứu chọn tạo giống kháng sâu bằng cách chuyển gen mã hoá các

ñặc tính mong muốn vào cây trồng

Năm 1980, những thí nghiệm chuyển gen ñầu tiên nhờ vi khuẩn A

tumefaciens vào cây trồng ñầu tiên ñược thực hiện Năm 1986, các thử

nghiệm ñầu tiên trồng cây biến ñổi gen trên ñồng ruộng ở một số quốc gia

Năm 1990, chuyển gen bất dục ñực cho ngô bằng súng bắn gen và thực phẩm

biến ñổi gen ñược chấp thuận ở Mỹ lần ñầu tiên Năm 1994, giống cà chua

Flavor Saver mang gen chín chậm, là sản phẩm cây trồng chuyển gen ñầu tiên

ñược thương mại hoá Năm 1998, lần ñầu thành công việc chuyển ñồng thời

10 gen vào một cây Toàn cầu có 48 giống cây chuyển gen ñược phép thương

mại hoá (trong ñó Mỹ có 35 giống) [38] Năm 1999, chuyển gen cho lúa có

giá trị dinh dưỡng cao hơn Diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu lớn

hơn 40 triệu ha [11] Năm 2006 ñược ghi nhận là năm ñầu tiên của thập niên

thứ hai của việc thương mại hóa cây trồng chuyển gen 2006 - 2015 Năm

2006, diện tích toàn cầu cây trồng chuyển gen tiếp tục tăng cao vượt ngưỡng

100 triệu ha (250 triệu mẫu Anh), khi lần ñầu tiên hơn 10 triệu nông dân (10,3

triệu) tại 22 nước canh tác cây chuyển gen, cao hơn so với 90 triệu ha và 8,5

triệu nông dân tại 21 nước năm 2005 Tỷ lệ chấp nhận cao chưa từng thấy là

minh chứng cho sự thật và sự tin tưởng của hàng triệu nông dân nhỏ và lớn

vào cây trồng chuyển gen ở các nước công nghiệp và ñang phát triển [51]

Năm 2007, Hoa Kỳ, Ac-hen-ti-na, Brazil, Canada, Ấn ðộ và Trung

Quốc tiếp tục là những nước trồng cây công nghệ sinh học (CNSH) chủ yếu

trên thế giới Hoa Kỳ là nước có diện tích canh tác cây trồng cây CNSH dẫn

ñầu thế giới, tuy nhiên tỉ lệ diện tích ñất trồng cây CNSH của Hoa Kỳ so với

toàn cầu ñang giảm do diện tích canh tác cây trồng CNSH trên toàn cầu ngày

một mở rộng [51]

Tám nước dẫn ñầu trồng hơn 1 triệu ha, sắp xếp theo diện tích giảm dần

là Hoa Kỳ (62,5 triệu ha), Ac-hen-ti-na (21 triệu ha), Brazil (15,8 triệu ha),

Ấn ðộ (7,6 triệu ha), Canada (7,6 triệu ha), Trung Quốc (3,8 triệu ha), Paraguay (2,7 triệu ha) và Nam Phi (1,8 triệu ha)

ðậu tương CNSH là giống cây chính ñược trồng trong năm 2008 với diện tích 65,8 triệu ha, chiếm 53% diện tích ñất trồng cây CNSH trên toàn cầu, tiếp theo là ngô CNSH (37,3 triệu ha, chiếm 30%), bông CNSH (15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm 5% diện tích ñất trồng cây CNSH trên toàn cầu)

Hiện nay ñã có 25 quốc gia cho phép trồng cây CNSH và 30 quốc gia khác ñã cho phép nhập khẩu các sản phẩm CNSH sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi, ñưa tổng số nước phê chuẩn cây trồng cây CNSH lên 55 nước Diện tích trồng tăng 74 lần từ năm 1996 ñến nay ñã khiến cây CNSH nhanh chóng trở thành công nghệ cây trồng ñược ứng dụng nhanh nhất Trị giá toàn cầu của thị trường cây trồng sinh học trong năm 2008 là 7,5

tỷ USD với tổng giá trị tích luỹ ñạt 50 tỷ USD từ năm 1996 ñến 2008 [51]

2.3 Giới thiệu chung về Bacillus thuringiensis (Bt)

2.3.1 Lịch sử phát hiện ñộc tố Bacillus thuringiensis

Shigetane Isiwata, nhà sinh học người Nhật Bản ñã phát hiện ra vi khuẩn này năm 1901 từ ấu trùng tằm bị bệnh

Sau ñó, Ernst Berliner (1911) ñã phân lập vi khuẩn này từ ấu trùng

Ephetia kuniella bị bệnh và ñặt tên là Bacillus thuringiensis (Bt), (vi khuẩn

ñất ñiển hình ñược phân lập ở vùng Thuringia, ðức)

ðến năm 1915, Berliner ñã phát hiện sự có mặt của tinh thể trong Bt

nhưng hoạt tính của chúng chưa ñược xác ñịnh

Bảng phân loại Bt: [56]

Bt là vi khuẩn ựược phân lập từ ựất, có khả năng sinh ra các protein thể

vùi dạng tinh thể trong quá trình sinh bào tử Sau ựó ựến những năm của thập

kỷ 50, các nhà khoa học mới phát hiện ra cấu trúc tinh thể của các ựộc tố gây

tê liệt bộ máy tiêu hoá của côn trùng (Steinhaus, E.A, 1951) [44]

Hannay (1953) [31] ựã phát hiện ra cấu trúc của các tinh thể gây ựộc

cho côn trùng và ựặt tên là nội ựộc tố δ Một số loài vi khuẩn khác cũng có

khả năng sinh ra các nội ựộc tố gây chết các loại côn trùng thuộc bộ cánh vảy,

cánh cứng và bộ hai cánh Chúng ựược sử dụng ựể sản xuất thuốc trừ sâu sinh

học trong suốt 40 thập kỷ qua (Lambert và Peferoen, 1992) đã có 67 chế

phẩm Bt ựược ựăng ký với trên 450 công thức khác nhau (Shewry và

Gutteridge, 1992) [54]

Gen mã hoá nội ựộc tố ựã ựược nhân vô tắnh từ thập kỷ 80 (Schnepf và

Whitley, 1981) [43], ựược chuyển vào cây thuốc lá và cây cà chua (Barton và

cs, 1987; Vaeck và cs, 1987) ựể biểu hiện tắnh kháng côn trùng [54]

Từ ựó cho ựến nay có rất nhiều thành tựu nghiên cứu về cây chuyển

gen cũng như các ựộc tố diệt côn trùng

2.3.2 Các loại protein ựộc tố của Bt

2.3.2.1 Nội ựộc tố δ (cry) và cơ chế tác ựộng của nội ựộc tố Bt

+ Phân loại:

Do cấu trúc tinh thể tự nhiên của các protein nên chữ cry ựược sử dụng

như thuật ngữ cho các protein và gen Ban ựầu, các nhà khoa học phân ra 4 nhóm gen ựộc tố theo sự tương ựồng của trình tự gen và loài côn trùng ựặc

hiệu (Hofte H và Whiteley HR, 1989) [32] Các gen cryI mã hoá protein 130 kDa, thường ựặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) Các gen cryII mã

hoá protein 70 kDa ựặc hiệu với ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) và hai cánh

(Diptera) Các gen cryIII mã hoá protein nặng 70 kDa ựặc hiệu với ấu trùng cánh cứng (Coleoptera) Các gen cryIV ựặc hiệu với ấu trùng bộ hai cánh (Diptera) Sau ựó có thêm nhóm cryV mã hoá các protein ấu trùng cánh cứng

(Coleoptera) và ấu trùng cánh vảy (Lepidoptea) (Tailor và cs, 1992) Ngày nay các gen mã hoá cho protein nội ựộc tố (gồm 140 gen ựã ựược công bố) ựược xếp chung vào nhóm có khả năng diệt ấu trùng các bộ cánh vảy (Lepidoptea), hai cánh (Diptera) và cánh cứng (Coleoptera)

+ Cơ chế tác ựộng của nội ựộc tố Bt

Các protein dạng tinh thể sẽ hoà tan trong ruột của côn trùng có pH cao (môi trường kiềm), giải phóng ra các protein gọi là nội ựộc tố δ (Hoftey, H và Whiteley, H.R, 1989) [33]

Mục tiêu chắnh của ựộc tố Bt là ruột giữa của côn trùng (Knowels,

1994) [34], [35] Các tiền ựộc tố không hoạt ựộng cho ựến khi chúng bị hoà tan bởi các enzyme phân giải protein trong ruột côn trùng (Tojo và Aijawa, 1983; Gill và cs, 1992; Lee và cs, 1992; Milne và Kaplan, 1993) [29], [37], [39], [46] Các ựộc tố gắn vào chất nhận ựặc hiệu ở trong màng của tế bào biểu mô trụ Sau khi gắn vào chất nhận, ựộc tố sẽ chèn vào màng nguyên sinh của tế bào ựể gây tổn thương cho côn trùng Sau khi gắn với tế bào biểu mô ruột giữa, chuỗi xoắn kép có thể xâm nhập vào màng và hình thành kênh trao ựổi ion (Knowels và Dow, 1993) [34] Sự hình thành ựộc tố sẽ tạo thành các

lỗ thủng trên màng tế bào biểu mô và làm mất cân bằng trao ựổi ion nhanh chóng Sự hình thành các kênh ion này phá huỷ thế màng (English và Slatin,

1992) [23], làm hoại tử ruột giữa, thoái hoá màng và biểu mô, cuối cùng là

nhiễm trùng vi khuẩn sau khi côn trùng chết Theo Knowles và Dow (1993)

[34] ñộc tố Bt làm ngừng các kênh bơm ion K+ khiến các tế bào trụ bị trương

lên và phá huỷ tính thẩm thấu Sự ngắt quãng của toàn bộ ruột ñã làm côn

trùng chết ñói hoặc nhiễm trùng ñường tiêu hoá

2.3.2.2 ðộc tố sinh dưỡng diệt côn trùng (VIP) và cơ chế tác ñộng

+ Phân loại:

Theo Estruch và cs 1996; Warren 1997; Chen và cs 2003 [19], [24], [25],

[26], [49] thì các protein sinh dưỡng diệt côn trùng ñược chia thành 2 nhóm

chính:

Nhóm liên hợp vip1 và vip2 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh cứng

Nhóm vip3 ñặc hiệu với côn trùng bộ cánh vảy

+ Cơ chế tác ñộng của VIP

Theo Wu và cs, 1997 [50] thì protein Vip cũng hoạt ñộng trong ruột giữa

của côn trùng Chúng gắn với chất nhận ñặc hiệu và chèn vào màng ruột giữa

của côn trùng và tạo thành các kênh ion, làm mất cân bằng sự trao ñổi chất và

gây tê liệt bộ máy tiêu hóa của côn trùng (Crickmore và cs, 1998) [21]

2.4 Một số thành tựu chuyển gen vào cây thuốc lá trên thế giới

Cây thuốc lá chuyển gen kháng chất diệt cỏ ñược tiến hành tại Mỹ và

Pháp năm 1986 Cây thuốc lá là ñối tượng ñược chuyển gen kháng sâu ñầu tiên

vào năm 1987 (Barton và cs, 1987; Fischoff và cs, 1987; Vaeck và cs, 1987)

[28] Trung Quốc là quốc gia ñã thương mại hóa cây thuốc lá chuyển gen kháng

bệnh (kháng virus khảm lá thuốc lá), kháng sâu (Zhao Rong min, Yang Ying

Chang và cs, 1993) Wong và cs (1992) cũng ñã tạo ñược cây thuốc lá chuyển

gen cry1A(c) mRNA có ñộc tố cao gấp 10 - 20 lần so với cây thuốc lá chuyển

gen dùng CaMV35S promoter, hàm lượng protein ñộc tố thu ñược chiếm gần

1% lượng protein hoà tan tổng số trong lá Gen cryIII cũng ñược chuyển vào cây

thuốc lá và cây khoai tây ñể kháng sâu Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata ) (Perlak và cs, 1993) [40] Gen cry1A(b) và cry1A(c) cũng ñược

chuyển vào cây ñể phòng trừ côn trùng cánh vảy (Van der Salm và CS, 1994)

100% sâu xanh (H virescens, H zea và S exigua) chết khi ăn lá của cây thuốc lá thuốc lá ñược chuyển gen cry2Aa2 (Kota và cs, 1999) [36] Selvapandian và cs (1998) chuyển gen cry1Ia5 vào thuốc lá và cũng thể hiện tính kháng sâu xanh (H armigera ) tương ñương với gen cry1A(b) hoặc cry1A(c)

Tuy nhiên do một số yếu tố khách quan mà sản phẩm nguyên liệu thuốc lá biến ñổi gen bị hạn chế trên thế giới nên nhiều thông tin về thuốc lá chuyển gen chưa ñược ñánh giá khách quan

2.5 Tình hình nghiên cứu về cây thuốc lá chuyển gen trong nước

Chủ trương của Việt Nam là cho phép trồng cây biến ñổi gen và ñẩy mạnh việc phát triển loại thực vật, ñộng vật này [53] Mới ñây nhất, Thủ tướng chính phủ ñã ký quyết ñịnh ñồng ý về Chương trình trọng ñiểm và ứng dụng CNSH trong lĩnh vực NN - PTNT ñến năm 2020

Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương ñối ñơn giản và thời gian phân hóa từ mô ñến cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá là cây mô hình vì vậy những nghiên cứu về chuyển gen trên cây thuốc lá ñã ñược tiến hành từ khá sớm Nguyên Liên Chi và cs (1989) [6] ñã chuyển thành công gen kháng

kanamycin vào mô thuốc lá (N.tabacum) bằng vi khuẩn A.tumefaciens Trần

Phương Liên và cs (1994) [10] cũng công bố kết quả nghiên cứu biến nạp một số gen chọn lọc vào các dòng thuốc lá bằng cách sử dụng Ti-plasmit vector Nguyễn ðức Thành và cs (1994) [11] ñã tiến hành nghiên cứu chuyển gen lục lạp thuốc lá Trần ðăng Kiên và cs (1999) [8] ñã nghiên cứu phương pháp biến nạp gen tạo giống thuốc lá có khả năng kháng sâu bệnh, trong ñó ñã xác ñịnh ñược mô lá là bộ phận tốt nhất biến nạp, nồng ñộ kanamycine (kan)

30 - 50 mg/l là tốt nhất cho quá trình sàng lọc mẫu sau biến nạp, ñã tạo ra

vector chứa gen Bt là Ti-plasmit/cry IA(c)/NOS, ñã tạo ñược chủng A

tumefacciens chứa plasmit vector pCAMBIA 1300:UBI - cry IA(c) NOS Vũ

Thị Bản và cs (2007) [2] ñã tiến hành nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá

vàng sấy kháng bệnh virus TMV (bệnh khảm lá) và ñã chuyển ñược gen CP

mã hóa vỏ virus gây bệnh khảm lá thuốc lá vào giống thuốc lá K326 và giống

C 9-1, thể hiện tính kháng bệnh TMV ở thế hệ T0

Cho ñến nay chưa có công bố chính thức nào về những nghiên cứu

chuyển gen kháng sâu vip3A vào cây thuốc lá ở Việt Nam Chính vì vậy

chúng tôi tiến hành nghiên cứu tạo cây thuốc lá mang gen kháng sâu vip3A

3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, hoá chất, thiết bị

3.1.1 Vật liệu

- Vật liệu thực vật: Giống thuốc lá K326 là giống thuốc lá nhập nội và

ñã ñược công nhận giống quốc gia, có một số ñặc ñiểm chính như sau: Chiều cao trung bình: 160 - 175cm; thời gian sinh trưởng: 120 ngày; thời gian ra nụ 10%: 53 ngày; năng suất khô: 1,8 - 2,3 tấn/ha; chất lượng tốt Hiện nay diện tích thuốc lá giống K326 chiếm khoảng 40% diện tích cây trồng thuốc lá trên cả nước

- Các vật liệu khác:

+ Các plasmit Plasmit Kích thước (bp) ðặc tính Nơi cung cấp

- Các enzyme giới hạn: BamHI, SacI, EcoRI

- Enzyme T4 ligase; T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp

- Các hoá chất khác: thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, kanamycine và các hoá chất thông dụng khác

- Thiết bị máy móc:

Bộ kit tinh sạch DNA, pipetman, máy soi Gel (Bio - Rad), máy chụp ảnh, máy ly tâm, máy ño pH, bộ ñiện di, máy PCR, bể ổn nhiệt

3.2 ðịa ñiểm và thời gian

- ðịa ñiểm: Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

- Thời gian: từ tháng 8 năm 2008 ñến tháng 9 năm 2009

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen

3.3.1.1 Nuôi cấy và lưu giữ chủng khuẩn

- Môi trường nuôi cấy LB (Luria and Betani)

- Phương pháp nuôi cấy:

Khuẩn giữ trong glycerol ñược lấy ra cấy lỏng trên môi trường LB có bổ

sung kháng sinh thích hợp Nuôi lắc 200v/p ở 37oC qua ñêm Sau ñó cấy ria trên

ñĩa petri chứa LB ñặc có kháng sinh, nuôi ở nhiệt ñộ và thời gian thích hợp

- Giữ chủng:

Bổ sung glycerol vô trùng ñến nồng ñộ cuối cùng là 15% vào 0,5 - 1ml

dịch vi khuẩn lỏng mới nuôi qua ñêm, trộn ñều và bỏ nhanh vào nitơ lỏng và

giữ chủng ở ñiều kiện -800C

3.3.1.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA plasmit của vi khuẩn E.coli

- 60 ml kali acetate 5M

- 28,5 ml H2O Dung môi loại protein:

- Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25:24:1)

- chloroform : isoamyl alchohol (24:1)

- TE 0,01M pH 8,0 b/ Quy trình:

- Cấy chuyển một khuẩn lạc E.coli vào 3 ml LB lỏng có bổ sung kháng

sinh chọn lọc, lắc qua ñêm ở 37oC, 200 v/p

- Chuyển 2 ml dịch nuôi cấy vào các ống Eppendorf loại 2 ml và ñem

ly tâm 8000 v/p, 5phút, 4oC ñể thu tế bào

- Cặn ñược hoà trong 100 µl dung dịch I

- Bổ sung ngay 200 µl dung dịch II, ñảo nhẹ nhàng

- Bổ sung tiếp 150 µl dung dịch III, ñảo nhẹ nhàng

- Thêm 550 µl dung dịch Phenol : chloroform : isoamyl alchohol (25 :

- Bổ sung RNase vào mẫu ñến nồng ñộ cuối cùng là 100 µg/ml, ủ mẫu

ở 370C trong 1 giờ, chiết lại bằng chloroform : isoamyl alchohol (24:1) và tủa

bằng cồn 100%

- ðiện di trên gel agarose 0,8% ñể xác ñịnh ñộ sạch của DNA

3.3.1.3 Phương pháp ñiện di DNA trên gel agarose

Các ñoạn DNA có khối lượng và ñiện tích khác nhau ñược tách ra khi

di chuyển từ cực âm sang cực dương trong cùng ñiện trường có ñiện thế và

cường ñộ thích hợp

a Hoá chất sử dụng: Agarose 0,8%, dung dịch ñệm TAE 1X (Tris HCl,

EDTA ); Ethidium bromide (EtBt) 10mg/ml, ñệm tra mẫu 10X

b Quy trình:

- Chuẩn bị gel agarose: cho 0,8 g agarose vào 100 ml dung dịch TAE

1X, lắc ñều và ñun cho agarose tan hoàn toàn, ñể nguội ñến khoảng 50 - 60oC,

ñổ dung dịch vào khay ñiện di có cài sẵn răng lược, ñể gel ñông cứng, rút lược

và ñặt bản gel vào bể ñiện di, ñổ dung dịch TAE ngập bản gel từ 1 - 2 mm

- Tra mẫu và ñiện di: mẫu DNA ñược trộn với ñệm tra mẫu 10X theo tỷ

lệ 1: 10, mix ñều và tra vào giếng, chạy ñiện di với thang DNA chuẩn ñể xác

ñịnh trọng lượng phân tử DNA

- Nhuộm bản gel: bản gel ñược lấy ra khỏi khuôn, ngâm 20 - 40 phút

trong dung dịch nước có chứa EtBt, rửa lại bằng nước và quan sát dưới ánh

sáng tử ngoại 254 nm trên máy soi DNA, ảnh ñược chụp bằng máy soi gel

3.3.1.4 Tinh sạch DNA từ bảng gel agarose

a Dụng cụ và hoá chất:

- Cột thôi gel; eppendorf; tip các loại

- Dung dịch QG (solubilization buffer), dung dịch PE (washing buffer),

dung dịch EB (elution buffer) hoặc nước cất khử ion

b Tiến hành:

ðiện di trên gel agarose, nhuộm, soi trên bàn soi UV và cắt lấy ñoạn gel chứa ñoạn DNA quan tâm cho vào ống eppendorf Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ 1Vmẫu : 3VQG và ủ trong 50oC trong 15 phút Sau khi gel tan hoàn toàn chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm cực ñại trong 1 phút và loại bỏ dịch chảy qua cột Bổ sung 500 µl dung dịch QG, ly tâm 1 phút Bổ sung tiếp 750 µl dung dịch PE vào cột, ñể ở nhiệt ñộ phòng 5 phút Sau ñó ly tâm cực ñại 1 phút, ñổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút ñể loại bỏ hết

PE Cuối cùng hoà tan DNA trong 30 - 50 µl nước cất

3.3.1.5 Phương pháp xử lý với enzyme giới hạn

Các vector ñược xử lý với enzyme giới hạn theo phản ứng:

3.3.1.6 Phản ứng ghép nối ñoạn gen với vector:

ðoạn DNA cần nối ghép và vector ñã ñược mở vòng ñược trộn lẫn với

nhau theo tỷ lệ 3 : 1 về số lượng phân tử T4 ligase ñược cho vào phản ứng với

nồng ñộ 1 ñơn vị/10µl phản ứng Hỗn hợp phản ứng ñược trộn theo thứ tự:

Phản ứng ñược ủ qua ñêm ở 14oC

3.3.1.7 Biến nạp DNA plasmit tái tổ hợp vào tế bào E.coli

Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α ñược tiến

hành theo Cohen và cộng sự (1972).Vi khuẩn dưới tác dụng của hoá chất

hoặc ñiện trường trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ cho các phân tử ADN

có thể chui vào

a Chuẩn bị tế bào khả biến:

Chủng khuẩn ñược cấy ria trên môi trường LB ñặc và nuôi qua ñêm ở

37oC, sau ñó lấy một khuẩn lạc ñơn cấy vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200

v/p ở 37oC qua ñêm Chuyển 0,5 ml dịch khuẩn sang 50 ml môi trường LB lỏng,

nuôi lắc 200 v/p, 37oC khoảng 3 giờ cho ñến khi OD 660nm ñạt từ 0,6 - 0,8 thì

chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm ñã giữ lạnh trên ñá và ly tâm 6000 v/p, 10

phút Thu cặn và hoà nhẹ nhàng trong 0,7 - 1,5 ml CaCl 2 0,1M Chia vào mỗi

ống eppendorf 50 µl dịch tế bào, bổ sung thêm 50 µl glycerol 60%, làm ñông

nhanh bằng nitơ lỏng và giữ ở -80 oC Sau ñó, các tế bào ñược phục hồi trong

môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp ñược phát hiện trên môi trường thích hợp Cấy trải lên ñĩa môi trường LB không có kháng sinh ñể kiểm tra

b Biến nạp DNA plasmit vào tế bào khả biến E coli bằng sốc nhiệt

- Bổ sung 5 µl ADN plasmit tiếp vào ống eppendorf chứa sẵn 100 µl tế bào khả biến ñã ñể trên ñá 30 phút, giữ trên ñá 30 phút

- Sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây rồi chuyển ngay sang giữ trong ñá 5 phút

- Bổ sung 0,5 ml môi trường SOC, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ

- Cấy trải dịch tế bào lên trên ñĩa LB ñặc có bổ sung kháng sinh thích hợp và nuôi qua ñêm ở 37oC

3.3.2 Phương pháp chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens bằng xung ñiện

- Chuẩn bị tế bào A tumefaciens khả biến trong các cuvet ñã khử trùng

- ðặt các ống cuvet ñã khử trùng vào ñá

- Bổ sung 5 µl plasmit tái tổ hợp vào 100 µl ñựng sẵn tế bào A tumefaciens khả biến

- ðảo nhẹ, ñặt trong ñá trong 5 phút, chuyển dịch sang ống cuvet mới

- Xung ñiện: 2,5kw; 25 µF và 400 Ω trong 4 - 5 µ

- Chuyển ngay ống dịch vào ñá, sau 5 phút, bổ sung 1 ml môi trường YEP, mix nhẹ và chuyển các tế bào sang ống eppendorf 2ml, nuôi lắc trong