Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (cratoxylum prunifolium kurtz)

Cây đỏ ngọn được dùng trong dân gian đã có từ lâu, nghiên cứu hoá thực vật cây đỏ ngọn thì mới chỉ được các nhà khoa học chú ý đến trong một số năm gần đây, để góp phần làm rõ thêm thành

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

(CRATOXYLUM PRUNIFOLIUM KURTZ)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

THÁI NGUYÊN - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

(CRATOXYLUM PRUNIFOLIUM KURTZ)

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số: 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH

THÁI NGUYÊN - 2008

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN

SKLM : Sắc kí lớp mỏng

UV : Ultraviolet spectrocopy

MS : Mass Spectroscopy

EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy

LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy

FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR : 1H-Nuclear Magnetic Resonance

13

C-NMR : 13C- Nuclear Magnetic Resonance

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

COSY : Correlated Spectroscopy

HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence

HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation

HIV : Human Immunodeficiency Virus

1

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận gió hoà nên

hệ thực vật rất phong phú, đa dạng Đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá thuộc loại có thể tái tạo được Ngay từ xa xưa cha ông ta đã biết khai thác nguồn tài nguyên quý báu này để làm đồ ăn, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu xây dựng và nhiên liệu phục vụ cuộc sống

Trong thế giới thực vật ấy có những loài cung cấp thức ăn cho chúng ta,

có những loài cung cấp vật liệu, có loài cung cấp hương thơm, quả ngọt, có nhiều loài được dùng để làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu, cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mĩ phẩm và dược phẩm

Việt nam có một vị trí thuận lợi về thiên nhiên như vậy nên nền Y học dân tộc cổ truyền phát triển từ lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước Tiếp thu truyền thống quý báu của các thế hệ cha ông, ngày nay Đảng

và Nhà nước ta đã xây dựng nhiều chính sách, nhiều hình thức động viên nhằm kế thừa và phát huy tốt nguồn tài nguyên quý báu có thể tái tạo được phục vụ con người có hiệu quả nhất

Nhiều cây cỏ đã được trồng để dùng làm thuốc, nhiều loài dùng làm nguyên liệu cung cấp tinh dầu cho công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi…, có loại được dùng làm thực phẩm chức năng đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v Trong số đó có cây đỏ

ngọn (Cratoxylum prunifolium) thuộc loại cây mọc hoang dại và phổ biến

khắp các vùng trên lãnh thổ nước ta Đặc biệt cây đỏ ngọn có nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc, Tây Nguyên và Nam Bộ

2 Cây đỏ ngọn đã và đang được dùng để làm thuốc và làm nước uống

trong phạm vi dân gian một cách khá phổ biến ở các nước châu Á, ở Việt

Nam đặc biệt vùng đồng bào dân tộc miền núi phía Bắc nước ta Gần đây

người ta phát hiện dịch chiết của lá cây đỏ ngọn có tác dụng chữa bệnh gan,

có tác dụng tốt với hệ thần kinh và tác dụng của nó không thua kém gì các

thuốc nhập ngoại

Cây đỏ ngọn được dùng trong dân gian đã có từ lâu, nghiên cứu hoá

thực vật cây đỏ ngọn thì mới chỉ được các nhà khoa học chú ý đến trong một

số năm gần đây, để góp phần làm rõ thêm thành phần hoá thực vật của cây đỏ

ngọn tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm dược liệu và

nguyên liệu cho các mục đích khác, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa

học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (Cratoxylum

prunifolium) Đối tượng nghiên cứu là cây đỏ ngọn mọc hoang, thu hái vào

tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức thành phố Thái Nguyên

“Cratoxylum prunifolium Kurtz” thuộc họ Ban “Hypericaceae” [1, 2, 5, 8, 11]

Cây đỏ ngọn phân bố rộng rãi ở vùng Nhiệt đới, Cận Nhiệt đới, Ôn đới,

chủ yếu ở vùng ôn đới bán cầu Bắc Chi Cratoxylum ở Việt Nam có 5 loài:

Cratoxylum maingayi Kurz có tên là lành ngạnh nhỏ, phân bố ở Bắc Trung Bộ

và Lâm Đồng; Cratoxylum prunifolium Kurz lành ngạnh lá hẹp phân bố ở vùng Đông Nam Bộ trên lãnh thổ VIệt Nam; Cratoxylum prunifolium Kurtz

cây đỏ ngọn, còn gọi là thành ngạnh đẹp mọc phổ biến ở vùng Đông Bắc

nước ta; Cratoxylum polyanthum Korth hay Cratoxylum ligustrinum Blume lành ngạnh; Cratoxylum cochinchinense Blumer còn gọi là lành ngạnh Nam

Bộ Hai loài cuối chủ yếu mọc ở Nam Bộ song cũng khá phổ biến ở các tỉnh Đông Bắc Bộ

Cây đỏ ngọn - Cratoxylum prunifolium Kurtz thường thấy mọc tự nhiên

ở hầu hết các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc Việt Nam có nhiều ở Xuân Mai - Ba Vì, Hà Tây, Sapa, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Vĩnh Phú Cây đỏ ngọn cũng phân bố phổ biến ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Malaysia, Philippin, Ấn Độ, Indonexia, Myanma, Thái Lan

Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây đỏ ngọn:

Cây đỏ ngọn là loại cây nhỏ, thân gỗ, có gai ở gốc (trong rừng lâu năm cây có thể cao và to) cành non có lông tơ, màu đỏ nên gọi là đỏ ngọn [11] Lá hình mác dài 12 - 13 cm, rộng 3,5 - 4 cm, mọc đối xứng, cuống ngắn 3 - 5

mm Mặt gân chính màu đỏ đến 1/3 lá non, gân lá và lá có màu đỏ đến quá

4 nửa Hoa mọc trên những cành ở kẽ lá màu trắng hoặc hồng có lông màu tía

Quả nang dài 15mm, rộng 7 - 8mm Hạt hình trứng dài 6mm, rộng 3mm

Hình 1.1 Ảnh cây đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae)

1.2 Một số công dụng của chi Cratoxylum

Hầu hết các loài thực vật thuộc chi Cratoxylum đều được nhân dân

sử dụng làm các bài thuốc dân gian để chữa bệnh, để chăm sóc và bồi

dưỡng sức khoẻ

Cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium mới thấy dùng trong phạm vi

nhân dân, làm thuốc kích thích tiêu hoá, ăn ngon hàng ngày hoặc sau khi đau

yếu, sau khi sinh Kinh nghiệm cho thấy ngày uống chừng 15 - 30 g lá khô

dưới hình thức sắc hoặc pha như trà Có khi phối hợp với lá vối nấu nước

uống cho tiêu cơm đã đem lại hiệu quả cao cho sức khoẻ con người [11]

Nhân dân ta ở các vùng đã thu hái lá cây đỏ ngọn vào dịp tết Đoan Ngọ phơi

khô để nấu nước uống mỗi khi cảm thấy cơ thể mệt mỏi

5 Trong những năm gần đây một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của dịch chiết toàn phần lá và thân cây đỏ ngọn Nhóm nghiên cứu của Học viện Quân Y - Hà Nội cho biết cây đỏ ngọn ít độc, dịnh chiết toàn phần của lá và thân cây đỏ ngọn có tác dụng chống ôxi hoá tốt, hoạt tính đạt 69% trong khi tanakan chỉ đạt 48% [9] và có tác dụng hoạt huyết, làm lưu thông máu, giảm đông ở những trường hợp tăng đông [12]

Bộ môn Dược học quân sự - Học Viện Quân Y trên cơ sở nghiên cứu lâm

sàng dịnh chiết của lá đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium trên chuột nhắt trắng và

thỏ có so sánh với thuốc tanakan do hãng Beaufour Ipsen của Pháp sản xuất đã đưa ra kết luận:

Dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn và dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn đều

có ảnh hưởng lên hoạt động của hệ thần kinh ở các mức độ khác nhau:

- Dịch chiết etylaxetat và dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn, Tanakan đều

có tác dụng hoạt hoá hệ thần kinh thực vật, thể hiện ở sự tăng rõ hàm lượng

Catecholamin trong máu động vật thí nghiệm sau khi uống các thuốc này

- Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn có tác dụng tương đương Tanakan

gây hoạt hoá đồng bộ các tế bào não ở thỏ thực nghiệm, thể hiện làm giảm thành phần sóng chậm delta, tăng thành phần sóng alpha trên điện não đồ, còn dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn không thể hiện rõ tác dụng hoạt hoá hệ thần kinh trung ương

- Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn có tác dụng làm tốt cả hai quá trình hưng phấn và ức chế có điều kiện ở não bộ động vật thí nghiệm (thông qua

hoạt động phản xạ có điều kiện), tương đương với Tanakan và tốt hơn tác

dụng này của dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn

- Mức độ ảnh hưởng làm tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương của các chất theo thứ tự giảm dần: dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn,

Tanakan, dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn [4]

6 Đối với cao nước (cặn tổng) 30 - 80 mg/kg cú hoạt tớnh khỏng khuẩn

với cỏc vi khuẩn staphylococcus auresu, Escherichia coli, Salmonella typhi

Dịch chiết tổng số từ lá cây Cratoxylum cochinchinense ở Thái Lan đã

được ng-ời ta thử nghiệm và cho thấy chúng có tác dụng chống nhiễm khuẩn,

chống ụxi hoỏ, những hoạt động của tế bào [22, 23, 24]

Ở Singapo dịch chiết cõy Cratoxylum cochinchinense được sử dụng

trong nhõn dõn cú tỏc dụng chống cỏc gốc tự do để chữa cỏc bệnh liờn quan đến

sự căng thẳng, mệt mỏi [25]

Tại Nhật Bản, từ rễ cõy của một số loài thuộc chi Cratoxylum người ta

bào chế thành thuốc làm tăng trớ nhớ, chống lóo hoỏ, mất ngủ ở người già

Ở Trung Quốc, lỏ của cõy đỏ ngọn người ta chế biến thành trà pha

nước uống hàng ngày và sử dụng một cỏch rộng rói Từ phần dịch chiết

etylaxetat của lỏ cõy đỏ ngọn đó tỏch được cỏc xanthone cú tỏc dụng khỏng ấu

trựng của muỗi gõy sốt da vàng hơn cả chất rotenon, khụng những thế cỏc

chất này cũn cú nhiều triển vọng làm thuốc chống mối [28]

Phần dịch chiết etylaxetat của Cratoxylum cochinchinense cú tỏc dụng

kỡm hẵm peroxit hoỏ lipit màng tế bào gan, kỡm hóm sự xuất hiện lipit ỏc tớnh

gõy viờm gan và cú tỏc dụng bảo vệ gan tốt [27]

Theo cỏc lương y, cõy đỏ ngọn cú vị ngọt, tớnh mỏt bộ phận dựng lỏ

non, vỏ cõy, vỏ rễ Người bị đau bụng ăn khụng tiờu, uống nước nấu của lỏ

lành ngạnh giỳp tiờu hoỏ tốt thường dựng 100g lỏ non nấu một lớt nước, thay

nước uống hàng ngày Khi bị cảm nắng, sốt thỡ dựng lỏ non 50g nấu với 1 lớt

nước uống

Trong dõn gian Việt Nam, cõy đỏ ngọn mới thấy dựng trong phạm vi nhõn

dõn làm thuốc kớch thớch tiờu húa, phục hồi sức khoẻ khi ốm đau, sinh đẻ, bảo vệ

thành mạch, chống lóo hoỏ, tăng trớ nhớ ở người cao tuổi Người ta thu hỏi lỏ đỏ

ngọn vào dịp Tết mồng 5 thỏng 5 (Tết Đoan Ngọ) để làm thực vật nấu nước

7 uống hoặc cú thể ủ sau đú đem phơi khụ mới dựng Gần đõy cú một vài tỏc giả ở Việt Nam đó nghiờn cứu và cho thấy lỏ đỏ ngọn cú tỏc dụng chữa bệnh, cú tỏc dụng chống gốc tự do, bảo vệ thành mạch, bảo vệ tế bào gan chống mự loà, chống ụxi hoỏ và miễn dịch invitro khỏ rừ [7]

Tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng

Y học cổ truyền Thỏi Nguyờn, Bỏc sĩ Hoàng Sầm đó sử dụng dịch chiết của lỏ

đỏ ngọn để làm thực phẩm chức năng, thay chố làm nước uống, chữa cỏc bệnh nan y như: ngứa, ghẻ lở, ronan thần kinh, mất ngủ, miệng đắng ăn khụng ngon, giảm trớ nhớ…

1.3 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu húa học thực vật chi Cratoxylum 1.3.1 Cỏc hợp chất cú khung triterpen

Theo tài liệu [19] từ dịch chiết n-hexan của thực vật Cratoxylum

cochinchinense đó tỏch được ngoài cỏc triterpen cú 5 vũng ngưng tụ nhúm

lupeol và β-mangostin cũn phõn lập được cỏc triterpen cú hai vũng ngưng tụ Sau khi tỏch bằng cỏc phương phỏp sắc kớ và dựa vào kết quả phõn tớch cỏc phổ của cỏc chất được tỏch ra người ta đề nghị cụng thức cấu tạo của 7 hợp chất triterpen hai vũng là:

R

I.a: (13E,17E)-polypoda-8 (26),13,17,21-tetraen-3β-ol; (R= β-OH)

II.c: (13E,17E)-3β-axetoxypolypoda-7,13,17,21-tetraene; (R= β - OAc)

II.d: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3-one; (R= O)

R

III.b: Polypoda-13,17,21-trien-3-one; (R =β - OH)

1.3.2 Các chất axit hữu cơ

Từ lá một loại rau thuộc loài Cratoxylum formosum ở Thái Lan Pilchaon

Maisuthisakul [23] đã phân lập được hai axit hữu cơ IV, V và cho biết các

hợp chất ấy đều có hoạt tính chống oxi hóa Sau khi tách, phân lập tác giả

đã đề nghị cấu trúc của nó có công thức là:

9

COOH HO

OH

O

OH OH

IV: Acid chlorogenic

O

OH HO

O O

V: Acid dicaffeoylquinic

1.3.3 Các chất có khung xanthone

Các xanthone là nhóm chất lớn nhất, phổ biến nhất có ở hầu hết các

loài thuộc chi Cratoxylum [6, 14, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30]

Đã phát hiện ra là các xanthone và dẫn xuất dưới dạng C-glycoside của

chúng Từ loài Cratoxylum cochinchinense [25] Soon Yew Tang cùng với các

cộng sự đã phân lập được C-glicoside của xanthone và xác định được công thức cấu tạo của nó có dạng VI

10

OH HO

O HO

HO

OH

Từ loài Cratoxylum formosum Nawong Boonnak cùng các cộng sự [22]

cũng đã phân lập được các xanthone có cấu trúc VII dưới đây:

MeO

R1

VII.a: Dulxis-xanthone VII.b: Β-mangostin; (R 1 = OMe)

VII.f 1 : Gerontoxanthone I; (R 1 = ; R 2 = OH)

R2

VII.g 1 : Macluraxanthone; (R 1 = ; R 2 = OH)

OMe

OH

Từ loài Cratoxylum cochinchinese của miền Nam nước ta Lê Thị Diệu

Nguyên và Leslie J Harrison [19] đã phân lập được ngoài các triterpen I, II và

III Hai nhà nghiên cứu xác định được các xanthone có cấu trúc VIII.a,VIII.b

O

R

O OH HO

OH

VIII.a: 1,3,7-trihydroxy-2,4-di (3-methyl-but-2-enyl) xanthone; (R = prenyl)

VIII.b: 2-geranyl-1,3,7- trihydroxy-4-3- methylbut-2-enyl) xanthone; (R=geranyl)

Từ loài Cratoxylum maingayi [14] người ta cũng phân lập được một số

hợp chất xanthone (IX), các chất này có cấu trúc đơn giản nhưng đều có tác

dụng như các chất có hoạt tính chống oxi hoá tốt

13

O

R HO

8 7 6 5

8 '

9 ' 1 3

OMe

2 3 4 5

6 7

9 '

4'

10 '

8 ' 8

IX.d: 7-hidroxy-1,2,3,8 -tetramethoxyxanthone; (R = H)

Từ loài Cratoxylum formosanum người ta cũng phát hiện được các

xanthone có cấu trúc phân tử như sau [21, 22]

O

OMe OMe

R3

R1

R2O

14

O OH

R1

O HO

HO

O

OMe O

X.e: 2,7-dihidroxy-1,8-dimethoxy xanthone

O

O HO

A

3 4'

1.3.4 Một số đại diện của khung anthraquinon

Từ loài Cratoxylum formosum ngoài việc xác định các xanthone

Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai và các cộng sự [22] còn phân lập được các anthraquinon có các cấu trúc XI Các tác giả còn cho biết các chất này có hoạt tính sinh học rất cao Chúng có tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, hạ đường huyết [20]

OH O OH

OR O

XI.c: Vismiaquinon XI.d: 3,4 - dihidrojacareubin

1.3.5 Một số đại diện của khung flavonoit

Từ loài Cratoxylum cochinchinense, Cratoxylum formosanum nhiều tác

giả đã phân lập được 2 flavonoit XII.a và XII.b [18, 13, 15] Chúng có hoạt

tính kìm hãm peroxit hoá lipit màng tế bào gan, có tác dụng tăng khả năng

thải độc của gan, có tác dụng kìm hãm sự xuất hiện lipit ác tính

OH

OH OH

XII.a: Đihiđrokampherol XII.b: Taxifolin

O O OH

OMe O

17

1.4 Những nghiên cứu hoá thực vật loài Cratoxylum prunifolium

Từ lá của loài Cratoxylum prunifolium, Xue-Li-Cao, Yoichiro Ito đã

dùng phương pháp sắc kí khí lỏng tốc độ cao phân lập được epigallocatechin gallat (XIII.a) và epicatechin gallat (XIII.b) [27]

O

C O

OH

OH

OH OH

OH OH OH

OH

OH OH

OH OH OH

HO

O

XIII.b: Epicatechin-3-O-gallate

Theo Nguyễn Liêm và các cộng sự [10], bằng các phản ứng định tính

cho biết Cratoxylum prunifolium có chứa các flavonoit, tanin pyrocatechic

phitosterol saponin triterpen và các axit hữu cơ, đường khử Tác giả còn cho biết ở cây đỏ ngọn của Việt Nam không thấy có ancaloit và anthraquinon

Từ vỏ cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium Phạm Đình Hùng, Nguyễn

Diệu Liên Hoa và các cộng sự tại Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh

đã phân lập được macluraxanthone, 1,7-đihidroxanthone và hai xanthone mới

18 [6] và cho biết chúng đều có tác dụng diệt muỗi gây sốt rét và có tác dụng tốt

trong việc diệt mối

Từ vỏ và rễ cây Cratoxylum prunifolium trồng ở tỉnh Nông Khai miền

Nam Thái Lan, Nawong Boonnak và các cộng sự đã chiết bằng điclometan,

phân lập các chất bằng sắc kí đã tách được 10 xanthone với sự khác nhau chỉ

là ở các mạch nhánh (R1 và R2) [22] và tác giả đã gọi tên chúng là các

prunifloron được đánh số từ 1 đến 10 Công thức của chúng có cấu trúc XIV

O

O

R1

R2OH

OR RO

HO

R: là H hoặc CH3

Tên của chúng lần lượt là: XIV.1 Pruniflorone A; XIV.2 Pruniflorone

B; XIV.3 Pruniflorone C; XIV.4 Pruniflorone D; XIV.5 Pruniflorone E;

XIV.6 Pruniflorone F; XIV.7 Pruniflorone G; XIV.8 Pruniflorone H; XIV.9

Pruniflorone I; XIV.10 Pruniflorone J

Cũng từ rễ của thực vật Cratoxylum prunifolium các tác giả Thái Lan

lại phát hiện được một anthraquinon mà cấu trúc của nó được tác giả mô tả có

dạng XV

O

O O

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu

Nguyên liệu để nghiên cứu gồm lá cây đỏ ngọn, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức - Thành phố Thái Nguyên

Cây đỏ ngọn, còn gọi là cây thành ngạnh đẹp, lành ngạnh đẹp, có tên

khoa học là: “Cratoxylum prunifolium Kurtz ”, họ Hyperaceas hay họ Ban

Mẫu cây tươi thu hái gồm cả cành nhỏ và lá được đem sấy ở 800

C để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 500C cho tới khi khô hoàn toàn Mẫu khô được chia riêng thành các phần lá, và cành Chọn mẫu lá làm đối tượng nghiên cứu Nghiền nhỏ mẫu ngâm, chiết trong etanol 90o ở nhiệt độ phòng nhiều lần

Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được dưới dạng xiro, chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol, các dịch chiết được bay hơi dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500

C dưới áp suất thấp Các cặn thô được phân chia bằng sắc

kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong

hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch

2.1.2 Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết

Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây đỏ ngọn chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí

và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm:

- Sắc kí lớp mỏng (SKLM)

- Sắc kí cột silicagen thường dùng Merck 63- 200nm

- Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại

20

2.1.3 Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những tính chất vật lý đặc

trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử

ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H- NMR, phổ 13

C- NMR, tuỳ theo từng loại chất Các số liệu phổ thực nghiệm của các

chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng

2.2 Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Dụng cụ và hoá chất

Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết

(pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng

trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA)

Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60

F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số

thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ

độ sạch của sản phẩm thu được

Các hệ dung môi khai triển SKLM:

Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV-

BIOBLOCK ) ở bước sóng = 254nm và 365nm Thuốc thử để hiện màu là

vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 , sau đó sấy ở nhiệt độ trên 1000C

21 Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức:

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy Eletronthermal IA - 9200

- Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410

- Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec

- Phổ khối ghi trên máy MS- Engine - 5989- HP ion hoá bằng va chạm eletron (LC- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/ WILLEY 250L

- Phổ 1H- NMR và 13C- NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, MeOD

2.3 Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) 2.3.1 Các dịch chiết

Lá cây đỏ ngọn đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi clorofom, etylaxetat, n-butanol, cuối cùng đuổi hết nước và hoà tan bằng metanol

Các dịch chiết trên được làm khô bằng Na2SO4 lọc và cất dung môi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500C Cặn được sấy khô

và cân để xác định trọng lượng

chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi

Rf =

22 Như vậy từ lá cây đỏ ngọn đã thu nhận được 04 phân đoạn cặn là: cặn

trong clorofom (ĐC), cặn trong etylaxetat (ĐE), cặn trong butanol (ĐB) và

cặn trong metanol (ĐM) Sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình ngâm chiết

Bảng 2.1 Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ

ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz)

Khối lượng mẫu lá

Bảng 2.2 Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn

4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6]) 1% Xanh thẫm +++

6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++

7 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam -

Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:

 Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli

 Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu

 Vi khuẩn: Salmonella typhi

24

Hình 2.1 Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch

25 Chúng tôi còn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học

cổ truyền Thái Nguyên Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết thô được trình bày trong bảng 2.3

Bảng 2.3 Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô

từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium)

Dịch chiết

Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch(mm) Staphylococcus auresu Escherichia coli Salmonella typhi

Đường kính (mm)

Hoạt tính Đường kính

(mm)

Hoạt tính

Đường kính (mm)

Hoạt tính

Chú ý: Dấu (+) là phản ứng có hoạt tính

2.4 Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn

Từ 787,4g lá Cratoxylum prunifolium khô chiết nhiều lần bằng etanol

900 đến khi dịch chiết trong suốt không màu, loại bỏ bớt dung môi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 500C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng xiro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với c lorofom đến khi thu được tất cả các chất có thể tan được trong CHCl3 đều được lấy ra hết, cô cạn dung dịch CHCl3 ở nhiệt độ thấp thu đuợc 52,264g chất (kí hiệu các chất ĐC)

Phần cặn không tan trong CHCl3 được lắc nhiều lần với EtOAc cho đến khi dịch chiết EtOAc hoàn toàn không màu và trong suốt, cô cạn dịch EtOAc trong máy cất quay thu được 34,654g chất tổng số (kí hiệu là các chất ĐE) Phần không tan được trong EtOAc, được lắc với n-butanol sau đó cũng cô cạn trong điều kiện áp suất thấp được 40,410g chất (kí hiệu là các chất ĐB)

26 Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên cho tan trong

MeOH thu đựoc 32,346g chất (kí hiệu là các chất ĐM)

2.4.1 Dịch chiết clorofom

Từ 11g cặn từ dịch clorofom của lá đỏ ngọn kí hiệu (ĐC) được phân

chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan - clorofom với các

tỷ lệ tăng dần clorofom từ 0% đến 100% kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí

lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu

được ba chất ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3

Rửa giải với các hệ dung môi n- hexan-clorofom (50:1), sau khi cất loại

dung môi, cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi B và phát

hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong dung

môi trên thu được 21mg chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ

nóng chảy 278-2800

C và cho các đặc trưng của một tritecpen

Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm-1): 1720 (C=O); 1500 (C=C); 3050 (CH3);

2940 (CH)

Phổ LC- MS, m/z (%) 424 [M+

]; 408 [M-O]+ PHổ 1

Phổ 1

H- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 5,33 (1H, dd, j = 5Hz và 2H, H6); 515 (1H, dd, j22,23 = 15, Hz, j22,20= 5Hz, H-22); 5,01 (1H, dd, j23,22 = 15Hz, j23,24 = 5Hz, H-23)

Phổ 13

C- NMR (500MHz, CDCl3); (ppm): 36,4 (t, C1); 29,67 (t, C2); 71,8 (d, C3); 42,3 (t, C1); 139,2 (s, C5); 121,4 (d, C6); 37,3 (t, C7); 31,85 (d,

C8); 51,15 (d, C9); 36,12 (s, C10); 24,35 (t, C11); 42,18 (t, C12); 31,4 (s, C13); 56,83 (d, C14); 25,38 (t, C15); 31,6 (t, C16); 55,9 (d, C17); 12,01 (q, C18); 18,95 (q, C19); 40,47 (d, C20); 21,03 (q, C21); 138,4 (d, C22); 129,2 (d, C23); 50,01 (d,

C24); 33,9 (t, C25); 21,19 (q, C26); 19,79 (d, C27); 28,89 (q, C28); 12,22 (q, C29)

2.4.1.3 β- Sitosterol

Tiếp tục rửa giải trên cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B, phát hiện nó bằng vanillin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại thu được 27mg chất rắn, tinh thể hình kim, nóng chảy 140- 1410

C,

Rf .100 = 71

Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm-1): 3450 vân rộng (H32, C3); 3010- 1650 (liên kết đôi)

28 Phổ EI- MS; m/z (%): 414 [M+

] (20); 413 [M-H]+ (41); 398 (28); 397 (100); 395 (32); 383 (11); 361 (11); 257 (3); 255 (6,3); 151 (5,6); 139 (11)

2.4.2 Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE)

Từ 15g cặn chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn (ký hiệu ĐE) được tiến

hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung

môi clorofom- metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực,

metanol 0% -100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử

phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau,

đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu đựơc chất (ĐE1)

Rửa giải trên cột bằng hệ dung môi clorofom- metanol (90:10), sau khi

kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi C, cất loại dung môi, thu được cặn thô,

kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 70mg chất rắn màu vàng, tinh thể

để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật:

Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các

chất ra khỏi thực vật Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo

Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung

môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước

Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Cratoxylum prunifolium) được thực

hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1)

Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết

Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định nêu trong bảng (2.2)

30

3.2 Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất

Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên

nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết

bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn có chứa các axit hữu cơ, streroit,

triterpenoit Ở dịch chiết bằng etylaxetat của lá cây đỏ ngọn có chứa các hợp

chất polyphenol, các hợp chất flavonoit, cũng ở phần dịch chiết này đã tách

được axit gallic và dẫn xuất của nó Trong dịch chiết n-butanol có chứa các

tanin, các đường khử Không phát hiện thấy có ancaloit, các xianua trong các

dịch chiết của lá đỏ ngọn Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các

nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 2.2

3.3 Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau

của cây đỏ ngọn

Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) đều là những

hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau Để phân lập từng chất ra khỏi

hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là

silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần

Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong

dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn

chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và

xác định quang phổ của chúng

Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây đỏ ngọn được thực hiện

như trong sơ đồ 2.1 Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng

clorofom của lá cây đỏ ngọn chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một

tritecpen và hai steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được axit gallic và

hỗn hợp các xanthone với flavonoit

3.3.1 Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1)

Chất ĐC-1 là chất rắn tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng

chảy ở 278-2800

C nó được tách từ phần cặn chiết clorofom Bằng sắc kí cột

31 silicagen với hệ dung môi n-hexan:clorofom thu được chất ĐC-1, chất này cho các phản ứng định tính của terpenoit

Khối lượng phân tử của chất ĐC-1 được xác định bằng phổ khối LC-

MS cho biết khối lượng phân tử của [M+

] m/z bằng 424,2 tương ứng với khối lượng phân tử bằng 424 u và tương ứng với công thức phân tử C30H48O Trong phổ LC-MS còn xuất hiện pic m/z 408,2 điều này tương ứng với mảnh [M-O]+ với m/z bằng 408

Phổ FT-IR: cho thấy các vân hấp thụ của nhóm xeton (C=O) ở νmax = 1720cm-1, liên kết đôi (C=C) ở νmax = 1500cm-1, các nhóm CH3 ở νmax = 3050cm-1 và các nhóm CH ở νmax = 2940cm-1, không phát hiện thấy các vân hấp thụ của nhóm OH Điều này có thể khẳng định được hợp chất ĐC-1 không có chức rượu mà là có chức xeton

Phổ 1H-NMR và phổ DEPT: cho biết hợp chất ĐC-1 có tín hiệu của 8 nhóm CH3 đều ở dạng singlet (xem hình 3.2 và 3.4) có các độ chuyển dịch hoá học như sau: ở độ chuyển dịch δ = 0,762ppm (3H, s, CH3); δ = 0,841ppm (3H, s, CH3); δ = 0,847ppm (3H, s, CH3); δ = 0,885ppm (3H, s, CH3); δ = 0,996ppm (3H, s, CH3); δ = 1,011ppm (3H, s, CH3); δ = 1,021ppm (3H, s,

CH3); δ = 1,07ppm (3H, s, CH3) Độ dịch chuyển hoá học ở δ = 5,48ppm (1H, d, J = 3,21 và 8,17Hz) là của proton liên kết tại cacbon ở liên kết đôi (nhóm = CH tại C15)

Phổ 13

C-NMR: nhận thấy nguyên tử cacbon ở trạng thái lai hoá sp2thuộc nhóm =CH có độ chuyển dịch hoá học δ = 117,19ppm Nguyên tử cacbon bậc 4 cũng ở trạng thái lai hoá sp2 tham gia vào liên kết đôi với nguyên tử này có độ chuyển dịch hoá học ở δ = 157,59ppm

Phổ 13

C-NMR còn cho một tín hiệu ở trường rất yếu tương ứng với độ chuyển dịch hoá học δ = 217,43ppm đặc trưng cho cacbon trong nhóm cacbonyl tại vị trí C-3

32 Như vậy, phổ NMR hoàn toàn phù hợp với phổ FT-IR không thấy có

vân đặc trưng của nhóm OH mà lại thấy xuất hiện vân đặc trưng của C=O

Các nguyên tử H đối với nhóm C=O thấy chỉ có 2H với δ = 2,50ppm (2H,

dd, J = 7,1 và 11Hz), còn có 2 proton ở vị trí  của nhóm =CH (tại C16) có độ

chuyển dịch hoá học δ = 2,27ppm (2H, dd, J = 3,3 và 4,08 và 6,39)

Trên cơ sở phân tích các tính chất hoá học, nhất là phân tích các thông

tin có được từ phổ LC- MS, FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR,

13

C-NMR, phổ DEPT, phổ HMBC, HSQC, phổ H-H COSY và phần mềm

ACD/HNMR ACD/CNMR mô phỏng phổ NMR cũng đã cho phép chúng tôi

quy kết hợp chất ĐC-1 là một triterpen phải có công thức cấu tạo như sau:

27

O

29 30

28 23

24

25 26

1

3 56 8 9 10

15

18 20 22 13

19 21

7

11

14 162

4

12 17

Taraxeron (hay Frendoolean-14-en-3-on)

33

Bảng 3.1 Phổ 13

C-NMR và 1H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn

Vị trí cacbon

13

C-NMR (δ-ppm)

ACD/13NMR (δ-ppm)

C-1

H-NMR (δ-ppm)

34

Hình 3.1

35

Hình 3.2

36

Hình 3.3

37

Hình 3.4

38

3.3.2 Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2)

Chất ĐC-2 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 1520-1550C,

tách được từ dịch chiết clorofom, phân lập bằng sắc kí cột silicagen, rửa giải

bằng hệ dung môi n-hexan-clorofom (90:10)

Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M+] ở 412 m/z Các phổ FT-IR, 1

NMR và 13C-NMR đều khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl, phổ FT- IR

Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của

hợp chất ĐC-2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất Stingmast

-5,22-dien-24R-3β-ol

HO

2 1

3

4 5 6

7 8 9 10 18 12

13 1716 19

21

22 24

26 27 28 29

11

14 15

23 25 20

Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol

39

Bảng 3.2 Phổ 13

C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16] Phổ 13

C-NMR của Stigmasterol

(ĐC-2)

Phổ 13

C-NMR của Stigmasterol [16]

Vị trí cacbon

40

Hình 3.5

41

Hình 3.6

42

Hình 3.7

43

Hình 3.8

44

3.3.3 β-sitosterol (ĐC-3)

Chất ĐC-3 là chất rắn tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy

140-1410C, nó được tách từ dịch chiết clorofom, trong hệ dung môi n-hexan-

H-NMR và phổ 13C-NMR cho thấy trong phân tử

có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm-1

rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3

= 72,1ppm) Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm-1 và 1650cm-1

ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1

H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ 13C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 =

121,7ppm) So sánh các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất ĐC-3 với

số liệu phổ NMR của β-sitosterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ

ra ở bảng 3.3

Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của

hợp chất ĐC-3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol

HO

2 1

3 4 5 6 7 8 9 10 18 12

13 1716 19

21

22 24

26 27 28 29

11

14 15

23 25 20

48

Hình 3.11

49

Hình 3.12

50

3.3.4 Axit gallic (ĐE-1)

Các chất thu được từ dịch chiết etylaxetat (ĐE) được phân chia trên sắc

kí cột với chất hấp phụ silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi

clorofom-metanol với tỉ lệ clorofom-metanol tăng dần từ 0% - 100% thu được nhiều phân đoạn

khác nhau trong đó có phân đoạn CHCl3:MeOH (9:1) chứa một chất sạch

được kí hiệu là chất ĐE-1

Chất ĐE-1 là chất rắn, tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy ở

2480 C-2500 C

Phổ IR cho vân hấp thụ mạnh ở νmax= 1700cm-1 đặc trưng cho nhóm

cacboxyl có νmax = 1700cm-1, với vân rất tù có số sóng νmax = 3100cm-1 đặc

trưng cho nhóm OH của phenol

Những số liệu về phổ NMR của chất ĐE-1 hoàn toàn phù hợp với phần

mềm ACD/NMR của axit gallic (xem bảng 3.4)

Bảng 3.4 Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong

phần mềm ACD/NMR của axit gallic

ACD/ 13 NMR (δ-ppm)

C-ACD/ 1 H-NMR (δ-ppm)

COOH

OH HO

OH

2 3 4 5 6

7 1

Axit gallic

Từ dịch chiết etylaxetat, ngoài axit gallic còn thu được một số phân đoạn không sạch khác có chứa các chất cho phản ứng màu với xianidin; cho phản ứng tạo màu xanh đen với FeCl3 Các mẫu này có chứa hỗn hợp các flavonoit, các polyphenol có hệ số Rf rất gần nhau và việc tách chúng bằng cột silicagen chưa đạt được sự phân chia tốt

Khi rửa giải bằng CH3OH 100% thu được phân đoạn cho các phản ứng màu giống dịch chiết tổng số bằng n-butanol Khi thực hiện phản ứng thuỷ phân các mẫu này trong axit HCl 2N thu được glucozơ và axit gallic Từ kết quả thuỷ phân này có thể cho rằng các phân đoạn chiết bằng etylaxetat và bằng n-butanol đều chứa các tannin và đó là galotanin Tuy nhiên các tannin

ấy được tạo ra bởi liên kết C-glycoside hay O-glycoside cấu trúc và thứ tự liên kết của chúng như thế nào, còn chưa được làm rõ vì chưa tách chúng thành các đoạn sạch

52

Hình 3.13

53

Hình 3.14