NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH

VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN

TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2008

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ NGỌC

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH

VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN

CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC

MÃ SỐ: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS CHU HOÀNG MẬU

Thái Nguyên- 2008

M U

1 Lý do ch n tài

u t ng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghi p ng n ngày, có giá

tr kinh t và hàm l ng dinh d ng cao H t u t ng ch a 30 % - 56% protein,

ch a nhi u lo i axit amin không thay th (lysin, tryptophan, metionin, cystein,

leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) c n thi t cho c

th ng i và ng v t M t c tính quan tr ng n a c a cây u t ng là có n t s n

r t o kh n ng c nh nit không khí, vì v y tr ng u t ng góp ph n c i t o

t và b o v môi tr ng [20]

S n xu t u t ng phát tri n m nh t i M , Brazil, Argentina, Trung Qu c và

nhi u n c khác S n l ng u t ng trên th gi i t hàng tr m tri u t n/ n m Trong

khi ó, Vi t Nam s n l ng m i ch t tr m nghìn t n/ n m, u ó ch ng t tình

hình s n xu t u t ng n c ta so v i khu v c v n còn m c th p thúc y s n

xu t u t ng v n quan tr ng là ch n t o c nh ng gi ng không ch cho n ng

su t cao, ph m ch t t t mà còn ph i thích h p v i u ki n a hình khí h u

c ta có h sinh thái r t a d ng, khí h u gi a các vùng, mi n l i không

gi ng nhau a hình có n 3/4 là i núi th ng có mùa khô hanh mi n B c, mùa

khô nóng Tây Nguyên…Nh ng n m g n ây di n bi n khí h u ngày càng ph c t p,

ng m a phân b không u gi a các vùng và gi a các th i k trong n m nên h n

hán và n ng nóng kéo dài u t ng là cây t ng i m n c m v i u ki n ngo i

c nh và thu c vào nhóm cây ch u h n kém, công tác ch n t o các gi ng u t ng có

ki u gen ch ng ch u ngày càng c quan tâm nghiên c u [10], [18], [23]

Vi t Nam, ngu n gen c a cây u t ng r t a d ng và phong phú; ngoài

nh ng gi ng nh p n i, gi ng l i t o và gi ng t bi n, còn có t p oàn các gi ng

a ph ng Nh ng gi ng u t ng a ph ng th ng có n ng su t th p, nh ng

l i có ch t l ng h t t t và kh n ng ch ng ch u cao v i các u ki n b t l i c a

ngo i c nh c tính ch u nóng, ch u h n c a các gi ng u t ng này ã c

nhi u nhà khoa h c quan tâm nghiên c u [18], [24], [31], [36] Tuy nhiên, các tác

gi m i ch t p trung nghiên c u các gi ng u t ng tr ng các t nh trung du,

ng b ng và các t nh vùng núi phía B c, trong khi ngu n gen c a cây u t ngcác t nh khu v c Tây Nguyên n c ta c ng r t a d ng, có nhi u c tính quý còn ít

c quan tâm

Tây Nguyên là vùng t v i hai mùa rõ r t, mùa m a và mùa khô, mùa khô

th ng kéo dài gây thi u n c tr m tr ng d n n n ng su t, s n l ng cây tr nghàng n m gi m m nh trong ó có cây u t ng Vì v y, vi c ánh giá, tuy n ch ncác gi ng u t ng có n ng su t và ch t l ng, có kh n ng ch ng ch u h n caolàm v t li u ch n gi ng là yêu c u th c ti n t ra cho ngành ch n gi ng u t ng vùng t Cao Nguyên này T nh ng lý do trên chúng tôi ã ti n hành tài:

“Nghiên c u c m hóa sinh và phân l p gen chaperonin liên quan n tính

ch u h n c a m t s gi ng u t ng a ph ng tr ng vùng Tây Nguyên”

nh m ánh giá ch t l ng h t và tìm hi u gen liên quan n kh n ng ch u h n c acây u t ng trong i u ki n sinh thái khu v c Tây Nguyên

2 M c tiêu nghiên c u

- So sánh ch t l ng h t c a m t s gi ng u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên

- Nghiên c u kh n ng ch u h n, c s hóa sinh và phân l p gen liên quan

n kh n ng ch u h n c a m t s gi ng u t ng tr ng t i khu v c Tây Nguyên

3 N i dung nghiên c u

- Phân tích c m hình thái, kh i l ng và kích th c h t c a m t s

gi ng u t ng tr ng t i Tây Nguyên

- Xác nh hàm l ng protein, lipit trong h t c a các gi ng u t ng nghiên c u

- Phân tích thành ph n axit amin trong protein h t c a các gi ng u t ng

- Xác nh hàm l ng protein tan, ho t c a proteaza giai n h t n y m m

- ánh giá kh n ng ch u h n c a các gi ng u t ng giai n cây nontrong i u ki n h n nhân t o

- Xác nh hàm l ng prolin giai o n cây non 3 lá th i m tr c và saukhi x lý b i h n

- Nhân, tách dòng và c trình t gen chaperonin liên quan n tính ch u h n

c a m t s gi ng u t ng tr ng t i Tây Nguyên

Ch ng 1

NG QUAN TÀI LI U

1.1 CÂY U T NG

1.1.1 c m sinh h c c a cây u t ng

u t ng có tên khoa h c là Glycine max (L) Merrill, có b nhi m s c th

2n = 40, thu c thân th o, h u (Fabaceae), h ph cánh b m (Papilionoidea)

u t ng có ngu n g c t các t nh phía B c và ông B c Trung Qu c, các vùng

k c n c a C ng hòa liên bang Nga, Tri u Tiên và Nh t B n.Các gi ng u t ng

ang tr ng t i n c ta c du nh p t Trung Qu c t lâu i [13]

V hình thái, cây u t ng các b ph n chính là r , thân, lá, hoa và qu

R u t ng có r c c g m r cái và r bên, trên b r c a cây u t ng có

nhi u n t s n ch a vi khu n Rhizobium japonicum có kh n ng c nh nit t khí

tr i cung c p m cho cây, có vai trò c i t o t [9]

Thân u t ng có hình tròn, thân non có màu xanh ho c tím, khi qu chín

thì thân ng sang màu vàng nâu

Lá u t ng g m 3 lo i lá: lá m m, lá n và lá kép (có 3 lá chét ôi khi có

4-5 lá chét)

Hoa m c thành chùm nách lá, m i chùm hoa có t 10-15 hoa, có màu tr ng

ho c tím, hoa u t ng t th ph n hoàn toàn Qu có th th ng ho c cong có

nhi u lông, m i qu ch a t 1-5 h t nh ng thông th ng là 2-3 h t

H t u t ng không có n i nh mà ch có m t l p v bao quanh phôi và 2 lá

m m H t có hình tròn ho c hình b u d c, tròn dài, tròn d t, v h t u t ng có màu

nâu, en, vàng, xanh Kh i l ng h t r t a d ng t 20-400 mg/h t

n c vào th i gian sinh tr ng c a cây u t ng ng i ta chia làm 3 lo i:

Gi ng chín s m (75-85 ngày), gi ng chín trung bình (80-100 ngày), và gi ng chín

mu n (110-120 ngày) Th i gian sinh tr ng là m t y u t quan tr ng l a ch n

cây tr ng luân canh t ng v [28]

1.1.2 Giá tr kinh t c a cây u t ng

u t ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây th c

ph m, v a là cây c i c i t o t V i u th ng n ngày, tr ng c nhi u v trong

m, có th tr ng thu n, tr ng xen, luân canh g i v , tr ng c nhi u vùng sinhthái khác nhau, vì v y sau lúa và ngô, cây u t ng có m t vai trò c bi t quan

tr ng trong n n nông nghi p nhi t i

V m t dinh d ng, h t u t ng có thành ph n dinh d ng cao ch a 56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là ngu n axit amin, vitamin (B1, B2,

30-C, D, E) r t quan tr ng i v i i s ng c a con ng i Protein u t ng còn cótác d ng h u hi u gi m cholesterol trong máu, gi m thi u nguy c các b nh liênquan n tim m ch, chúng c ng ng n c n s phát tri n các m m ung th , ng n ng a

b nh th n, b nh ti u ng, b nh x p x ng

Trong công nghi p, s n ph m t cây u t ng c s d ng r t a d ng

nh dùng tr c ti p h t khô ho c ch bi n thành u ph , ép thành d u u t ng,làm bánh k o, s a u, n c gi i khát, n c ch m áp ng nhu c u m trong

kh u ph n n hàng ngày c a ng i c ng nh gia súc

nh ng qu c gia phát tri n, ng i ta còn dùng u t ng vào các k nghkhác nh bi n ch cao su nhân t o, m c in, s n, xà phòng, ch t t nhân t o, ch tnhiên li u l ng, d u làm tr n trong k ngh hàng không

Trong tr ng tr t, cây u t ng còn có tác d ng c i t o t, t ng n ng su tcác cây tr ng khác u này có c là do ho t ng c nh N2c a loài vi khu n

Rhizobium c ng sinh trên r cây Nh kh n ng c nh m nên sau m i v thu

ho ch thành ph n hóa tính c a t tr ng c c i thi n rõ r t, l ng m trong t

t ng và khu h vi sinh v t hi u khí trong t ng t ng Do ó, có l i i v i cây

tr ng khác và sau khi thu ho ch toàn b thân lá, r , lá ph l i b m t t v a có tác

d ng che ph ch ng xói mòn, v a là ngu n h u c giàu m c i t o t

1.1.3 Tình hình s n xu t u t ng trên th gi i và Vi t Nam

Trên th gi i (tính n tháng 4/ 2006), có 78 n c tr ng u t ng v i di ntích là 91,3 tri u ha; n ng su t 22,9 t / ha, s n l ng t 236,1 tri u t n Các n c

s n xu t u t ng ng u th gi i là: M , Brazil, Argentina và Trung Qu cchi m kho ng 90-95% t ng s n l ng u t ng trên toàn th gi i [45]

Nh v y, có th th y u t ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n kinh t

th gi i không ch do c gieo tr ng trên di n tích l n 78 n c, mà h t u t ng

còn c s d ng r ng rãi làm th c ph m và nguyên li u cho công nghi p

B ng 1.1 S n l ng u t ng c a m t s n c trên th gi i niên v 2006 – 2007

(Theo Oil World); n v tính: tri u t n

Vi t Nam, trong vòng h n 20 n m qua (t 1985- 2006) di n tích, n ng

Hi n nay cây u t ng c tr ng c 7 vùng nông nghi p trên c n c,

do i u ki n sinh thái c a m i vùng khác nhau nên có s khác bi t khá rõ v di ntích tr ng, n ng su t và s n l ng [21]

B ng 1.3 Di n tích, n ng su t và s n l ng u t ng c a 7 vùng n m 2005

(1000 ha)

ng su t (Kg/ha)

S n l ng (1000 t n)

ng 3.1 cho th y Tây Nguyên là vùng có di n tích tr ng u t ng l n th

3 trong 7 vùng nông nghi p trên c.Cùng v i s ng tr ng a các lo i cây

tr ng chính nh cao su, cà phê, h tiêu, ca cao….thì cây u t ng ng ang cchú tr ng và phát tri n trên vùng t này

M c dù, s n l ng u t ng n c ta có t ng nh ng so v i các n c trên

th gi i và trong khu v c n ng su t c a ta v n còn th p, và c bi t trong nh ng

m g n ây di n tích, n ng su t và s n l ng u t ng c a n c ta gi m i áng

sinh thái nh ng vùng khác nhau b ng ph ng pháp truy n th ng k t h p v i hi n

i s áp ng c yêu c u c a th c ti n t ra và ó c ng là chi n l c quan

tr ng v s phát tri n cây u n c ta

1.1.4 Thành ph n hóa sinh h t u t ng

Trong h t u t ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein

30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các

vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nh a, cellulose Ngoài ra, h t u t ng

còn có các axit amin c b n isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin,

tryptophan, valin [20]

Protein là thành ph n ch y u trong h t u t ng Chúng chi m kho ng

30%-55% kh i l ng khô c a h t D a vào h s l ng, ng i ta chia protein c a h t

u t ng thành 3 lo i: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin Nh ng lo i

protein chính trong h t u t ng là: protein d tr (chi m 70% t ng s protein),

các enzim, các ch t c ch proteaza và lectin Thành ph n c a protein g m có

albumin (9,5%), globulin tan trong n c (75,8%), globulin ch tan trong NaCl là

3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25]

Thành ph n axit amin c a h t u t ng: Protein c a các lo i u ,

nh t là u t ng, c xem là protein có ch t l ng t t nh t trong các lo i protein

th c v t Chúng có ch a t t c các axit amin không thay th H n n a protein c a

cây h u còn có hàm l ng lysin r t cao so v i protein t các lo i ng c c.Tuy

v y, hàm l ng các axit amin có ch a g c SH (metionin, cystein) còn th p [8], [40]

Hàm l ng lipit trong u t ng khá cao chi m kho ng 12-25% kh i

ng khô, trong ó hàm l ng các axit béo no th p, kho ng 13%, không có

cholesterol, 30% là các axit béo ch a no m t n i ôi L ng axit béo không no c n

thi t: axit linoleic 50%, và c bi t có 7% axit anpha linolenic là ngu n cung c paxit béo chu i m ch dài omega 3 quan tr ng cho c th nh DHA (DocosaHexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44]

Ch t l ng lipit c a h t u t ng r t t t, cho nên nó c s d ng r ng rãitrong công nghi p ch bi n th c ph m H t u t ng còn có các lo i vitamin tantrong lipit, c bi t là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong h t u

ng còn ch a m t s ch t khác nh hydrat cacbon, mu i khoáng, axit nucleic,kích thích sinh tr ng

Tóm l i, h t u t ng có giá tr dinh d ng cao.Trong ó, hàm l ngprotein d tr và ch t l ng c a chúng là y u t quy t nh làm cho u t ng trthành ngu n th c ph m quan tr ng cho ng i và th c n cho gia súc [18]

1.2 NGHIÊN C U V C TÍNH CH U H N C A CÂY U T NG 1.2.1 Khái ni m v h n và tác ng c a h n n th c v t

H n i v i th c v t là khái ni m dùng ch s thi u n c do môi tr nggây nên trong su t quá trình hay t ng giai n, làm nh h ng n sinh tr ng vàphát tri n c a cây

Thi u n c tr c tiên nh h ng n s cân b ng n c c a cây, t ó nh

ng n ch c n ng sinh lý nh quang h p, hô h p dinh d ng khoáng và cu icùng nh n s sinh tr ng phát tri n c a th c v t Cây s ch t non ho c gi m s c

s ng, gi m n ng su t [19]

Hi n t ng m t n c có th do tác ng s c p, là k t qu c a s thi u n ctrong môi tr ng, ho c là tác ng th c p c gây ra b i nhi t th p, s tnóng hay tác ng c a mu i H n c ng nh y u t ngo i c nh b t l i khác khi tác

ng lên c th th c v t s gây ra ph n ng c a c th Tùy theo t ng loài, gi ng

mà m c ph n ng c a c th c ng nh thi t h i do khô h n gây ra khác nhau:

m t s b ch t, m t s b t n th ng nh ng c ng có m t s khác không b nh

ng Kh n ng th c v t có th gi m thi u m c t n th ng do thi u h t n c gây

ra g i là tính ch u h n [19]

Vi t Nam là m t n c có a hình a d ng và di n bi n khí h u ph c t p, l ng

a phân b không u gi a các vùng, mi n và gi a các th i k trong n m nên h n

hán có th x y ra b t k mùa nào, vùng nào Di n tích có t i 3/4 lãnh th là i núi,

t canh tác c a các khu v c này th ng xuyên b h n nên thành ph n th nh ng c a

các vùng khác nhau r t rõ r t T t c các y u t trên chi ph i m nh m m c n c ng m

và kh n ng gi n c c a t ch ng l i khô h n cây có th gi không b m t

c, gi m di n tích lá, rút ng n chu k s ng…Kh n ng duy trì áp su t th m th u n i

bào có tác d ng b o v ho c duy trì s c s ng c a t bào ch t khi b m t n c [2] Có

hai lo i h n do môi t ng tác ng là h n t và h n không khí [1], [5]

Tác ng a n lên cây ch y u theo hai h ng chính là: làm t ng nhi t

cây và gây m t n c trong cây N c là y u t gi i h n i v i cây tr ng, v a là s n

ph m kh i u v a là s n ph m trung gian và cu i cùng c a các quá trình chuy n hoá

sinh h c N c là môi tr ng các ph n ng trao i ch t x y ra [2]

S tác ng c a h n, gây nên hi n t ng co nguyên sinh và làm cho cây b

héo S co nguyên sinh các t bào di n ra khi n ng n c trong môi tr ng quá

cao hay do h n n c làm cho n c trong t bào th t thoát ra ngoài nên kh i

H n hán làm gi m m nh quang h p Khi hàm l ng n c trong lá còn

kho ng 40-50% quang h p c a lá s b ình tr c n tr s sinh tr ng c a cây

Nh v y, nh h ng c c oan c a h n b t c giai n sinh tr ng nào c a

cây tr ng c ng nh h ng n các y u t c u thành n ng su t và s n l ng cây tr ng

1.2.2 C s sinh lý, sinh hóa và sinh h c phân t c a tính ch u h n

1.2.2.1 C s sinh lý, sinh hóa c a tính ch u h n

Khi g p h n th c v t luôn có nh ng bi n i v m t sinh lý, sinh hóa nh m

không m t n c Có hai c ch b o v th c v t t n t i trên môi tr ng thi u

c ó là vai trò c a b r và kh n ng u ch nh áp su t th m th u [2]

Vai trò c a b r : kh n ng thu nh n n c ch y u ph thu c vào b r

tránh m t n c nh ng cây ch u h n th ng có b r kh e, dài, m p, có s c xuyên

sâu s hút c n c nh ng n i sâu trong t ho c r lan r ng v i s l ng l n

[19] Th c v t nói chung, và cây u t ng nói riêng, khi giai n cây non

th ng ch u tác ng m nh c a h n vì b r ch a phát tri n y còn y u

Kh n ng u ch nh áp su t th m th u (ASTT): là m t c tính quan tr ng

c a t bào khi b m t n c do nóng h n Nh ng th c v t t n t i trên môi tr ng m tcân b ng v áp su t th m th u òi h i ph i có kh n ng ch ng l i u ki n kh cnghi t ó Trong u ki n khô h n ASTT c u ch nh t ng lên giúp cho t bàothu nh n c nh ng phân t n c t t B ng c ch nh v y, th c v t có th v tqua c tình tr ng h n c c b

Thông th ng, thi u n c gây r i lo n toàn b ph ng th c chuy n hóa

th c v t, làm t ng ho c gi m hàm l ng các ch t chuy n hóa nh : ng lên v hàm

ng prolin, n ng ion K+, các lo i ng, axit h u c [2], [4], [30] S t ng

h p và tích l y các ch t trên di n ra r t nhanh khi t bào m t n c, các ch t hòa tan

s c tích l y nh m ch ng l i vi c gi m m t n c, t ng kh n ng gi n c c a

ch t nguyên sinh và chúng có th t ng tác v i lipit ho c protein màng ng n ch n

s phá h y màng và các ph c protein [24] Quá trình này liên quan n s bi u hi n

c a các gen, hàng lo t các gen ngh c ho t hóa t ng h p t o ra các ch t c n thi t

ch ng l i s khô h n [1]

c ta n m trong khu v c nhi t i gió mùa h n là y u t t ng xuyên tác

ng gây nh h ng n sinh tr ng, phát tri n c a cây tr ng, nh h ng x u n

ng su t và ph m ch t c a chúng Vì v y, vi c nghiên c u các c ch ch u h n s

là c s cho vi c c i thi n gi ng c ng nh t o ra c các gi ng có tính ch ng ch u.Khi nghiên c u v kh n ng ch ng ch u c a các cây tr ng l y h t ng i ta

th c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tích hóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm l ng protein tan, thành

ph n axit amim, prolin

Các proteaza óng vai trò quan tr ng trong c th s ng và nh t là trong th i

k n y m m c a h t Chúng r t a d ng Thành ph n ph c t p c a các proteaza h t

c t o ra b i s a d ng ch c n ng do chúng m nhi m trong th i k n y m m.Proteaza nói chung không ch tham gia vào phân gi i protein d tr trong h t, nh mcung c p các axit amin cho th i k phát tri n u tiên c a cây mà chúng còn tham giavào quá trình vi x lý phân t protein Proteaza tham gia vào phân gi i các protein l

ho c b bi n tính khi g p u ki n c c oan (l nh, m n, h n, tác ng c h c ) [18].

Tr n Th Ph ng Liên (1999) khi nghiên c u so sánh ph n di ho t tính proteaza

c a các gi ng u t ng ch u nóng ch u h n khác nhau ã nh n xét r ng Proteaza

trong quá trình h t n y m m c a h t t t c các gi ng u t ng nghiên c u r t a

d ng, có ho t tính cao, có kh n ng phân gi i hoàn toàn protein d tr t o nguyên

li u t ng h p protein cho c th m i X lý nhi t cao ch nh h ng n ho t

tính proteaza m t s gi ng ch u h n, không nh h ng n gi ng ch u nóng [18]

Nguy n Th Kim Dung (2003) nghiên c u s bi n ng ho t proteaza giai

o n h t n y m m c a các gi ng l c ã rút ra k t lu n, ho t c a proteaza trong

giai o n h t n y m m có xu h ng t ng t 1 n 5 ngày tu i, sau ó gi m t 7 n

9 ngày tu i [6] C ng theo h ng nghiên c u này Nguy n Th Thu Ngà (2007), cho

r ng các giai n h t n y m m làm bi n i ho t c a proteaza và hàm l ng

protein tan S bi n i này tuân theo quy lu t chung : t ng các giai n t 3 n

7 ngày tu i, b t u gi m giai n 9 ngày tu i, hàm l ng protein tan và ho t

proteaza có m i t ng quan thu n ch t ch [29]

Nh ng thay i hóa sinh khác do h n gây ra c ng c nhi u tác gi quan

tâm nghiên c u: nh s thay i hàm l ng prolin khi cây g p h n

Prolin là m t axit amin có vai trò quan tr ng trong s u hòa ASTT trong

t bào, ng th i là m t axit amin a n c có kh n ng gi và l y n c cho t bào,

ng n ch n s xâm nh p c a ion Na+ t ng tác v i protein màng, ng n ch n s phá

h y c a màng và các ph c protein khác Các k t qu nghiên c u u cho th y khi cây

tr ng g p h n thì cây gi m t ng h p protein và t ng t ng h p prolin [26], [28]

Soulages và cs (2003) ã ch ng minh ngoài vai trò t ng c ng kh n ng ch u

h n thì chu i axit amin L – Prolin nhóm II còn có kh n ng ch ng l i các tác ng

b t l i c a nhi t i v i cây u t ng [ 38] Theo inh Th Phòng (2001), lúa

khi gây h n sinh lý b ng dung d ch sorbitol 5% hàm l ng prolin c a các dòng ch n

l c t ng lên v t xa so v i i ch ng, s t ng hàm l ng prolin liên quan n kh

ng ch u h n [30] Kh o sát ch t l ng h t và kh n ng ch u h n c a m t s gi ng

lúa c n a ph ng vùng núi phía B c, Chu Hoàng M u và cs ( 2005) ã nh n xét,

kh n ng ch u h n c a các gi ng lúa c n có liên quan n hàm l ng protein và hàm

ng prolin Khi g p h n, cây lúa c n gi m hàm l ng protein và t ng hàm l ngprolin [24] Nguy n Th Thúy H ng ( 2006), khi nghiên c u v kh n ng ch u h n c acác gi ng u t ng a ph ng c a T nh S n La c ng ã nh n xét r ng: khi g p h ncác gi ng u t ng có s gi m t ng h p protein và t ng c ng t ng h p prolin [26 ]

i u ki n ngo i c nh Bi u hi n c a quá trình này là vi c sinh t ng h p m t lo t các

ch t trong t bào, m t s hormon ho c ch t kích thích giúp cho cây có kh n ngthích ng Khi i sâu vào nghiên c u m c phân t c a hi n t ng nóng h n

th c v t ng i ta ã có nh ng b c ti p c n khác nhau trên nhi u loài cây tr ng các giai o n phát tri n khác nhau c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n

ph m bi u hi n gen [19] Nhóm các protein c c bi t quan tâm bao g m:protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA

Protein s c nhi t (heat shock protein- HSP): HSP có h u h t các loài

th c v t nh : lúa mì, m ch, lúa g o, ngô, u nành, hành, t i… chúng chi mkho ng 1% protein t ng s trong lá c a các loài th c v t này HSP c t ng h pkhi t bào g p i u ki n c c oan nh : h n, nhi t cao, mu i cao S xu t hi n

c a HSP có ch c n ng ng n c n ho c s a ch a s phá y do stress nóng và m

r ng giá tr ng ng v i s ch ng ch u nhi t cao Trong các t bào th c v t HSP

t bào ch t t p trung thành các h t s c nhi t (HSG-Heat Shock Granules) Ng i tacho r ng các HSP g n k t trên các ARN polymeraza ng n c n s phiên mã t ng

h p mARN trong quá trình b stress nóng Sau s c nóng các h t này phân tán vàliên k t dày c v i các ribôxôm ho t ng sinh t ng h p protein [19]

HSP có th chia làm 6 nhóm d a trên c s kh i l ng phân t khác nhau:

110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa Trong ó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhi u i

di n c a ch t môi gi i phân t (g i là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có ch c

ng b o v cho t bào nh ng không ph i là môi gi i phân t Ubiquitin có ho t

tính proteaza v i ch c n ng phân gi i các protein không có ho t tính enzym

Ubiquitin có MW r t th p, ít ch u nh h ng c a nhi t nên có vai trò t s a ch a

c a t bào khi g p y u t c c oan, c bi t là nhi t cao [19]

Môi gi i phân t (MGPT): MGPT là m t nhóm g m nhóm g m nhi u lo i

protein khác nhau, nh ng chúng u có ch c n ng tham gia t o c u trúc không gian

úng cho protein trong t bào Ph n l n các ch t MGPT có ho t tính ATP-aza, có

ch c n ng: (1) Gi n nh chu i polypeptit khi ang t ng h p và t o c u trúc

không gian úng cho chúng, (2) T o l i c u trúc không gian c a protein sau khi v n

chuy n qua màng t bào, (3) L p ráp các chu i polipeptit vào ph c t o c u trúc

b c 4, (4) MGPT c t ng c ng nh quá trình t ng h p trong u ki n c c oan

do nhu c u c p thi t c a t bào, nh t là s c nhi t

H CCT: Chaperonin c a t bào ch t, còn g i là chaperonin ch a

polypeptit-l c a ph c t (CCT), hay còn g i polypeptit-là ph c vòng ch a popolypeptit-lypeptit-polypeptit-l c a ph c t (TriC) polypeptit-là

m t nhóm môi gi i phân t m i Chúng giúp cho vi c t o c u trúc không gian úng

c a protein trong khung t bào actin và tubulin trong t bào ch t Chúng óng vai

trò quan tr ng trong qua trình hình thành thoi vô s c c a giai n phân bào, c

bi t là th i k phát tri n m m t h t Chaperonin t bào ch t là m t ph c có kh i

ng phân t kho ng 90 kDa bao g m 8 ti u n v có tên làα, , , , , , ,

(t ng ng v i CCT1- CCT8) và hình thành nên c u trúc vòng bi kép [16] Trong

d ch chi t t bào các ti u n v trong c u trúc không gian c a vòng bi có vai trò r t

quan tr ng g n c ch t Ch c n ng này g n li n v i s có m t c a 4 ti u n v :CCTα Vì quá trình t o c u trúc không gian trong CCT không có s tham gia

c a protein d ng GroES, nên c ch t protein c gi l i trong kh i hình tr nh c

ch óng m c bi t theo ki u b c thang c a các vùng CCT Ngoài CCT còn có hainhóm nhân t cùng tác ng A và B tham gia vào c u trúc không gian úng c aprotein Trong ó nhóm nhân t A không óng vai trò trong công vi c u ch nh

ho t tính c a CCT Nó không tham gia t ng tác v i CCT nh ng l i tham gia vào

t o c u trúc không gian úng c a protein khi gi i phóng ra kh i CCT [18].Các nhóm HSP 100, HSP 90 u có tính b o th cao và có ho t tính ATP-aza M t s tìm th y trong t bào bình th ng, nh ng ph n l n chúng sinh ra khi

g p các u ki n ngo i c nh b t l i nh h n, nóng, l nh Ch c n ng chính c achúng là ng n ch n s co c m c a protein và tái ho t hoá các protein bi n tính [19]

1.2.3 Nghiên c u v tính ch u h n cây u t ng

Trong các cây tr ng l y h t thì cây u t ng có nhu c u v n c cao h ncác lo i cây khác ó chính là do trong h t và cây u t ng có hàm l ng protein

và lipit r t cao, t ng h p 1kg ch t khô c n 500 - 530 kg n c Trong quá trình

n y m m thì nhu c u v n c c a u t ng c ng khá cao 50%, trong khi ó ngô

ch là 30%, lúa là 26% [20 ]

Nghiên c u v các c tính ch u h n c a cây u t ng v ph ng di n sinh

lý và di truy n ã cho th y r ng, các c tính này liên quan ch t ch n c mhoá keo c a nguyên sinh ch t, c m c a quá trình trao i ch t Tính ch u h n

c a cây u t ng là tính tr ng a gen Chúng th hi n nhi u khía c nh khác nhau

nh : v s phát tri n c a b r , tính chín s m t ng i, c ng nh b n ch t ditruy n c a t ng gi ng có kh n ng s d ng n c ti t ki m trong quá trình sinh

tr ng và phát tri n c a cây n c vào c m này, u t ng c chia thànhhai nhóm [18]

- Nhóm ch u c s m t n c trong t ng giai n phát tri n c a cây

- Nhóm ch u c s thi u n c trong t t c giai n phát tri n c a cây

giai n cây con khi g p h n, u t ng có th d v t qua h n, còn

nh ng giai n sau nh giai o n ra hoa, k t qu , h t chín s a mà g p h n thì s

d n n n ng su t gi m áng k

Trong nh ng n m g n ây các nhà khoa h c ã có nhi u thành công khi

nghiên c u sâu h n v tính ch u h n c a cây u t ng

Maitra và Cushman (1994) ã phân l p c cDNA c a dehydrin t lá u

ng khi b m t n c, ngoài ra các tác gi còn phân l p c cDNA c a LEA nhóm D

- 95 t lá và r cây u t ng khi b h n [36]

Jinn và các tác gi khác (1997) nghiên c u v sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ã

nh n th y, chúng t ng lên l ng l n trong m m u t ng d i tác ng c a nhi t

c tìm th y c u trúc d ng h t trong nguyên sinh ch t và trong nhân cùng v i

protein b bi n tính.[35]

m 2004, nhóm nghiên c u g m Huang và cs c a Tr ng i h c T

nhiên và K thu t Pingtung, ài Loan, ã phân l p c gen P5CS u t ng t

mARN v i kích th c 2148bp [45] Gen P5CS là nhân t gi i h n cho nh p t ng

h p proline th c v t trong u ki n b t l i do h n và do m n gây nên [39]

Nghiên c u c a Porcel và Cs (2005), ã ch ra r ng, gen mã hoá protein dehydrin

(LEA-DII) có vai trò v i kh n ng ch ng ch u c a u t ng

Vi t Nam ã có m t s công trình nghiên c u phân l p các gen liên quan

n kh n ng ch u nóng, ch u h n c a cây u t ng Nghiên c u phân l p và c

trình t gen chaperonin t gi ng u t ng ch u nh Bonminori- Nh t n v i kích

th c phân t 1,6 kb c a Nông V n i và cs (1997) [12] Nghiên c u c a Tr n Th

Ph ng Liên (1999) ã phân l p, xác nh trình t gen chaperonin t bào ch t CCT

t gi ng u t ng t bi n M103 v i kích th c 1602 bp mã hóa cho 533 axit

amin Trình t gen này có s thay i axit amin 3 v trí 99 (Ser Thr), 280 (Ser Gly)

và 308 ( Ser Ala), s thay i này tuân theo quy lu t t ng kh n ng ch u nhi t

Tác gi kh ng nh s thay i này là c n c lý gi i kh n ng ch u nóng c a gi ng

t bi n M103 [18] Tr n Th Ph ng Liên và cs (2003), ã phân l p c gen

chaperonin CCTδ t gi ng u t ng a ph ng ch u n Cúc Vàng, gen này g m

1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17] Nguy n Th Thu Hi n (2005), phân

l p c gen dehydrin v i kích th c 751bp liên quan n kh n ng ch u h n t hai

gi ng u t ng vàng M ng Kh ng và Cao B ng 4 [11]

1.3 NH N XÉT CHUNG

1.3.1 u t ng là cây tr ng có giá tr kinh t cao, là cây công nghi p, cây

th c ph m, v a là cây c i c i t o t c tr ng ph bi n nhi u qu c gia trên th

gi i Vi t Nam, cây u t ng chi m m t v trí quan tr ng trong n n nôngnghi p Trong nh ng n m g n ây n ng su t và s n l ng u t ng tuy có s t ngáng k , nh ng so v i các n c trên th gi i n ng su t c a các gi ng u t ng

c ta còn m c th p

1.3.2.Trong h t u t ng có các thành ph n ã bi t tính theo t l protein30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các mu i khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; cácvitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ó, hàm l ng protein d tr và ch t l ng c achúng là y u t quy t nh làm cho u t ng tr thành ngu n th c ph m quan

tr ng cho ng i và th c n cho gia súc

1.3.3 u t ng là lo i cây có nhu c u v n c cao h n các lo i cây tr ngkhác, thu c vào nhóm ch u h n kém H n ã nh h ng l n n quá trình sinh tr ng,phát tri n c a cây u t ng và làm gi m n ng su t, ch t l ng Nghiên c u v tính

ch u h n c a cây u t ng ng i ta th c hi n theo nhi u h ng khác nhau: phân tíchhóa sinh trong h t n y m m nghiên c u a d ng enzym - amylaza và proteaza hàm

ng protein tan, thành ph n axit amin i sâu vào nghiên c u m c phân t ,

c nghiên c u nhi u nh t là các protein s n ph m bi u hi n gen Nhóm các protein

c c bi t quan tâm bao g m: protein s c nhi t, môi gi i phân t , LEA

1.3.4 Trên th gi i ã thành công trong vi c nghiên c u gen mã hóa protein

u t ng và các trình t gen này ã c công b trên ngân hàng gen th gi i

T i Vi t Nam, ã có m t s tác gi nghiên c u v tính ch u h n và ã phân l p, gi itrình t gen liên quan n tính ch u h n c a cây u t ng, trong ó có chaperonintrên các gi ng u t ng khác nhau Tuy nhiên, vi c nghiên c u các gi ng u

ng a ph ng c a các t nh khu v c Tây Nguyên còn ít c quan tâm chú ý

Ch ng 2 NGUYÊN LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U

2.1 NGUYÊN LI U

2.1.1 Nguyên li u th c v t

Các gi ng u t ng a ph ng: Az mpa Gia Lai (AZP), Sa Th y

-Kon Tum (ST), Ch mnga- k L k (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truy n

th c v t - Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p

Gi ng a ph ng Duy Linh- Lâm ng (DL) và gi ng i ch ng HN9 do

Trung tâm Khuy n Nông t nh k L k cung c p

5 Az mpa AZP Gi ng a ph ng, Az mpa- Gia Lai

2.1.2 Hóa ch t, thi t b và a m nghiên c u

Hóa ch t: dùng cho các thí nghi m phân tích hoá sinh và sinh h c h c phân

t : g m các lo i hoá ch t mua c a các hãng Anh, c, M , Trung Qu c: EDTA,

CTAB, TAE, Agarose…

Các hóa ch t thông d ng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol

(70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, n c kh ion,

NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin…

Thi t b : Các thi t b chính c s d ng phân tích hoá sinh và sinh h c

phân t g m:

- Máy quang ph UV-Vis Cintra 40 (Australia)

- Máy i n di + b ngu n PowerPac 300 (Bio-Rad, M )

- Máy phân tích axit amin t ng - HP amino Quan SeriesII (HewlettParkard, M )

- Máy phân tích trình t gen ABI 3100 Genetic Analyzer (M )

- B n nhi t (Techne, OSI, Anh)

- Máy PCR (ABI System, M )

- Máy soi ADN (Bio-Rad, M )

- Máy li tâm l nh ( c)

- Máy khu y tr n Voltex ( c)

- Máy o pH (Metter Toledo, Th y S )

a m nghiên c u: Các thí nghi m c th c hi n t i Phòng thí nghi m

Di truy n h c và Công ngh gen, Khoa Sinh- KTNN, Tr ng i h c S ph m

-i h c Thá-i Nguyên Các phân tích ax-it am-in t ng và xác nh trình t gen

c th c hi n t i Phòng thí nghi m tr ng m Công ngh gen, Vi n Công nghsinh h c, Vi n Khoa h c và Công ngh Viêt Nam

2.2 PH NG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1 Ph ng pháp hoá sinh

2.2.1.1 Phân tích hóa sinh giai n h t ti m sinh

Hàm l ng lipit =A B(%)

A

−Trong ó: A: Kh i l ng m u ban u

B: Kh i l ng m u sau khi lo i lipit

(2) Xác nh hàm l ng protein

Protein tan t ng s xác nh theo ph ng pháp Lowry c mô t trong tài

li u c a Ph m Th Trân Châu và cs (1998) [3]

Cân 0,05g m u ã nghi n nh , s y khô cho vào ng Eppendorf, m i m u l p

l i 3 l n Cho vào m i ng 1,5ml dung d ch m photphat citrat ( pH=10 ), o u

b ng máy voltex, trong t l nh 4oC qua êm, em ly tâm thu d ch 12000

vòng/phút trong 20 phút r i thu l y d ch Thí nghi m c l p l i 3 l n

D ch chi t c nh m c lên 5ml và o h p th quang ph trên máy quang

(3) Xác nh hàm l ng và thành ph n axit amin trong h t

Hàm l ng axit amin c xác nh trên máy HP - Amino Quant s d ng

ortho-phtalADNehyt t o d n xu t i v i các axit amin b c 1 và 9 fluoreryl

-metyl - cloroformat i v i các axit amin b c 2 M u c x lý theo ph ng pháp

thu phân pha l ng theo h ng d n s d ng máy phân tích axit amin t ng

2.2.1.2 ánh giá kh n ng ch u h n thông qua phân tích m t s ch tiêu hóa

sinh giai n h t n y m m

(1) Chu n b m u

H t các gi ng u t ng c ngâm trong n c 1h, sau ó c m

b ng dung d ch MS pha loãng 10 l n ch a sorbitol 7% H t n y m m sau các

th i gian 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày c l y xác nh ho t

c proteaza và hàm l ng protein tan i ch ng là h t u t ng c b ng

ng chu n xây d ng b ng tyrosin, và c tính theo công th c:

VH /mg = (n k) D HSPL

T m

− × ×

×Trong ó:

n: s o trên máy ng thí nghi m (mg/ml)HSPL: h s pha loãng

k: s o trên máy ng ki m tra (mg/ml)m: kh i l ng m u (mg)

D: s ml d ch chi tT: th i gian enzym v i c ch t

H t u t ng n y m m gieo vào ch u (kích th c 30cm x 30cm) ch a cát

vàng ã r a s ch, m i ch u tr ng 30 cây, m i gi ng tr ng 4 ch u Thí nghi m c

l p l i 3 l n trong i u ki n và ch ch m sóc nh nhau Th i gian u t i n c

cho m, khi cây u t ng c 3 lá ti n hành gây h n nhân t o và ánh giá kh

=

Trong ó:

W(%): Kh n ng gi n c c a cây sau khi x lý b i h n

Wft(g): Kh i l ng t i c a cây sau khi x lý b i h n (g)

Wfc(g): Kh i l ng t i c a cây không x lý (g)

(3) Xác nh t l thi t h i do h n gây ra c tính theo công th c

( ) (%)

o

N b a

T: T s kh i l ng c a r / thân lá khô

Wr: Kh i l ng khô c a r (mg)

Wtl: Kh i l ng khô c a thân lá (mg)

(6) Xác nh hàm l ng prolin theo Bastes (1973) [33].

Tách chi t prolin: Nghi n 0,5 gram thân lá cây u t ng ã x lý h n

ng ng tr c h n, h n 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong c i chày x , thêm 10ml dung

d ch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu d ch làm thínghi m o h p th quang ph b c sóng 520 nm

Hàm l ng prolin c tính theo công th c:

X % =

m AxHSPL

x 100%

M i thí nghi m c nh c l i 3 l n S d ng toán th ng kê xác nh tr s

th ng kê nh trung bình m u( x), ph ng sai (σ2

), và sai s trung bình m u(S x),

h s t ng quan R… theo tài li u c a Chu V n M n và cs (2001) [22] Các s li u

c x lý trên máy vi tính b ng ch ng trình Excel v i m c ý ngh aα = 0,05 [32]

Xác nh kho ng cách và thi t l p m i quan h gi a các gi ng u t ng b ng

Quy trình tách chi t ADN t ng s c th c hi n theo các b c sau:

- L y kho ng 200g m m u t ng ã l nh -850C nghi n nhanh trong

c i và chày x (c i chày ã c vô trùng và trong t -850C)

- B sung 0,8ml m r a, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, lo i b d ch n i

c này làm 2 l n

- Thêm 700µl m tách, mix nh , 650C trong 2h, sau ó l y ra nhi t

phòng 5 phút

- Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), tr n u 20 phút

- Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút Hút c n th n 500µl d ch trong sang ng

- Làm khô ADN trong box b t qu t

- Hòa tan ADN trong 50 µl n c kh ion

2.2.4.2 Ph ng pháp i n di ADN trên gel agarose

T o b n gel agarose v i n ng thích h p Dung d ch m dùng cho i n di

là TAE 1X Tra m u và ch y n di v i hi u n th là 80V -100V, sau ó ADN

c nhu m b ng ethidium bromide, soi d i èn UV và ch p nh

2.2.4.3 Ph ng pháp nhân b n n ADN thu c gen mã hóa cho chaperonin

o n gen ADN c hi u thu c gen chaperonin c a u t ng c nhân b n

b ng k thu t PCR v i c p m i MC1 và MC2 do hãng Invitrogen cung c pMC1: 5’- GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C

MC2: 5’- CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATATCA TC

S n ph m PCR c ki m tra b ng n di trên gel agaroza (nh mô t trên)

Quá trình g n c ti n hành 12 ti ng nhi t 140C Sau khi g n n ph m

c bi n n p vào E Coli DH5α Các khu n c E.coli ch a vect tái t h p mang

n ph m PCR c ch n l c trên môi tr ng LB ch a ampixilin, IPTG và Xgal

2.2.4.5 Ph ng pháp bi n n p ADN plasmit vào t bào E coli ch ng DH5α

- L y t bào kh bi n DH5α trong l nh – 750C trên á 30 phút

- Tr n 4µl dung ch ph n ng g n (ligate) vào ng t bào kh bi n, sau ó

trên á 30 phút

- S c nhi t 420C, th i gian 1 phút 30 giây, sau ó trên á 2 phút

- B sung 300µl môi tr ng LB ng, sau ó nuôi l c t c 200 v/p 370C

trong 1 gi

- C y tr i toàn b d ch t bào ã bi n n p trên m t a môi tr ng LB c

ch a ampixilin (100µg/ml), Xgal và IPTG

- Gi a c y vi khu n trong m 370C qua êm

2.2.4.6 Ph ng pháp tách chi t ADN plasmit t vi khu n

- L y m t khu n c E Coli ch a plasmit c y vào 2ml môi tr ng LB ng

c ng v i ch t kháng sinh ampixilin (n ng 100µg/ml) L c qua êm nhi t

370C, 200 vòng/ phút

- L y 1,5 ml ch nuôi c y vào ng eppendorf Li tâm 5000 vòng/ phút trong

10 phút thu c n t bào

- B sung 150µl dung ch I, tr n u b ng máy voltex

- B sung 150µl dung ch II, o nh b ng tay kho ng 3 l n

- Ti p c b sung 150µl dung ch III, o nh b ng tay kho ng 3 l n

- Thêm 400µl chlorofom: isoamyl alcohol (24:1) o nh

- Hòa c n ADN- plasmit trong 40µl TE có ARNaza ( n ng 100µl/ml)

- b n nhi t 370C trong 1 gi lo i ARN

- i n di trên gel azaroza 1% ki m tra

2.2.4.7 Ph ng pháp xác nh trình t gen b ng thi t b t ng

Xác nh trình t ADN theo ph ng pháp thông ng nh t ó là xác nh

tr c ti p thông qua ph n ng k t thúc u cu i- ph ng pháp enzym a Sanger[41] V i các n m i có g n hu nh quang và b hóa ch t chu n (kit) nhân trình

t gen b ng PCR v i Tap ADN polymeraza Chu trình nhi t: 950C 36 giây, 500C 36giây, 720C 84 giây, k t thúc 40C Sau ó s n ph m nhân gen có g n hu nh quang

c bi n tính b ng nhi t và phân tích trên máy xác nh trình t ADN t ng ABIPRISM 3100 Avant Genetic Analizer S li u nh n c x lý trên máy vi tính

b ng ph n m m Clustalx

Ch ng 3

T QU VÀ TH O LU N 3.1 ÁNH GIÁ CH T L NG H T C A 5 GI NG U T NG

NGHIÊN C U

3.1.1 c m hình thái, kích th c và kh i l ng h t 5 gi ng u t ng

nghiên c u

K t qu phân tích c m hình thái, kích th c và kh i l ng 1000 h t c a 5

gi ng u t ng a ph ng: Duy Linh- Lâm ng (DL), Sa Th y - Kon Tum (ST),

Ch mnga- k L k (CNg), Az mpa- Gia Lai (AZP), và gi ng i ch ng HN9 c

trình bày trên b ng 3.1 B ng 3.1 cho th y h u h t các gi ng u t ng u có hình

tròn, màu h t có màu vàng và vàng nh t Màu s c r n h t có màu nâu, nâu nh t và

en, ây là m t c tính quan tr ng trong vi c giám nh gi ng Riêng gi ng Duy

Linh -Lâm ng có hình thái r t khác bi t so v i các gi ng khác, c m chính c a

gi ng này: h t dài d t lõm gi a, màu h t tr ng xanh, r n màu nâu nh t

ng theo th t t cao n th p nh sau: HN9 >ST >CNg >AZP >DL

3.1.2 Hàm l ng protein và lipit trong h t c a 5 gi ng u t ng nghiên c u

H t u t ng g m có lipit, protein, hydratcacbon và các ch t khoáng Trong

ó protein và lipit là hai thành ph n quan tr ng c s d ng ánh giá ch t

ng h t trên ph ng di n hóa sinh K t qu phân tích hàm l ng lipit và protein

c a 5 gi ng u t ng c trình bày trong b ng 3 2

Trên ph ng di n hóa sinh, ch t l ng h t c a các gi ng u t ng c xác

nh d a vào k t qu phân tích hàm l ng protein, lipit và thành ph n axit amin trongprotein c a h t B ng 3.2 cho th y hàm l ng protein và lipit c a 5 gi ng u t ngnghiên c u khá chênh l ch nhau, hàm l ng protein dao ng trong kho ng t 33,12%

n 38,35%, k t qu này phù h p v i các tài li u ã công b [18], [24], [31] Trong ó

DL và AZP là 2 gi ng có hàm l ng protein cao nh t (38,35% và 37,87%), gi ng NH9

có hàm l ng protein th p nh t (33,12%) Hàm l ng protein c a 5 gi ng u t ng

c s p x p theo th t t ng d n là: NH9< ST< CNg< AZP< DL

Lipit là m t trong nh ng ch tiêu quan tr ng ánh giá ch t l ng h t T

k t qu phân tích b ng 3.2 cho th y hàm l ng lipit c a các gi ng nghiên c u dao

ng trong kho ng t 12,26% n 18,33% NH9 là gi ng có hàm l ng lipit cao

nh t (18,33%), gi ng DL có hàm l ng lipit th p nh t (12,26%), k t qu nghiên c u

chúng tôi cho th y r ng các gi ng u t ng a ph ng có hàm l ng lipit không

cao Hàm l ng lipit c a 5 gi ng u t ng c s p x p theo th t t ng d n: DL<

AZP< CNg< ST < NH9

Trong 5 gi ng u t ng nghiên c u, gi ng DL có hàm l ng protein cao

nh t (38,35%), nh ng hàm l ng lipit l i th p nh t (12,26 %) Gi ng NH9 có hàm

ng protein th p (33,12%) nh ng hàm l ng lipit l i cao (18,33%) Nh v y hàm

ng protein và lipit trong h t u t ng có m i t ng quan ngh ch [18], [25]

B ng 3.2 Hàm l ng protein và lipit c a h t 5 gi ng u t ng (%TL khô

Trong các cây h u, thì h t u t ng có hàm l ng protein cao nh t,

protein t ng s trong h t u t ng ch y u là protein d tr , tuy nhiên trong t bào

v n có nh ng n polypeptit m i c t ng h p, nh ng enzym nh proteaza,

amylaza….Các enzym này tham gia vào quá trình chuy n hóa các ch t nh : protein

d tr trong h t, tinh b t…cùng v i peptit là nh ng y u t tham gia vào quá trình

th m th u c a h t trong giai n n y m m [18] Vì v y, phân tích hàm l ng

protein và lipit trong h t là m t trong nh ng ch tiêu cho phép xác nh m c

ch ng ch u c a gi ng trên ph ng di n hóa sinh

3.1.3 Thành ph n axit amin trong protein h t c a 5 gi ng u t ng

Ch t l ng c a h t u t ng không nh ng ph thu c vào hàm l ng protein

mà còn ph thu c vào thành ph n axit amin trong protein h t B ng cách s d ng

ph ng pháp phân tích hàm l ng axit amin trong h t trên h máy HP- Amino Quant

và d a vào s c ký , chúng tôi ã xác nh c hàm l ng axit amin trong protein

h t c a 5 gi ng u t ng

Hình 3.2 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng DL

Hình 3.3 S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng ST

K t qu phân tích thành ph n và hàm l ng axit amin trong protein h t c a 5

gi ng u t ng, chúng tôi thu c 17 axit amin (3 axit amin còn l i, bình th ng

không phân tích c trên máy t ng), trong ó hàm l ng cystein và cystin c

tính chung, k t qu c trình bày b ng 3.3 Quá trình th y phân các m u nghiên

c u trong HCl s làm tryptophan b phân h y hoàn toàn, còn glutamin và asparagin

chuy n hóa thành axit glutamic và axit aspartic

B ng 3.3 Hàm l ng axit amin trong h t c a 5 gi ng u t ng (g aa/100g protein)

B ng 3.3 cho th y hàm l ng axit amin có ch a nhóm SH u th p: metionin

t (0,87g n 1,03g/100g protein) còn cystein và cystin t (0,58g n0,78g/100gprotein) Gi ng CNg có hàm l ng metionin cao nh t (1,03g/100gprotein), th p nh t là gi ng AZP (0,87g/ 100g protein) Trong 5 gi ng u t ngnghiên c u hàm l ng axit amin t ng s chênh l ch nhau không áng k , nh nghàm l ng m i lo i axit amin t ng gi ng l i có s khác nhau

u t ng c coi là lo i u ch a proterin có ph m ch t t t nh t trong s

các lo i protein th c v t Các axit amin không thay th (treonin, valin, metionin,

phenylalanin, isoleuxin, leucin, lysin) u có trong thành ph n axit amin c

nghiên c u Hàm l ng prolin c a các gi ng u t ng trong kho ng (4,39g n

5,42g/100g, trong ó CNg có hàm l ng này cao nh t (5.56g/100gprotein), th p

nh t là gi ng NH9 (4,39g/100g protein) Hàm l ng lysin trong kho ng t (11.30g

n 11,86 g/100g protein), cao h n so v i các lo i ng c c, trong ó gi ng DL và

AZP là 2 gi ng có kh n ng ch u h n có hàm l ng lysin cao nh t

(11,86g-11,69g/1000g protein) i u này làm t ng giá tr c a u t ng v m t dinh d ng

vì lysin v n là axit amin gi i h n trong g o và các lo i ng c c khác [18]

Hình 3.6.S c ký axit amin c a b t gi ng u t ng AZP

3.1.4 Nh n xét v c m hình thái, hóa sinh h t c a 5 gi ng u t ng

(3) Lipit dao ng trong kho ng t 12,53% n 18,33 % NH9 là gi ng cóhàm l ng lipit cao nh t (18,33%), hai gi ng AZP và DL có hàm l ng lipit th p

nh t (12,26% và 12,53%)

(4) ã xác nh c 17 lo i axit amin có trong h t c a 5 gi ng u t ngtrên, trong ó có 7 lo i axit amin không thay th Gi ng DL và AZP có hàm l nglizin cao nh t (11,86g và 11,69g)

3.2 ÁNH GIÁ KH N NG CH U H N C A 5 GI NG U T NG 3.2.1 Kh n ng ch u h n c a 5 gi ng u t ng nghiên c u giai n h t n y m m

3.2.1.1 Ho t a proteaza và hàm l ng protein tan trong h t n y m m khi

vi c tìm hi u v s bi n ng ho t proteaza và s phân gi i protein d tr tronggiai o n h t n y m m là m t trong nh ng c s ánh giá tính ch u h n c a cây h

u nói chung và cây u t ng nói riêng

Trong nghiên c u này chúng tôi ti n hành ánh giá kh n ng ch u h n c a 5

gi ng u t ng thông qua s bi n ng v ho t proteaza và hàm l ng proteingiai o n h t n y m m d i tác ng c a sorbitol n ng 7% Dung d ch sorbitol

t o áp su t th m th u cao, c nh tranh n c v i t bào h t làm cho h t không hút

c n c, gây ra s thi u n c trong t bào K t qu nghiên c u c trình bàytrên b ng 3.4