Tình hình nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các loại thuốc protein tái tổ hợp trong y học

Công nghệ sinh học ngày nay đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống. Trong những năm gần đây, chúng ta đã chứng kiến sự bùng nổ trong việc ứng dụng di truyền học, tế bào học, protein tái tổ hợp để nâng cao chất lượng cuộc sống; từ các phương pháp điều trị mới đến các xét nghiệm chẩn đoán nhanh chóng và các hướng liệu pháp điều trị mới trong y học. Hiện nay, trong y học, các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormon, enzym... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong công nghệ sinh học phân tử việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, growth hormon...mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khă

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Công nghệ sinh học ngày nay đang ngày càng đóng vai trò quan trọngtrong cuộc sống Trong những năm gần đây, chúng ta đã chứng kiến sự bùng nổtrong việc ứng dụng di truyền học, tế bào học, protein tái tổ hợp để nâng caochất lượng cuộc sống; từ các phương pháp điều trị mới đến các xét nghiệm chẩnđoán nhanh chóng và các hướng liệu pháp điều trị mới trong y học

Hiện nay, trong y học, các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càngđược sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormon, enzym Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là chiết

từ các bộ phận của động vật Tuy nhiên do nhu cầu ngày càng cao trong khinguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt nên việc tổng hợp proteintái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong công nghệ sinhhọc phân tử việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháptổng hợp sinh học Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá họcsong phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính tối ưu và thực tiễn cao Thực tếhiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một

số loại protein làm thuốc như insulin, growth hormon mà còn để tổng hợp rất nhiềuhợp chất khác mà nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặpkhó khăn

2 Mục tiêu của chuyên đề

2.1 Khái quát những nội dung cơ bản về protein và protein tái tổ hợp

2.2 Tổng hợp và phân tích tình hình nghiên cứu, phát triển và ứng dụng các loạithuốc protein tái tổ hợp trong y học

2.3 Nêu bật những định hướng phát triển, ứng dụng của protein tái tổ hợp cóhoạt tính sinh học cao nhằm phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng

3 Nội dung của chuyên đề

Chuyên đề sẽ được trình bày theo những nội dung chính sau:

Chương 2 Nguyên lý sản xuất và định hướng phát triển protein tái tổ hợp

CHƯƠNG 1 PROTEIN VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP

1.1 Protein

Protein được phát hiện lần đầu tiên ở thế kỷ XVIII (1745 bởi Beccari);mới đầu được gọi là allbumin (lòng trắng trứng) Mãi đến năm 1838 , Mulderlần đầu tiên đưa ra thuật ngữ protein (xuất phát từ chữ Hy lạp proteos nghĩa là

“đầu tiên”, “quan trọng nhất”)

Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thểsống Về mặt số lượng, nó chiếm hơn 50% trọng lượng khô của tế bào Về thànhphần cấu trúc, protein được tạo thành chủ yếu từ các amino acid qua liên kếtpeptide Cho đến nay người ta đã thu được nhiều loại protein ở dạng sạch cao cóthể kết tinh được và đã xác định được thành phần các nguyên tố hoá học, thôngthường trong cấu trúc của chúng gồm bốn nguyên tố chính là C H O N với tỷ lệ

C ≈ 50%, H ≈ 7%, O ≈ 23% và N ≈ 16% Đặc biệt tỷ lệ N trong protein khá ổnđịnh Ngoài ra trong protein còn gặp một số nguyên tố khác như S ≈ 0-3% và P,

Fe, Zn, Cu

1.2 Chức năng sinh học của protein

Ngoài vai trò là thành phần chính trong cấu trúc của tế bào và mô, proteincòn có nhiều chức năng phong phú khác quyết định những đặc điểm cơ bản của

sự sống như sự truyền đạt thông tin di truyền, sự chuyển hoá các chất đó là cácenzyme, các kháng thể chống lại bệnh tật, các hormon dẫn truyền các tín hiệutrong tế bào v.v đều có bản chất là các protein

Sự phát triển của sinh học phân tử dựa trên lý thuyết trung tâm “DNARNA Protein” Như vậy, sự biến đổi DNA sẽ dẫn đến sự biến đổi cấu trúc củaphân tử protein và do đó chức năng sinh học của nó sẽ bị biến đổi kéo theonhững thay đổi có liên quan đến toàn bộ cơ thể Trong quá trình tiến hoá củasinh vật sự hình thành và thích nghi một chức năng mới diễn ra ở một giai đoạnlịch sử lâu dài Sự xuất hiện một protein mới biến dạng (mất hoạt tính hoặc đột

Y học là ngành khoa học về sự sống, ngày nay với tiến bộ của khoa học,những hiểu biết về bệnh lý ở mức độ phân tử đã vượt ra khỏi giới hạn của giảiphẩu tế bào hoặc cơ quan Sinh học phân tử ra đời đã tạo ra cuộc cách mạngtrong các quan niệm về bệnh Từ đó, sự phát triển của bệnh học phân tử luônluôn đi kèm với sinh học phân tử.

Sự biến đổi cấu trúc của một protein hay sự xuất hiện các enzyme có cấutrúc bất thường đều do yếu tố di truyền gây nên Dựa theo các biểu hiện ditruyền người ta chia các protein bệnh lý ra làm hai loại lớn:

a Những biến đổi về số lượng của protein: Là sự thay đổi do sự tăng hoặc

giảm protein nào đó, thậm chí xuất hiện những protein mà tế bào bình thườngkhông tổng hợp một cách thường xuyên Những protein này vẫn có cấu trúc bìnhthường và như vậy không có những biến đổi của gene cấu trúc Những lệch lạcnày do rối loạn quá trình điều hoà sinh tổng hợp protein Do protein vẫn có cấutrúc bình thường mà chỉ thay đổi về số lượng nên chúng vẫn có chức năng bìnhthường và chỉ thay đổi về mức độ hoạt động Trong trường hợp là proteinenzyme thì những lệch lạc về số lượng enzyme sẽ dẫn đến những rối loạn dâychuyền chuyển hoá các chất trong cơ thể sống

b Những biến đổi về chất lượng protein: Là những rối loạn về cấu trúc

protein do gene bị biến đổi, dẫn đến cấu trúc protein thay đổi kéo theo sự thayđổi chức năng sinh học của protein đó Ví dụ, sự biến đổi cấu trúc củahemoglobin (Hb) là protein có chức năng vận chuyển oxygen trong máu dẫn đếnbệnh thiếu máu, hay như bệnh thiếu máu do hồng cầu hình lưỡi liềm v.v…

Ngoài ra, protein còn tham gia vào hệ thống miễn dịch Trong cơ thể, cónhiều cơ quan, nhiều loại tế bào và đặc biệt nhiều loại protein thực hiện cácchức năng riêng biệt tạo nên hiệu quả miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu.Các protein miễn dịch được nhắc đến nhiều hơn cả là các kháng thể, bổ thể vàcác cytokine

1.3 Các phương pháp thu nhận, tinh sạch protein tái tổ hợp

Các phương pháp thu nhận và tinh sạch protein đều dựa trên những tínhchất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan của

protein cần thu nhận Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khácnên việc thu nhận các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết.

Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tínhchất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau như: nhiệt

độ, nồng độ proton (pH), sử dụng các tác nhân hóa học, cơ học, sóng siêu âmv.v

Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người tathường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối vớimẫu hạt khô) Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết proteinenzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết

Muốn tách được các protein trong các thành phần của tế bào, người ta cònphải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dungmôi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent).Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quannày thường chứa mỡ

1.3.2 Chiết rút protein

Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các proteinenzyme bằng các dụng dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằngnước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với cácprotein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùythuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu

Để loại bỏ các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao khác,người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tínhchọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kếttủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phươngpháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel

1.3.3.2 Các kỹ thuật thông thường trong tinh sạch protein

Sau khi nhận được dịch chiết protein thô, người ta thường sử dụng cácphương pháp khác nhau để tách chiết và đồng thời làm tinh sạch protein như: lytâm, thẩm tích, sắc ký lọc gel, sắc ký trao đổi ion, sắc ký ái lực v.v…

a Phương pháp ly tâm.

Máy ly tâm được sử dụng để tách các phần khác nhau khỏi dung dịch.Người ta gọi pha lỏng là chất lỏng bên trên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kếtxuống đáy ống ly tâm được gọi là kết tủa Thực chất, sự ly tâm tăng tốc độ kếttủa của những tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm Sự sai khác về tỷ trọng của nguyên

liệu lơ lững so với chất lỏng càng lớn thì tốc độ kết tủa sẽ càng cao Mặc dầungười ta coi số vòng quay trong một phút là đơn vị thông thường của lực ly tâm,nhưng quy ước ấy không thỏa mãn.

Chính vì vậy, mức độ tăng lực ly tâm được đo một cách chính xác hơnbằng những bội số của trị số gia tốc của lực hút ở mặt biển, có nghĩa là được đomột lực ly tâm tương đối (relative centrifugal force, RCF) hoặc là được đo bằngcác giá trị là bội số của lực hút trọng trường (xg) Công thức để tính lực ly tâmtương đối là:

4 π2r n2

32,2

Trong đó r là bán kính đến đáy của ống ly tâm tính ra "foot" (1 foot =30,48cm), n là số vòng quay trong 1 giây Có thể tính giá trị của lực ly tâmtương đối một cách trực tiếp theo công thức:

Lực ly tâm tương đối (g) = 1,1118 x 10-5 x R x N2

Trong đó: R là bán kính (cm) nắp ly tâm tính từ tâm của trục đến đáy ống

ly tâm, N là số vòng quay trong một phút

Do tính chất không bền với nhiệt của phần lớn các loại protein enzyme,khi tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh Trong trường hợpđiều kiện thí nghiệm có hạn chế, có thể sử dụng một số phương pháp nhằm đảmbảo duy trì mẫu ở nhiệt độ thấp Cần làm lạnh tốt mẫu và ống ly tâm trước khi lytâm Có thể đặt trực tiếp máy ly tâm bé vào tủ lạnh, đưa dây dẫn ra ngoài qualớp đệm của cánh cửa tủ lạnh

b Phương pháp thẩm tích

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối vớinhững chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharid) nhưng thấm đối vớicác dạng dịch các tinh thể Các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọnglượng phân tử thấp ) có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước sẽkhuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vàodung dịch keo, trong khi đó các ion (cation và anion) và các chất phân tử nhỏ sẽchuyển vào dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường chuyển vào dung dịch rửa)

Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ammonium sulphate

ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằngnguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túi colodion hoặccellophane (loại sau hay được dùng hơn) Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượnglớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate

có pH = 7, nồng độ 0,01M) Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kíchthước lỗ chỉ cho các chất có phân tử đi qua vào các dung dịch đệm loãng theođịnh luật khuếch tán Như vậy, muối sẽ khuyến tán vào nước hoặc dung dịchđêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ

di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein là những đại phân tửkhông thể vượt qua túi thẩm tích và được giử lại trong túi Bằng cách thay đổithường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein , mặc dầutrong quá trình thẩm tích, nó là dung dịch được pha loãng hơn Có thể làm giảmbớt hoặc loại trừ sự pha loãng như thế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, cónghĩa là khi dung dịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh đầy đủ, đểdòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của cácphân tử vào dung dịch Phương pháp này thường đòi hỏi có thiết bị đặc biệt

Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa proteinvào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi) Cho thuốc sát trùng hoặc toluen đểbảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị hỏng) Buộc túivào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữachậu Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thườngxuyên Muối (NH2)SO4 hòa tan trong nước và bị loại dần Thời gian thẩm tích

có thể từ 24 - 48 giờ, làm thẩm tích lần cuối cùng bằng nước cất

Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy khuấy cơhọc hay máy khuấy từ Tất cả quá trình thẩm tích các protein thường thao tác ởmôi trường lạnh

c Sắc ký lọc gel

Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biếntrong tách chiết và tinh sạch protein

Dịch chiết protein enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưngvẫn chưa đảm bảo độ đồng nhất cần thiết được tiếp tục làm sạch bằng phươngpháp sắc ký cột

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau nhau về kíchthước, hình dạng và phân tử lượng của protein enzyme có trong hỗn hợp để táchchúng ra

Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme được tốt, chất rây phân tử phải

là chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan

và tương đối bền với các yếu tố cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được

sử dụng cho mục đích lọc phân tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co)

và phải là chất ưa nước (hidrofil)

Gel sephadex là chất thỏa mãn các yếu tố trên Sephadex là chế phẩm

dextran do các loài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được

nuôi cấy trên môi trường chứa saccharose Trọng lượng phân tử của dextran cóthể đạt tới hàng triệu và lớn hơn Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốcglucose tạo thành các liên kết 1,6 Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kíchthước của lỗ sàng phân tử càng nhỏ

Phương pháp lọc phân tử trên sephadex được tiến hành như sau: chosephadex vào cột thủy tinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhấtđịnh Sau đó cho dung dịch protein enzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dungmôi thích hợp, các phân tử có trọng lượng phân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽkhuếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạt sephadex bị trương phồng, cònchất có trọng lượng phân tử lớn hơn (protein enzyme) không có khả năng đi vào

mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột Vì vậy

ta có thể tách được chất có trọng lượng phân tử cao hơn thoát ra khỏi cột geltrước so với chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex (Pharmacia) của ThụyĐiển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khác nhau có ký hiệu

từ G10 đến G200 Số ký hiệu để chỉ ra mức độ hút nước của chúng Ví dụ G10

để chỉ khi trương phồng thì 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g)

Các sephadex có ký hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việclọc phân tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở cácngưỡng khác nhau.

Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích.Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polisacharid, là chế phẩm dextrannhư sephadex (pharmacia) còn có molselect (Reanal) - là sản phẩm của Hungaryđược ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu

Ngoài nhóm chất rây phân tử là chế phẩm dextran còn có nhóm chất râyphân tử là chế phẩm gel acrilamid bao gồm biogel (Bio - Rad) và acrilex(Reanal) Acrilex gel là loại copolimer, được tạo ra từ acrilamid và N, N' -metilen bisacrilamid Các acrilex gel có ký hiệu từ P - 300 dùng để tách các chất

có trọng lượng phân tử trong ngưỡng từ 100 - đến 300.000 Có thể sử dụng ởvùng pH từ 2 - 11

Chất thứ ba là agarose gel, đã loại sulphate Hay phổ biến là loạisepharose (pharmacia) Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử cótrọng lượng lớn hơn 106

Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất cótrọng lượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polimer, polisaccharid,acid nucleic, protein) Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay choquá trình thẩm tích Và hơn thế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme,chúng còn được sử dụng để cô đặc dung dịch protein enzyme

d Phương pháp sắc ký trao đổi ion.

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng

số của các protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên

cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệmloãng và các tác nhân trao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion cóthể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit Đây là những chất giátrơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lướiphân nhánh (sephadex, molselect) hoặc là chất nhựa polistirol Chất giá thể nàythường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chất trao đổi ion có chất giá là

celluose, sephadex, molselect thông thường được dùng để tách protein enzyme,còn các chất trao đổi ion có chất giá là polistirol (ví dụ như dowex, amberlite)chỉ dùng để tách các peptide có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.

Trên những cationit, thì các protein kiềm có thừa những nhóm amin vànhững nhóm kiềm khác được hấp phụ (liên kết ion) Sự hấp phụ trên các cationitđược tiến hành với những dung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5

Các anionit được sử dụng để phân tích các protein acid có thừa nhữngnhóm carboxyl tự do Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy được tiếnhành với những dung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở pH 7,5 - 8,5

Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pH tương ứng, các chấtionit trở nên tích điện Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá sẽ hình thành một lớpđiện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó Nếu thêmprotein enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử protein enzyme mang điệntích sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại Khi dùng mộtdung dịch đệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác cólực ion lớn hơn thì phân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion.Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trongNaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient

Các phân tử protein enzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ratrước do lực liên kết với chất trao đổi ion yếu Còn những protein enzyme nào

có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy ra bằng một lực ion của muối lớn hơn.Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách được từng phần các loại proteinenzyme Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăng dần nồng độ cácion thay thế

Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta có thể rút ra từ cột cácloại protein enzyme khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết enzyme protein saukhi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động Theo thứ tự từng phần dịch thuđược, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hayphương pháp đo quang phổ và xác định đoạt hoạt độ của enzyme

e Phương pháp sắc ký ái lực

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand)vào chất mang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cầntách sẽ tương tác đặc hiệu với nó Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate)hoặc chất ức chế (inhibitor) cạnh tranh Trong trường hợp hai chất khángnguyên và kháng thể có ái lực liên kết đặc hiệu với nhau, người ta thay thế vị tríchất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên và kháng thể để nghiên cứu từng loạigiống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu của chúng Hay nói cáchkhác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzyme hoặc protein tanghiên cứu Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cho lọc gelnhư sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose

Ở trên cột giá thể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phùhợp, chỉ có protein enzyme nào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào,các protein khác thì chảy xuống cột Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợphoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnh tranh đã được hòa tan vào thì cóthể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch

f Kết tinh protein

Đây là phương pháp đặc hiệu tốt nhất để tách từng phần protein enzyme ởgiai đoạn tinh chế cuối cùng

Khi protein enzyme đã được làm tinh khiết hoàn toàn, trong những trườnghợp riêng biệt, người ta có thể tiến hành kết tinh chúng Lưu ý, protein enzyme ởtrạng thái tinh thể không được coi là bằng chứng về sự tinh khiết Các tinh thểprotein enzyme kết tinh lần đầu đôi khi có độ sạch không vượt quá 50% và cóthể chứa các protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh proteinenzyme trong dung dịch (NH4)2SO4 Quá trình kết tinh có thể tiến hành từ từ kéodài vài ngày thậm chí hàng tuần nếu muốn nhận được các tinh thể tốt Thôngthường là thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme khá đậm đặc chođến khi làm vẩn đục nhẹ dung dịch Sau đó đặt dung dịch vào một nơi, đồng thờităng rất từ từ nồng độ muối trong dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ

muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc hơn vào dung dịch proteinenzyme theo từng giọt, thêm muối qua màng bán thấm hoặc có thể cho bay hơichậm chạp dung dịch protein enzyme Trong quá trình kết tinh có thể thay đổichỉ số pH hoặc nhiệt độ Để kết tinh protein enzyme được dễ dàng, ở những giaiđoạn trước đó, người ta thường tách từng phần các protein enzyme bằng cácdung môi hữu cơ Điều này có lẽ liên quan đến việc loại bỏ lipid ra khỏi dungdịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho quá trình kết tinh.

1.3.4 Làm khô và bảo quản chế phẩm protein

Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kếtnước của chúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khô ở độ nhiệt trong phòngthì đa số protein enzyme bị biến tính Protein enzyme chỉ có thể được giữ ở dạngkhô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ởnhiệt độ thấp Nhiều protein như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể đượckết tủa bằng rượu hoặc acetone Nếu kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lýbằng rượu tuyệt đối, bằng acetone hoặc bằng ether và sau đó làm khô thật nhanhthì protein sẽ không bị biến tính Ở dạng khô, bột protein có thể giữ một thờigian lâu, khi hòa tan nó trong nước, nó thể hiện những tính chất ban đầu củamình

Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy Vì vậy,người ta sử dụng phương pháp làm đông khô là phương pháp làm khô proteinphổ biến nhất, phương pháp này có thể sử dụng được cho hầu hết protein

Dung dịch protein đã được thẩm tích được làm đóng băng và làm thănghoa băng ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân nhờ máy hút chân không mạnh.Nơi nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp (-

75oC) Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein Sau đó bột này có thể được giữ ở

độ nhiệt cao hơn Protein đã được làm đông khô khi hoà tan trong nước cất sẽcho dung dịch protein nguyên thể Người ta đã bảo quản huyết thanh máu bằngphương pháp đông khô, huyết thanh khô này có thể được sử dụng trong mục đíchtruyền máu

1.4.1 Các phương pháp xác định hàm lượng protein

Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được.Nếu protein nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt

độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzymelàm chuyển hoá 1 mol cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn) Như vậy

cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng proteingiảm nhưng hoạt độ enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao Proteinđược coi là sạch nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt

độ riêng của chúng Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượngchúng bằng các phương pháp khác Nếu protein là hormon hoặc các độc tố thìchúng được xác định qua hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra; ví dụ như hormonsinh trưởng (growth hormone) sẽ kích thích sự sinh trưởng của các tế bào đíchnuôi cấy Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng

độ chất mà chúng vận chuyển

Định lượng protein theo phương pháp Lowry

Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sảnphẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate với phức hợp đồng -protein Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm Cường độ màucủa hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein Dựa vào đồ thị chuẩnprotein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính đượchàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại proteinkhác nhau Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được proteintrong dung dịch ở nồng độ 1 g/ml Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiềuvào loại protein Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độmàu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsinnhưng cao hơn gelatin

Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phảnứng, nên phương pháp này cho kết quả chính xác chỉ khi protein đã được tinhsạch

c Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ

Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độhấp thụ tia cực tím của nó Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nóđược tính theo giá trị đo được Nếu protein không tinh sạch thì nồng độ củaprotein tổng được tính tương đối từ độ hấp thụ Nguyên tắc của phương phápnày là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm Độ hấp thụ ở280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụcủa dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein chophép tính nồng độ của protein tinh sạch

Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào màkhông biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau:

Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ tia cực tím thường được dùng để địnhlượng protein đã tinh sạch hoặc để xác định protein trong các phân đoạn nhậnđược khi sắc ký tách các protein qua cột

1.5 Quy trình, nguyên lý sản xuất protein tái tổ hợp

Các protein có hoạt tính sinh học đang ngày càng được sử dụng rộng rãi

để làm thuốc như các hormon, enzym trước đây nguồn nguyên liệu để sản xuấtcác loại protein này chủ yếu là chiết từ các bộ phận của động vật Tuy nhiên donhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thànhlại đắt nên việc tổng hợp protein được đặt ra một cách cấp thiết