nghiên cứu vi nấm và cách điều trị bệnh nấm trên cá

TÓM TẮT Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định tác nhân gây bệnh và đặc điểm bệnh học của bệnh trương bóng hơi trên cá tra Pangasianodon hypophthalmus.. Mặc dù, đã có một số công trình

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THUỶ SẢN

PHẠM MINH TRÚC

NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRƯƠNG BÓNG

HƠI TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2012

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA THUỶ SẢN

PHẠM MINH TRÚC

NGHIÊN CỨU TÁC NHÂN GÂY BỆNH TRƯƠNG BÓNG

HƠI TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)

LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts TỪ THANH DUNG

Ts PHẠM MINH ĐỨC

2012

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts Từ Thanh Dung và Ts Phạm Minh Đức đã giúp đỡ, động viên và tận tình hướng dẫn trong suốt thời gian triển khai thí nghiệm, phân tích ở phòng thí nghiệm và hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đồng thời đã tạo các điều kiện thuận lợi và cơ hội học tập giúp tôi nâng cao kiến thức

Xin gửi lời cám ơn chân thành đến các anh chị của Bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản cũng như các thầy cô của Khoa Thủy sản về những lời khuyên quý báu và sự hướng dẫn nhiệt tình trong quá trình học tập và thực hiện đề tài

Cám ơn các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản K34 đã giúp đỡ rất nhiệt tình trong suốt quá trình phân tích và triển khai thí nghiệm tại khoa

Chân thành cám ơn các anh chị lớp Cao học Nuôi trồng thủy sản K17

và các bạn đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, mẹ và chồng tôi đã chia sẻ những khó khăn, giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi học tập và nghiên cứu tại trường

Xin chân thành cám ơn!

TÓM TẮT

Nghiên cứu được tiến hành nhằm xác định tác nhân gây bệnh và đặc

điểm bệnh học của bệnh trương bóng hơi trên cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) Tổng 59 cá bệnh thu từ 11 ao nuôi cá tra có dấu hiệu bóng

hơi trương to, chứa chất dịch và bọt khí Tất cả mẫu bóng hơi được soi tươi dưới kính hiển vi và phân lập trên môi trường GYA, sau đó ủ ở 28ºC từ 1-4

ngày cho nấm phát triển Dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, sợi nấm, bào

tử và kích thước sợi nấm, bào tử xác định được 49 chủng nấm phân lập thuộc

giống Fusarium sp với tần suất xuất hiện 100% Kết quả giải trình tự gen 28S

rRNA cho thấy 2 chủng vi nấm F1P2và F1P2-tái phân lập tương đồng 100%

với loài Fusarium oxysporum; F12P2và F12P2-tái phân lập tương đồng 100%

với loài Fusarium subglutinans Hai chủng vi nấm Fusarium sp F1P2 và

Fusarium sp F12P2 được chọn gây thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm được

tiến hành với 4 nhóm cá tra giống khỏe tiêm mật độ bào tử nấm khác nhau và một nhóm cá đối chứng tiêm nước muối sinh lý tiệt trùng với 3 lần lặp lại Kết quả là tỉ lệ biểu hiện trương bóng hơi của cá tiêm F1P2 mật độ 8x106 và 8x103 bào tử/ml lần lượt là 46,67 và 3,33%; trong khi tiêm F12P2mật độ 6x106 và 6x103 bào tử/ml lần lượt là 13,33 và 0% Kiểm tra mô học các cơ quan mang, gan, thận, tỳ tạng và bóng hơi chủ yếu là hiện tượng xung huyết, xuất huyết, mất liên kết và hoại tử ở nhiều vùng trên mô tế bào Đồng thời phát hiện rải rác bào tử nấm hình thuyền trên mô bóng hơi

ABSTRACT

The purpose of the study was to determine the causative agents and pathological characteristics of swim bladder inflammation disease on striped

catfish (Pangasianodon hypophthalmus) In 59 diseased fish from difference

farms with the clinical signs of listless swimming, swollen swim bladder with ascites and air-bubbles inside were collected and sampled All swimbladders

of the diseased fish were examined fungus on microscopy before cultured on GYA medium, then incubated for 1-4 days at 28ºC Basing on the morphological characteristics, colony pigmentation, hyphae, conidiopores and

conidia, all 49 fungal isolates were identified such as Fusarium sp Two

Fusarium sp F1P2 and Fusarium sp F12P2 isolates were chosen for infection

experiments The experiments were devided into 4 groups of the healthy striped catfish fingerling Experimental fish were injected at the different concentrations of conidia suspension, and 1 control group with saline sterile-water The experiments were done with triplicate Results showed that fish with swim bladder inflammation injected at high dose (8x106 conidia ml-1) and

a low dose (8x103 conidia ml-1) of the Fusarium sp F1P2isolate reached 46,67

and 3,33%, respectively While, the Fusarium sp F12P2 isolate with swim bladder inflammation at a high dose (6x106 conidia ml-1) and a low dose (6x103 conidia ml-1) reached 13,33 and 0%, respectively Most of infected fish

in the experiments showed clinical signs as those in the natural infection

Molecular techniques with 28S rRNA genes partial sequencing was used to

identify the causative agents Fusarium sp was found as causative agent of the

swim bladder inflammation disease on striped catfish Histopathologically, gill, liver, spleen, kidney and swim bladder tissue of infected fish were congestive phenomena, hemorrhage, cell necrosis appeared; and the presence

of fungal conidia in swim bladder tissue

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam kết luận văn này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và kết quả này chƣa đƣợc dùng cho bất kỳ luận văn cùng cấp nào khác

Cần thơ, ngày 27 tháng 12 năm 2012

Ký tên

Phạm Minh Trúc

MỤC LỤC

Lời cảm tạ i

Tóm tắt ii

Abstract iii

Lời cam đoan iv

Mục lục v

Danh sách bảng vii

Danh sách hình viii

Danh mục từ viết tắt ix

CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

1.3 Nội dung đề tài 2

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nghiên cứ u bê ̣nh nấm trên động vật thủy sản 3

2.1.1 Cách tiếp cận nghiên cứu bệnh nấm 3

2.1.2 Bệnh nấm thường gặp trên cá 3

2.1.3 Một số nghiên cứu bệnh liên quan đến Fusarium 5

2.2 Một số phương pháp nghiên cứu bệnh nấm 6

2.3 Một số nghiên cứu về bóng hơi 7

2.3.1 Cấu trúc và vai trò bóng hơi 7

2.3.2 Cấu trúc bóng hơi cá tra 8

2.3.3 Nghiên cứ u bệnh trên bóng hơi ở động vật thủy sản 9

2.4 Những nghiên cứu mô học trên động vật thủy sản 12

CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.1 Phương pháp thu mẫu cá 15

3.3.2 Phương pháp giải phẫu và kiểm tra kí sinh trùng 16

3.3.3 Phương pháp phân lập và định danh nấm 16

3.3.4 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn trên cá tra trương bóng hơi 18

3.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm 19

3.3.6 Phương pháp mô học 20

3.3.7 Phương pháp xử lý số liê ̣u 20

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

4.1 Kết quả thu thập thông tin về bệnh trương bóng hơi trên cá tra 21

4.1.1 Thông tin về kỹ thuật nuôi 21

4.1.2 Tình hình bệnh trương bóng hơi và cách xử lý của người nuôi 22

4.2 Hiện trạng ao thu mẫu cá tra bệnh trương bóng hơi 23

4.3 Dấu hiệu bệnh lý cá tra bệnh trương bóng hơi 23

4.4 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng trên cá tra bệnh trương bóng hơi 24

4.5 Kết quả kiểm tra vi khuẩn trên cá tra bệnh trương bóng hơi 25

4.6 Kết quả phân lập và định danh nấm 25

4.7 Kết quả gây cảm nhiễm vi nấm Fusarium sp 29

4.7.1 Dấu hiệu bệnh lý 29

4.7.2 Mức độ nhiễm bệnh 30

4.8 Kết quả giải trình tự gen 28S rRNA 31

4.9 Biến đổi cấu trúc mô học cá tra bệnh trương bóng hơi 33

4.9.1 Mang 34

4.9.2 Gan 35

4.9.3 Thận, tỳ tạng 38

4.9.4 Bóng hơi 40

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Đề xuất 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 50

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 4.1: Kết quả nhiễm kí sinh trùng trên cá tra bệnh trương bóng hơi 25

DANH SÁCH HÌNH

Hình 3.1: Phương pháp nuôi nấm trên lam kính 18

Hình 4.1: Cá bệnh bơi lờ đờ tầng mặt 23

Hình 4.2: Bệnh lý cá trương bóng hơi 24

Hình 4.3: Khuẩn lạc nấm Fusarium sp trên môi trường GYA sau 7 ngày nuôi cấy 26

Hình 4.4: Đặc điểm hình thái Fusarium sp (F1P2): 27

Hình 4.5: Cá cảm nhiễm bơi ở mặt bể và mất thăng bằng ngửa bụng 29

Hình 4.6: Cá cảm nhiễm bóng hơi trương to 30

Hình 4.7: Tỉ lệ cá chết tích lũy sau 30 ngày cảm nhiễm 2 chủng vi nấm Fusarium sp F1P2 và Fusarium sp F12P2 30

Hình 4.8: Tỉ lệ trương bóng hơi và nhiễm nấm trong thí nghiệm cảm nhiễm 2 chủng vi nấm F1P2 và F12P2 31

Hình 4.9: Kết quả tra cứu BLAST search của 2 chủng vi nấm F1P2 và F1P2- tái phân lập 32

Hình 4.10: Kết quả tra cứu BLAST search của 2 chủng vi nấm F12P2 và F12P2- tái phân lập 33

Hình 4.11: Mang cá khỏe 34

Hình 4.12: Mang cá bệnh 35

Hình 4.13: Gan cá khỏe 35

Hình 4.14: Gan cá bệnh 37

Hình 4.15: Thận cá khỏe 38

Hình 4.16: Thận sau cá bệnh 39

Hình 4.17: Bóng hơi cá khỏe 40

Hình 4.18: Bóng hơi cá bệnh 42

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu

Nuôi trồng thủy sản Việt Nam được đánh giá là một trong những ngành sản xuất có tốc độ tăng trưởng rất nhanh Theo Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn 2012, tổng sản lượng thuỷ sản 9 tháng đầu năm ước đạt 4.313 ngàn tấn, tăng 6% so với cùng kỳ năm trước; sản lượng nuôi trồng ước đạt 2.318 ngàn tấn, tăng 7% so với cùng kỳ năm trước Trong đó ĐBSCL là nơi có sản lượng thủy sản lớn nhất cả nước Theo báo cáo của Tổng cục thống kê 2011, ĐBSCL có tổng diện tích nuôi trồng thủy sản là 739,8 nghìn ha và tổng sản lượng nuôi trồng là 2.131 ngàn tấn

Ở ĐBSCL, cá tra (Pangasius hypophthalmus) là đối tượng nuôi nước

ngọt có giá trị kinh tế cao đóng vai trò chủ lực về xuất khẩu và cung cấp thực phẩm nội địa Từ năm 2000, cá tra đã trở thành đối tượng nuôi quan trọng và xuất khẩu chủ lực thứ hai sau tôm sú Theo Tổng cục Thủy sản (2011), diện tích nuôi cá tra đạt 5.400 ha; sản lượng đạt trên 1,141 triệu tấn; kim ngạch xuất khẩu là 1,4 tỷ USD trong năm 2010; diện tích nuôi và sản lượng cá tra ước đạt 6.000 - 6.300 ha và 1,2 - 1,3 triệu tấn; kim ngạch xuất khẩu từ 1,45

- 1,55 tỷ USD trong năm 2011 Cá tra được nuôi với quy mô công nghiệp ở

An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long và Sóc Trăng Tuy nhiên, hình thức nuôi thâm canh là nguyên nhân dẫn đến suy thoái môi trường gây nhiều dịch bệnh do quản lý môi trường chưa đúng mức và chất lượng con giống kém không rõ nguồn gốc cũng là nguyên nhân Hầu như các vùng nuôi cá tra đều xuất hiện những loại bệnh phổ biến như: xuất huyết, gan thận mủ, trắng gan trắng mang và kí sinh trùng

Bệnh được cho là thách thức quan trọng của ngành thủy sản với số lượng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và nhiều bệnh chưa xác định rõ nguyên nhân như: vàng da, trắng gan trắng mang và gần đây là trương bóng hơi Đây

là một hiện tượng bệnh lý mới xuất hiện đã gây trở ngại lớn cho người nuôi Bệnh thường xảy ra với dấu hiệu bóng hơi trương to, chứa nhiều dịch và bọt khí Cá bệnh không chết hàng loạt mà bỏ ăn kéo dài cho đến chết; đặc biệt bệnh không có thuốc trị và chưa rõ nguyên nhân Mặc dù, đã có một số công trình nghiên cứu về bệnh trên bóng hơi như: cá chép với bệnh viêm bóng hơi (Markiewicz, 1966 trích dẫn bởi Roberts, 2000), cá song với bệnh trương bóng

hơi (Bùi Quang Tề, 2006), và sự nhiễm nấm Phialophora spp lên bóng hơi cá

hồi Đại Tây Dương (Lumsden, 2006) Tuy nhiên, “trương bóng hơi” trên cá tra Việt Nam hiện chưa có công trình nghiên cứu nào cũng như phương pháp

phòng trị Từ thực tiễn đó, đề tài: “Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trương bóng

hơi trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” là cấp thiết

1.2 Mục tiêu đề tài:

Đề tài được thực hiện nhằm xác định tác nhân gây bệnh và đặc điểm

bệnh học bệnh trương bóng hơi trên cá tra (Pangasinodon hypophthalmus) Từ

đó cung cấp dữ liệu cho những nghiên cứu về biện pháp phòng và trị bệnh

1.3 Nội dung đề tài

- Thu thập thông tin và thu mẫu bệnh trương bóng hơi trên cá tra

- Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra

- Gây cảm nhiễm và đặc điểm mô học cá tra bệnh trương bóng hơi

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về nghiên cư ́ u bê ̣nh nấm trên động vật thủy sản

2.1.1 Cách tiếp cận nghiên cứu bệnh nấm

Bệnh nấm được chẩn đoán bằng cách quan sát tiêu bản tươi, phân lập

và định danh dựa vào đặc điểm hình thái qua quá trình sinh sản vô tính và hữu tính của nấm phân lập được Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm trên môi trường thạch thường được ứng dụng như sau: cắt một phần nhỏ mẫu bệnh phẩm làm tiêu bản tươi, quan sát dưới kính hiển vi xem có sự xuất hiện của khuẩn ty hay bào tử nấm không, nếu có thì tiến hành phân lập bằng cách rửa mẫu qua nước muối sinh lí vô trùng 2-3 lần và cấy vào giữa của đĩa Petri có

chứa môi trường nuôi cấy nấm (Phạm Minh Đức và ctv, 2010)

Các loại môi trường thường được sử dụng như: Cherry-decoction agar, Cornmeal agar, Oatmeal agar, Potato-dextrose agar, Glucose-glutamate, Gys-

tellurite hoặc YpSs-tellurite (Games et al., 1890) Hai loại kháng sinh như:

ampicilline và streptomycine thường được sử dụng trong quá trình phân lập nấm bằng cách rắc một ít (liều lượng 500 µg/ml) lên xung quanh mẫu cấy Các loại môi trường GYA, và PGYSA thường được ứng dụng lần lượt trên các loài nấm gây bệnh trong môi trường nước ngọt và lợ, mặn Tiến hành cấy truyền nhiều lần để được nấm thuần bằng cách lấy một phần nhỏ mẫu agar có chứa sợi nấm ở rìa khuẩn lạc mang cấy sang một đĩa agar mới, quá trình này được

lập đi lặp 2-3 lần (Phạm Minh Đức và ctv, 2010)

2.1.2 Bệnh nấm thường gặp trên cá

Nấm là một trong những tác nhân gây bệnh khá phổ biến trên động vật

thủy sản nước ngọt và nước mặn (Loan et al., 2006) Nấm được chia làm 2

nhóm chính gồm: nấm bậc thấp (không vách ngăn) chủ yếu là nấm thủy mi

(Saprolegnia, Achlya, Aphanomyces) và nấm bậc cao (có vách ngăn) chủ yếu

là nấm bất toàn (Fusarium, Exophiala, Ochroconis, Acremonium) Nấm gây

bệnh ở động vật thủy sản thường có cấu tạo hình sợi phân nhánh Những nấm này sinh ra ở đầu mút sợi nấm và phát triển rất nhanh tạo thành từng đám chằng chịt Từng sợi nấm gọi là khuẩn ty (Phạm Minh Đức và Nguyễn Thị Thu Hằng, 2009)

Các loài cá nước ngọt thường nhiễm lớp nấm noãn Oomycetes đặc biệt

là giống Saprolegnia (Neish và Huges, 1980) Ngoài ra, giống Achlya cũng

được xem là tác nhân quan trọng gây bệnh nấm thủy mi trên cá nước ngọt

(Yanong, 2003) Khi ký sinh trên cá, các sợi nấm tập trung thành búi như bông bên ngoài cơ thể ký chủ và phát triển rất nhanh với hình thức sinh sản bằng các túi động bào tử được hình thành trên đầu mút các sợi nấm hoặc sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp giữa túi noãn và các túi giao tử đực (Kabata, 1985)

Bệnh nấm thủy mi thường được ghi nhận trên các loài cá chép Cyprinus

carpio, trê trắng Clasrias batrachus, trê vàng C macrocephalus và cá măng Chanos chanos ở Indonesia, Malaysia, Philipphine, Singapore và Thái Lan

(Kabata, 1985), trên cá hồi Onchrhynchus nerka (Hussein và Hatai, 1999), trên cá rô phi Oreochromis niloticus ở Thái Lan (Panchai et al., 2007) Ngoài

ra, nấm thủy mi cũng được xem là tác nhân nguy hiểm trong sản xuất giống cá nước ngọt với khả năng phát triển nhanh và lây lan mạnh từ trứng không được thụ tinh bị nhiễm sang các trứng lân cận làm ảnh hưởng đến quá trình trao đổi khí và tỉ lệ nở của trứng (Yanong, 2003) Nấm phát triển trên trứng cá chép

Cyprinus carpio ở Thái Lan (Chukanhom và Hatai, 2004) và trên cá tra ở Việt

Nam (Loan et al., 2006) Một số yếu tố môi trường như nhiệt độ, nồng độ

muối (NaCl) và pH được cho là có ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Với kết quả của nhiều nghiên cứu trước đây với khoảng nhiệt độ 15-300C là tốt

nhất cho sự phát triển của các loài thuộc giống Saprolegnia (Klinger và

Francis-Floyd, 1996)

Hội chứng lở loét (EUS-Epizootic Ulcerative Syndrome) cũng được đánh giá là có ảnh hưởng lớn đến các loài cá ở vùng nước ấm, ngọt và lợ Tác

nhân gây bệnh được xác định là Aphanomyces invadans Ngoài ra, nấm

Aphanomyces piscicida được phân lập từ cá bệnh tại Nhật bản vào năm 1971,

sau đó Aphanomyces cũng được phân lập ở Úc, Châu Á và Mỹ (Yanong,

2003) Các dấu hỉệu cá bị nhiễm EUS thể hiện trên thân, đầu, vây và nắp mang với các vết bị ăn mòn màu đỏ, sau đó lan thành các vết loét rộng kèm theo

rụng vây, xuất huyết và làm chết cá (Lilley et al., 1998)

Một số loài cá và trứng được ghi nhận bị nhiễm Aphanomyces như: cá

chẽm, cá lóc, cá gai, cá vàng, cá mòi dầu, nhóm cá sặc và trứng cá hồi (Royo

et al., 2004) Trên GYA, khuẩn lạc nấm Aphanomyces có màu trắng, khuẩn ty

phân nhánh và không có vách ngăn, đường kính 7-15µm Động bào tử sơ cấp hình cầu 10-15 µm và tập trung tại đầu nút khuẩn ty, động bào tử thứ cấp dạng quả thận với hai tiên mao Túi noãn hình quả lê hoăc hình cầu với đường kính 16-25 µm, mỗi túi noãn chứa một noãn bào tử hình cầu đường kính 14-22 µm thường lệch tâm với các hạt nhỏ sáng bao quanh Nhiệt độ tối ưu là 20-250

C

và pH là 5-10 (Kitancharoen và Hatai, 1997)

Nấm Saprolegnia là tác nhân cơ hội gây bệnh ở cá chép Cyprinus

carpio, cá lóc Chanos chanos và cá Odonthetes bonariensis (ở Nhật bản

(Kitancharoen et al., 1995) S diclina nhiễm trên trứng cá chép ở Thái Lan (Chukanhom và Hatai, 2004), S salmonis sp nhiễm ở cá hồi O nerka

(Hussein và Hatai, 1999)

Branchiomyces nhiễm trên cá hồi O mykiss, cá hồi cẩm thạch, cá chó,

cá chép, cá chình Nấm Branchiomyces có khuẩn ty khoảng 19-21µm, phân

nhánh, đầu mút bao bọc hai lớp thành tế bào dầy Dấu hiệu bệnh lý khi cá bị nhiễm nấm là mang chuyển sang màu hồng nhạt hoặc màu trắng đục, các tơ mang dính lại hoặc sưng to, hoại tử, vùng hoại tử bị tróc ra, quan sát tiêu bản tươi thấy khuẩn ty có màu nâu sáng, phân nhánh và không có bào tử (Yanong, 2003)

Ngoài ra, nấm bất toàn bậc cao cũng được xem là tác nhân gây bệnh trên một số loài cá nước ngọt và trên các loài động vật biển (Yanong, 2003)

Giống Fusarium là tác nhân chính gây tỉ lệ chết cao trên một số loài cá nước ngọt như Barbus rana, Channa punctatus, Labeo rohita, Mastaceamblus

armatus, Mystus tengra, Puntius sophore và Wallago attu ở Ấn độ (Deepa et al., 2000), trên cá tráp đỏ Pagrus sp nhiễm nấm với dấu hiệu bệnh lý thể hiện

trên thận cá bị sưng và nhạt màu (Hatai et al., 1986), trên cá mập Sphyrna

lewini, F solani gây bệnh trên vùng đầu với các vết phù và nhớt màu

trắng đục (Crow et al., 1995) Giống nấm này cũng tìm thấy trên cá rô đồng

bệnh nấm nhớt (Trần Ngọc Tuấn, 2010) và cá lóc (Lư Trí Tài, 2010)

Gần đây, 3 nhóm nấm Fusarium sp., Aremonium sp.và Geotrichum sp được tìm thấy trên cá rô đồng bệnh nấm nhớt (Trần Ngọc Tuấn, 2010) Nấm

Acremonium khuẩn lạc phát triển nhanh trên môi trường PYGSA, đường kính

khoảng 70mm sau 10 ngày ở 20oC, khuẩn lạc màu hơi trắng, vàng nhạt hoặc hơi hồng Sợi nấm tập trung thành chùm Cuống sinh bào tử là thể hình dạng búp măng Bào tử thường một tế bào, hình cầu hoặc trụ, thẳng hoặc cong, vách

tế bào nhẵn và mỏng, có kích thước 4-10x2,5-3µm, thường tập trung ở đầu mút Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển 20-300C (De Hoog et at., 2000)

2.1.3 Một số nghiên cứu bệnh liên quan đến Fusarium

Giống Fusarium là tác nhân gây tỉ lệ chết cao trên một số loài cá nước ngọt như: Barbus rana, Channa punctatus, Labeo rohita, Mastaceamblus

armatus, Mystus tengra, Puntius sophore (Deepa et al., 2000)

Cá mập Sphyrna lewini nhiễm F.solani trên vùng đầu với các vết phù

và nhớt màu trắng đục (Crow et al., 1995) Các loài F solani, F moniliforme

và F oxysporum được xem là có liên quan đến bệnh đen mang trên tôm he

Nhật Bản P japonicas (Khoa et al., 2005) Loài F incarnatum được ghi nhận gây bệnh đen mang t rên tôm sú P monodon Việt Nam (Khoa et al., 2004), và

F tabacinumtìm thấy trên tôm crayfish Austropotamobiu pallipes (Alderman

và Polglase, 1985) Ngoài ra, Loài F solani được phân lập trên tôm hùm

Homarus americanus (Lightner và Fontain, 1975), tôm he Penaeus californiensis và tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (Burns et al.,

1979)

Vấn đề nhiễm nấm Fusarium sp đã tăng lên trong những năm gần đây trên cá nước ngọt Một báo cáo phân lập được Fusarium sp từ Carasslus

auratus và xác định là Fusarium oxysporum (Ke Xiao-Li et al., 2010)

Gần đây, ở Việt Nam Fusarium sp cũng được tìm thấy trên cá rô đồng bệnh

nấm nhớt với tỷ lệ 30% (Trần Ngọc Tuấn, 2010) và trên cá lóc 14,3% (Lư Trí Tài, 2010)

2.2 Một số phương pháp nghiên cứu bệnh nấm

Hiện nay, ngoài phương pháp nghiên cứu truyền thống dựa vào các dấu hiệu bệnh lí và đặc điểm về hình thái, sinh hóa của nấm phân lập thì phương pháp sinh học phân tử đang có xu hướng được ứng dụng và phát triển mạnh (Atkins và Clark, 2004) Phương pháp sinh học phân tử đã được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh nấm trên các đối thượng động vật thủy sản Các

kỹ thuật được sử dụng bao gồm: PCR, mẩu dò ADN/ARN, restriction enzyme digestion, probe hybridization, in situ hybridization và microarray để chẩn đoán bệnh trên cá (Atkins và Clark, 2004) Mặt khác, phương pháp này còn giúp định danh nấm một cách chính xác như đối với một số loài nấm

Aphanomyces astaci và Saprolegnia parasitica không thể tạo được các cấu

trúc sinh sản hữu tính trên môi trường nuôi cấy do đó việc định danh bằng phương pháp hình thái học đôi khi gặp nhiều khó khăn Chính vì vậy, việc ứng dụng phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh nấm là rất cần thiết (Lilley và Chinabut, 1999) Trong một nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR và mẫu dò ADN/ ARN đã cung cấp những dữ liệu cần thiết liên quan đến bệnh nấm gây EUS trên một số loài cá nước ngọt (Lilley và Chinabut, 1999) Trước

đó, đoạn AND của Achlya bisexuali đã được mô tả có sự xuất hiện của một đoạn mạch đơn dài hơn so với những nghiên cứu trước đó (Hudspeth et al., 1977) và RNA polymerase của Achlya biosexualis cũng đã ly trích (Hahn, 1982) Trong một nghiên cứu về xác định yếu tố độc lực của Saprolegnia

parasitica, kết quả đã khẳng định rằng có nhiều gen trên ESTs (Expressed

sequence tags) có chức năng sinh độc lực gây bệnh trên cá (Torto-Alalibo et

al., 2005) Ngoài ra, phương pháp RAPD-PCR đã được sử dụng để định danh

Saprolegnia sp gây bệnh trên cá hồi nuôi ở Phần Lan và Thụy Điển, từ đây có

thể nghiên cứu về tình hình dịch tễ học của loài này trong khu vực

(Bangyeekhun et al., 2003)

Bên cạnh đó, một nghiên cứu tìm hiểu về so sánh giữa các cặp bazơ

nitơ ở ITS1 và ITS2 của Aphanomyces frigidophilus phân lập lần đầu tiên trên tôm hùm nước ngọt Austropotamobius pallipes ở Châu Âu với mẫu chuẩn

trong Genbank sequence trong tổng số 673 cặp đã xác định được mức độ

giống nhau đến 99% (Ballesteros et al., 2006) Hơn nữa, loài Aphanomyces

astaci được phân lập trên tôm hùm nước ngọt Astacus astacus ở Phần Lan

cũng được định danh bằng phương pháp PCR khi so sánh với kiểu gen của A

astaci được phân lập trên tôm Pacifastacus leniusculus và trên tôm hùm nước

ngọt khác ở Thụy Điển (Vennerstrom et al., 1998) Aphanomyces invadans

cũng đã được phân lập và chứng minh là tác nhân chính gây ra bệnh EUS trên

cá bằng sensitive PCR và kỹ thuật fluorescent peptide nucleic acid in situ

hybridization (Vandersea et al., 2006) Khi tìm hiểu về khả năng phát sinh

giống loài bằng phương pháp sinh học phân tử, kết quả thí nghiệm cho thấy tất

cả các chủng Fusarium incarnatum được phân lập trên tôm sú P monodon

nuôi ở Việt Nam và 3 chủng được phân lập từ cây nông nghiệp ở Nhật Bản

đều có cùng nguồn gốc phát sinh loài (Khoa et al., 2004) Hơn nữa, dựa trên trình tự phiên mã ribosome 5.8S và ribosome 28S của Fusarium solani được phân lập trên tôm he P japonicus bệnh đen mang chỉ ra rằng tất cả 5 chủng F

solani đều có cùng nguồn gốc phát sinh loài mặc dù được phân lập từ những

địa điểm và thời gian khác nhau (Khoa et al., 2005) Gần đây, một nghiên cứu

về xác định tác nhân gây bệnh nâu mang trên tôm tít Oratosquilla oratoria

bằng phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tích các đoạn ITS (ITS1,

5.8S rDNA và ITS2) và β-tubulin đã khẳng định hai loài Plectosporium

oratosquillae và Acremonium sp là tác nhân gây bệnh chính ở tôm tít (Duc et al., 2009)

2.3 Một số nghiên cứu về bóng hơi

2.3.1 Cấu trúc và vai trò của bóng hơi

Theo Lumsden (2006), ở cá vây tia, bóng hơi là cơ quan quan trọng nhất giúp cá nổi Trong một vài loài nó còn có khả năng hô hấp Bóng hơi c á nằm trong xoang bụng là một cơ quan rỗng nằm giữa ống tiêu hóa và thận sau Bóng hơi có màu trắng đục và hình dạng thay đổi tùy theo loài, có thể hình ống dài, hình trứng hay hình thoi Bóng hơi có nhiều tên gọi khác nhau như: swim-bladder, air-bladder hay gas-bladder Số ngăn của bóng hơi thay đổi tùy loài, có thể có 1 ngăn, 2 ngăn, 3 ngăn, nhiều ngăn Bóng hơi cá

Salmonids có một ngăn và trên cá Cyprinid có nhiều ngăn Cá có 2 dạng bóng

hơi là bóng hơi hở và bóng hơi kín Bóng hơi hở nối với thực quản bởi ống khí Ống nối của bóng hơi và thực quản có thể tồn tại hoặc mất đi khi cá trưởng thành Cá có bóng hơi hở thì ống nối vẫn tồn tại khi cá trưởng thành, ngược lại cá có bóng hơi kín vẫn hở tạm thời vào giai đoạn đầu và khi trưởng thành ống nối sẽ thoái hóa và bóng hơi kín lại Đối với cá vây tia mềm trưởng thành thì bóng hơi hở trong khi cá vây tia gai thì bóng hơi kín

Bóng hơi được tạo thành bởi một lớp mỏng hình khối, biểu mô sinh chất hoạt dịch, lớp mô dầy tạo thành bởi cơ trơn hoặc cơ vân và cuối cùng là lớp dưới màng nhầy nơi có nhiều mạch máu nhất Nhiều loài cá có lượng tế bào nhỏ tương tự tế bào bạch huyết bên trong biểu mô Lưới mirable có ở hầu hết các loài cá, nó có nhiều mạch máu để mang khí vào trong bóng hơi Hầu hết các loài cá, bóng hơi đều chứa khí O2, CO2, N2 ngoại trừ cá ở tầng nước quá sâu Đối với cá ở tầng nước sâu, khoang bóng hơi chứa các acid béo ngắn chuỗi (Lumsden, 2006)

Bóng hơi đóng vai trò quan trọng trong sự sống của cá đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Trong số những chức năng quan trọng của bóng hơi là tạo âm thanh, hô hấp, nghe và cân bằng Chức năng hô hấp chỉ quan trọng ở một số loài và chức năng tạo âm thanh cũng giới hạn ở một số loài Chức năng quan trọng nhất của bóng hơi là cân bằng bởi vì nó là cơ quan có thể thay đổi lượng không khí Vì vậy, nó có thể cân bằng với môi trường xung quanh dưới những áp suất khác nhau (Hall, 1924)

Bore (1680) là người đầu tiên cho rằng bóng hơi có chức năng hô hấp (trích dẫn bởi Hall, 1924), nó có thể hoạt động như 1 lá phổi và là nơi dự trữ oxy giúp cá tồn tại trong thời gian ngắn Ngoài ra, bóng hơi là 1 cơ quan thủy tĩnh, giúp cá điều tiết tỉ trọng cơ thể, qua đó cá có thể lên xuống các tầng nước được dễ dàng Ngoài 2 chức năng trên bóng hơi còn có chức năng quan trọng trong sự nhạy cảm với áp lực nước, nhạy cảm với âm thanh và đặc biệt là bóng hơi có thể tạo ra âm thanh có ý nghĩa quan trọng trong mùa sinh sản cũng như trong việc tấn công hay phòng thủ với kẻ thù (Hall, 1924)

2.3.2 Cấu trúc bóng hơi cá tra

Bóng hơi của cá tra thuộc dạng bóng hơi kín, có dạng hình ống dài bên trong chứa các hổn hợp khí O2, CO2, N2 với tỉ lệ khác với trong không khí (Đỗ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền, 2000) Theo Grizzle

& Rogers (1976) bóng hơi cá tra có 2 ngăn và chia làm 3 khoang

Cá da trơn Pangasius hypophthalmus ở Đông Nam Á sử dụng bóng hơi

như là một cơ quan hô hấp phụ Bóng hơi nằm ở phần lưng của khoang cơ thể

và được nối với thực quản bởi một ống khí ngắn có chứa các tế bào niêm dịch Nghiên cứu mô học và vi thể cho thấy thành bóng hơi gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng là màng thanh mạc, ở giữa là mô liên kết có nhiều sợi collagen và lớp bên trong cùng là biểu mô hô hấp Lớp trong cùng tạo thành nhiều vách ngăn nhô ra đưa vào khoang của bóng hơi Vách ngăn ở giữa chia chiều dọc bóng hơi thành hai khoang Biểu mô hô hấp gồm những tế bào phẳng đơn bao phủ mạng lưới mao quản dầy Tế bào biểu mô có lông nhỏ dài và mỏng trên

bề mặt của chúng Tế bào chất của nó có nhân lớn, bộ máy Golgi, mạng lưới nội chất, ty thể, nhiều electron và thể dạng tấm tích lũy chất hoạt động bề mặt Hàng rào máu khí bao gồm biểu mô, mô liên kết, và nội mô dày từ 0,2 - 2,4 µm (Podkowa và Goniakowska, 1998)

2.3.3 Nghiên cư ́ u bệnh trên bóng hơi ở động vật thủy sản

Theo Lumsden (2006), bệnh trên bóng hơi chưa đư ợc nghiên cứu phổ biến Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cũng đóng góp những thành tựu đáng kể Trại ương cá vược và cá tráp biển xuất hiện bệnh về bóng hơi làm bóng hơi xẹp xuống được biết là do những chất chứa protein, dầu nổi trên mặt nước làm

ảnh hưởng sự phát triển của bóng hơi (Divanach et al 1996) Theo Wolf

(1937), bệnh bóng hơi tại ao cá hồi giống đã gây tổn thất lớn được xem là có

liên quan đến Psedomonas fluorescens nhưng ông không cho rằng đây là mầm

bệnh đầu tiên Theo ông, cá bệnh là do những vi khuẩn cơ hội xâm nhập vào

cơ thể theo khoan bóng Túi khí xẹp ở cá bị ảnh hưởng, thành bóng hơi dầy và xuất hiện lượng vi khuẩn lớn trong mô liên kết phù

Ngoài ra, sự thiếu hay gi ảm lượng khí trong bóng hơi có thể làm cá chết hoă ̣c giảm phát triển gây nên di ̣ tâ ̣t cơ và xương Đây cũng là mô ̣t trong số yếu tố chính làm gi ảm tỉ lê ̣ sống ở tra ̣i ương và năng suất những loài nuôi gần đây thấp Một trường hợp khác là trương bong bóng khí Bệnh này có thể

do viêm bóng hơi , sự bao bo ̣c nhiều ống khí hay sự giảm nhanh áp suất Cá vùng nước sâu có thể bị căng bụng , mắt lồi khi chúng được mang lên tầng mă ̣t

là một điển hình Việc chữa trị kịp thời có thể dùng kim đâm thủ ng bóng hơi nhưng dễ gây viêm nhiễm Sưng phồng bóng hơi do những đảo lô ̣n v ề sinh lý

từ sự mất cân bằng acid-bazơ cũng là trườ ng hơ ̣p phổ biến Vấn đề căng quá mức của bóng hơi có th ể gọi với nhiều tên khác nhau như: swimladder stress hay distress syndrome Một trường hợp khác về bệnh bóng hơi là xuất huyết bóng hơi Bệnh này có thể là do vi khuẩn hay viru s gây ra mă ̣c dù số ma ̣ch máu ở thành bóng hơi tương đối thấp Điểm xuất huyết đươ ̣c chú ý khi bóng

hơi là cơ quan đích của virus nhiễm trên cá vư ợc Iridovirus gây ra tỉ lê ̣ chết

trên cá vược với đ ặc trưng là đỏ thành bóng hơi , bong bóng khí bám chặt vào thành bóng do sự tăng biểu mô và phù n ề Mạch máu tăng là do sự xung huyết

và sự hình thành mạch đã làm cho tình trạng viêm nhiễm tăng liên tục

nên xuất huyết, hoại tử cùng nhiều tế bào viêm Trường hợp “ gastric dilation

and air sacculitis” (GDAS) ở cá hồi (Chinook) thì khoang bóng hơi chứa đầy

dịch sệt có mùi thối Kiểm tra mô bê ̣nh ho ̣c th ấy có mô ̣t vài chỗ viêm nhỏ trên bóng hơi, đă ̣c biê ̣t có thêm phù nề vỏ ma ̣ch máu và lớp dưới màng nhày Đây

là dấu hiệu hiện diện của nhiều túi khí Lấy chất di ̣ch từ cá bi ̣ GDAS thì thấy

có hiện diện của một số vi khuẩn , nấm, tảo cùng với bạch cầu trung tính Ổ

bê ̣nh lớn lên theo hướng làm đầy khoan khí và thường tràn lan đến thực quản Ngoài ra, cách đây khoảng 20 năm, sau khi đưa cá chình Nhật Bản vào Châu

Âu thì sự nhiễm trùng bóng hơi ở cá chình Châu Âu với Anguillicola crassus

đã xuất hiện Kiểm tra mô bê ̣nh ho ̣c thấy có sự tăng biểu mô , giản và nghẽn mạch máu; và sự hiện diện của giun, trứng, ấu trùng trong khoan bóng hơi Ấu trùng còn sống và chết cũng được tìm thấy ở lớp dưới biểu mô và bên ng oài thì bị sưng viêm, phù nề , sơ hóa Giun tròn cũng ảnh hưởng lên bóng hơi cá

hồi là Cystidicola spp., và có thể xuất hiện rất nhiều Khả năng gây bệnh của loài này thấp, mă ̣c dù Cystidicola farionis được cho là nguyên nhân làm tăng tỉ

lê ̣ chết ở cá hồi chấm hồng Bắc Cực

Một trường hợp đặc trưng của bệnh bóng hơi trên cá chép là sưng bóng hơi (SBI) (Markiewicz, 1966), bệnh này phát triển thành vết viêm, hoại tử một phần hoặc cả khoang bong bóng, vách bong bóng xuất hiện chất dịch nâu đỏ

Csaba et al (1984) và khoa bệnh kí sinh cho rằng nguyên nhân là do protozoa

Cá hồi tự nhiên tìm thấy lượng lớn giun tròn trong bóng hơi nhưng đây không

là mầm bệnh quan trọng Ngoài ra, sự nhiễm khuẩn thường xuyên có thể gây

ra sưng bóng hơi Một bệnh đặc trưng khác của bóng hơi có thể do nguồn gốc gen xuất hiện trên loài cá sóc Khi sự phát triển của bóng hơi giảm thì cá không giữ được thăng bằng trong nước (trích dẫn bởi Roberts và Rodger, 2000)

Cá chết và hấp hối hầu hết bóng hơi trương phồng do hoại tử thần kinh – hay bệnh virus màng lưới não ở cá biển (Viral nervous Necrosis - VNN /Viral encephalopathy and retinopathy - VER) là b ệnh cấp tính xuất hiện từ

trại ương giống Tác nhân gây bệnh là Betanodavirus hình cầu, có acid nhân là

ARN Ấu trùng 10 – 25 ngày tuổi hoặc cá giống bỏ ăn, cá chết rải rác bơi lờ

đờ trên tầng mặt do bóng hơi trương phồng Cá nhiễm bệnh bơi lội mạnh không định hướng, đầu chút xuống dưới Bệnh cấp tính hoặc thứ cấp tính ở cá

mú hương hoặc cá mới nuôi lồng có dấu hiệu giống nhau Cá bơi hỗn loạn không định hướng, hàm dưới có vết hoại tử do chà sát với lưới Nhiều cá có màu đen và thường bơi chậm chạp Cá dưới 20 ngày tuổi không thấy dấu hiệu

rõ, cá sau 20-45 ngày tuổi dấu hiệu bệnh cá yếu bơi gần tầng mặt, cá 45 ngày – 4 tháng tuổi khi bị bệnh bơi không định hướng kém ăn hoặc bỏ ăn thân đen xám, đuôi và vây chuyển sang màu đen, mắt đục hoặc bóng hơi trương phồng

ra Cá bệnh hoạt động yếu đầu treo trên mặt nước hoặc nằm dưới đáy bể Cá chết sau 3-5 ngày có dấu hiệu bệnh (Bùi Quang Tề, 2006) Cá biển nuôi ở Khánh Hòa cũng bị hoại tử thần kinh với màu sắc đen sậm bơi không định hướng, bơi xoắn ốc đuôi cong và liệt cứng, bụng cá chướng to do bóng hơi căng phồng, ruột không có thức ăn nhưng thường có dịch màu xanh lá cây Thân và nội tạng không dấu hiệu tổn thương Bệnh này gây chết nhiều ở cá con và chịu tác hại nhiều hơn cá lớn Các loài mắc bệnh này là cá mú, cá

chẽm, cá giò (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2008)

Cá song chấm nâu nuôi thương phẩm ao đất bị viêm bóng hơ i với các triệu chứng căng bong bóng, bụng căng phồng, có các bong bóng nhỏ trong lá mang Khi nhiễm bệnh cá thường bơi chút đầu xuống hoặc hướng lên trên mặt nước, cá bị nổi một cách thụ động mà không thể lặn xuống đáy được Giải phẫu nội tạng cá thấy bong bóng chiếm khoảng 3/4 khoang bụng Hiện tượng này xuất hiện khi có mưa rào lớn, dẫn đến hiện tượng cá chết khá nhiều trong các ao nuôi Đến nay, chưa xác định được nguyên nhân và chưa có biện pháp phòng trị (Lê Xuân, 2004)

Theo Bùi Quang Tề (2006), bệnh viêm bóng hơi ở cá chép (SBI) có trạng thái ngạt thở, tách đàn, bơi ở tầng mặt hoặc chết chìm ở tầng đáy Cá mất thăng bằng bơi không định hướng, mang, mắt và da có hiện tượng xuất huyết

Cơ thể có màu tối, những chỗ viêm có nhiều chất nhầy, mắt lồi nhẹ, mang nhợt nhạt, các tơ mang dính bết lại Máu loãng chảy ra từ hậu môn, bụng trướng to Giải phẫu bên trong xoang bụng, cho thấy hiện tượng xuất huyết trên bề mặt các nội tạng, trong ổ bụng có dấu hiệu tích nước, bóng hơi xuất huyết và teo dần một ngăn, xoang bụng chứa nhiều dịch nhờn Tác nhân gây bệnh là Rhabodovirus carpio Bệnh xảy ra vào mùa có nhiệt độ thấp, thường

vào cuối đông đầu xuân ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam, trong các ao nuôi cá thịt hay cá bố mẹ đều có thể gặp bệnh này Thời tiết, khí hậu và chất lượng môi trường ao nuôi là các điều kiện cần thiết, có thể làm suy giảm hệ thống

miễn dịch ở cá nuôi, tạo điều kiện cho bệnh này bùng phát và gây tác hại Ngoài ra tác động cơ học do nhốt giữ mật độ cao hay do ký sinh trùng gây thương tổn cũng là điều kiện cho sự xâm nhập và gây bệnh của virus Bệnh xuất hiện ở Châu Âu, Liên Xô cũ, Bắc Mỹ, Trung Quốc, và Việt Nam Năm 1977-1980, bệnh viêm bóng hơi ở cá chép Hung bố mẹ nhập vào Việt Nam tại Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I và gây tỷ lệ chết cao

2.4 Những nghiên cứu mô học trên động vật thủy sản

Từ khi học thuyết tế bào ra đời, cùng với sự hoàn thiện chiếc kính hiển

vi và kỹ thuật hiển vi đã đưa mô học phát triển mạnh Đến cuối thế kỷ XIX, bắt đầu thời kỳ phát triển rầm rộ của khoa học mô tả Những thành công lớn trong kỹ thuật mô học nữa sau thế kỷ XIX là việc chế tạo ra máy cắt lát mỏng nghiên cứu tỉ mỉ cấu trúc vi thể của tế bào và mô (Phạm Phan Địch, 1988) Theo Roberts (1995), việc phân tích mô bệnh học vi thể là nghiên cứu những thay đổi diễn ra trong mô cơ thể trong suốt quá trình bệnh Những thay đổi này thường là những đặc điểm đặc trưng của cơ thể và nó góp phần không nhỏ vào việc xác định ra tác nhân gây bệnh

Những thay đổi mô học được xem là chỉ thị sinh học trong việc đánh

giá sức khỏe cá tiếp xúc với tác nhân gây hại (Thophon et al., 2003) Một

trong những lợi thế lớn của việc sử dụng chỉ thị sinh học mô học trong kiểm soát môi trường là kiểm tra được những cơ quan đích như mang, thận và gan,

mà chúng là những cơ quan có chức năng quan trọng như bài tiết, hô hấp

(Gernhofer et al., 2001)

Đề cập đến các công trình nghiên cứu mô học đã có không ít những nhà khoa học nghiên cứu về lĩnh vực này như Chinabut và limsuwan (1983)

nghiên cứu mô học trên cá trê trắng (Clarias batrachus) nhiễm vi khuẩn

Aeromonas hydrophila Kết quả quan sát được gan, thận sau bị thoái hóa, hoại

tử, tỳ tạng bị xung huyết, mô liên kết gia tăng, các tế bào lympho giảm đi ở một số cá bị nhiễm khuẩn, thận trước xuất huyết và hoại tử Bên cạnh đó Nash

và ctv (1986), có nghiên cứu bệnh vi khuẩn có liên quan đến dịch bệnh trên cá

bống mú và cá chép, tác giả sử dụng phương pháp mô học để xác định những thay đổi vi thể trên các cơ quan khi bị vi khuẩn tấn công Kết quả nghiên cứu cho thấy lớp biểu mô da bị thoái hóa, vẩy bị mất lớp bì và trung tâm các bó cơ

bị xuất huyết, hoại tử và các tế bào bị sưng viêm Trên thận và tỳ tạng xuất hiện các vùng mô tạo máu bị hoại tử rải rác ở các trung tâm hoại tử Ở cả gan, thận, tỳ tạng, tuyến tụy đều cho thấy sự gia tăng của các đại thực bào sắc tố

Supranee và Robert (1999), viết tài liệu về bệnh cá và mô học ở cá bệnh lở loét (EUS) Tác giả miêu tả dấu hiệu bệnh lý và những thay đổi cấu

trúc tế bào của đối tượng nhiễm bệnh Do cá bệnh lở loét có nhiều tác nhân sơ cấp và cơ hội xâm nhập gây bệnh (nấm, vi khuẩn) nên tác giả đã chia thành 5 dạng biểu hiện của bệnh tương ứng với từng dạng sẽ có những biến đổi cấu trúc mô

Ở Việt Nam cũng đã có một số nghiên cứu trong lĩnh vực mô học chủ

yếu trên đối tượng nuôi phổ biến hiện nay Nguyễn Quốc Thịnh và ctv (2004)

đã có những nghiên cứu trên cá tra trắng gan, thể hiện nhiều thay đổi về mặt cấu trúc, đặc biệt ở gan, thận, tỳ tạng có hiện tượng xung huyết, xuất huyết và nhiều vùng bị hoại tử trầm trọng xuất hiện ở hầu hết các vùng chức năng của các cơ quan Vi khuẩn cũng đã được tìm thấy trên mẫu mô của các cơ quan này, những vi khuẩn này tạo thành bó ở rìa các vết hoại tử Đồng thời ở mang

cá bệnh có sự dính lại của các tia mang làm cản trở hoạt động hô hấp của cá

Bóng hơi cá hồi (Chinook) chứa đầy di ̣ch sê ̣t có mùi thối khi ki ểm tra

mô học thấy xuất hiện một vài chỗ viêm nhỏ trên bóng hơi , đă ̣c biê ̣t có thêm phù vỏ mạch máu và lớp dưới màng nhày Ngoài ra, mô ho ̣c bóng hơi cá chình

Châu Âu nhiễm Anguillicola crassus thấy có sự tăng biểu mô , giản và nghẽn mạch máu; và sự hiện diện của giun, trứng, ấu trùng trong khoan bóng hơi Ấu trùng cũng được tìm thấy ở lớp dưới biểu mô và bên ngoài thì b ị sưng viêm, phù nề, sơ hóa (Lumsden, 2006)

Ngoài ra, mô bệnh học cũng được ứng dụng nhằm đánh giá sự hiện diện của nấm trong các mẫu bệnh phẩm Một số phương pháp thường được sử dụng như nhuộm Heamatoxylin và Eosin (H&E), nhuộm Grocott´s và nhuộm PAS Nhuộm Grocott´s sử d ụng methenamine-siver để xác định sự hiện diện của nấm trong các mẫu mô với các sợi nấm bắt màu nâu và đen Hơn nữa, nhuộm bằng acid Periodic-Schiff (PAS-light green) cũng thường được ứng dụng với các sợi nấm màu hồng và đỏ trong mô bệnh học (Duc và Hatai, 2009) Nghiên cứu cho thấy tôm he Nhật Bản, tôm hùm nước ngọt và tôm sú

bệnh đen mang do Fusarium sp dễ dàng thấy được sự hiện diện của bào tử và

sợi nấm trên các mang bệnh khi nhuộm H&E, PAS, và Grocott’s

(Rhoobunjongde et al., 1991)

Khi kiểm tra mô học trên cá vàng cảm nhiễm Fusarium oxysporum thì

các tế bào cơ bị thoái hóa, hoại tử với nhiều tế bào viêm và cũng tìm thấy sợi nấm trên mô Tế bào gan bị phù Sự xung huyết và nghẽn mạch máu cũng xuất hiện Cuống bào tử đính có thể xâm nhập vào mạch máu Ngoài ra, mô gan bị viêm nặng, thận xung huyết và một phần bị hoại tử Mạc treo bị bong tróc Họ cho rằng nếu sợi nấm xâm nhập vào màng nhầy và xâm nhập vào chất nền thì mạch máu có thể là mục tiêu xâm nhập quan trọng Hoại tử sẽ lan rộng ra

xung quanh các mạch máu Khi sợi nấm đã xâm nhập vào mạch máu, chúng

có thể gây ra nghẽn mạch Những mô hoại tử là nơi thích hợp để Fusarium lan

rộng và làm tăng nhanh sự lây nhiễm Cá bị nhiễm bệnh có thể chết vì khó thở

(Ke Xiao-Li et al., 2010).

CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện tại các phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ và phòng xét nghiệm Nam Khoa – Biotek – Thành phố Hồ Chí Minh Thời gian: Từ 15/08/2011 đến 25/05/2012

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu cá bệnh: tổng 73 cá tra (200-900g) gồm 14 cá khỏe và 59 cá bệnh thu tại các ao nuôi thâm canh có biểu hiện trương bóng hơi ở Bến Tre, Đồng Tháp, An Giang và Cần Thơ

Mẫu cá giống: 300 cá tra giống khỏe (15-25g/con) dùng làm thí nghiệm cảm nhiễm mua từ trại giống Hồng Ngự - Đồng Tháp

Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, đĩa petri, micropipet 1ml, 5ml, hộp đầu col 1ml, 5ml, chai 100ml, 250ml, 500ml, lame, lamen, bình xịt cồn, …

Thiết bị: kính hiển vi, tủ lạnh, tủ ấm, tủ sấy, tủ cấy, nồi thanh trùng, bể thí nghiệm (60L), máy sục khí và các dụng cụ và thiết bị cần thiết khác

Hóa chất : Cồn tuyệt đối, nước muối sinh lý, nước cất, thuốc nhuộm

Hematoxylin và Eosin, thuốc nhuộm Giemsa, thuốc nhuộm lactophenol cotton blue, kháng sinh ampiciline và streptomycine, dung dịch formol trung tính 10%, xylen, sáp ong, keo dán Enterlan

Môi trường : môi trường nuôi cấy vi khuẩn tryptic soy agar (TSA) Môi

trường nuôi cấy nấm: GYA (glucose yeast extract agar), PDA (potato dextrose agar )

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu mẫu cá

Mẫu thu được giữ sống bằng thùng mốp xốp có sục khí và vận chuyển

về phòng thí nghiệm phân tích hoặc phân tích tại hiện trường thu mẫu Mẫu cá được tiến hành phân lập và trữ lại làm mô học

Cùng với việc thu mẫu cá thì cũng tiến hành thu thập thông tin bệnh trương bóng hơi ở những hộ này bằng những nội dung soạn sẵn được chuẩn bị

từ phiếu thu mẫu ở phụ lục 1 Ghi nhận các thông tin chủ yếu về quá trình

nuôi, cách chăm sóc, cho ăn, sự biểu hi ện của bệnh , thời gian bo ̣c phát bê ̣nh ,

tác hại của bệnh, cách xử lý và phương pháp phòng trị của người nuôi

3.3.2 Phương pháp giải phẫu và kiểm tra ký sinh trùng

Dựa theo tài liệu của Noga (2010) và phương pháp phân tích mẫu trong phòng thí nghiệm sinh học bệnh học khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ

Quan sát bên ngoài: Đặt cá lên khay và quan sát các dấu hiệu bên

ngoài như: màu sắc, vây, vẩy… tìm ký sinh trùng kích thước lớn Ghi nhận về tình trạng mẫu trước khi mổ cá Dùng nước muối sinh lý NaCl 0,85% nghiên cứu ký sinh trùng trên cá nước ngọt

Kiểm tra ký sinh trùng trên da: Dùng dao (hoặc lame) cạo lớp nhớt trên

thân cá đến đuôi Để mẫu lên một miếng lame sạch rồi nhỏ giọt nước lên mẫu Đậy lame lại và quan sát mẫu dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 4–10X

Kiểm tra ký sinh trùng trên vây: Dùng kéo cắt tất cả các vây của cá cho

vào đĩa lồng có chứa nước muối sinh lý hay nước ngọt Sau đó quan sát dưới kính hiển vi soi nổi và quang học đối với vây cá nhỏ và soi nổi đối với vây cá lớn

Kiểm tra ký sinh trùng trên mang: Cắt lấy toàn bộ cung mang, cho vào

đĩa lồng có chứa nước muối sinh lý và quan sát dưới kính hiển vi soi nổi tìm

ký sinh trùng có kích thước lớn Sau đó, cạo nhớt trên cung mang, ép tiêu bản

và quan sát dưới kinh hiển vi quang học vật kính 10 – 40X

Quan sát các cơ quan nội tạng: xoang bụng, ruột, gan, thận, bóng hơi

Mổ cá và quan sát kỹ xoang bụng tìm bào tử và bào nang của ký sinh trùng trong xoang bụng

Mổ các cơ quan nội tạng và phết mẫu để tìm kí sinh trùng

Phương pháp xác định mức độ nhiễm ký sinh trùng

Tỉ lệ nhiễm (%) = X 100

Cường độ nhiễm = Số kí sinh trùng/thị trường

3.3.3 Phương pháp phân lập và định danh nấm

Phân lập nấm: nấm được phân lập dựa theo phương pháp của Phạm

Minh Đức và ctv., (2010) Trước khi phân lập, dùng dao cạo lớp trong cùng

của gan, thận, bóng hơi nhi ễm bệnh ép lên lame có nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm

Số mẫu nhiễm kí sinh trùng Tổng số mẫu đã kiểm tra

cotton blue rồi quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40-100X Khi quan sát tiêu bản tươi thấy có sự xuất hiện của sợi nấm hoặc bào tử nấm thì tiến hành phân lập nấm Những mẫu xuất hiện sợi nấm hoặc bào tử thì đư ợc cắt nhỏ vớ i đường kính 2 mm, rửa mẫu 2 lần qua nước muối sinh lí (0,85% NaCl) tiệt trùng và cấy vào đĩa môi trường GYA có bổ sung thêm 2 loại kháng sinh ampiciline và streptomycine (500µg/ml mỗi loại) xung quanh mẫu cấy Ủ ở nhiệt độ 280C trong 1-4 ngày để nấm phát triển Tiếp tục cấy truyền 2-3 lần để

có nấm thuần Khi có nấm thuần cấy chuyển các chủng nấm sang môi trường GYA, PDA để quan sát các đặc điểm về hình thái học và khả năng phát triển của các chủng nấm trên mỗi loại môi trường nuôi cấy

Định danh nấm : Nấm được định danh theo khóa phân loại của De

Hoog et al.,(2000) dựa vào đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường GYA, PDA;

đặc điểm hình thái bào tử, sợi nấm; kích thước bào tử và sợi nấm

Khẳng định kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 28S rRNA tại phòng thí nghiệm Nam Khoa – Thành phố Hồ Chí Minh

Tần suất xuất hiện (TSXH) của các giống nấm được xác định bằng cách:

TSXH = x 100%

Để quan sát đặc điểm hình thái và đo kích thước sợi nấm, bào tử ta tiến

hành nuôi nấm trên lam kính theo mô tả của De Hoog et al (2000) Phương

pháp này được thực hiện như sau: đặt lame lên que thủy tinh hình chữ V có lót giấy thấm bên dưới và giữ ẩm bằng nước cất Sau đó cắt khối môi trường GYA (1x1x1 cm) đưa lên lame và cấy nấm vào 4 mặt bên của khối agar Tất

cả được đặt trong đĩa petri vô trùng Đĩa cấy được ủ ở nhiệt độ 28oC từ 5-7 ngày cho nấm phát triển bao phủ lamen Khi đó lấy lamen ra và đặt trên lame kính có sẵn giọt thuốc nhuộm cotton blue Mẫu nhuộm được cố định bằng keo dán cho việc quan sát đặc điểm hình thái và đo kích thước

Số chủng trong mỗi giống nấmTổng số chủng nấm phân lập được

Hình 3.1: Phương pháp nuôi nấm trên lam kính Kích thước bào tử và sợi nấm được đo dựa theo phương pháp của Nguyễn Thị Quỳ (2002) Đặt thước đo vật kính vào bàn kính hiển vi, điều chỉnh sao cho vạch đầu tiên của thước đo vật kính trùng với thước đo thị kính

và đếm xem một khoảng cách của thước đo thị kính trùng với bao nhiêu khoảng của vật kính (mỗi khoảng của thước đo vật kính có độ dài là 10 µm)

Từ đó tính chiều dài mỗi khoảng cách trên thước đo thị kính theo công thức 1; lấy thước đo vật kính ra và thay bằng tiêu bản nấm lên bàn kính hiển vi; xác định độ dài của bào tử và sợi nấm là bao nhiêu vạch sau đó tính bằng công thức 2

b là khoảng cách thước đo vật kính trùng với a

c là khoảng cách thước đo thị kính của bào tử nấm

3.3.4 Phương pháp kiểm tra vi khuẩn trên cá tra bệnh trương bóng hơi

Song song với kiểm tra kí sinh trùng và phân lập nấm, nghiên cứu cũng tiến hành phân lập vi khuẩn Dùng que cấy tiệt trùng lấy mẫu vi sinh ở gan, thận, tỳ tạng, bóng hơi cấy lên môi trường TSA ủ ấm 28oC từ 24-48 giờ Ghi nhận lại hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trên đĩa cấy

10b

a

3.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm gây cảm nhiễm nấm

Thí nghiệm gây cảm nhiễm được thực hiện tại bộ môn Sinh học và Bệnh thủy sản – Khoa thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ

Cá tra giống khỏe (15-25g/cá) được thuần hóa trong bể (500L) nước sạch 5-7ngày Trước thí nghiệm 2 ngày, cá ngừng cho ăn và kiểm tra kí sinh trùng, vi khuẩn trên 5 cá trước khi bố trí

Dụng cụ: bể composit, xô, vợt, sọt, đá bọt, ống sục khí Tất cả đem khử trùng với chlorine 200ppm trong một ngày, rửa lại với nước sạch và phơi khô

Trước khi bố trí phải khử trùng nước bằng chlorine 20ppm và sục khí liên tục 5-7 ngày Sau đó kiểm tra nước cho đến khi hết chlorine, mức nước bể thí nghiệm là 30L

Chuẩn bị bào tử nấm thí nghiệm

Hai chủng vi nấm Fusarium sp F1P2 và Fusarium sp F12P2 được

dùng trong thí nghiễm gây cảm nhiễm là những chủng phân lập được từ cá tra bệnh trương bóng hơi Các chủng nấm thí nghiệm được nuôi ở 28oC trong 10 ngày trên môi trường GYA Bào tử được thu bằng cách cho trực tiếp 20 ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng vào đĩa cấy, sau đó trãi đều bằng que cấy vô trùng và lấy phần dung dịch lỏng, tiến hành lọc với hai lớp gạc y khoa vô trùng để loại bỏ các sợi nấm và phần agar bị tróc ra

Mật độ bào tử được xác định bằng cách dùng buồng đếm hồng cầu

Cách xác định mật độ bào tử cho thí nghiệm

Cách tính số lượng bào tử nấm

M = B x 104 x p

Trong đó:

M: mật độ bào tử (bào tử/ml)

B: tổng số bào tử trong 25 ô vừa

P: độ pha loãng ban đầu

Phương pháp tính mật độ bào tử cho thí nghiệm gây cảm nhiễm

Y: thể tích nước thêm để pha loãng mật độ bào tử cần sử dụng cho thí nghiệm (ml)

Cá lờ đờ, biểu hiện bệnh được tái phân lập và định danh

Thí nghiệm được tiêm với các mật độ bào tử nấm như sau:

Nghiệm thức 1: Cá tiêm bào tử nấm chủng F1P2 (8x106 bào tử/ml) Nghiệm thức 2: Cá tiêm bào tử nấm chủng F1P2 (8x103 bào tử/ml) Nghiệm thức 3: Cá tiêm bào tử nấm chủng F12P2 (6x106 bào tử/ml) Nghiệm thức 4: Cá tiêm bào tử nấm chủng F12P2 (6x103 bào tử/ml) Nghiệm thức 5 (đối chứng): Cá không tiêm bào tử nấm

3.3.6 Phương pháp mô học

Mẫu được cố định từ các cơ quan: mang, gan, thận, tỳ tạng, bóng hơi bằng formol trung tính 10% (4g NaH2 PO4 , 6,5g Na2 HPO4, 100 ml Formol và

900 ml Nước cất) trong 48h sau đó chuyển sang cồn 70o và giữ lại đến khi xử

lý mẫu Mẫu cắt với độ dày 5-7mm và xử lý qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu, tẩm paraffin Sau đó đúc khối mẫu, dán mẫu, và nhuộm Haematoxylin & Eosin và Giemsa (Phụ lục 4) Sau đó, quan sát mẫu dưới kính hiển vi và chụp lại ảnh

3.3.7 Phương pha ́ p xử lý số liê ̣u

Số liệu được phân tích bằng chương trình Microsoft Excel và luận văn được trình bày bằng chương trình Microsoft Word

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu thập thông tin về bệnh trương bóng hơi trên cá tra

4.1.1 Thông tin về kỹ thuật nuôi

Trong tổng số 11 hộ nuôi cá tra cho biết họ mua con giống từ Nông Trường Sông Hậu, An Giang hoặc tự sản xuất con giống Nghề nuôi cá tra không còn là ngành non trẻ nên phần lớn người nuôi có khả năng tự sản xuất con giống khép kín cho mình Chủ động được nguồn con giống là thuận lợi trong việc tăng lợi nhuận trong nghề nuôi

Diện tích ao nuôi trung bình 3.000 – 7.000 m2, mật độ thả giống từ

48-62 con/m2 và cở giống thả trung bình khoảng 20g/con Theo thông tin từ các

hộ nuôi cho biết thả giống với mật độ cao mầm bệnh dễ xảy ra do cá nuôi luôn

ở tình trạng stress, thiếu oxy và kích cỡ không đồng đều Tình trạng stress liên tục làm bệnh dễ bộc phát và gây chết cá Ngoài ra, lượng thức ăn dư thừa và chất thải của cá làm tăng mùn bã hữu cơ, nước luôn giàu dinh dưỡng Khí

NH3, tiêu hao oxy hóa học, tiêu hao oxy sinh học cao mà oxy hòa tan thấp nên người nuôi thay nước liên tục để loại chất độc góp phần đưa mầm bệnh vào ao nuôi nhất là lấy trực tiếp từ sông Hơn nữa với mật độ cao cá cạnh tranh không gian sống dẫn đến phân đàn cao Cá yếu và cá nhỏ luôn bị cá khỏe chen lấn, cạnh tranh thức ăn, không gian sống nên dạt vào bờ Nhóm cá này ngày càng yếu dễ bệnh hơn do nước gần bờ xấu, thiếu thức ăn

Nguồn thức ăn được sử dụng chủ yếu trong suốt quá trình nuôi là thức

ăn công nghiệp và thức ăn tự chế với chế độ cho ăn 2lần/ngày vào lúc 8 giờ sáng và 4 giờ chiều Tùy theo mỗi hộ nuôi mà có sự lựa chọn thức ăn của các công ty khác nhau như: Việt Thắng, Cargill, Hầu hết các loại thức ăn được sử dụng có hàm lượng đạm từ 24-28% Việc sử dụng thức ăn công nghiệp tạo điều kiện thuận lợi cho các hộ nuôi trong quá trình quản lý chất lượng môi trường nước và chủ động được nguồn thức ăn

Nhìn chung chế độ thay nước của các trại nuôi chủ yếu theo nước trong

ao, khi thấy ao bẩn thì thay chứ không có quy định rõ ràng, trung bình thay khoảng 30% lượng nước trong ao Tuy nhiên, các hộ đều lấy trực tiếp từ sông không qua ao lắng xử lý nước Hầu hết các trại nuôi cá tra đều không chịu bỏ diện tích cho ao xử lý nước mà nước ao nuôi được thải trực tiếp ra sông rạch

và nước cấp vào cũng được lấy trực tiếp từ sông rạch nên việc tạo điều kiện bệnh xuất hiện rất cao

4.1.2 Tình hình bệnh trương bóng hơi và cách xử lý của người nuôi

Trong vài năm gần đây, phong trào nuôi cá tra xuất khẩu ở ĐBSCL tăng rất nhanh Thế nhưng do phát triển quá nhanh không theo quy hoạch nên bệnh trên cá tra nuôi hiện nay ngày càng nhiều nhưng việc điều trị lại kém hiệu quả đang là một khó khăn lớn cho người nuôi

Kết quả thu thập thông tin cho thấy bệnh trương bóng hơi trên cá tra đang là mối lo ngại lớn trong những năm gần đây do không biết được nguyên nhân và việc điều trị không mang lại hiệu quả Bệnh thường xuất hiện ở giai đoạn 2-5 tháng nuôi và kéo dài nhiều tháng Cá trương bóng hơi thường tập trung gần bờ ao, nơi dòng nước chảy và nổi trên tầng mặt rất lâu Cá bệnh không chết nhanh mà bỏ ăn kéo dài vài tháng rồi chết Giai đoạn nhiễm nặng,

cá bệnh bị lở loét khắp thân Hộ nuôi cũng cho biết vào thời điểm bộc phát bệnh cá chết 50-300 con/ngày Mặc dù tỉ lệ chết không cao (<5%) nhưng khi bệnh nặng tỉ lệ nhiễm được cho biết là đến 40% Và đặc điểm lớn của bệnh này là cá bệnh ăn giảm đến bỏ ăn, hiện chưa có thuốc đặc trị và không thể trị khỏi mà thường kéo dài đến cuối vụ nuôi Đồng thời tình trạng sức khỏe kém

là cơ hội cho nhiều bệnh khác xâm nhập Vì thế cá trở nên gầy yếu, FCR cao, chất lượng thịt giảm, màu thịt cơ xấu, năng xuất thấp là một tổn thất lớn dễ thấy của người nuôi

Khi bệnh bộc phát hầu hết các trại nuôi đều xử lý thuốc và hóa chất để điều trị Các loại thuốc và hóa chất thường được sử dụng gồm: đồng sulfate, muối, chlorine dạng bột và một số thuốc kháng sinh như: sulfamethoxazole, rifamicine, enrofloxacine, kanamicine, vimenro, amoxicilline với liều lượng theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Phụ lục 3) Ngoài việc sử dụng kháng sinh

để trị bệnh cho cá, các hộ nuôi còn sử dụng một số loại như vitamin C, sorbitol, methionin bổ sung vào thức ăn với mục đích tăng đề kháng cho cá Hơn nữa, quá trình bộc phát bệnh hộ nuôi còn thay nước 30% mỗi ngày để tăng oxy và giảm độc cho cá Điều đáng lưu tâm là việc sử dụng kháng sinh của hầu hết các hộ nuôi là dùng đại trà chứ không biết rõ có hiệu quả hay không Tuy nhiên, một số hộ nuôi cho biết họ chỉ khống chế môi trường và bổ sung chất đề kháng khi bệnh xảy ra mà không dùng kháng sinh vì họ cho rằng kháng sinh không có tác dụng điều trị Kết quả thu thập thông tin cũng cho thấy bệnh xảy ra nhiều ao cùng lúc trong cùng hộ nuôi Một số hộ nuôi cho biết bệnh đã từng xảy ra trước đó với tần suất thấp nhưng không rõ nguyên nhân và sau 1-2 tháng cá bệnh nặng hơn không thể trị khỏi Một đặc điểm đáng chú ý mà người nuôi cho biết là bệnh có thể xảy ra trong cùng 1 ao ở 2

vụ kế tiếp nhau

4.2 Hiện trạng ao thu mẫu cá tra bệnh trương bóng hơi

Bệnh trương bóng hơi trên cá tra gây trở ngại đáng kể cho người nuôi Tình hình bệnh được đánh giá qua bảng phỏng vấn thông tin trực tiếp (Phụ lục 1) Kết quả phỏng vấn cho thấy thời gian bệnh xảy ra từ 2 - 5 tháng nuôi (200 - 900g/con) tập trung chủ yếu vào mùa khô tháng 12 đến tháng 4 dương lịch với tên gọi là “ trương bóng hơi” hay còn gọi là “bệnh cá heo” Cá được thu trong khoảng thời gian từ tháng 08/2011 đến tháng 04/2012 Theo thông tin ghi nhận, các ao cá thu mẫu đã biểu hiện bệnh lý từ 1,5-2,5 tháng Cá trương bóng hơi tập trung gần bờ nổi trên mặt nước rất lâu và dễ dàng thấy những vết loét trên lưng đối với cá bệnh nặng Cá bệnh không chết hàng loạt mà bỏ ăn và kéo dài nhiều tháng rồi chết

Hình 4.1: Cá bệnh bơi lội lờ đờ tầng mặt

4.3 Dấu hiệu bệnh lý cá tra bệnh trương bóng hơi

Phần lớn cá trương bóng hơi giảm tăng trọng, cơ thể ốm yếu do bỏ ăn thời gian dài Khi bệnh bộc phát ngoài tự nhiên thì biểu hiện bệnh lý theo từng cấp độ nặng nhẹ khác nhau Cá bệnh nhẹ màu sắc cơ thể nhợt nhạt, bóng hơi trương cứng một phần hay cả khoang bóng, bên trong bóng hơi có dịch Giai đoạn nhiễm nặng thì dấu hiệu trầm trọng hơn, trên thân có nhiều mảng trắng,

cá nổi trên tầng mặt rất lâu ngoài ra kèm theo bội nhiễm gây lở loét khắp thân Đồng thời cơ thể cá gầy yếu trọng lượng rất thấp, 180-200g sau hơn 4 tháng nuôi Khi giải phẫu bóng hơi thấy cả khoang bóng trương to, bên trong bóng hơi hoại tử, mềm nhũn, xuất hiện nhiều bọt khí và chất dịch màu trắng (Hình 4.2 B) Kiểm tra mẫu tươi bên trong bóng hơi (100x) thấy nhiều bào tử hình thuyền (Hình 4.2C và 4.2D) và sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Theo Lumsden (2006), nhiễm nấm trên bóng hơi là rất phổ biến Chúng có thể xâm

nhập trực tiếp từ ống dẫn khí Hai nhóm nấm phân bố rộng Phoma và

Saprolegnia được ghi nhận nhiễm trên bóng hơi

Trường hợp đặc trưng của bệnh bóng hơi trên cá chép là sưng bóng hơi (Markiewicz, 1966), bệnh này phát triển thành vết viêm, hoại tử một phần

hoặc cả khoang bong bóng, vách bóng hơi xuất hiện chất dịch nâu đỏ Csaba et

al (1984) cho rằng nguyên nhân là do protozoa Ngoài ra, sự nhiễm khuẩn

thường xuyên có thể gây ra sưng bóng hơi Khi sự phát triển của bóng hơi giảm thì cá không thể giữ được thăng bằng trong nước (trích dẫn bởi Roberts

và Rodger, 2000)

Hình 4.2: Bệnh lý cá trương bóng hơi (A) Cá khỏe (B) Cá trương bóng hơi bên trong chứa dịch và bọt khí (C) & (D) Bào tử nấm bên trong bóng hơi (100x)

4.4 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá tra bệnh trương bóng hơi

Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên 59 cá có dấu hiệu trương bóng hơi

tìm thấy 2 loại ký sinh trùng trên mang là trùng mặt trời - Trichodina và sán

16 móc - Dactylogyrus và 1 loại ký sinh trùng trong ruột là trùng lông -

Ichthionyctus với cường độ nhiễm thấp Ngoài ra, soi tươi bóng hơi có dấu

hiệu bệnh không tìm thấy được ký sinh trùng

D

C

Bảng 4.1 Kết quả nhiễm ký sinh trùng trên cá tra bệnh trương bóng hơi

STT Kí sinh trùng Cơ quan nhiễm Tỉ lệ nhiễm(%) Cường độ nhiễm

67,8 55,9 50,8

3-5

1 2-4

Kết quả cho thấy cá nhiễm trùng bánh xe với cường độ 3-5 trùng/thị trường Theo nghiên cứu của Hà Ký và Bùi Quang Tề (2000), nếu tỉ lệ nhiễm

Trichodina 90-100% và cường độ nhiễm 20-30 trùng/thị trường sẽ gây nguy

hiểm cho cá Mặt khác, trùng bánh xe được xem là tác nhân cơ hội và thường được tìm thấy cùng với các loài ngoại ký sinh trùng khác trên bề mặt cơ thể cá (Wootten, 1989) Vì vậy, với cường độ 3-5trùng/thị trường không gây ảnh hưởng đến cá

Theo Bauer (1969, 1977), Dactylogyrus với cường độ nhiễm 20-30

sán/cá thể có thể làm chết cá (Trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Hằng và Phạm

Minh Đức, 2009) Ở nghiên cứu này, cường độ nhiễm Dactylogyrus 1sán/thị

trường không gây nguy hiểm cho cá Ngoài ra, xuất hiện nhóm trùng lông nội

ký sinh Ichthionyctus trên hầu hết các đoạn ruột của cá khi kiểm tra mẫu Tần

số xuất hiện của Ichthionyctus là 50,8% và cường độ nhiễm 2-4 trùng/thị trường Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) mặc dù chúng ký sinh với lượng lớn

nhưng loài này không gây hại cho ký chủ, chúng chỉ làm bệnh nặng thêm khi vật chủ bị bệnh viêm ruột

4.5 Kết quả kiểm tra vi khuẩn trên cá tra bệnh trương bóng hơi

Đồng thời với việc phân lập nấm, nghiên cứu cũng tiên hành phân lập

vi khuẩn trên cá tra bệnh trương bóng hơi Kết quả phân lập từ 59 cá bệnh thì

có 3 mẫu lên khuẩn lạc ở bóng hơi (chiếm 5%) Tuy nhiên, màu sắc và đặc điểm khuẩn lạc khác nhau và được phân thành 3 nhóm Điều này cho thấy các nhóm vi khuẩn này có thể là tạp khuẩn không phải là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra

4.6 Kết quả phân lập và định danh nấm

Qua 7 đợt thu mẫu trong tổng số 11 ao cá tra bệnh trương bóng hơi tại Bến Tre, Đồng Tháp, An Giang và Cần Thơ với 59 mẫu cá bệnh và 14 cá khỏe Các mẫu gan, thận và bóng hơi được tiến hành phân lập trên GYA Kết quả phân lập nấm trên gan, thận, bóng hơi lần lược là 67; 54,2 và 83,1% Từ các mẫu nấm cấy từ cá tra bệnh trương bóng hơi phân lập được 49 chủng nấm chiếm 83,1% Các chủng nấm được kiểm tra hình dạng, kích thước và tốc độ phát triển trên môi trường GYA, PDA Khi kiểm tra đặc điểm khuẩn lạc nấm

và tốc độ phát triển trên mỗi loại môi trường cho thấy khuẩn lạc có nhiều màu

sắc khác nhau: hồng nhạt, vàng nhạt, đỏ tía, các sợi nấm dạng bông mọc nhô khỏi bề mặt môi trường (Hình 4.3) Trên môi trường GYA, khuẩn lạc phát triển nhanh đường kính đạt 60 mm và trên PDA khuẩn lạc phát triển nhanh hơn đạt 73 mm ở 28 °C sau 7 ngày nuôi cấy

Hình 4.3: Khuẩn lạc nấm Fusarium sp trên môi trường GYA sau 7 ngày nuôi

cấy (A), (B) Khuẩn lạc chủng F12P2 (C), (D) Khuẩn lạc chủng F1P2

Để quan sát đặc điểm hình thái và đo kích thước, nghiên cứu tiến hành nuôi nấm trên lame kính Sau 7 ngày, kiểm tra thấy được tất cả các chủng nấm đều có đại bào tử hình thuyền, cong ở 2 đầu, có từ 1-5 vách ngăn (Hình 4.4D) với đường kính 1,5-3,5µm Ngoài đại bào tử còn xuất hiện tiểu bào tử và đôi khi có bào tử vách dầy Khi kiểm tra hình dạng sợi nấm cho thấy các sợi nấm đều phân nhánh, có nhiều vách ngăn, cuốn bào tử chồi phát triển nhiều (Hình 4.4C, F) và đường kính đạt từ 2-4,5µm