Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây lô hội (Aloe vera Linne.var Sinensis Berger) bằng phương pháp nuôi cấy nuôi cấy in vitro và phương pháp giâm hom

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát sinh chồi nách tạo vật liệu giâm hom thân cây Lô hội.. Một trong những tính năng kỳ diệu của loài dược thảo này đ

Bộ giáo dục vμ đμo tạo trường đại học nông nghiệp i

-

Bùi Thị hồng quyên

Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội

(Aloe vera Linne var Sinensis Berger) bằng phương pháp

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp

Chuyên ngành : trồng trọt Mã số : 60.62.01

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Kim Thanh

Hμ nội - 2007

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đ được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Bùi Thị Hồng Quyên

Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngoài sự cố gắng của bản thân tôi đ

nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, bạn bè và

người thân

Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong

Khoa Nông học những người đ trực tiếp giảng dạy trang bị những kiến thức

bổ ích trong suốt thời gian học đại học cũng như học cao học của mình Tôi

xin được gửi lời chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý

Thực vật, các anh chị trong Trung tâm chuyển giao TBKH&CN Sở KHCN

Vĩnh Phúc đ chân thành đóng góp ý kiến giúp cho luận văn của tôi được

hoàn thiện hơn Đặc biệt tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo

TS Nguyễn Thị Kim Thanh người đ tận tình hướng dẫn giúp đỡ và động viên

tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này

Bên cạnh đó tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tất cả người thân, bạn

bè những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và

2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng cây Lô hội trong và ngoài nước 142.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ

2.4 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và ứng dụng trong nhân giống vô

4.1 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Lô hội bằng phương pháp nuôi cấy in vitro 434.1.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo vật liệu khởi đầu in vitro 434.1.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi Lô hội in vitro 484.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp xytokinnin và auxin đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội in vitro 534.1.3 Nghiên cứu kỹ thuật ra rễ tạo cây hoàn chỉnh cây Lô hội in vitro 574.1.4 Nghiên cứu kỹ thuật ra cây ngoài vườn ươm (sau ống nghiệm) 63

4.2 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả

năng phát sinh chồi nách tạo vật liệu giâm hom thân cây Lô hội 67

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý IBA đến khả năng ra rễ và

4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng đến

khả năng phát sinh chồi nách cây Lô hội 70

Danh mục các chữ viết tắt

BAP : Benzyl Adenin Purin

Ki : Kinetin NXB : Nhà xuất bản

TB : Trung bình THT : Than hoạt tính

4.1 ảnh hưởng của phương thức và thời lượng khử trùng đến tỷ lệ

4.2 ảnh hưởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi của

4.3 ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội 50

4.4 ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Lô hội

4.5 ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA đến khả năng nhân

nhanh chồi Lô hội in vitro (sau 3 tuần nuôi cấy) 54

4.6 ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh

chồi Lô hội in vitro (sau 3 tuần nuôi cấy) 56

4.7 ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng ra rễ cây Lô hội in vitro 59

4.8 ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ cây Lô hội in vitro 60

4.9 ảnh hưởng của hàm lượng Than hoạt tính (THT) tới khả năng

ra rễ của cây Lô hội in vitro (sau 2 tuần nuôi cấy) 62

4.10 ảnh hưởng của thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống của cây giai đoạn

4.11 Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây sau ống nghiệm (sau

4.12 ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến khả năng phát

4.13 ảnh hưởng của IBA tới kết quả giâm thân cây Lô hội 69

4.14 ảnh hưởng của việc phun chế phẩm dinh dưỡng tới khả năng

2.1 Cây Lô hội 1năm tuổi ở vườn thí nghiệm 6

4.1 ảnh hưởng của phương thức và thời lượng khử trùng đến tỷ lệ

4.2 ảnh hưởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi của

4.3 ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến hệ số nhân chồi 504.4 Giai đoạn nhân nhanh chồi Lô hội in vitro 514.5 ảnh hưởng của hàm lượng kinetin đến hệ số nhân chồi 534.6 ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α-NAA đến hệ số nhân chồi Lô hội in vitro 554.7 ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IAA đến hệ số nhân chồi Lô hội

in vitro 57

4.9 ảnh hưởng của hàm lượng α-NAA tới tỷ lệ chồi ra rễ 594.10 ảnh hưởng của hàm lượng IBA tới khả năng ra rễ chồi Lô hội in vitro 614.11 ảnh hưởng của hàm lượng Than hoạt tính (THT) tới khả năng

ra rễ của cây Lô hội in vitro 624.12 ảnh hưởng của thời vụ ra cây đến tỷ lệ sống của cây giai đoạn

4.13 ảnh hưởng của thời vụ hủy đỉnh sinh trưởng đến hệ số nhân

1 Mở đầu

1.1 Đặt vấn đề

Cây Lô hội (Aloe Vera) thuộc họ Huệ tây (Liliaceae) [3],[19], cây mọc

nhiều ở các vùng có khí hậu nóng và khô Đây là cây dược liệu được dùng

trong cả đông y và tây y Cây có vị đắng, tính hàn, đi vào bốn kinh can, tì vị và

đại trường Những tính năng của Lô hội đ được khắp nơi trên thế giới biết

đến, từ thời văn minh cổ Ai Cập, Hy Lạp, ấn Độ, Châu Phi và được sử dụng

cách đây hơn 2000 năm [9]

Một trong những tính năng kỳ diệu của loài dược thảo này đ được các

nhà khoa học tại Trường Đại học Bang Texas (Mỹ) nghiên cứu đó là dịch

chiết của cây Lô hội có khả năng làm nhanh lành vết thương, do trong dịch

chiết chứa hoạt chất có tính thẩm thấu cao làm gin nở mao mạch, làm tăng

lượng máu cung cấp cho vùng xung quanh vết thương, làm tăng tốc độ phân

chia tế bào, kích thích hệ thống miễn dịch Trong cây Lô hội có chất đông

dính (gel) rất có ích trong việc điều trị các chứng rối loạn tiêu hoá và bệnh

tiểu đường Một số công trình nghiên cứu ở nước ngoài cũng đ ghi nhận và

khuyến cáo uống dịch chiết Lô hội (2 - 5 gram/ngày) có tác dụng làm chậm

quá trình lo hoá, tăng cường hệ thống miễn nhiễm và có tác dụng tốt cho

đường tiêu hoá

Trong những năm gần đây chất gel chiết rút từ cây Lô hội được dùng

nhiều trong các ngành công nghệ dược phẩm, hoá mỹ phẩm như: kem thoa lên

da, thuốc viên hay thuốc mỡ để trị bệnh với các thương hiệu thuốc Lô hội, mỹ

phẩm Lô hội, và thực phẩm dưới dạng nước uống xirô

ở Việt Nam, cây Lô hội có nhiều dòng khác nhau, trong đó cây Aloe

Vera được ghi nhận là một trong những cây thuốc cổ truyền Việt Nam, cây

phân bố nhiều ở các vùng ven biển miền Trung Từ xa xưa nhân dân ta đ biết

đến các tác dụng của cây Lô hội và sử dụng trong các bài thuốc Đông y Ngày nay để tăng cường sử dụng hoá mỹ phẩm có nguồn gốc từ thảo dược thì một trong các cây trồng được quan tâm phát triển đó là cây Lô hội

Tuy nhiên vấn đề cây giống cho các vùng nguyên liệu còn gặp khó khăn vì trong tự nhiên cây Lô hội rất khó nhân giống bằng hạt Vì vậy người dân vẫn thường nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp truyền thống

đó là phương pháp tách chồi thụ động có hệ số nhân giống không cao, cây sinh ra có sức sống thấp vì thế không thể sản xuất được số lượng lớn cây giống theo quy mô công nghiệp

Trong những năm gần đây, nhằm tạo ra các giống cây trồng chất lượng tốt, không phụ thuộc vào mùa vụ, nhiều địa phương trong cả nước đ ứng dụng phương pháp giâm hom vào công tác nhân giống.Tuy nhiên phương pháp này cho kết quả không cao ở nhiều đối tượng cây trồng và chưa đáp ứng được

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân

giống vô tính cây Lô hội (Aloe vera Linne.var Sinensis Berger) bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro và phương pháp giâm hom thân ”

1.2 Mục đích, yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội Aloe vera Linne.var

Sinensis Berger trên cơ sở đó từng bước xây dựng quy trình nhân cây Lô hội

bằng phương pháp nuôi cấy in vitro và giâm hom cho thực tiễn sản xuất

1.2.2 Yêu cầu

* Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây Lô hội bằng phương pháp

nuôi cấy in vitro:

- Xác định phương pháp khử trùng và thời điểm lấy mẫu thích hợp cho

tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao

- Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp, rút ngắn giai đoạn tái

sinh chồi

- Xác định môi trường nhân nhanh cho hệ số nhân cao, chất lượng chồi

tốt

- Xác định môi trường ra rễ tối ưu với tỷ lệ ra rễ cao

- Xác định thời vụ, giá thể ra cây đảm bảo tỷ lệ cây sống ngoài vườn

ươm cao

* Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Lô hội bằng phương pháp giâm hom:

- Xác định ảnh hưởng của thời vụ huỷ đỉnh sinh trưởng đến khả năng

phát sinh chồi nách cây Lô hội

- Xác định khả năng phát sinh chồi nách qua việc phun chế phẩm dinh

dưỡng

1.2.3 ý nghĩa khoa học

- Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất điều tiết sinh trưởng đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh và tạo rễ cho chồi in vitro của cây Lô hội

- Làm rõ ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh thông qua yếu tố mùa vụ

đến khả năng sống và tái sinh của mẫu cấy cũng như khả năng sống và sinh trưởng của cây in vitro ở giai đoạn vườn ươm

2 Tổng quan tμi liệu

2.1 Giới thiệu chung về cây Lô hội

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Cây Lô hội (Aloe vera Linne) là loại cây thảo mộc đ có từ thời thượng

cổ [8] Khoảng 5000 năm trước Công Nguyên, nhiều dân tộc ả rập ở vùng

Trung Đông đ biết sử dụng cây Lô hội để phục vụ cho cuộc sống của mình

Rồi từ vùng Trung Đông cây Lô hội di thực sang nhiều quốc gia khác như: ấn

Độ, Trung Quốc, Malaixia, Mexico, CuBa Lịch sử tồn tại và phát triển của cây

Lô hội trên khắp thế giới gắn liền với sự hiểu biết ngày càng phong phú về các

lĩnh vực: sinh học, dược lý Tại nhiều quốc gia, dân gian vẫn coi cây Lô hội

như “một đấng hào kiệt’’ bởi lẽ nó rất hữu ích và cũng rất dễ tìm, dễ trồng [12]

Đến nay, sau nhiều năm nghiên cứu, các nhà khoa học đ chứng minh

được rằng: cây Lô hội có nguồn gốc từ Bắc Phi và Trung Đông, từ rất lâu nó

được loài người sử dụng để làm thuốc Theo tài liệu cổ nhất của người Sumeri

viết bằng chữ hán nôm trên những phiến đất nung tìm thấy ở thành phố Nippur

từ niên đại 2200 năm trước Công Nguyên Dựa trên các ghi chép của người Ai

Cập cổ đại trên giấy sậy cho thấy: Người Ai Cập cổ dùng lá Lô hội đơn thuần

hoặc phối hợp với nhiều dược thảo thành 12 dạng bào chế khác nhau, dùng

chữa nhiều bệnh bên trong và bên ngoài [42]

Vào cuối thế kỷ XIII nhà khoa học người ý Macro Polo (1254 - 1323)

đ thực hiện chuyến đi nghiên cứu thực vật nhiệt đới Châu á đến Trung Quốc

Macro Polo đ giới thiệu cho người dân bản xứ một loại cây dược thảo (sau

này gọi là Lô hội), từ Trung Quốc cây Lô hội được di thực sang Việt Nam

[36], [38]

Cây Lô hội là loại cây bụi như xương rồng, còn được gọi bằng một số

tên khác như: Tượng đảm, Long tu, Du thông, Lưỡi hổ, Hổ thiết thuộc chi Aloe, họ Huệ tây (Liliaceae) [6] Trong khoảng 180 loài thuộc chi Aloe thì chỉ

có 4 loài được sử dụng để làm thuốc bổ dưỡng và chữa bệnh, một số loài có

độc tố Hai loài được chú ý nhiều nhất là Aloe Ferox Mill và Aloe vera Linne Theo sách "Cây cỏ Việt Nam" của Phạm Hoàng Hộ thì chi Aloe ở nước

ta chỉ có 1 loài là Aloe vera L Sinensis Berger tức là cây Lô hội lá nhỏ [8],[9]

2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây Lô hội

Hình 2.1 Cây Lô hội 1năm tuổi trong vườn thí nghiệmTheo Võ Văn Chi (1991) [4], Đỗ Thanh Hội (1997),[10] thì cây Lô hội

là loại cây dạng thân cỏ, mập, màu xanh lục nhạt, thân ngắn

Cây Lô hội trưởng thành có lá mập, dài 30 – 50 cm, rộng 5 – 10 cm, dày 1- 2cm

Lá Lô hội gồm 2 phần: phần vỏ ngoài là lớp vỏ xanh, khi cắt ngang chảy ra nhựa màu vàng có mùi hắc, để khô chuyển thành màu đen, phần trong

là phần thịt mọng nước dạng gel

Cụm hoa của cây cao khoảng 1m, mọc thành chùm, hoa to đều có màu vàng lục nhạt

Quả nang hình trứng màu xanh, chứa nhiều hạt Nếu rạch một đường

giữa lá Lô hội tươi rồi dùng thìa nạo ở giữa lá Lô hội quan sát sẽ có một chất

gel trong suốt

2.1.3 Thành phần hóa học của cây Lô hội

Phân tích các thành phần lấy từ lá Lô hội, các nhà nghiên cứu tìm thấy

các chất sau:

* Hợp chất anthraquinon: Đây là thành phần có tác dụng chữa bệnh

của cây Lô hội bao gồm:

- Aloe emodine chất này không có trong dịch tươi Lô hội mà có trong

nhựa khô, chiếm 0,05 - 0,5% Chất này tan trong ether, cloroform, benzen,

- Barbaloin: chiếm 15 - 30% thành phần nhựa của Lô hội, chất này sẽ

tan dần khi để ngoài không khí và ánh sáng, tan được trong nước, cồn,

Axeton, tan ít trong Benzen và Cloroform

- Aloinosid A, Aloinosid B, Anthranol

* Glycosid, Aloezin, Aloenin

* Chất nhựa: Esther của acide Cinnamic

* Chất hữu cơ: monosacharide, polysacharide, cellulose, mannose,

L- Rhamnose

* Các vitamine: B1, B2, B6, acide folic

* Các Enzym: oxydase, lipase, amilase, catalase, allnilase

* Các nguyên tố khoáng vi lượng: zinc, potasodium, mangesium,

manganese, calcium

Theo Al.Awadi F và cộng sự (1991) và Aloe Vera, Ajabnoor MA

(1990) [26], [27], [28]

2.1.4 Tác dụng dược lý của cây Lô hội

Từ năm 1700 trước Công Nguyên, con người đ biết sử dụng cây Lô hội

để trị bách bệnh như: da, làm lành vết thương Sau đó người ta đ dần dần phát hiện thêm nhiều tác dụng chữa bệnh khác của cây Lô hội [12]

- Năm 1981: Hội đồng khoa học Quốc gia Hoa Kỳ đ bảo vệ các viện bào chế các sản phẩm Lô hội [27]

- Năm 1986 đến nay: Hàng loạt các sản phẩm được tổng hợp từ Lô hội ra

đời và ngày càng phát triển

Theo y học cổ truyền

Do cây Lô hội có vị đắng, tính hàn, vào 4 kinh: Can, tỳ, vị, đại tràng nên có tác dụng thông đại tiện, mát huyết, hạ nhiệt, trị cam tích, kinh giản ở trẻ em, ăn uống không tiêu, giúp tiêu hóa, đắp ngoài trị phỏng, rôm sảy

Hình 2.2 Chất gel trong lá cây Lô hội Theo y học hiên đại

- Lô hội có tác dụng bồi bổ cơ thể sau khi ốm, giúp tiêu hóa tốt, kích thích nhẹ niêm mạc ruột không cho cặn b ở lâu trong ruột Sử dụng với liều nhỏ (0,05 – 0,10g) Ngoài ra Lô hội còn có tác dụng đẩy mạnh nhưng tác dụng chậm, gây sự xung huyết nhất là ở ruột già, có tác dụng sau 10 – 15 giờ, phân mềm nho, không lỏng sử dụng với liều nhỏ (0,05 – 0,10g)[2]

- Có tác dụng làm lành vết thương: Lô hội có chứa nhiều khoáng chất như

Canxi, Potassium, Kẽm có chứa nhiều vitamin C và E Các chất này là tiền

chất cơ bản để đẩy nhanh tiến trình làm lành da Canxi giữ vai trò quan trọng

trong hệ thống thần kinh và mô cơ, nó cũng là chất xúc tác chính trong quá

trình làm lành vết thương

- Chống viêm nhiễm dị ứng: Lô hội có tác dụng làm lành vết đứt, vết loét,

vết phỏng hay vết sưng do côn trùng cắn đốt trên da vì nó có chứa những hợp

chất hữu cơ gồm vitamin, các hormon, chất Magnesium lactate có tác dụng

ức chế phản ứng Histamin, ức chế và loại trừ Bradykinin là những thành phần

gây phản ứng dị ứng và viêm [24]

- Chống sự lo hóa tế bào:

+ Lô hội có chứa Canxi có liên quan đến tân dịch trong tế bào cơ thể,

duy trì sự cân bằng giữa trong và ngoài tế bào, tạo ra các tế bào khỏe mạnh

+ Lô hội có chứa 17 amino - axit cần thiết để tổng hợp protein và tế

bào

+ Lô hội có chứa các chất khoáng như: Potassium, Sodium là các yếu tố

cần thiết cho sự trao đổi chất và các hoạt động của tế bào

- Giải độc cho cơ thể:

+ Lô hội có chứa nguyên tố Natri, Uronic axit nên có tác dụng cải thiện

và kích thích chức năng gan, thận, hai cơ quan chủ yếu của việc loại trừ chất

độc trong cơ thể

+ Lô hội có phần chất xơ cuốn sạch các thành phần chất thải nằm kẹt

trong các nếp gấp của ruột

- Sinh năng lượng và dinh dưỡng:

+ Lô hội có chứa Vitamin C thúc đẩy quá trình trao đổi chất, sinh năng

lượng cần thiết, duy trì hoạt động miễn dịch giúp phòng chống được nhiều bệnh

+ Lô hội có chứa amino axit để tạo prrotein giúp hình thành tế bào và mô + Lô hội chứa các enzym cần thiết để phân giải các chất đường, đạm và chất béo trong dạ dày và ruột

- Lô hội có vai trò tá dược:

+ Có chứa chất lignin là chất giúp thấm sâu và luân chuyển cùng với các yếu tố khác mà nó liên kết, đây là lý do nhiều sản phẩm dược phẩm, mỹ phẩm pha trộn với Lô hội

+ Có polysaccharide, các chất khoáng, vitamin, amino axit cùng với chất lignin tẩy sạch tế bào chết, kích thích tái sinh tế bào mới và bổ sung dinh dưỡng cho da

Các ứng dụng điều trị trong lâm sàng

- Trị táo bón: bột Lô hội, cao mật bò, bột cam thảo tá dược vừa đủ Hay dùng là: Lô hội tươi 100g, đậu xanh cả vỏ 20g, đường cát 50g nấu ăn

- Trị đau lưng: Lô hội tươi 50g, đậu đen 50g, đường cát 100g nấu ăn

- Trị mụn nhọt: gi nhuyễn cả lá lẫn vỏ đắp lên vùng xưng đỏ

- Trị rôm sảy mụn: lấy nước cốt Lô hội tươi thoa lên vùng da bệnh [2] 2.1.5 Kỹ thuật trồng cây Lô hội

ở nước ta, cây Lô hội có thể trồng được ở nhiều nơi, nhưng sinh trưởng và phát triển tốt ở những khu vực có số ngày nắng trong năm cao như khu vực Miền Trung và Tây Nguyên Khi trồng cây Lô hội không phải đầu tư ban đầu nhiều, kỹ thuật chăm sóc đơn giản và trồng một lần có thể thu hoạch lâu dài [12]

Kỹ thuật làm đất

- Chọn đất: Lô hội là cây chịu được khô hạn, nhưng không chịu được ngập úng, do đó phải chọn vùng đất cao ráo, thoáng xốp, tốt nhất là đất pha cát để dễ thoát nước

- Làm đất: Đất trồng phải được cầy bừa kỹ, mục đích làm nhỏ đất và

san phẳng ruộng trồng, sau đó lên luống, đánh rnh trồng Thông thường

luống được đánh cao khoảng 20 cm để dễ thoát nước Đánh rnh trồng theo

mật độ hàng cách hàng 80 cm, cây cách cây 40 cm

- Bón lót: Sử dụng phân chuồng hoai để bón lót Mỗi cây bón lót

khoảng 500- 700g phân chuồng, khoảng 2,5 tấn phân chuồng/ha

Thời vụ trồng

Cây Lô hội có thể trồng quanh năm, nhưng tốt nhất là trồng vào mùa

Xuân và mùa Thu, vì đây là thời gian cây Lô hội con có thể phục hồi và phát

triển nhanh nhất

Kỹ thuật trồng

Cây con trồng được lấy từ vườn ươm, khi đào cây con nên cẩn thận, lấy

được càng nhiều rễ càng tốt, nhằm thu ngắn thời gian hồi sức của cây con

Khi trồng để mầm cây con nhô khỏi mặt đất, nếu lấp đất lên trên ngọn

cây sẽ gây úng thối khi tưới nước, giữ cho cây thẳng đứng và rễ phủ đều mới

lấp chặt đất, nếu đất không đủ ẩm để giữ gốc nên tưới thêm nước Sau đó, nếu

trời khô hạn phải thường xuyên tưới nước giữ độ ẩm vừa đủ, nếu trời mưa liên

tục thì phải chú ý thoát nước, vì cây con rất dễ bị chết do úng nước

Cây Lô hội vừa trồng xong mầm lá sẽ đỏ hoặc vàng, nhưng khi câyđ

bén rễ mầm sẽ xanh trở lại Cây Lô hội giống sau khi đưa ra khỏi vườn ươm

nên để ở chỗ râm mát từ 2 - 3 ngày, sau đó mới đem ra trồng thì cây con sẽ

nhanh mọc mầm và tỉ lệ sống cao hơn [11]

Kỹ thuật chăm sóc

Việc chăm sóc cây Lô hội chủ yếu gồm các khâu kỹ thuật:

- Tưới nước: Cây Lô hội chịu được nắng hạn nhưng lại phát triển tốt khi

có độ ẩm trong đất vừa phải Vì vậy, trong mùa khô phải tưới nước thường

xuyên giữ độ ẩm cho đất Tốt nhất 3 - 5 ngày phải tưới nước 1 lần giúp cây

sinh trưởng tốt, đạt năng suất chất lượng cao

- Tiêu nước: Cây Lô hội không chịu được ngập úng quá lâu Do vậy, nếu trời mưa dài ngày phải khơi thông rnh trồng tạo điều kiện để thoát nước tốt Nếu để mương rnh bị tích nước sẽ gây thối rễ, làm cho cây Lô hội chết hàng loạt

- Làm cỏ xới xáo đất: Trong quá trình chăm sóc cây Lô hội phải xới xáo đất và trừ cỏ nhiều đợt Việc xới đất thường xuyên sẽ giúp cho nền đất

được thông thoáng và trừ được các loại cỏ dại, làm cho quá trình chuyển hoá các chất dinh dưỡng trong đất được nhanh chóng để cây Lô hội dễ hấp thu, sinh trưởng và phát triển nhanh hơn

- Bón phân: Cây Lô hội có khả năng hấp thụ và chuyển hóa nhanh các chất dinh dưỡng trong đất Do đó, ngoài việc bón lót bằng phân chuồng (khoảng 2,5 tấn/ha) phải thường xuyên bón thúc cho cây Lô hội bằng phân NPK Thời gian bón thúc tốt nhất là 1 tháng/lần, với liều lượng khoảng 100kg/ha Khi bón phân tránh làm bẩn lá, thường bón trước khi trời có mưa hoặc phải tưới nước sau khi bón phân Mỗi lần bón phân nên kết hợp với xới xáo đất để cây dễ hấp thụ hơn [11]

Phòng trừ bệnh hại Biểu bì lá của Lô hội được bao bọc bởi một lớp giáp cứng, nên các loại côn trùng khó có thể gây hại Nhưng trong điều kiện trồng với mật độ dày, đất quá ẩm và nhiệt độ thấp, lá của Lô hội sẽ bị một số loại trực khuẩn gây hại Trên mặt lá xuất hiện nhiều đốm đen và sẽ ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của cây

Biện pháp phòng trừ: Đảm bảo thông thoáng trong vườn trồng Lô hội phải kịp thời tiêu nước để khống chế độ ẩm của đất phù hợp, làm cỏ đúng lúc giúp cây phát triển mạnh, tạo nên khả năng kháng bệnh tốt Nếu xuất hiện dấu hiệu bệnh do trực khuẩn gây ra, nên nhanh chóng cắt bỏ những lá mang bệnh

đem tiêu hủy, tránh lây lan sang các lá khác

Trồng cây Lô hội chủ yếu là thu hoạch lá, do vậy trong quá trình phòng

trừ bệnh hại không nên sử dụng các loại thuốc hóa học

Cây Lô hội là loại cây chịu khô hạn rất tốt Trong mùa khô, không cần

nước tưới, cây vẫn có thể sống được Khi đất có độ ẩm thích hợp, cây sẽ tiếp

tục phát triển Sau khi trồng khoảng 6 tháng, cây Lô hội có thể cho thu hoạch

và sau mỗi tháng lại thu hoạch một lần Sau một năm xung quanh cây mẹ lại xuất

hiện nhiều cây con, chọn những cây con to khỏe thay thế cây mẹ thì có thể cho thu

hoạch lâu dài mà không phải ươm trồng lại từ đầu [11]

Hiện nay, có khoảng 300 loài Lô hội, trong đó Lô hội Aloe Vera có đặc

điểm lá xanh thẫm, bẹ lá to là loại dễ trồng và cho năng suất cao, do đó giống

Lô hội Aloe Vera đang được nhân trồng đại trà [12]

2.1.6 Kỹ thuật thu hoạch và chế biến

Lô hội muốn có dược tính cao yêu cầu phải có qui trình trồng trọt và

thu hái hợp lý Các lá đầu tiên thu hái là các lá tốt nhất được ưu tiên dùng

trong mỹ phẩm Sau khi rửa sạch lá bằng hơi nước, người ta lấy phần thịt bên

trong lá, loại bỏ celluloza rồi xác định thành phần và hoạt tính sinh học để chế

tạo gel [12]

2.1.7 Các phương pháp nhân giống cây Lô hội

Thông thường Lô hội sinh sản không phụ thuộc vào hạt Việc thừa kế

phát triển đời sau là dựa vào mầm thân

Mầm thân của Lô hội gồm 3 loại: mầm ngọn, mầu hút, mầm thân

ngầm

- Mầm ngọn:

Mầm ngọn là phần thân trên mặt đất, là mầm quan trọng của sinh

trưởng phát dục Sự sinh trưởng của bộ phận trên mặt đất của cây chủ yếu phụ

thuộc vào sức sống của mầm ngọn

Với giống Lô hội Aloe vera sự phân hoá phát dục gốc nguyên thủy của lá mầm ngọn mạnh hơn sự sinh trưởng hướng lên trên của mầm ngọn Trong thời kỳ sinh trưởng, trọng tâm của dinh dưỡng và vùng hoạt động về trao đổi chất đều dồn vào việc sinh trưởng và phân hoá của lá, làm cho lá to, nhiều nạc, thân ngắn Vào thời kỳ cuối của tuổi non, toàn bộ điểm sinh trưởng đều bị bẹ lá bó chặt, hầu như không nhìn thấy thân

Mầm ngọn của cây Lô hội cũng giống như các cây khác, đều có ưu thế của điểm sinh trưởng ngọn, gây ức chế sự phát dục của mầm ở phần dưới, thậm chí còn ức chế sự sinh sản của mầm ở phần dưới đất của cây Trong sản xuất đại trà, muốn tăng tốc độ nhân giống nên ngắt mầm ngọn của thân để phần dưới của cây mọc ra nhiều mầm

- Mầm hút:

Mầm hút là mầm mọc từ nách lá của bộ phận thân trên mặt đất của cây,

do mầm nách phát triển hình thành, ngoài một số chủng loại có đặc trưng cây thân gỗ, phần lớn mầm nách đều nhạy cảm với ánh sáng và trở thành chồi tiềm ẩn, nhiều năm không nảy lộc Nhưng khi giâm vào đất lại rất dễ nảy lộc thành mầm thân ngầm Khi điểm sinh trưởng bị ức chế, mầm nách chịu sự kích thích từ nội tại cơ thể cũng có thể nảy mầm hút

Cây Lô hội khi được vun đất, cũng có thể kích thích mầm nách của bộ phận bên trên của cây nảy lộc Bởi vậy bằng cách xử lý nhân tạo, mầm nách của cây Lô hội có thể dùng để nhân giống

- Mầm thân ngầm:

Là chồi mầm phát sinh ở dưới mặt đất, số lượng nhiều, mọc phổ biến Trong quá trình sinh sản tự thân để sinh sản thay thế, là nguồn chủ yếu để tách cây giống[11]

2.2 Tình hình sản xuất và sử dụng cây Lô hội trong và ngoài nước Việc phát hiện ra tác dụng và sử dụng cây Lô hội đ có từ rất sớm,

khoảng 400 năm trước Công Nguyên, lá Lô hội khô và nhựa Lô hội bắt đầu

được các thương nhân biến thành một mặt hàng để đem bán sang Châu á

Sau đó, chừng 50 năm trước Công Nguyên, Celsius một thầy thuốc Hy

Lạp đ sử dụng nhựa cây Lô hội trong y học làm thuốc tẩy Từ đây Lô hội

ngày càng được sử dụng rộng ri trong y học Hy Lạp - La M và y học

phương Tây sau này [12]

Lịch sử đó ghi lại: Aristote thuyết phục Alexandre Le Grand phải chinh

phục Châu Phi bằng mọi giá, để có đủ cây Lô hội chữa trị vết thương cho binh sĩ

Khoảng thế kỷ thứ VII, VIII đời Tùy - Đường, cây Lô hội được sử dụng

ở Trung Quốc Quyển sách thuốc sớm nhất của Trung Quốc (đời Đường) ghi

chép về Lô hội là cuốn bản thảo, người Trung Quốc gọi cây này là Lô hội, có

nghĩa là loại cây cho nhựa đen Các thầy thuốc Trung Quốc dùng Lô hội để

chữa các bệnh sốt cao, co giật ở trẻ em cũng như dùng làm thuốc tấy sổ Vào

thế kỷ XVI, XVII cây Lô lội theo chân người Tây Ban Nha sang châu Mỹ Cây

trở nên phổ biến tại đảo Caribê, Trung và Nam Mỹ Từ đây vùng đất mới này

lại trở thành nơi sản xuất Lô hội chính để xuất khẩu sang Châu Âu [32]

Năm 1720 cây Lô hội được Carl Von Linne miêu tả và đặt tên Aloe

Vera Linne, đó cũng là tên khoa học của cây dùng tới ngày nay Năm 1820,

Lô hội chính thức được công nhận trong Dược điển Mỹ với tác dụng tẩy xổ và

bảo vệ da [18]

Cũng theo truyền thuyết Ai Cập, nữ hoàng Cleopactre – người được tôn

vinh là “nữ hoàng sắc đẹp” đ sử dụng cây Lô hội để tạo ra một làn da mịn

màng tươi tắn Vì vậy bà đ được lưu danh vào sổ sách với một vẻ đẹp huyền

thoại, không hề bị sự tàn phá khắc nghiệt của thời gian làm cho tàn phai

Đại đế Hy Lạp Alexandra đ dùng cây Lô hội để chữa vết thương cho

binh lính của mình trong những cuộc viễn chinh Những tính năng của cây Lô

hội dần dần đ được khắp nơi trên thế giới biết đến, từ thời văn minh cổ Ai

Cập, Ba Tư, Hy Lạp, ấn Độ và Phi Châu [12], [51],[52] Các nhà nghiên cứu thảo dược và y học dân gian xem Lô hội là một loại

“Cây thuốc” loại cây có dạng giống cây xương rồng và lá hình dao găm chứa

đầy chất gel trong suốt này đ được mang từ Châu Phi sang Bắc Mỹ vào thế

kỷ 16 [44]

Nhưng trước khoảng thời gian này khá lâu, Aloe – một cái tên có nghĩa

là “Chất đắng trong suốt” đ được biết rộng ri như là một loại cây chủ lực có tác dụng chữa thương Người Ai Cập cổ xưa đ ví cây Lô hội là một “loại cây bất tử” và đ chôn nó cùng với các vị vua Ai Cập Trong những thập niên gần

đây, các nghiên cứu y khoa đ xác định và đưa ra nhiều tuyên bố quan trọng của loại “chất đắng trong suốt” này được dùng với dạng dung dịch hoặc cũng

có thể dùng dưới dạng viên nang mềm chính là thành phần cốt lõi của cây Lô hội [12]

Năm 1996, Tổ chức lương thực thế giới FAO đ tổ chức điều tra các loại thực vật hoang dại dựa vào các tiêu chuẩn tổng hợp để tiến hành bình chọn các loài cây có lợi cho cơ thể con người, đ xếp cây Lô hội là “ Cây thực phẩm bổ dưỡng tốt nhất cho con người ở thế kỷ 21” và thành lập Uỷ ban khoa học về Lô hội quốc tế IASC để tư vấn những vấn đề liên quan đến sản phẩm Lô hội phục vụ con người

Hiện nay trên thế giới đ có 1500 mặt hàng mỹ phẩm, thực phẩm bổ dưỡng từ Lô hội Các nước có nền công nghiệp phát triển như Mỹ, Nhật Bản, Hàn Quốc là những quốc gia có ngành sản xuất và chế biến Lô hội phát triển mạnh [33]

Sau đây là những công bố ngắn gọn về tác dụng của cây Lô hội trong y học: Làm lành vết thương

Dịch chiết lá Lô hội thoa vào vết thương sẽ làm tê nhẹ vết thương và giúp giảm ngứa, giảm sưng đau, đồng thời có tác dụng kháng khuẩn và chống

nấm, làm tăng việc lưu thông máu ở vùng bị thương, kích thích các nguyên

bào sợi và tế bào da có nhiệm vụ làm lành vết thương

Một nghiên cứu trên động vật tại hiệp hội y khoa đ phát hiện ra rằng, cả

hai phương cách uống và thoa ngoài da đều có tác dụng đẩy nhanh quá trình làm

lành vết thương Các con vật được thử nghiệm này đ được pha dung dịch Lô hội

(100mg/kg trọng lượng cơ thể) vào nước uống của chúng trong vòng hai tháng

hoặc được thoa trực tiếp 25% chất kem Lô hội lên vết thương trong vòng 6 ngày

[12], [46]

Lô hội có tác dụng tích cực trong cả hai trường hợp, diện tích vết

thương đ giảm 62% ở những con đ uống Lô hội với tỷ lệ giảm 51% trong

nhóm thử nghiệm Trường hợp thoa ngoài da đ giảm 51% diện tích vết

thương so với tỉ lệ 33% trong nhóm thử nghiệm [15],[25]

Hỗ trợ quá trình hồi phục sau phẫu thuật

Lô hội có tác dụng rút ngắn thời gian phục hồi sau phẫu thuật

Người ta thử nghiệm trên các bệnh nhân lứa tuổi 18 bị bệnh mụn trứng

cá phải chịu phẫu thuật da mặt Người ta đắp những miếng băng lên mặt họ,

một bên là miếng băng phẫu thuật, một bên là miếng băng có thấm dung dịch

Lô hội Kết quả là bên có tẩm dung dịch Lô hội lành nhanh hơn bên kia gần

75 tiếng đồng hồ [41]

Một bác sĩ da liễu James Fult trong bài thực hành của mình ông đ

dùng Lô hội để đẩy nhanh quá trình làm lành vết thương Ông tuyên bố: “Bất

cứ vết thương nào chúng ta cần chữa trị, dù là khâu một vết mổ hay tẩy tế bào

chết trên da thì bao giờ việc sử dụng Lô hội cũng vẫn tốt hơn” [38]

Làm dịu vết bỏng

ở một nghiên cứu ở Thái Lan, 27 bệnh nhân bị bỏng ở mức độ khác

nhau được chia thành hai nhóm Một nhóm được đắp một miếng gạc thấm

dung dịch Lô hội, một nhóm được đắp một miếng gạc có thêm dung dịch

Vaseline (petroleum jelly) Kết quả là các vết bỏng của nhóm dùng Lô hội lành nhanh hơn, với thời gian lành trung bình là 12 ngày so với nhóm sử dụng Vaseline là 18 ngày [15], [36]

Làm giảm thiểu tối đa chứng phát cước Lô hội còn có tác dụng đối với chứng phát cước Các nhà nghiên cứu

đ đưa một cách điều trị chuẩn mực về chứng bệnh này (dùng thuốc kháng sinh, ipuprofen và làm ấm lại) cho 154 bệnh nhân với các mức nặng nhẹ khác nhau Trong số các bệnh nhân dùng kem Lô hội, có đến 67,9% đ lành mà không bị tổn hại đến mô so với tỷ lệ trong nhóm được thử nghiệm là 32,7% Các nhà nghiên cứu kết luận rằng chính chất Lô hội đ ngăn việc giảm lượng máu đến các phần mô bị tê cóng, một nguyên nhân chung khiến cho mô bị tổn hại trong chứng phát cước [37], [38]

Bảo vệ khỏi chất phóng xạ Lô hội có tác dụng bảo vệ da khỏi bị tác hại do tia X Họ phát hiện ra rằng Lô hội là một nhân tố chống ôxy hoá rất hiệu quả, có tác dụng tẩy đi các gốc hoá học tự do chất phóng xạ gây ra Họ còn phát hiện ra rằng nó cung cấp được hai chất có tác dụng làm lành vết thương trên cơ thể là superoride dismutase (một loại enzyme chống oxy hoá) và glutathione (một loại axit amin kích thích hệ thống miễn dịch) [38]

Làm lành các vết thương tổn do bệnh vẩy nến Một số nghiên cứu đ thí nghiệm trên 60 bệnh nhân dùng loại kem có chứa 0,5 % chiết suất Lô hội Người ta bôi loại thuốc mỡ này 3 lần một ngày trong 5 ngày liên tiếp (tổng cộng 15 lần bôi trong một tuần) và bôi trong 4 tuần Kết quả kiểm tra sau 8 tuần thử nghiệm là các bệnh nhân trong nhóm có dùng chiết xuất Lô hội đ lành các tổn thương trên da nhiều hơn (82,8%) so với nhóm dùng thuốc an thần (7,7%) [26]

Có tác dụng đối với các vấn đề về ruột

Một số nghiên cứu được công bố về nước uống Lô hội có tác dụng

trong việc chữa trị các bệnh viêm nhiễm đường ruột 10 bệnh nhân được uống

nước Lô hội một ngày 3 lần, mỗi lần là 2 ounce và uống liên tục trong 7 ngày

Sau một tuần, tất cả các bệnh nhân đ tránh khỏi được bệnh tiêu chảy, 4 người

đ cải thiện vấn đề về ruột, và 3 người cho biết là cảm thấy khoẻ hơn

Các nhà nghiên cứu kết luận rằng Lô hội có khả năng cân bằng hai hệ

thống đường ruột bằng cách “điều chỉnh độ pH trong đường ruột, đồng thời cải

thiện tính co bóp của ruột - dạ dày, tăng tính nhuận tràng và làm giảm lượng vi

sinh vật trong phân, kể cả men.” Các nghiên cứu đ chứng minh rằng nước dinh

dưỡng Lô hội có tác dụng giúp giải độc tố trong đường ruột, trung hoà tính axit

trong dạ dày, đồng thời làm giảm chứng táo bón và loét dạ dày [33]

Gần đây một báo cáo của Smith L (1997) [45], đối với các chứng bệnh

tiểu đường, Lô hội còn có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu cho chứng

bệnh tiểu đường Người ta thử nghiệm trên 5 bệnh nhân bị tiểu đường bằng cách

cho uống 1/2 muỗng canh chiết xuất từ Lô hội mỗi ngày, trong vòng 14 tuần trở

lên Kết quả là lượng đường trong máu đ giảm ở tất cả các bệnh nhân, trung

bình giảm khoảng 45% mà không có sự thay đổi về trọng lượng [12]

Giảm chứng sưng khớp

Lô hội còn có tác dụng giúp phòng chống được chứng viêm khớp và

làm giảm sự viêm nhiễm tại các khớp do chứng viêm khớp gây ra Lô hội còn

có thể ức chế khả năng phản ứng tự miễn dịch gắn liền với một số dạng viêm

khớp [12]

Người ta tiêm vào một số con vật thử nghiệm một loại vi khuẩn gây ra

các triệu chứng viêm khớp như sưng và viêm Để xác định xem nó có khả

năng hạn chế chứng viêm khớp hay không, người ta đ tiêm chất Lô hội dưới

da hàng ngày và kéo dài trong 13 ngày Hàng ngày người ta dùng thước đo

nhằm xác định độ viêm và sưng [41]

Các nhà nghiên cứu còn cho biết nhiều hợp chất từ Lô hội có khả năng chống viêm Một loại axit hữu cơ trong Lô hội có tác dụng làm giảm chứng viêm đến 79,7% và ức chế phản ứng tự miễn dịch đến 42,4% Một hợp chất Lô hội (anthraquinone) cũng có khả năng làm giảm chứng viêm nhưng không có tác dụng đối với phản ứng tự miễn dịch [42], [43]

Bổ sung dinh dưỡng cho các bệnh nhiễm HIV Nước uống dinh dưỡng Lô hội đ chứng tỏ là một thành phần trong chương trình bổ sung dinh dưỡng dành cho người bị nhiễm HIV dương tính Người ta cho 29 bệnh nhân uống nước ép Lô hội nguyên chất 100% (4 lần một ngày, mỗi lần 5 ounce) song song với việc bổ sung chất axit béo thiết yếu và một chế độ bổ sung khác có chứa các vitamin, chất khoáng và axit amin Các bệnh nhân được khuyên duy trì chế độ ăn bình thường và không uống các loại

bổ sung khác [12]

Sau 90 ngày, tất cả các bệnh nhân đ có biến chuyển tốt hơn đối với các vấn đề viêm nhiễm, bệnh nấm, chứng mệt mỏi và tiêu chảy cũng như làm tăng lượng bạch cầu trong máu (có nghĩa là hệ thống miễn dịch của họ đang có phản ứng tích cực) Tình trạng sức khoẻ chung của họ cũng đ được cải thiện Trong khoảng 25% bệnh nhân, Lô hội đ đánh bại được khả năng tái sản xuất của virus

Các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng Lô hội (chiết suất mannose và một

số hợp chất khác) có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch, đặc biệt là các tế bào trợ giúp T4, các bạch cầu kích hoạt phản ứng miễn dịch chống viêm nhiễm [39], [40]

hội/kg trọng lượng cơ thể và 32% ở những con uống theo liều 100mg/kg trọng

lượng Một thử nghiệm trên các tế bào ung thư người (bên ngoài cơ thể) đ

phát hiện ra rằng những liều Lô hội cao có khả năng hạn chế sự phát triển của

các tế bào ung thư này [41]

Các nhà nghiên cứu đ phát hiện ra một hợp chất (lectin) từ Lô hội khi

được tiêm thẳng vào các khối u đ kích hoạt được hệ thống miễn dịch chống

ung thư Các tế bào chữ T đ bắt đầu tấn công các tế bào trong khối u được

tiêm bằng lectin [12]

Lô hội khởi động hệ thống miễn dịch bằng cách kích hoạt các đại thực

bào (loại bạch cầu “nuốt” lấy các sinh kháng thể), nguyên nhân việc phóng

thích các chất kích hoạt miễn dịch và chống ung thư như interferon,

interleukine Hơn nữa, các nhà nghiên cứu tuyên bố Lô hội còn có khả năng

đẩy mạnh sự phát triển các tế bào bình thường (không bị ung thư) [34]

Có tác dụng tốt với bệnh ung thư phổi

Tác dụng phòng ngừa bệnh của Lô hội đ được xác định trên 673 bệnh

nhân bị ung thư phổi tại Okinawa Nhật Bản Cuộc thử nghiệm này đ quan sát

mối quan hệ giữa các số lượng tương đối của 17 loại dinh dưỡng từ thực vật

trong chế độ ăn, đồng thời quan sát quá trình diễn ra của căn bệnh ung thư

phổi trong một giai đoạn hơn 5 năm [30], [31]

Trong số đó, duy chỉ có Lô hội là loại dinh dưỡng từ thực vật có tác dụng

bảo vệ khỏi bệnh ung thư Các nhà nghiên cứu tuyên bố: “Theo các kết quả

dịch tễ học cây trồng cho biết thì Lô hội có tác dụng ngăn chặn các chất gây

ung thư phổi” Hơn nữa, Lô hội còn là “một loại chất phòng ngừa rộng ri”,

hay còn gọi là “một loại dưỡng chất phòng chống được nhiều loại bệnh ung

thư cho con người” [35]

Một nghiên cứu tại Mỹ cho thấy chỉ những Aloe có thành phần nguyên

vẹn về hoạt tính sinh học mới có hiệu quả làm lành vết thương, chống viêm,

điều hòa miễn dịch, nhuận trường, vì vậy nếu dùng nhiều qua đường tiêu hóa,

có thể dẫn đến tiêu chảy Khi ứng dụng trong mỹ phẩm, Aloe có tác dụng làm

ẩm da, dưỡng da, hồi phục những tế bào da bị tổn thương [32]

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, 80% dân số toàn cầu sử dụng các loại thảo dược truyền thống để bảo vệ sức khỏe Viện Thực vật học Trung Quốc khẳng định, cùng với Trung Quốc và Lào, Việt Nam là một trong những nước có tài nguyên cây thuốc phong phú nhất Tuy nhiên, nguồn cây thuốc của Việt Nam đang cạn kiệt vì hoạt

động khai thác bừa bi và sự yếu kém trong công tác bảo tồn

Theo truyền thuyết, từ thời Trung Hoa cổ đại, cây Lô hội được di thực sang Việt Nam và phát triển tốt tại đây Nhưng khi đó, ít ai có thể nghĩ được rằng đến nhiều thế kỷ sau cây Lô hội sẽ trở thành một thế mạnh trong phát triển kinh tế nông thôn, một phương cách trong bài toán xoá đói giảm nghèo cho người nông dân Việt Nam

Theo Nguyễn Thiện Thành – Chủ nhiệm bộ môn điều trị học tuổi cao Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, là người từ lâu say mê nghiên cứu áp dụng các lợi ích của Lô hội Trong kháng chiến chống Pháp,

được biết các công trình của Filatov qua sách báo, ông đ phổ biến cách sản xuất thuốc Philatop làm từ Lô hội trong chiến Khu 9, góp phần bảo vệ sức khoẻ cho cán bộ, chiến sĩ Năm 1955 sau khi tập kết ra Bắc, ông vinh dự được sang Liên Xô dự hội nghị khoa học, chúc thọ nhà bác học Filatov 80 tuổi Tại

đây ông được Filatov đích thân giải thích về sức sống kỳ diệu của Lô hội Hiện nay chế phẩm Philatop Lô hội vẫn tiếp tục được sử dụng tại một

số bệnh viện của Việt Nam Quan trọng hơn nữa trị liệu Filatop đ được sử dụng rộng ri để chữa những căn bệnh được coi là khó chữa như: viêm tắc võng mạc, thoái hoá hoàng điểm, cận thị với xu thế nặng dần Còn nhiều chỉ

định khác dùng Philatop - Lô hội trong nội khoa, chuyên khoa thần kinh, ngoại khoa và cũng đ cho những kết quả rất tốt

Cuối năm 2002, một bài viết nhỏ trên báo Ninh Thuận đ làm nức lòng nhiều bà con nông dân miền Trung, vốn phải chịu những thử thách khắc nghiệt của điều kiện tự nhiên Bài viết đó có nội dung như sau:

Nông dân x Văn Hải tăng thu nhập nhờ trồng cây Lô hội: X Văn Hải

(thị x Phan Rang- tỉnh Ninh Thuận) có hơn 806 hecta diện tích đất sản xuất

nông nghiệp, trong đó có 271 hecta đất ruộng chuyên sản xuất lúa và 523

hecta đất rẫy và đất làm vườn khác Ngoài việc thích nghi trồng các loại cây

hành, tỏi, nho và bông vải, đất rẫy và đất làm vườn tại x Văn Hải còn phù

hợp trồng các loại cây công nghiệp ngắn ngày, dài ngày

Thời gian gần đây một số hộ đ mạnh dạn chuyển một số diện tích đất

sang trồng cây Lô hội, hiện đang được tiêu thụ mạnh trên thị trường.Tuy đất bị

cằn cỗi đối với các loại cây truyền thống, nhưng lại thích nghi với cây Lô hội -

loại cây trồng mới, vì cây Lô hội phát triển tốt chỉ trong vòng 3 - 4 tháng là có

thể cho thu hoạch Nhờ chi phí đầu tư sản xuất rất thấp so với các loại cây

khác, đặc biệt cây Lô hội cho thu hoạch liên tục Chỉ cần cắt những bẹ đủ kích

cỡ là bán được, vì vậy trong vòng một tháng mỗi hecta Lô hội cho thu li từ 8

đến 15 triệu đồng Nhờ có hiệu quả trong sản xuất nên diện tích đất trồng cây

Lô hội ngày càng thêm mở rộng Theo ước tính hiện nay, toàn x Văn Hải có

khoảng 35 - 40 ha đất trồng cây Lô hội

Theo ông Lê Đặng Chương - Ban quản lý thôn Văn Sơn - Văn Hải cho

biết: chi phí sản xuất cây Lô hội thấp so với các loại cây trồng khác, đồng thời

phù hợp với thổ nhưỡng của địa phương nên nông dân mở rộng diện tích Tuy

nhiên, việc mở rộng diện tích sản xuất cây Lô hội mang tính tự phát và không

có sự quản lý hướng dẫn chăm sóc của ngành chức năng nên nông dân đang

gặp khó khăn nhất là giá cả trôi nổi, bấp bênh

Do không nắm vững phương pháp chăm sóc nên cây Lô hội hiện nay có

xuất hiện một số bệnh, trong lúc đó thị trường tiêu thụ đòi hỏi sản phẩm đạt

chất lượng và đúng kích cỡ quy định Vì vậy, nông dân địa phương rất mong

ngành chức năng quan tâm hướng dẫn cho nông dân cách chăm sóc cũng như

ổn định giá cả tiêu thụ để nông dân an tâm sản xuất cây Lô hội - loại cây có

nhiều triển vọng tại x Văn Hải như hiện nay Như vậy là một hướng làm ăn

mới, nhiều hứa hẹn đ mở ra cho bà con nông dân miền Trung khô nóng bởi

gió Lào cát trắng

Rất nhanh chóng, loài cây này đ thu hút được sự quan tâm của nhiều người Cần phải chăm sóc loại cây này như thế nào? Vụ mùa gieo trồng và thu hoạch được tính toán ra sao? Những thắc mắc liên tiếp được gửi về các phòng nông nghiệp của địa phương và nhiều cơ quan truyền thông báo chí Các nhà khoa học cũng đ vào cuộc để kịp thời hỗ trợ giải đáp những thắc mắc về vấn

đề kỹ thuật cho người nông dân, theo đó, người nông dân đ hoàn toàn có thể yên tâm khi biết được rằng: cây Lô hội là một loại cây trồng cạn, có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, việc chăm sóc không quá phức tạp, cho hiệu quả kinh tế cao Người dân hoàn toàn có thể tự tin trồng cây Lô hội trên diện tích đất của mình [12]

ở nước ta, cây Lô hội có thể trồng được ở nhiều nơi, nhưng sinh trưởng và phát triển tốt ở những khu vực có số ngày nắng trong năm cao như khu vực miền Trung và Tây Nguyên Khi trồng cây Lô hội, nông dân không phải đầu tư ban

đầu nhiều, kỹ thuật chăm sóc đơn giản và trồng một lần có thể thu hái lâu dài

Về mặt chuyên môn, Lô hội muốn có dược tính đòi hỏi phải qua một qui trình trồng trọt, thu hái gắt gao chứ không phải loại nào cũng có thể dùng kèm thuốc, làm thực phẩm dinh dưỡng [29]

Như vậy từ một cây loại quen thuộc trong dân gian, Lô hội hiện đang là nguồn dược liệu "vàng ròng" Không có gì thuyết phục bà con nông dân hơn

là những gì họ đ và đang được chứng kiến: chỉ trong một thời gian ngắn, hiện nay Ninh Thuận là một trong những tỉnh có diện tích cây Lô hội nhiều nhất Cây dược liệu này chủ yếu được trồng trên những vùng đất cát và pha cát ven biển, canh tác các loại cây trồng khác kém hiệu quả Nhờ đó đời sống của bà con nông dân đ từng bước khởi sắc Tuy nhiên, để việc chuyển hướng cây trồng thực sự đạt được hiệu quả cao, người nông dân vẫn rất cần sự hỗ trợ

về chuyên môn và nghiệp vụ của các nhà khoa học

Bên cạnh những hiệu quả về kinh tế, việc phát triển cây Lô hội còn có ý nghĩa về mặt x hội và bảo vệ môi trường sinh thái Không ít lần chúng ta đ

nghe được lời cảnh báo về nguy cơ cạn kiệt các nguồn dược liệu Việt Nam Hiện

nay, nhiều loài cây thuốc quý của Việt Nam đứng trước nguy cơ tuyệt chủng,

trong đó 31 loài ở mức bị đe dọa tuyệt chủng cao Các cây thuốc trước kia có thể

khai thác hàng chục nghìn tấn/năm như: ba kích, đẳng sâm, hoàng tinh đ giảm

rõ rệt Đ từng có thời kỳ sự vắng bóng cây Lô hội trong đời sống và tự nhiên, sự

thờ ơ của người nông dân về loài cây này khiến các nhà khoa học không khỏi lo

ngại về khả năng thu hẹp cây Lô hội trên toàn lnh thổ [12]

Ông Ngô Quốc Luật, Viện Dược liệu cho biết: ở các khu bảo tồn thiên

nhiên, tình trạng khai thác cây thuốc rất tùy tiện Tại khu bảo tồn thiên nhiên

Bình Châu, Phước Bửu (Bà Rịa - Vũng Tàu), từ năm 1998 hằng ngày có

khoảng 5 - 10 người tự do vào rừng lấy dây ký ninh (trị sốt rét) và vận chuyển

ra khỏi rừng một cách công khai với số lượng khoảng 80-100kg dây

tươi/người Do đó, số loài ký ninh ngày càng suy giảm và loại cây này hiện đ

trở nên hiếm thấy ở đây

Tại khu bảo tồn thiên nhiên Ta Kou (Bình Thuận), thần xạ (một dược

liệu có công dụng chính là trị viêm xoang) bị khai thác với số lượng lớn, bán

công khai cho khách thập phương Giải pháp được nhiều người đưa ra là Nhà

nước cần quan tâm hơn nữa đến việc nghiên cứu, bảo tồn đa dạng sinh học,

trong đó cần chú trọng đến lĩnh vực cây thuốc ở vườn quốc gia và khu bảo tồn

thiên nhiên

Bà Đặng Thị Hoa, Trung tâm Khoa học X hội và Nhân văn Quốc gia,

Dự án trồng 5 triệu ha rừng mới chỉ quan tâm đến cây lấy gỗ, cây nguyên liệu

và cây ăn quả chứ chưa chú ý đến cây dược liệu, trong khi giá trị hàng hóa của

loại cây này rất cao Chẳng hạn như: số tiền thu được từ 0,2 hecta sa nhân

cũng tương đương với thu nhập từ 1,5 hecta dong riềng Vì vậy, để phát triển

nguồn dược liệu, có thể mở rộng việc trồng cây thuốc như một loại cây xóa

đói giảm nghèo tại những nơi có điều kiện thiên nhiên thích hợp Do đó có thể

thấy hướng đi của bà con nông dân Ninh Thuận hiện nay là một hướng đi

đúng đắn và cần nhân rộng [12],[18]

Cây Lô hội được sử dụng rất nhiều trong các bài thuốc đông y cổ truyền, các sản phẩm chiết suất từ Lô hội được biết đến nhiều trong những năm gần đây [1].Tuy nhiên các nghiên cứu cụ thể về nhân giống, sản xuất, chế biến còn rất mới mẻ Hiện nay mới có một số cơ sở như Viện nghiên cứu dược liệu, Viện sinh học nhiệt đới, Sở Khoa học Công nghệ một số địa phương đặt vấn đề nghiên cứu

2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật giâm cành, giâm hom

* Cơ sở khoa học Khi có tác động cắt cành thì auxin sẽ được hình thành một cách nhanh chóng tại đỉnh sinh trưởng và các cơ quan non, sau đó qua hệ thống mạch libe, auxin được vận chuyển về phần vết cắt cành chiết, cành giâm để kích thích tạo

rễ bất định Người ta chia sự hình thành rễ bất định làm ba giai đoạn :

- Giai đoạn phản phân hoá của tế bào tượng tầng trở lại chức năng phân chia của mô phân sinh tạo khối tế bào bất định (callus) Lượng auxin lớn để phản phân hoá tế bào (10-4 - 10-5 g/cm3)

- Giai đoạn tái phân hoá : các tế bào bất định tái phân hoá hình thành mầm rễ bất định cần lượng auxin thấp hơn (10-7 g/cm3)

- Giai đoạn sinh trưởng của mầm rễ để hình thành rễ bất định Lượng auxin cần rất thấp (10-11 - 10-12 g/cm3) hoặc không cần

Thường sử dụng các chất thuộc nhóm auxin ngoại sinh để kích thích sự tạo rễ bất định nhanh và hiệu quả trong kỹ thuật giâm chiết cành: IBA, α-NAA, 2,4D

* Ưu điểm của phương pháp giâm cành, giâm hom

- Cây con giữ nguyên tính trạng của cây mẹ, cây đồng đều thuận tiện cho quá trình chăm sóc, thu hoạch

- Thời gian nhân giống tương đối nhanh, hệ số nhân giống cao

- Chu kỳ khai thác ngắn, hiệu quả kinh tế cao

2.4 Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào và ứng dụng trong nhân giống vô tính

cây trồng

2.4.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên liệu thực

vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện vô

trùng [1]

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên

học thuyết về tính toàn năng của tế bào Cuối thế kỷ 19 đầu thế kỷ 20 nhà sinh

lý thực vật người Đức Haberlandt (1902) đ phát biểu tính toàn năng của tế

bào như sau: mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng

tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh [1], [7]

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đ phân

hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể

sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển

thành một cá thể hoàn chỉnh Cho đến nay con người đ hoàn toàn chứng

minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào

riêng rẽ

Trong nuôi cấy in vitro, tế bào thực vật thể hiện tính toàn năng thông

qua sự phản phân hoá và phân hoá của tế bào

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chính thể thống nhất bao gồm nhiều

cơ quan chức năng khác nhau.Tuy nhiên tất cả các loại tế bào đó đều bắt

nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử

tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng

riêng biệt (chuyên hóa)

Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành

các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khác

nhau.Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô

chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

Tế bào phôi sinh —> Tế bào dn —>Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt Tuy nhiên, khi tế bào đ phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ

Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào Phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dn Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một qúa trình hoạt hóa, ức chế các gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đ được m hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào

2.4.2 Giới thiệu các bước trong kỹ thuật nhân giống in vitro

Sự thành công hay thất bại của nhân giống vô tính phụ thuộc phần lớn vào việc thực hiện các bước nhân giống in vitro Quy trình này bao gồm các giai đoạn sau:

Giai đoạn chuẩn bị

Đây là bước đầu tiên của quy trình nhân giống Tuỳ theo điều kiện, giai

đoạn này kéo dài từ 3- 6 tháng

Giai đoạn này gồm các khâu như: chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu (cây mẹ

thường là cây ưu việt, khoẻ, có trí vị kinh tế) chọn cơ quan để lấy mẫu (thường

là chồi đỉnh, chồi nách, chồi ngủ, lá non, đầu rễ) Mô chọn để nuôi cấy thường

là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các

đặc tính quý của cây mẹ

Sau đó chọn chế độ khử trùng thích hợp làm sao để lấy mẫu cấy bị

nhiễm là thấp nhất, đồng thời khả năng sinh trưởng và phát triển vẫn tốt

Phương pháp vô trùng mẫu cấy dùng để khử trùng là cồn 70%, HgCl2, NaOCl,

Ca(ClO3)2, H2O2 Nồng độ chất chất khử trùng được chọn trên cơ sở thực tiễn

thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng độ thấp, mô già nồng độ cao, có

nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất khử trùng với nhau Cũng

có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào môi trường nhằm tăng

hiệu quả khử trùng [23]

Thời gian khử trùng được xác định bằng thực nghiệm đối với từng loài

cây, loại mô hoặc mô nuôi cấy Nhìn chung, mô non khử trùng trong thời gian

ngắn, mô già trong thời gian dài hơn

Giai đoạn khởi động mẫu cấy

Sau khi khử trùng, ta đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên môi trường

dinh dưỡng nhân tạo thích hợp để tái sinh mô cấy Môi trường này được xác

lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm

khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phòng nuôi cấy với điều kiện nhiệt

độ, ánh sáng phù hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy ban đầu

sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi

vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Đây sẽ là những vật liệu khởi đầu

để cho quá trình nhân nhanh tiếp đó

Giai đoạn nhân nhanh Khi mẫu cấy sạch đ được tạo ra và từ đó nhân được các cụm chồi, các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn nhân nhanh Người ta cần thu được tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy và thành phần môi trường đ được tối ưu hoá nhằm đạt được mục tiêu này Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường kéo dài trong khoảng 1 – 2 tháng tuỳ mỗi loại cây

Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể tự phát sinh rễ, nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân đối về thân, lá, rễ để đạt tiêu chuẩn của một cây giống [14]

Giai đoạn vườn ươm

Đây là giai đoạn đánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in vitro khi chuyển cây từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Khi đưa ống nghiệm ra ngoài vườn ươm, nhằm giảm đi hiện tượng

“sốc” do thay đổi môi trường cần có giai đoạn thích nghi Quá trình thích nghi với điều kiện ngoài của cây yêu cầu phải chăm sóc đặc biệt, do đó ở giai đoạn này cần chủ động để điều khiển được quá trình chiếu sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp vào trong điều kiện cách ly sạch bệnh để các cây con đạt tỷ lệ sống cao

2.4.3 ý nghĩa trong công tác nhân giống vô tính cây trồng Như chúng ta đ biết khi nhân giống bằng hạt không đảm bảo truyền đầy

đủ các đặc tính di truyền quý của bố mẹ cho hậu thế vì vậy hậu thế có xu hướng phân ly theo các định luật của Mendel Ngay cả khi truyền đạt được các tính trạng di truyền của bố mẹ thì nhân giống bằng hạt vẫn gặp một số khó khăn như: một số loại hạt nhỏ tỷ lệ nảy mầm thấp, thời gian nảy mầm dài, nhiều loại cây gỗ quý có chu kỳ ra quả dài, trong những trường hợp này thì nhân giống vô

tính nói chung và nuôi cấy mô nói riêng có ý nghĩa lớn hơn [17]

Theo Nguyễn Quang Thạch (1995), [14] Nhân giống vô tính bằng nuôi

cấy mô với ưu điểm nổi bật là có thể tạo ra hàng loạt các cá thể đồng nhất về

mặt di truyền từ một cá thể ban đầu với hệ số nhân giống cao ở quy mô công

nghiệp có thể được ứng dụng để:

+ Nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân

giống bằng phương pháp nhân giống thông thường khác

+ Duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý, đặc biệt là những kiểu gen có

nguy cơ bị tuyệt chủng nhằm mục đích làm nguyên liệu khởi đầu cho việc tạo

giống cây trồng

+ Duy trì và nhân nhanh những dòng bố mẹ đồng hợp tử để phục vụ cho

công tác tái sản xuất hạt lai

+ Tạo ra các cây sạch bệnh virus nhằm phục tráng giống cây trồng

+ Bảo quản nguồn gen thực vật

3 Đối tượng, nội dung vμ phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng

- Đề tài được tiến hành trên cây Lô hội dòng Aloe vera Linne Sinensis Berger (Lô hội lá nhỏ) được cung cấp từ Viện nghiên cứu cây dược liệu Trung ương

+ Đối với kỹ thuật nhân giống in vitro, chúng tôi sử dụng vật liệu ban

đầu là chồi đỉnh của cây Lô hội được trồng trong vườn ươm từ cây giống có nguồn gốc in vitro

+ Đối với kỹ thuật giâm hom, chúng tôi sử dụng các đoạn thân của cây Lô hội trưởng thành (1năm tuổi) trồng trong vườn ươm từ cây giống in vitro

- Chất điều tiết sinh trưởng (ĐTST): auxin, Xytokinin (BAP)

- Chế phẩm dinh dưỡng : Thành phần bao gồm 10% dung dịch dinh dưỡng MS (Muraskige & Skoog) + 5ppm BAP (Benzyl Adenin Purin) được sản xuất tại Trung tâm ứng dụng & chuyển giao tiến bộ KH&CN - Sở KHCN Vĩnh Phúc

3.2 Nội dung nghiên cứu 3.2.1 Nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy

in vitro

a Giai đoạn tạo vật liệu ban đầu in vitro Thí nghiệm1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ khử trùng đến khả năng sống của mẫu cấy

CT

Lần 1 Thời gian (phút)

Lần 2 Thời gian (phút)

Số mẫu thí nghiệm Ký hiệu

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời điểm lấy mẫu đến khả

năng tái chồi của mẫu cấy

Thời điểm lấy mẫu được tiến hành trên 4 thời vụ sau :

CT Thời điểm lấy mẫu Số mẫu thí

Số mẫu thí nghiệm Ký hiệu CT1 0 50 Đ/C

α

α - NAA (mg/l)

Số mẫu thí nghiệm Ký hiệu CT1 2,5 0 50 Đ/C

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP + IAA đến khả

năng nhân nhanh chồi

CT

BAP (mg/l)

IAA (mg/l)

Số nghiệm thí nghiệm Ký hiệu CT1 2,5 0 50 Đ/C

Ghi chú: 2,5mg/l BAP là công thức tối ưu của thí nghiệm 3

c.Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng αα - NAA trong môi

trường đến khả năng ra rễ của chồi Lô hội in vitro

Thí nghiệm11: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể ra cây đến tỷ lệ sống

của cây con ngoài vườn ươm

CT3 Trấu hun + Cát mịn (tỉ lệ 1:1) 100

3.2.2 Phương pháp giâm hom thân

Thí nghiệm 12: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ huỷ đỉnh sinh trưởng

đến khả năng phát sinh chồi nách tạo vật liệu giâm hom thân cây Lô hội

1 Hủy đỉnh sinh trưởng tháng 3 Hủy ĐST T3

2 Hủy đỉnh sinh trưởng tháng 6 Hủy ĐST T6

3 Hủy đỉnh sinh trưởng tháng 9 Hủy ĐST T9

4 Hủy đỉnh sinh trưởng tháng 12 Hủy ĐST T12

Thí nghiệm 13: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý IBA đến khả năng

ra rễ và nảy mầm đoạn hom thân cây Lô hội

* Các thí nghiệm trong kỹ thuật nuôi cấy in vitro

- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 30 - 100 bình tùy từng thí nghiệm Thời gian theo dõi 1tuần/ lần

- Mỗi bình cấy đồng đều 1 chồi

- Các bình nuôi cấy in vitro được đặt trong phòng nuôi có chế độ chiếu sáng: 16 giờ sáng/8 giờ tối với cường độ ánh sáng 2.500 – 3.000 Lux

- Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 20C

- Độ ẩm không khí: 50 – 60%

* Các thí nghiệm trong kỹ thuật giâm hom thân

- Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 15 -

35 hom (cây) tùy theo từng thí nghiệm

- Thời gian theo dõi : 30 ngày/ lần 3.3.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy in vitro

- Sử dụng môi trường MS (Muraskige & Skoog, 1962 – phụ lục) có chứa 15-30g/l đường Saccaroza, 6,5g/l agar tùy từng thí nghiệm

- Các chất điều tiết sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm auxin và cytokinin, than hoạt tính bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ khác nhau tùy

từng thí nghiệm

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là : 5,8 – 6,0

- Thể tích dung dịch dinh dưỡng (môi trường nuôi cấy) trong bình nuôi

cấy là 50 - 70 ml/ bình

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất

1,1atm trong 25 phút

3.3.2 Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy được chọn là chồi đỉnh được lấy từ các cây Lô hội trưởng thành,

sạch bệnh, sinh trưởng tốt trồng ở vườn cây mẹ Mẫu được cắt bằng dao hoặc

kéo sắc rồi được đem vào rửa sạch bằng nước xà phòng long dưới vòi nước

chảy và tráng lại 3 - 4 lần bằng nước cất

Khử trùng sơ bộ bằng cồn 75% Tiếp đó đem mẫu vào tủ cấy để tiến hành

các bước khử trùng bằng HgCl2 0,1% theo 2 phương pháp là khử trùng đơn

hoặc khử trùng kép tùy theo từng thí nghiệm

Khử trùng kép : Lần 1 khử trùng bằng HgCl2 0,1% sau đó tráng lại mẫu

bằng nước cất vô trùng, khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% thời gian khử trùng

tùy theo từng thí nghiệm

3.3.3 Phương pháp nhân nhanh

Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2-3cm cấy vào môi

trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm

xytokinin và auxin ở các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghiệm

3.3.4 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh

Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4-5 cm, có trạng thái

sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo

thành cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ là môi trường MS được bổ sung các

chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin và than hoạt tính ở các nồng độ

khác nhau tùy theo từng thí nghiệm

3.3.5 Phương pháp giâm hom thân

- Cây Lô hội trưởng thành được lấy từ vườn cây mẹ, cắt bỏ phần lá, rễ, phần thân cây được rửa sạch, cắt thành từng đoạn 2,0 - 2,5 cm sao cho các hom đều có mắt ngủ

- Hom được xử lý chống nấm thối bằng dung dịch Benlate 0,15% trong

10 phút Sau đó được xử lý kích thích ra rễ bằng IBA rồi tiến hành giâm vào cát mịn đ được xử lý bằng thuốc chống nấm Benlate trước đó khoảng 5 ngày 3.3.6 Phương pháp huỷ đỉnh sinh trưởng

Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm tại vườn thí nghiệm Dùng kéo hoặc dao sắc huỷ bỏ đỉnh sinh trưởng, mỗi ô thí nghiệm trên 15 cây mẹ 3.3.7 Phương pháp xử lý chế phẩm dinh dưỡng

- Cây Lô hội trưởng thành được giâm ươm tại vườn thí nghiệm Mỗi ô trồng 35 cây mẹ theo cự ly 40 x 35cm, các ô thí nghiệm và đối chứng đồng nhất về điều kiện đất đai và kỹ thuật chăm sóc

- Dùng chế phẩm dinh dưỡng 10% MS + 5ppm BAP, phun 10 ngày/lần 3.4 Các chỉ tiêu theo dõi

* Chỉ tiêu theo dõi trong phòng thí nghiệm:

- Quan sát sự biến đổi hình thái, màu sắc của mẫu cấy

Σ mẫu sống và sạch VSV +Tỷ lệ mẫu sống (%) =

Σ mẫu nuôi cấy x 100

Tổng số mẫu nhiễm +Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

Tổng số mẫu cấy ban đầu

x 100

Tổng số mẫu chết + Tỷ lệ mẫu chết (%) =

Tổng số mẫu cấy ban đầu

x 100

Σ số chồi tạo thành + Hệ số nhân chồi (lần) =

Σ số chồi ban đầu X 100

Σ chồi tạo rễ + Tỷ lệ ra rễ (%) =

Σ chồi thí nghiệm x 100

Σ số rễ + Số rễ trung bình =

++ : Chồi trung bình, lá xanh

+ : Chồi gầy, lá xanh nhạt

* Chỉ tiêu theo dõi ngoài vườn ươm

Tổng số cây sống + Tỷ lệ cây sống (%) =

Tổng số cây theo dõi

x 100

Tổng chiều cao cây + Chiều cao cây trung bình (cm) =

Tổng số cây Tổng số lá

+ Số lá trung bình (lá) =

Tổng số cây

Số hom nảy mầm + Tỷ lệ hom nảy mầm (%) =

Số hom thí nghiệm

x 100

Số hom ra rễ + Tỷ lệ hom ra rễ (%) =

- Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least Significant Different) ở độ tin cậy 95%

- Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%

3.6 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 8/2006- 10/2007 tại Trung tâm ứng dụng và chuyển giao tiến bộ KH&CN thuộc Sở Khoa học Công nghệ Tỉnh Vĩnh Phúc

4.1 Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Lô hội bằng phương pháp nuôi

cấy in vitro

4.1.1 Nghiên cứu kỹ thuật tạo vật liệu khởi đầu in vitro

Đây là giai đoạn đưa mẫu nuôi cấy vào điều kiện in vitro Trong kỹ

thuật nhân giống vô tính in vitro thì vấn đề tạo nguồn mẫu ban đầu hoàn toàn

sạch vi sinh vật như: nấm, khuẩn nhưng vẫn còn khả năng tái sinh là quan

trọng, chính vì vậy phải đòi hỏi chế độ khử trùng hợp lý Đối với kỹ thuật khử

trùng người ta thường dùng các loại hoá chất như: Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2,

HgCl2, cồn70% để khử trùng mẫu cấy với nồng độ và phương thức khử trùng

khác nhau tuỳ theo từng loại cây trồng

Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng HgCl2(0,1%) đây là loại hoá

chất có hiệu quả khử trùng cao cho nhiều loại đối tượng cây trồng như: khoai

tây, cúc, cẩm chướng, bạch đàn, trinh nữ hoàng cung

Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phương thức khử trùng (khử

trùng đơn, khử trùng kép) với thời gian khử trùng khác nhau đến hiệu quả tạo

vật liệu khởi đầu in vitro

4.1.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của phương thức và thời gian khử trùng đến hiệu

quả tạo vật liệu khởi đầu in vitro cây Lô hội

Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành nghiên cứu so sánh hai

phương thức khử trùng (đơn, kép) với thời gian khử trùng khác nhau trên mẫu

nuôi cấy là chồi đỉnh của cây Lô hội vụ Xuân được trồng trong vườn ươm Kết

quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.1

Bảng 4.1 ảnh hưởng của phương thức và thời gian khử trùng

đến tỷ lệ sống của mẫu cấy (sau thời gian 10 ngày) Thời gian

khử trùng (phút) CT

Lần 1 Lần 2

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu chết (%)

Tỷ lệ mẫu sống bật chồi (%)

- Đối với phương pháp khử trùng đơn chúng tôi tiến hành khử trùng mẫu ở các thời gian khác nhau 3 phút, 5 phút, 7 phút kết quả cho thấy: Khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu sống có khả năng bật chồi tăng Cụ thể

là tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm từ (90,2%) ở công thức 1 xuống còn (25,8%) ở công thức 3 khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút

Trong các công thức khử trùng với thời gian 3 phút và 5 phút chưa thấy xuất hiện mẫu chết nhưng khi tăng đến 7 phút thì tỷ lệ mẫu chết là (5,7%) ở công thức 3

Tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng từ (9,8%) ở công thức 1 đến (68,5%) ở công thức 3 khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút đến 7 phút

đến tỷ lệ sống của mẫu cấy

- Đối với phương pháp khử trùng kép: chúng tôi vẫn sử dụng tổng thời gian khử trùng là 3 phút, 5 phút, 7 phút nhưng tiến hành khử trùng làm 2 lần Lần đầu khử trùng trong thời gian 2 phút, 3 phút, 4 phút sau đó rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng rồi khử trùng tiếp lần thứ 2 trong thời gian 1 phút, 2 phút, 3 phút

Chúng tôi nhận thấy hiệu quả khử trùng vẫn theo quy luật như khử trùng đơn, tức là tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần, tỷ lệ mẫu chết và tỷ lệ mẫu sống bật chồi tăng dần theo chiều tăng của tổng lượng thời gian khử trùng từ 3 phút,

5 phút đến 7 phút Tỷ lệ mẫu nhiễm VSV giảm (92,5%) xuống còn (10%), tỷ

lệ mẫu chết tăng từ (0%) lên (23,2%), tỷ lệ mẫu sống bật chồi tăng từ (7,5%)

đến (66,8%)

So sánh hai phương thức khử trùng đơn và kép thì phương thức khử trùng đơn cho kết quả khử trùng cao hơn không đáng kể so với phương thức khử trùng kép ở phương thức khử trùng đơn tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng

từ (9,8%) đến (68,5%), còn ở phương thức khử trùng kép có tỷ lệ mẫu sống và bật chồi tăng từ (7,5%) đến (66,8%) khi tăng thời gian khử trùng từ 3 phút, 5 phút đến 7 phút

Như vậy từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp nhất là khử trùng đơn bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 7 phút, kết quả khử trùng cho tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt (68,5%)

4.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy

Trạng thái sinh trưởng phát triển của cây trồng ở các thời vụ khác nhau thì khác nhau Vì vậy để tìm hiểu ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Lô hội in vitro chúng tôi tiến hành lấy mẫu ở các thời vụ khác nhau trong năm: mùa Thu, mùa Đông, mùa Xuân, mùa Hè

Các mẫu cấy được khử trùng ở chế độ khử trùng đơn trong thời gian 7phút, sau đó cấy vào môi trường dinh dưỡng kết quả nghiên cứu được thể hiện ở bảng 4.2 và hình 4.2