Luận văn thạc sĩ Kỹ thuật Nghiên cứu quá trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

Axit lactic ñược hình thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua, nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản xuất t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

HỒ THỊ HẢO

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN

AXIT LACTIC TỪ TINH BỘT HẠT MÍT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS.TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Đà Nẵng - Năm 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Công trình ñược hoàn thành tại ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS TRƯƠNG THỊ MINH HẠNH

Phản biện 1: PSG.TS TRẦN THỊ XÔ

Phản biện 2: PGS.TS PHẠM NGỌC ANH

Luận văn ñược bảo vệ trước hội ñồng chấm Luận văn tốt

nghiệp thạc sĩ Kỹ thuật họp tại Đại Học Đà Nẵng vào ngày 23

tháng 4 năm 2011

* Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Trung tâm Học liệu, Đại học Đà Nẵng

2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic 28

3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ xút ñến quá trình tách lớp vỏ nâu ở hạt mít

31

3.3 Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm 34 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau quá trình thủy phân 38 3.5 Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường 48

3.7 Kết quả thí nghiệm theo thực nghiệm TYT 22 52

3.9 Kết quả tính bước chuyển ñộng δj của các yếu tố 56 3.10 Kết quả thực nghiệm tối ưu hóa theo ñường lên dốc 57

Số hiệu

1.2 Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường

3.5 Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men 40

3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3

42 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng

khác nhau

42

3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành 45 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành 46 3.12 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

EMP : Embden-Mayerhoff-Parnas

ATP : Adenosine Triphosphate

ADP : Adenosine Diphosphate

PP : Pentoza Phosphat

L.bulgaricus : Lactobacillus bulgaricus:

L acidophilus : Lactobacillus acidophilus

Opt : Optimum

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Số liệu, kết quả báo cáo trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố ở bất cứ công trình nào khác

Tác giả

Hồ Thị Hảo

MỞ ĐẦU

1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có hương vị nhẹ Axit lactic ñược hình

thành do quá trình lên men tự nhiên trong các sản phẩm như phomai, sữa chua,

nước tương, bột chua, sản phẩm từ thịt, rau muối chua… Axit lactic ñược dùng sản

xuất trong một số thực phẩm như các sản phẩm bánh, ñồ uống, các sản phẩm từ

sữa, thịt, xà lách Trong các sản phẩm thực phẩm ñồ uống, axit lactic ñược sử dụng

ñể ñiều chỉnh ñộ pH hoặc như một chất bảo quản [27], [30]

Trong công nghiệp nhẹ, axit lactic là dung môi cho công nghiệp sản xuất sơn,

vecni, nhuộm và thuộc da Trong công nghiệp rượu, axit lactic ñược dùng dưới

dạng muối của canxi Đặc biệt là gần ñây, các nhà khoa học trên thế giới ñã nghiên

cứu tổng hợp nhựa axit polylactic (PLA) – một loại nhựa sinh học từ axit lactic

PLA là sự lựa chọn thích hợp thay cho nhựa có nguồn gốc từ dầu mỏ, vì nó vừa có

thể phân huỷ ñược, vừa ít ñộc tính ñối với con người PLA ñược sử dụng làm

nguyên liệu sản xuất bao bì phân bón, thực phẩm và các loại bát, ñĩa dùng một lần

Đặc biệt trong y học và dược học, kết hợp với sự phát triển của công nghệ sinh học

và di truyền, axit lactic ñược nghiên cứu nhằm sản xuất phục vụ những nhu cầu

thiết yếu về sức khỏe của con người Trong phẫu thuật chỉnh hình, các hợp chất cao

phân tử tổng hợp từ axit lactic và những dẫn xuất của nó là những chất liệu cấy

ghép sinh học thích hợp và hiệu quả cao Canxi lactat là loại dược phẩm nhằm bổ

sung canxi dưới dạng dễ hấp thu cho cơ thể Sắt lactat ñược sử dụng ñể chữa bệnh thiếu

máu…[16], [28], [37]

Axit lactic ñược sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như rỉ ñường,

củ cải ñường, nước mía, tinh bột Nhằm ñể hạ chi phí sản xuất axit lactic, ngày

nay ñang có rất nhiều nghiên cứu thay thế nguồn cacbon và nitơ ñắt tiền trong môi

trường lên men bằng các nguyên vật liệu rẻ tiền hơn Trong ñó, tập trung chủ yếu

vào việc tận dụng các phế phẩm nông nghiệp như bã mía, bã ngô, lõi ngô, cám mỳ, rơm rạ, rỉ ñường [16],[23],[28],[36]

Mít là loại trái cây nhiệt ñới có giá trị Quả mít ñã ñược sử dụng ñể ăn tươi từ lâu ñời Trong những năm gần ñây mít ñược sử dụng rất nhiều trong các ngành chế biến thực phẩm ñể tạo ra các sản phẩm khác nhau như: mứt mít, mít sấy, sản xuất bánh kẹo,…Hạt mít ở trong quả mít chiếm trung bình từ 10 – 15% trọng lượng trái, ngoài ra trong hạt mít chứa một hàm lượng khá lớn tinh bột và protein Mặc dù khối lượng nhiều nhưng nó chỉ ñược coi là phế phụ phẩm và thường bị loại bỏ trong quá trình sử dụng, sản xuất và gây khó khăn cho việc xử lý rác thải ô nhiễm môi trường Chúng ta ñã biết sử dụng hạt mít ñể chế biến một số món ăn nhỏ tuy nhiên sự hiểu biết về các thành phần dinh dưỡng còn hạn chế [35]

Quá trình nghiên cứu xác ñịnh thành phần dinh dưỡng của hạt mít ñã ñược khảo sát trong thời gian gần ñây, trong hạt mít có chứa tới 77,76% tinh bột và là một nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có [38], [43] Thủy phân tinh bột từ hạt mít ñể lên men sản xuất cồn và axit lactic là một hướng mới nhưng chưa ñược nghiên cứu nhiều Việc tận dụng ñược nguồn phụ phẩm rẻ tiền, dễ kiếm, cũng như nhằm hạn chế lượng chất thải trong quá trình chế biến, chống ô nhiễm môi trường là một thiên hướng lớn ñối với các nhà nghiên cứu Trong công nghệ sản xuất axit lactic, việc sử dụng các nguồn nguyên liệu như ñường, rỉ ñường, nước mía ép, củ cải ñường, tinh bột…ñã ñược nghiên cứu nhiều nhưng hiện nay việc sử dụng tinh bột hạt mít ñể sản xuất axit lactic thì chưa thấy công bố

Ở nước ta, việc sử dụng axit lactic trong công nghệ thực phẩm và phi thực phẩm khá nhiều nhưng chủ yếu là thu mua từ nước ngoài với giá thành cao Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít (một nguồn phế phẩm công nghiệp khổng lồ và rẻ tiền) ñể làm nguyên liệu trong công nghệ lên men lactic nhằm hạ giá thành cho sản phẩm axit lactic là thật sự có ý nghĩa không chỉ về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về bảo vệ môi trường sống của chúng ta

Chính vì những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn chọn ñề tài “Nghiên cứu quá

trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít” là một việc làm cấp thiết hiện nay.

2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít làm nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu nhận dịch lên men

- Xác ñịnh các thông số công nghệ tốt nhất như nồng ñộ dịch ñường, nhiệt

ñộ lên men, thời gian lên men, pH lên men cho quá trình lên men axit lactic bằng

cách sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa nhằm thu ñược

hàm lượng axit lactic sau lên men là cao nhất

- Đề xuất ñược quy trình lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

3 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít làm nguồn nguyên liệu chính ñể tiến hành thủy phân thu

nhận dịch ñường

- Sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes – Đan Mạch sản

xuất và chế phẩm γ-amylaza của Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất

- Sử dụng chủng vi khuẩn Lactobacillus casei ñể lên men dịch sau thủy phân

4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

- Sử dụng hạt mít ñược thu mua tại các ñầu mối nguyên liệu của Công ty cổ

phần Vinamit trên Daklak

- Lên men axit lactic từ dịch thủy phân từ tinh bột hạt mít

- Phương pháp lấy mẫu, chuẩn bị mẫu và bảo quản mẫu

6 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

- Phân tích và xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, thành phần dịch lên

men và xác ñịnh hàm lượng axit lactic bằng các phương pháp hóa học

- Thực hiện lên men axit lactic trên môi trường lỏng

- Tối ưu hóa các ñiều kiện lên men bằng phương pháp quy hoạch thực

nghiệm và phương pháp tối ưu nhằm thu ñược hàm lượng axit lactic là cao nhất

7 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Tận dụng lượng phế phụ phẩm trong quá trình chế biến các sản phẩm từ quả mít ñể tạo ra nguồn nguyên liệu chính ñể sản xuất axit lactic

- Giải quyết ñược vấn ñề ô nhiễm môi trường, bảo vệ sức khỏe cộng ñồng, nâng cao hiệu quả kinh tế trong sản xuất

- Tăng nguồn thu nhập cho người trồng mít

- Giảm lượng axit lactic ngoại nhập, chủ ñộng sản xuất, tiết kiệm ngoại tệ

8 CẤU TRÚC CỦA LUẬN VĂN

Ngoài phần mở ñầu, kết luận và kiến nghị, tài liệu tham khảo, phụ lục, trong luận văn gồm có các chương sau:

+ Chương 1: Tổng quan

+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

+ Chương 3: Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về axit lactic

1.1.1 Lịch sử lên men lactic

Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kỵ khí ñường tạo thành axit lactic ñã

ñược biết và sử dụng từ lâu ñời trong dân gian như: lên men chua rau quả, làm sữa chua…

Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Shale lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic

từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược sự lên men chua

sữa là do nhóm vi khuẩn lactic Năm 1878 Lister phân lập thành công vi khuẩn

lactic ñầu tiên và ñặt tên là Bacterium lactis, nay gọi là Streptococus lactic Về sau

các nhà khoa học liên tiếp phân lập ñược nhiều loại vi khuẩn lactic khác nhau Từ

ñó công nghiệp lên men sản xuất axit lactic ñược hình thành từ năm 1881 [1], [3]

Ngày nay, việc sản xuất và tiêu thụ axit lactic trên thế giới khá nhiều Vì axit

lactic ñược lên men từ nhiều nguyên liệu khác nhau, chủ yếu là những nguyên liệu

có chứa tinh bột, ñường và nguyên liệu có khả năng chuyển hóa thành ñường Hơn

nữa, ña số các loại nguyên liệu này thường là phế phẩm trong nhiều ngành công

nghiệp như rỉ ñường, rơm rạ… [16], [25], [28], [36]

1.1.2 Cấu tạo của axit lactic

Công thức phân tử: C3H6O3, khối lượng phân tử là 90,08; tỉ trọng 1,21;

nhiệt ñộ sôi 122oC; ñiểm tan 18oC [1] Axit lactic là hỗn hợp của 2 dạng ñồng phân

D-axit lactic và L-axit lactic:

D-axit lactic L-axit lactic

Hình 1.1 Hai dạng ñồng phân của axit lactic [52]

Axit lactic là axit hữu cơ không màu, có mùi nhẹ, tan trong nước và trong cồn Trong cấu tạo phân tử của chúng có một cacbon bất ñối xứng nên chúng có hai ñồng phân quang học: D-axit lactic và L-axit lactic Hai ñồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một quay sang phải và một quay sang trái Do ñó tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác nhau

Loại L-axit lactic ở dạng tinh thể không màu Chúng có khả năng tan trong nước, tan trong cồn etylic, tan trong eter, không tan trong CHCl3 Nhiệt ñộ nóng chảy là 28oC, góc quay cực ở 15oC là 2,67o

Loại D-axit lactic là dạng tinh thể, tan trong nước, tan trong cồn Nhiệt ñộ nóng chảy là 28o

C, nhiệt ñộ sôi 103o

C, góc quay ở 15o

là -2,26o Nếu D-axit lactic và L-axit lactic có trong hỗn hợp theo tỉ lệ 50:50, người ta gọi là hỗn hợp raxemic Hỗn hợp này ñược kí hiệu là DL-axit lactic Trong quá trình lên men không có một hỗn hợp lý tưởng này mà chỉ có ñược hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ DL-axit lactic là dịch lỏng dạng sino, có khả năng tan trong nước, trong cồn, không tan trong CHCl3, nhiệt ñộ nóng chảy của chúng là 16,8oC, nhiệt ñộ sôi là 122oC [1], [3]

1.1.3 Cơ sở của qúa trình lên men axit lactic

Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men lactic là những phản ứng chuyển hydro và ñiện tử Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất là các enzyme oxy hóa – khử (dehydrogenase, oxydase…) chủ yếu từ

vi sinh vật Như vậy, lên men là quá trình oxy hóa - khử sinh học ñể thu năng lượng

và các hợp chất trung gian Tùy thuộc vào các sản phẩm tạo thành mà quá trình lên men lactic ñược chia thành 2 loại: lên men lactic ñồng hình và lên men lactic dị

hình [8], [11]

Lên men lactic ñồng hình, thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men

dị hình các sản phẩm cuối cùng khá ña dạng: axit lactic, etanol, axit axetic và CO2 Chỉ có lên men lactic ñồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp

Các vi khuẩn lactic ñồng hình phân giải glucose theo con ñường EMP [3]

Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của men xúc tác cho phản ứng tạo axit

lactic, lactac dehdrogenase, và tùy vào sự tồn tại của men lactate-racemase mà có

thể xuất hiện các dạng decacboxyl hóa và chuyển thành axit axetic, etanol và CO2

cũng như tạo thành axeton Mức ñộ tạo thành sản phẩm này phụ thuộc vào sự có

mặt của oxi

Sự hình thành nên axit lactic trải qua hàng loạt giai ñoạn trung gian với sự

tham gia của các enzyme tương ứng Các phản ứng chuyển hóa glucose theo con

ñường EMP ñược chia làm 2 giai ñoạn:

- Giai ñoạn ñầu ñược gọi là giai ñoạn ñầu tư năng lượng, gồm 5 phản ứng

ñầu tiên Ở giai ñoạn này, ñường ñược hoạt hóa bởi sự photphoril hóa Phản ứng

này tạo ra 1 mol ñường 6 cacbon ñã ñược photphoril hóa, fructozo – 1,6 –

diphotphat Đường này sau ñó ñược cắt thành 2 mol trizophotphat Hai mol

trizophotphat ñược hình thành từ 1 mol glucose sau 2 lần photphoril hóa mức ñộ

cơ chất tạo thành 4 mol ATP

- Giai ñoạn thứ hai, là giai ñoạn phát sinh năng lượng Giai ñoạn này gồm

những phản ứng còn lại Ở giai ñoạn này, các trizophotphat sẽ ñược hoạt hóa tiếp

ñể tạo thành hai hợp chất chứa các liên kết photphat cao năng

1,3-diphotphoglycerat và photpho enolpiruvat Cả hai hợp chất này ñược coi như hợp

chất siêu cao năng lượng Hai chất này sẽ chuyển photpho cao năng cho ADP ñể

tạo thành ATP Quá trình này ñược gọi là photphoril hóa ở mức cơ chất

Lượng axit lactic tạo thành chiếm hơn 90% Chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị

khử cacbon ñể chuyển thành axit lactic, etanol, CO2 và axeton [1], [3]

Phương trình phản ứng tạo axit lactic: C6H12O6 = 2CH3CHOHCOOH

+225cal Sự lên men lactic ñồng hình ñược biểu diễn theo sơ ñồ sau:

Glucose Gluco-6- photphat Fructo-1,6-diphotphat Glyceraldehyt-3-photphat Dihydroaxeton photphat NAD

NADH2 1,3-Diphotphoglyxerat 3-Photphoglyxerat 2-Photphoglyxerat Photphoenol pyruvat Pyruvat NADH2

NAD Lactat

Hình 1.2 Lên men axit lactic ñồng hình nhờ các phản ứng theo con ñường EMP [3]

Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzyme chủ yếu của con ñường EMP,

do bị ñột biến một hoặc nhiều hơn một enzyme của con ñường này, ñó là aldolase

và trizophotphatizomerase

Hình 1.3 Lên men axit lactic dị hình theo các phản ứng của con ñường PP [4]

Trong sự lên men lactic dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau ñược tạo thành Các

tác nhân gây lên men lactic dị hình là Lactobacillus brevis, Leuconostoc mensenteroides

Sự lên men lactic dị hình xảy ra khi vi khuẩn gây lên men thiếu enzyme cơ bản của sự ñường phân là aldolase và trioso isomerase Khi ñó, glucose ñược chuyển hoá theo con ñường pentosophosphat từ glucoso 6 phosphat ñến xiluloso 5 phosphat Sau ñó,

dưới tác dụng của enzyme pentosophosphat cetolase mà xiluloso 5 phosphat bị phân ly

tạo thành glyceraldehyd 3 phosphat và acetyl phosphat Acetyl phosphat có thể ñược chuyển hoá tiếp tục thành ethanol hoặc axit axetic tuỳ theo hệ enzyme của từng vi sinh vật Còn glyceraldehyd 3 phosphat thì bị khử H2 ñể chuyển thành axit lactic giống như trường hợp lên men lactic ñồng hình

Sự lên men lactic dị hình ñược ứng dụng trong lên men thức ăn gia súc và muối chua rau quả Các vi khuẩn có khả năng gây lên men các ñường mono và disaccharid (sau khi ñã thuỷ phân thành monosaccharid nhờ enzyme tương ứng của vi khuẩn)

1.2 Tác nhân tổng hợp axit lactic

Vi sinh vật là tác nhân chủ yếu gây nên sự lên men Trong tế bào vi sinh vật

có một hệ enzyme rất phức tạp Tuy nhiên, không phải tất cả vi sinh vật ñều có khả năng tổng hợp một phức hệ enzyme như nhau Nhiều thí nghiệm nghiên cứu các enzyme riêng biệt có nguồn gốc từ vi sinh vật chứng tỏ rằng ngay cả cùng một loài, khác nhau về lượng enzyme tổng hợp ñược Vì vậy, việc tuyển chọn chủng có hệ enzyme ñặc trưng cho một sản xuất nào ñó luôn luôn liên quan tới việc khảo nghiệm hàng chục, hàng trăm loài vi sinh vật khác nhau Để có ñược chủng ứng dụng cho từng sản xuất riêng là vấn ñề khó khăn, phức tạp và lâu dài [1]

1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic

Theo khóa phân loại Bergey, nhóm vi khuẩn lactic thuộc:

Giới: Bateria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillates Họ: Lactobacillaceae & Streptococcaceae…

Vi khuẩn lactac có chung các ñiểm như: bắt màu gram (+), không di ñộng,

lactic có khả năng tạo bào tử), nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, kị khí tùy ý, tế bào

không chứa cytochobrom và enzyme catalase, lên men tổng hợp axit lactic [1], [5]

Bảng 1.1 Hình thái và kiểu lên men lactic của một số vi khuẩn lactic [1], [3]

lên men (tỉ lệ phân tử) axit lactic

Pediococcus cerevisiae ñồng hình lactat DL

Leuconostoc cremoris dị hình lactat : acetat : CO2 (1:1:1) D(-)

Leuconostoc mesenteroides dị hình lactat : acetat : CO2 (1:1:1) D(-)

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều loài khác nhau về hình dạng, song về mặt sinh lý và khả năng lên men chúng tương ñối ñồng nhất Môi trường sinh trưởng của chúng ngoài gluxit, khoáng, muối amon, photphat còn cần vitamin nhóm B, vitamin H, axit folic, axit nicotinic và axit amin khác [1], [11]

1.2.2 Một số vi khuẩn lactic ñiển hình

Lactobacillus casei:

- Thuộc loại trực khuẩn nhỏ, có kích thước rất ngắn

Chúng có thể tạo chuỗi, không di ñộng, gram (+)

- Có khả năng lên men một số loại ñường như

glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose

- Trong quá trình lên men chúng tạo ra L-axit lactic

Hình 1.4 Lactobacillus casei [52]

- Lactobacillus casei thuộc nhóm các vi khuẩn lên men lactic ñồng hình

Cấu trúc tế bào của lactobacillus casei thường thẳng, hình que và sắp xếp

theo dây chuyền Kích thước tế bào khoảng 0,7-1,1 x 2,0-4,0 micrometer Nó thuộc dạng yếm khí tùy tiện Điều này có nghĩa nó là một sinh vật có khả năng phát triển trong cả hai môi trường hiếu khí và kỵ khí, nhưng phát triển tốt hơn và nhanh hơn trong sự hiện diện của oxygen

Điều ñặc biệt của vi khuẩn này là có khả năng hoạt ñộng trong một khoảng nhiệt ñộ và pH tương ñối rộng, nhiệt ñộ hoạt ñộng nằm trong khoảng: 30-40oC, pH tối thích vào khoảng 5.5

Các nhà khoa học ñã tìm thấy lactobacillus casei có nhiều ñặc tính có lợi hỗ trợ sức khỏe con người Nó có thể cải thiện và tăng cường tiêu hóa Một số chủng

vi khuẩn giúp kiểm soát tiêu chảy, có tác dụng chống viêm ruột, giảm dung nạp ñường lactose, giảm táo bón, Ngoài ra, nó còn là vi sinh vật sử dụng ñể sản xuất axit lactic, một sản phẩm ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sinh học và trong ngành công nghiệp thực phẩm Lactobacillus casei ñược sử dụng rộng rãi trong

công nghiệp, nhất là trong sản xuất sữa

Lactobacillus bulgaricus:

- Thuộc loại trực khuẩn có kích thước rất dài, liên kết với nhau tạo thành

chuỗi, gram (+)

- Chúng không có khả năng di ñộng

- Chúng có khả năng lên men ñược các loại ñường

như glucose, lactose, galactose, fructose

- Chúng không có khả năng tạo ra nitrit từ nitrate

Hình 1.5 L.bulgaricus [52]

Lactobaciilus acidophilus:

- Thuộc loại trực khuẩn gram (+) di ñộng

- Kích thước: rộng 0,6µ – 0,9µ

- Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẽ Đôi

khi cũng tạo thành chuỗi ngắn

- Có khả năng lên men một số loại ñường như

glucose, fructose, galactose, maltose, mannose, lactose,

saccharose ñể tạo thành axit lactic Hình 1.6 L.acidophilus [52]

- Chúng không có khả năng lên men một số loại ñường như xylose,

arabinose, rhamnose, glycerol, mantitol, sorbitol, dulcitol, inositol

- Nhiệt ñộ phát triển tối ưu là 45 – 50o

- Chúng lên men ñược các loại ñường như:

glucose, maltose, rhamnose, lactose Hình 1.7 Streptococcus lactic[52]

1.3 Ứng dụng của axit lactic

1.3.1 Trong công nghệ thực phẩm

Vi khuẩn lactic có nhiều trong thiên nhiên, do ñó chúng rất gần gũi với

những hoạt ñộng sống của con người, trong ñó phần lớn là trong ngành chế biến

thực phẩm

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể len men sữa chua: nhiều loại vi khuẩn lactic ñược ñưa vào quá trình sản xuất sữa chua Sự lên men lactic trong quá trình sản xuất vừa tăng giá trị dinh dưỡng vừa có tính chất chữa bệnh ñường ruột giúp ăn ngon miệng, dễ tiêu hóa vừa có tác dụng bảo quản lâu hơn sản phẩm sữa khỏi bị hư hỏng Ứng dụng ñể sản xuất dưa chua: muối chua rau quả là một quá trình hoạt ñộng của vi khuẩn lactic và vi khuẩn axetic Trong rau quả, vi khuẩn sẽ phát triển tạo axit lactic và axit axetic cùng với một số chất hữu cơ khác Các axit hữu cơ này làm giảm pH của dịch, chống lại sự phát triển của các vi sinh vật gây thối làm hư thối rau quả Bên cạnh ñó, nhờ có lượng axit hữu cơ tạo thành sẽ làm tăng hương vị của khối ủ chua rau quả, ñồng thời giữ ñược màu tự nhiên và bảo ñảm ñược chất lượng của sản phẩm ủ chua Vì vậy, cũng như sản xuất sữa chua, muối chua rau quả

là quá trình vừa mang ý nghĩa chế biến vừa mang ý nghĩa bảo quản

Ứng dụng trong sản xuất tương: sản xuất tương theo phương pháp của người miền Bắc (Việt Nam) có giai ñoạn ngả nước ñậu sau khi rang Quá trình ngả nước ñậu này có nhiều phản ứng sinh hóa khác nhau xảy ra, trong ñó có quá trình lên men lactic tạo pH thích hợp cho sản phẩm và làm tăng hương vị cho sản phẩm Ứng dụng sản xuất ñậu phụ: giai ñoạn kết tủa protein của ñậu trong quá trình sản xuất ñậu phụ theo phương pháp truyền thống thường dùng nước dưa chua (có vi khuẩn lactic) ñể tạo kết tủa nhờ pH giảm ñến ñiểm ñẳng ñiện của protein ñậu nành Ứng dụng ñể sản xuất các sản phẩm lên men từ sữa: các sản phẩm sữa có sử dụng lên men lactic thông thường là: sữa chua uống, sữa chua ăn, phomat, bơ…Các qúa trình biến ñổi và chuyển hóa trong sản xuất ñều làm cho sản phẩm thêm giàu dinh dưỡng và tạo cho sản phẩm có hương vị ñặc trưng

Ứng dụng ñể ủ thức ăn cho gia súc: về nguyên tắc trên các loại cỏ, lá cây có chứa các chất dinh dưỡng phù hợp với vi khuẩn lactic nên khi tiến hành ủ các loại

cỏ, lá cây thì khối ủ này trở nên chua và giữ ñược màu sắc hương vị của cây, lá Quá trình ủ chua này cũng góp phần bảo quản thức ăn cho gia súc [5], [8], [15]

1.3.2 Trong y học

Ứng dụng vi khuẩn lactic ñể chữa bệnh

ñường ruột: nước Pháp ñã sản xuất và ñưa ra thị

trường hàng chục năm nay một sản phẩm mang tên

biolactyl Sản phẩm này chuyên trị tiêu chảy bằng

một nhóm nhiều vi khuẩn lactic

Hình 1.8 Thuốc Biolactyl [50]

Ứng dụng axit lactic theo phương pháp vi lượng ñồng cân (homeopathy):

trong quá trình vận ñộng của cơ thể, mô cơ hoạt ñộng mạnh và trong một thời gian

dài sẽ gây ra hiện tượng mệt mỏi Hiện tượng mệt mỏi này do các phản ứng sinh

hóa xảy ra trong mô cơ, tạo axit lactic Các thầy thuốc ñã tạo ra một vị thuốc bao

gồm axit lactic kết hợp với cây kim sa có khả năng giúp cơ thể không còn mệt mỏi

và có khả năng làm việc trong thời gian dài

Ứng dụng axit lactic trong phẩu thuật chỉnh hình, người ta thường sử dụng

loại vật liệu có tên là purasorb

- Purasorb là một hợp chất cao phân tử ñược sản xuất từ axit lactic

- Purasorb ñược sử dụng như những ñinh gim, gắn phần xương lại với nhau;

khi xương ñịnh hình, purasorb sẽ tự tiêu hủy

Ứng dụng axit lactic trong nha khoa: Trong nha khoa có hai chế phẩm ñược

sử dụng nhiều ñó là puramex và puracal Puramex gồm các thành phần như

amulinium lactac, Fe-lactac, Mg-lactac, Mn-lactac, Zn-lactac; puracal chỉ có canxi

lactac Các chế phẩm này thường làm răng khỏe hơn

Ứng dụng trong sản xuất vật liệu sinh học (biomaterials): các nhà khoa học

ñang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các

copolymer của axit lactic Các copolymer này có tính năng rất giống những bộ

khung xương ñộng vật Hướng này ñang ñược nghiên cứu và trong tương lai nó sẽ

ñược ứng dụng nhiều

Ứng dụng trong sản xuất các loại sữa bột giàu canxi: Bổ sung lactac canxi vào thành phần sữa bột dinh dưỡng, bánh ngọt, bánh nướng ñể tăng lượng canxi

cho cơ thể [8], [15]

1.3.3 Ứng dụng trong công nghệ vật liệu

Chất dẻo trong tương lai: người ta ñã nghiên cứu những chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo cũ khó bị phân hủy Chất dẻo mới này là một loại polymer có tên gọi là axit polylactic (PLA) Đó là sản phẩm ñược tạo ra nhiều loại vật liệu ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: công nghiệp dệt, công nghiệp thuộc da, công nghiệp bao bì…Những vật liệu này sau khi vứt bỏ chúng sẽ bị phân hủy bởi vi sinh vật, không gây ô nhiễm môi trường [13], [16], [17]

1.3.4 Ứng dụng trong mỹ phẩm

Các loại lactate kim loại ñược sử dụng trong thành phần của một số mỹ phẩm chăm sóc da như punosal của hãng mỹ phẩm Punac Mỹ phẩm này có tác dụng chống lại các vi sinh vật có trên bề mặt da, làm ẩm và sang da [8], [18]

1.4 Tình hình nghiên cứu axit lactic trên thế giới

Axit lactic ñược các nhà nghiên cứu nước ngoài quan tâm khá nhiều, nhưng chủ yếu tập trung ứng dụng của axit này trong công nghiệp thực phẩm, trong nông nghiệp và lâm nghiệp, trong y tế và y học

- Năm 1780 nhà bác học Thụy Điển Scheele lần ñầu tiên ñã tách ñược axit lactic từ sữa bò lên men chua Năm 1857 Pasteur ñã chứng minh ñược lên men sữa là

do nhóm vi khuẩn lactic [1] Năm 1878 , Joseph Lister (1827 – 1912) ñã phân lập thành

công vi khuẩn lactic ñặt tên là Bacterium lactic nay gọi là Streptococcus lactic [13]

Sau ñó có nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới ñã nghiên cứu và khảo sát lên men sản xuất axit lactic từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau Vi khuẩn lên men chủ yếu

từ nguồn cacbon chính là dịch ñường, từ một số nguyên liệu có khả năng chuyển biến thành ñường Năm 2001, Hassan K Sreenath, AnaB.Moldes, RichardG Koegel

& Richard J Straub, Sản xuất axit lactic từ chất thải nông nghiệp [36] Năm

2003, Takashi Ueno, Yasuhiro Ozawa, Masaki Ishikawa, Kotoyoshi Nakanishi &

ñóng hộp) và bã nho (từ sản xuất vang nho) [39] Năm 2006, Walaiporn

Timbuntam Klanarong Sriroth, Yutaka Tokiwa, nghiên cứu sản xuất axit lactic

từ nước mía bởi lactobacillus sp Năm 2007, Buenaventurada P Calabia

Yutaka Tokiwa, Sản xuất D- axit lactic từ rỉ ñường, nước mía và nước ép

củ cải ñường của Lactobacillus delbrueckii [16]

- Năm 2007, Sarote Sirisansaneeyakul Tiyaporn Luangpipat Wirat

Vanichsriratana Thongchai Srinophakun Henry Ho-Hsien Chen Yusuf Chisti,

Tối ưu hóa sản xuất axit lactic bằng cách cố ñịnh lacbacillus lactic IO-1 [33]

- Năm 2007, Se´ bastien Givry Vincent Prevot Francis Duchiron, sản

xuất axit lactic từ thủy phân hemicenllulo bởi các tế bào của Lactobacillus

bifermentans cố ñịnh trong Alginat- Ca bằng cách sử dụng phương pháp phản

ứng bề mặt [22]

Hầu hết các ñề tài nghiên cứu ñều tập trung sản xuất axit lactic từ nhiều

nguồn nguyên liệu khác nhau Nhưng chưa có ñề tài nào dùng tinh bột từ hạt mít ñể

lên men lactic

1.5 Tình hình nghiên cứu axit lactic trong nước

Tại Việt Nam, việc sử dụng axit lactic vào nhiều ngành công nghiệp khác

nhau và nguồn axit lactic chủ yếu thu nhập từ nước ngoài với giá thành khá cao Sự

quan tâm của các nhà khoa học trong nước về lên men sản xuất axit lactic chủ yếu

từ nguồn nguyên liệu chính là rỉ ñường Tháng 1 năm 2010, PGS.TS Lê Thanh

Mai, nghiệm thu ñề tài cấp bộ “sản xuất axit lactic từ rỉ ñường”, trường Đại Học

Bách Khoa Hà Nội [49] Tuy nhiên, việc sử dụng hạt mít làm nguyên liệu cho quá

trình lên men lactic thì chưa ñược nghiên cứu Tuy vậy, hạt mít ñược quan tâm và

nghiên cứu ở một số Trường Đại Học tuy không nhiều Năm 2009, tại trường Đại

Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh, Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn Thúy

Hương, Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột hạt mít bằng enzyme Termamyl

120L và AMG 300L ñể lên men rượu chưng cất [42]

Như vậy, việc sử dụng axit lactic hiện nay ở nước ta rất nhiều, trong khi ñó

liệu khác nhau ñể có thể lên men axit lactic thì khá phong phú như rỉ ñường, ñường

củ cải, nước mía, các phế phẩm công nghiệp khác…Nhưng nghiên cứu lên men thu nhận axit lactic từ tinh bột hạt mít thì chưa ñược các nhà khoa học quan tâm, hạt mít lại là một nguồn phế phẩm trong công nghệ sản xuất các sản phẩm thực phẩm

từ quả mít, chính vì vậy mà chúng tôi ñã mạnh dạn ñề cập ñến việc nghiên cứu lên men axit lactic từ tinh bột hạt mít

1.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến tổng hợp axit lactic từ vi sinh vật

1.6.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng

1.6.1.1 Nguồn cacbon

Nguồn cacbon có ý nghĩa hàng ñầu trong sự sống sinh vật, thức ăn chủ yếu cùa vi sinh vật hyñrocacbon Trao ñổi, chuyển hóa hyñrocacbon ñáp ứng ba nhu cầu của tế bào: sản sinh ra năng lượng, tạo ra những tiền chất, tạo ra các quá trình oxy hóa-khử ñể biến ñổi những tiền chất thành các sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối cùng dùng ñể xây dựng tế bào, ñồng thời tích tụ trong môi trường một hoặc một vài sản phẩm sinh tổng hợp thừa [1], [3]

1.6.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nitơ là nguyên tố quan trọng trong tế bào Vi sinh vật cũng như các cơ thể sống khác ñều cần nitơ trong quá trình sống ñể xây dựng tế bào Chúng góp phần tạo nên nhóm amin (_NH2) và nhóm imin (_NH_) trong các phân tử axit amin cấu tạo nên protein, các vòng purine và pyrimidine, trong nhiều vitamin và trong một số hợp chất khác có trong nguyên sinh chất của tế bào Việc chọn nguồn nitơ là rất cần thiết ñể ñảm bảo ñược hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế [1], [3]

1.6.1.3 Ảnh hưởng của photphat vô cơ

Tất cả các hoạt ñộng của tế bào ñều cần năng lượng, nguồn năng lượng ñược tích trữ chủ yếu ở các liên kết cao năng với gốc phosphat Vì thế các gốc này có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học ở tế bào [1], [3]

1.6.1.4 Ảnh hưởng của nguồn muối khoáng

Môi trường tổng hợp ñòi hỏi phải bổ sung các nguyên tố khoáng cần thiết

Nhu cầu của các nhóm vi sinh vật khác nhau thì khác nhau về nguyên tố khoáng

hoặc nguyên tố vi lượng Nguyên tố vi lượng ñóng vai trò rất quan trọng vì chúng

có chức năng giúp cho một số enzyme hoạt ñộng trong quá trình trao ñổi chất của tế bào

Nếu trong môi trường thiếu một số nguyên tố vi lượng vi sinh vật sẽ không

phát triển bình thường, dễ dẫn ñến chết tế bào hoặc có sự phát triển bất thường [1],

[3], [4]

1.6.2 Ảnh hưởng của ñiều kiện nuôi cấy

Sinh trưởng và trao ñổi chất của chúng nghiên cứu liên quan chặt chẽ ñến

hàng loạt các yếu tố khác nhau, tác ñộng qua lại với nhau và với môi trường bên

ngoài Ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài thường thể hiện dưới dạng thích hợp

hay không thích hợp cho hoạt ñộng của tế bào và các enzyme trong chuỗi trao ñổi

chất [1], [3]

1.6.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ

Hoạt ñộng trao ñổi chất của vi sinh vật có thể coi là kết quả của các phản

ứng hóa học Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt ñộ nên yếu tố nhiệt

ñộ rõ ràng ảnh hưởng sâu sắc ñến các quá trình sống của tế bào Tế bào thu ñược

nhiệt chủ yếu từ môi trường bên ngoài, một phần cũng do cơ thể thải ra, do kết quả

của hoạt ñộng trao ñổi chất Vấn ñề ñáng lưu ý là cùng một loài vi sinh vật, tùy

theo quá trình sinh lý khác nhau mà ñòi hỏi những nhiệt tối thích khác nhau

Hầu hết tế bào sinh dưỡng bị ức chế ở nhiệt ñộ cao do protein bị biến tính,

một hoặc hàng loạt enzyme bị mất bất hoạt, ngược lại ở nhiệt ñộ thấp có thể làm

bất hoạt quá trình vận chuyển các chất qua màng tế bào do ảnh hưởng ñến cấu hình của

enzyme [1], [3]

1.6.2.2 Ảnh hưởng của pH

Vi sinh vật sống và phát triển trong các môi trường lỏng chịu ảnh hưởng trực

tiếp hoặc gián tiếp của các ion H+ và OH- do các phân tử nước phân ly ra Trong

các dung dịch thường xuyên có ion H+ tự do Nồng ñộ H+ trong môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng lớn ñến sự trao ñổi chất và phát triển của vi sinh vật

pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn ñến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp của vi sinh vật Sự ảnh hưởng của pH ñến vi sinh vật một cách không giống nhau Có những pH mà ở ñó vi sinh vật vẫn phát triển bình thường, nhưng các sản phẩm tạo thành ít hoặc hoàn toàn không tạo thành [1], [3], [4]

tùy theo giống loài và từng khu vực)

Hạt mít ñược coi là phế phụ phẩm trong quả mít, hạt mít chiếm khoảng 10 – 15% tổng khối lượng của trái mít. Hình 1.10 Hạt mít [45]

Hạt mít ñược chứa bên trong múi mít và ñược bao bọc trong một lớp vỏ mỏng

màu trắng Hạt mít tươi thường có màu nâu sáng cho ñến nâu, có hình bầu dục hoặc

hình tròn

Chiều dài hạt khoảng 2 – 3 cm (0.8 – 1.2 inch), ñường kính khoảng 1.0 –

1.5cm (0.4 – 0.6 inch) Trung bình trong một quả mít có 100 – 500 hạt Hạt mít có

thể bảo quản trong thời gian một tháng nếu ñược bảo quản trong ñiều kiện lạnh và

Amylose của tinh bột

Protein của tinh bột

pH

Khả năng hấp thụ nước

Khả năng hấp thụ dầu

7.70 ± 0.20 11.02 ± 0.46 1.01 ± 0.12 2.36 ± 0.04 3.97 ± 0.04 81.64

8.57 ± 0.25 11.17 ± 0.21 0.99 ± 0.08 1.67 ± 0.11 3.92 ± 0.03 82.25 77.76 ± 0.96 32.05 ± 1.20 1.84 5.68

205 92.6

5.1 17.2 2.2 3.06 3.6

1.7.2 Tinh bột hạt mít

Từ bảng 1.2, tôi thấy hàm lượng tinh bột trong hạt mít ñạt tới 77.76 ±0.96%

so với tổng số hàm lượng chất khô có trong hạt Dưới kính hiển vi ñiện tử quét

(SEM), và kính hiển vi quang dưới ánh sáng bình thường cho thấy các hạt tinh bột

có hình tròn và hình vuông là chiếm ưu thế (hình 1.11) [19]

Hình 1.11 Hình chụp cấu hình phân tử tinh bột hạt mít [19]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Hạt mít

Hạt mít ñược thu mua tại một số cơ sở bóc múi mít cung cấp cho Công ty

Vianamit - tại thị xã Buôn Hồ, huyện Krôngbuk, tỉnh Daklak

2.1.2 Enzyme thủy phân

Tinh bột hạt mít ñược thủy phân bởi 2 loại chế phẩm enzyme: α-amylaza và

γ-amylaza Chế phẩm enzyme α-amylaza do hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất

Còn chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất Chế

phẩm α-amylaza có dạng lỏng màu nâu ñậm, không có mùi, nhiệt ñộ tối thích từ 90

÷105o

C, pH tối thích từ 4,5÷5 Chế phẩm enzyme γ-amylaza cũng có dạng lỏng, màu

nâu ñen, có mùi hắt khó chịu, pHopt=3,5 – 5, topt= 50 – 60oC

2.1.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactobacillus casei ñược lấy từ công ty Nanogen Biopharma, thành

phố Hồ Chí Minh Chủng ở dạng ñông khô nên cần phải hoạt hoá lại trước khi sử

dụng Chúng tôi bảo quản chủng vi khuẩn này ở ñiều kiện 0-5o

C trong suốt thời gian nghiên cứu

2.1.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất trong quá trình nghiên cứu

Thiết bị:

- Tủ sấy: dùng ñể sấy nguyên liệu và dụng cụ

- Máy so màu

Hình 2.1 Máy so màu hiệu JENWAY 6305 Hình 2.2 Tủ sấy nguyên liệu

- Một số thiết bị thông dụng khác như: Tủ cấy Laminar; Nồi hấp thanh trùng Hirayama HVE-50; Cân ñiện tử Excell; Tủ ấm Memmert; Máy lắc Edmund Buhler Gmbtt… (phụ lục 2.1)

- Dụng cụ, vật liệu dùng trong thực nghiệm (phụ lục 2.2)

Hóa chất: Sử dụng các hóa chất trong phòng thí nghiệm Trường Đại học

Bách Khoa Đà Nẵng và một số hóa chất liên quan mua tại Đà Nẵng và TP Hồ Chí Minh (phụ luc 1.1 và 1.2)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hóa học

2.2.1.1 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột theo phương pháp thủy phân nhờ axit [6]

Nguyên tắc: Thủy phân tinh bột thành ñường bởi dung dịch HCl 2% ở ñiều

kiện ñun sôi trong bình cách thủy với thời gian là 2 giờ Dịch ñã thủy phân ñược làm nguội và trung hòa bằng NaOH với chỉ thị metyl da cam Hàm lượng ñường trong dung dịch ñược xác ñịnh theo các phương pháp Graxianop (ñược trình bày ở

mục 2.2.1.2 bên dưới) Từ hàm lượng ñường ñịnh lượng ñược, áp dụng công thức

ñể xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít, xem phụ lục 3.1 và 3.2

2.2.1.2 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp Graxianop [6]

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng

2K3Fe(CN)6 + 2KOH 2K4Fe(CN)6 +H2O + O Tiếp theo oxi hóa ñường ñể tạo thành axit ñường CH2CH(CHOH)4 + O COOH(CHOH)4COOH Phản ứng tổng quát là:

4K3Fe(CN)6 + 4KOH + CH2CH(CHOH)6CHO 4K4Fe(CN)6+ COOH(CHOH)4COOH + 2H2O

2.2.1.3 Xác ñịnh hàm lượng axit lactic bằng phương pháp hóa học [12]

ñến khi tan hoàn toàn Lọc và bảo quản trong chai nút kín

- Dung dịch para oxydiphenyl 0,75%

+ Para oxydiphenyl 0,75gam

+ NaOH 2% vừa ñủ 100ml

Cách tiến hành và tính toán theo phụ lục 3.5

2.2.1.4 Xác ñịnh hàm lượng ñường khử bằng phương pháp so màu sử dụng acid

dinitro salicylic (DNS) [6]

Mục ñích: Nhằm kiểm tra và ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân

ñể thuận lợi cho quá trình lên men

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng tạo màu giữa ñường khử với thuốc thử axit

dinitrosalicylic DNS Cường ñộ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng ñộ

dịch ñường khử trong phạm vi nhất ñịnh Dựa trên ñồ thị ñường chuẩn ñối với

glucoza tinh khiết tính ñược hàm lượng ñường khử trong mẫu phân tích

Phương pháp tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.6

2.2.1.5 Xác ñịnh hoạt lực của α- amilaza theo Rukhliadeva [6]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme có

trong dịch chế phẩm nghiên cứu tới các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo

cường ñộ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iot

bằng máy so màu quang ñiện sẽ tính ñược hoạt ñộ enzyme

Đơn vị hoạt ñộ enzyme α- amilaza là lượng enzyme chuyển hóa ñược một

gam tinh bột tan thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau ở 30oC trong thời gian một giờ (pH cho amilaza của malt là 4.8 – 4.9, của nấm mốc là 4.7, của vi khuẩn là 6.0…)

Cách tiến hành xem phụ lục 3.3

2.2.1.6 Xác ñịnh hoạt lực của γ-amilaza theo phương pháp vi lượng của V.Y.Rodzevich, O.P.Korenbiakina [6]

Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme

γ-amilaza có trong chế phẩm nghiên cứu Xác ñịnh lượng glucoza tạo thành sẽ tính

ñược hoạt ñộ enzyme

Đơn vị hoạt ñộ γ-amilaza là lượng enzyme tác dụng lên dung dịch tinh bột

tan pH= 4,7 ở nhiệt ñộ 30oC trong thời gian một giờ giải phóng ñược 1mg glucoza Cách tiến hành xem phụ lục 3.4

C từ 60 ñến 72giờ Cuối cùng

là xay bột ñáp ứng cho quá trình nghiên cứu sau này

Hạt mít Làm sạch và làm ráo Tách lớp vỏ cứng bên ngoài

Tách vỏ nâu Rửa sạch và làm nhỏ Sấy khô

Xay bột

2.2.2.2 Phương pháp thủy phân tinh bột hạt mít bằng chế phẩm enzyme α-amylaza

và γ-amylaza

Quá trình thủy phân tinh bột hạt mít ñược thực hiện nhờ hai loại chế phẩm

enzyme α-amylaza và γ – amylaza [42] Bột hạt mít trước lúc dịch hóa ñược hồ hóa

ở pH = 5- 5.5, nhiệt ñộ 95o

C trong bể ổn nhiệt Trong quá trình dịch hóa bằng chế

phẩm enzyme α-amylaza, tinh bột hạt mít ñược chuyển hóa thành maltoza, một ít

ñường glucoza và chủ yếu là các dextrin Sau ñó chúng tôi tiến hành ñường hóa bởi

chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể cuối cùng thu nhận sản phẩm là dịch ñường ñáp

ứng cho quá trình lên men lactic

Trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và thừa kế kết quả nghiên cứu của Nguyễn

Minh Hiền, Nguyễn Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42], tác giả ñã

sử dụng chế phẩm enzyme α-amylaza của hãng Novozymes - Đan Mạch sản xuất

với tỷ lệ 0,1% ñể dịch hóa tinh bột và 0,12% chế phẩm enzyme γ – amylaza cũng

do hãng này sản xuất cho quá trình ñường hóa Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử

dụng chế phẩm γ-amylaza do Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất nên tỷ

lệ chế phẩm enzyme sử dụng cần phải ñược nghiên cứu thêm Chính vì thế mà

chúng tôi ñã ñề xuất quy trình thủy phân như sau:

Bột hạt mít ñem hòa nước

Hồ hóa ở to = 95o

Ở ñây chúng tôi sẽ cố ñịnh các ñiều kiện dịch hóa bởi chế phẩm α-amylaza

và chỉ khảo sát hàm lượng chế phẩm γ – amylaza bổ sung trong quá trình ñường

hóa sao cho hiệu suất thủy phân là cao nhất

2.2.2.3 Môi trường lên men lactic [34]

Bảng 2.1 Thành phần môi trường lên men axit lactic (Fer) [34]

Sau khi phối trộn tất cả các thành phần, tiến hành hiệu chỉnh pH môi trường

bằng H2SO4 20% và NaOH 5N [34] ñể ñưa pH về giá trị cần cho quá trình lên men

Hấp tiệt trùng dịch lên men ở nhiệt ñộ 121o

C trong thời gian 20 phút

2.2.2.4 Phương pháp lên men lactic

- Giống vi khuẩn sau khi nuôi cấy ñạt yêu cầu, kiểm tra và khảo sát theo các ñiều

kiện thích hợp

- Dịch ñường sau khi xác ñịnh nồng ñộ và bổ sung một số thành phần khác

Tiến hành hấp thanh trùng ở nhiệt ñộ 121o

C trong 20 phút

- Chuyển giống từ môi trường nuôi cấy sang môi trường lên men theo tỉ lệ

xác ñịnh trong quá trình khảo sát

2.2.3 Phương pháp vi sinh vật

2.2.3.1 Phương pháp hoạt hóa vi khuẩn

Môi trường ñể nuôi cấy vi khuẩn lactobacillus casei là môi trường MRS agar

của Merck, Đức Đây là môi trường có pha chế sẵn và có thành phần như sau: [14], [29]

Bảng 2.2 Thành phần môi trường MRS Agar

Chủng vi khuẩn lactobacillus casei ở dạng ñông khô, hoạt hóa ở môi trường

trên theo các bước sau:

- Dùng que cấy lấy một lượng vừa phải chủng ñông khô cho vào lọ ñựng 10ml nước muối sinh lý ñã qua hấp tiệt trùng, khuấy tan ñều

- Chuẩn bị môi trường MRS ñã hấp tiệt trùng, ñổ ñều trên 5 ñĩa petri, làm nguội

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch khuẩn trên cho vào ñĩa petri, sau ñó dùng que trang trang ñều trên bề mặt thạch

- Nuôi cấy trong thời gian 48h, ổn ñịnh ở nhiệt ñộ 30o

C trong tủ bảo ôn

2.2.3.2 Phương pháp xác ñịnh gián tiếp số lượng tế bào bằng cách ñếm các khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch [5]

Nguyên tắc: Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho ñến khi hình

thành một khuẩn lạc có thể trông thấy ñược Đây là cơ sở của việc ñịnh lượng tế bào trên ñĩa thạch, bởi số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất ñịnh chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống ñó Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay ở phase ổn ñịnh ñều có khả năng hình thành khuẩn lạc

Vì vậy, số lượng khuẩn lạc ñếm ñược gần như tương ñương với số lượng tế bào sống

Để ñịnh lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ ñược hình thành từ một tế bào Do dịch tế bào sử dụng trong phòng thí nghiệm thường có nồng ñộ cao, thường nhiều hơn 106

tế bào/ml, nên cần thiết phải ñược pha loãng trước khi cấy Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng ñể giảm nồng ñộ tế bào từ 10 ñến 100 lần cho ñến khi ñạt vài nghìn tế bào/ml Cách tiến hành ñược thể hiện ở phụ lục 3.8

2.2.3.3 Phương pháp chuyển giống sang môi trường lên men

Giống phải ñược hoạt hóa trước khi lên men ñể ổn ñịnh trạng thái sinh lý, tiến hành nhân giống theo các cấp, thể tích cấp sau lớn hơn cấp trước khoảng 10 lần [1], [10] Trong lên men công nghiệp việc rút ngắn thời gian lên men là cần thiết,

do ñó môi trường nhân giống ñược thiết kế có thành phần giống môi trường lên men nhằm tạo ñiều kiện thích nghi cho chủng nghiên cứu và giảm thời gian lên men

Mật ñộ giống cấy phải ñược xác ñịnh trước khi thực hiện việc lên men thông

qua phương pháp xác ñịnh gián tiếp mật ñộ tế tào bằng cách ño OD620nm [39]

Trong qúa trình nhân giống và lên men phải theo dõi tính thuần khiết của

giống cấy, tránh tình trạng bị tạp nhiễm vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng ñến hiệu suất

lên men và làm sai lệch kết quả khảo sát

2.2.4 Phương pháp toán học

Áp dụng quy hoạch thực nghiệm ñể khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố ảnh

hưởng ñến quá trình lên men và tối ưu hóa hàm một mục tiêu hai yếu tố [2]

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát ñặc ñiểm của các nguyên liệu trong nghiên cứu

3.1.1 Bột hạt mít

3.1.1.1 Xử lí và thu nhận bột hạt mít

Theo quy trình ñã trình bày ở mục 2.2.2.1, chúng tôi ñã tiến hành xử lý và

thu nhận bột hạt mít Theo quy trình này, vỏ cứng ñược tách bằng phương pháp cơ học, còn vỏ nâu thì sử dụng NaOH Để tìm ra nồng ñộ xút thích hợp cho việc tách

vỏ nâu, chúng tôi ñã tiến hành ngâm hạt mít trong dung dịch NaOH có nồng ñộ: 1%, 2%, 3% và 4% trong khoảng thời gian từ 3 - 5 phút Kết quả khảo sát ñược trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng ñộ xút ñến quá trình tách lớp vỏ nâu ở hạt mít

1 1 Lớp vỏ nâu tách không hết, màu của hạt ñậm tối

2 2 Lớp vỏ nâu chưa tách hết triệt ñể, màu của hạt không

ñẹp, hơi vàng nâu

3 3 Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

4 4 Đã tách sạch lớp vỏ nâu của hạt, màu của hạt ñẹp, trắng

Như vậy, bắt ñầu ở nồng ñộ NaOH 3% là ñã tách hết lớp vỏ nâu, ngâm lại bằng nước lạnh và rửa sạch ñể không còn lưu lại mùi của xút Ở nồng ñộ xút càng cao thì lớp vỏ nâu cũng ñược tách sạch, tuy nhiên về mặt kinh tế sẽ không ñạt yêu cầu và mùi của xút còn lưu lại trên hạt mít ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít Vì vậy chúng tôi chọn nồng ñộ NaOH 3% ñể tách sạch lớp vỏ nâu của hạt mít Sau khi tách xong vỏ nâu, hạt mít ñược thái nhỏ, ñể ráo, sấy khô, xay thành bột ñể thuận lợi cho quá trình nghiên cứu

Nguyên liệu sau khi sấy khô, ñể kiểm tra dư lượng của NaOH còn trong hạt mít vì mùi của NaOH ảnh hưởng ñến chất lượng của bột hạt mít, chúng tôi tiến

sau ñó dùng quỳ tím và áp sát vào lát hạt mít ñồng thời nhúng vào nước ngâm Kết

quả cho thấy, giấy quỳ tím không ñổi màu Như vậy, qua thời gian ngâm rửa và

sấy, NaOH không còn lưu lại trong mẫu hạt mít

Hình 3.1 Bột hạt mít thu nhận

Bột hạt mít thu nhận ñược có màu trắng ñục, gần giống như màu của bột ngủ

cốc, có hương thơm ñặc trưng

3.1.1.2 Xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít

Chúng tôi tiến hành xác ñịnh hàm lượng tinh bột của hạt mít theo phương

pháp thủy phân bằng axit như ñã trình bày ở 2.2.1.1 Từ ñó tôi ñịnh lượng hàm

lượng ñường khử tạo thành theo phương pháp Graxianop như ñã trình bày ở mục

3.1.2 Chế phẩm enzyme

Trong quá trình thủy phân tinh bột hạt mít, chúng tôi sử dụng 2 loại chế

phẩm enzyme như ñã trình bày ở mục 2.2.2.2 Để khảo sát hiệu quả của quá trình

thủy phân cũng như ñịnh lượng ñược hàm lượng enzyme bổ sung, trước khi thủy phân tinh bột, chúng tôi xác ñịnh lại hoạt lực của chế phẩm enzyme tại thời ñiểm nghiên cứu

3.1.2.1 Xác ñịnh hoạt lực của chế phẩm enzyme α-amylaza

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm với chế phẩm enzyme ñưa về bằng cách

pha loãng 10 lần Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.1.5 và phụ lục 3.3

Chúng tôi tiến hành thực nghiệm và nhận thấy: ống chứa dung dịch kiểm chứng có màu xanh, ống chứa dung dịch thí nghiệm có màu tím

Đo cường ñộ màu của các dụng dịch ở bước sóng λ = 656nm so với nước cất, kết quả ñược trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả ño OD của dịch kiểm chứng và mẫu thí nghiệm

D D D

=

Trong ñó: D1 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch kiểm chứng

D2 là mật ñộ quang ño ñược của dung dịch thí nghiệm

0,1 là lượng tinh bột ñem phân tích, gam

C: là lượng tinh bột ñược thủy phân

Vậy hoạt lực của chế phẩm enzyme α-amylaza ñược tính như sau:

Cứ 5ml enzyme thủy phân ñược 0,051g bột trong 10phút

Kết luận: Từ kết quả trên, trong suốt quá trình nghiên cứu, cứ theo ñịnh kỳ

chúng tôi kiểm tra lại hoạt lực của chế phẩm enzyme này ñể thuận lợi cho việc

khảo sát hàm lượng enzyme bổ sung khi thủy phân

3.1.2.2 Xác ñịnh hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza

Hoạt lực của chế phẩm enzyme γ – amylaza ñược xác ñịnh theo phương

pháp ñã trình bày ở mục 2.2.1.6 và phụ lục 3.4 Chúng tôi tiến hành thực nghiệm và

sau thực nghiệm, chúng tôi có ñược kết quả như sau:

Hoạt lực của enzyme tính bằng “ñơn vị/ml” ñược xác ñịnh như sau:

10603,3

HdG

a = a2 – a1

* Ở mức pha loãng 10 lần:

105,0

603,31)6,03,4(

Kết luận: Cũng tương tự như chế phẩm enzyme α-amylaza, chúng tôi xác

ñịnh ñược hoạt lực của chế phẩm γ – amylaza với mục ñích thuận lợi cho suốt quá

thể bị giảm, nếu vậy chúng tôi thay chế phẩm mới sản xuất khác hoặc tăng hàm lượng chế phẩm enzyme bổ sung khi thủy phân

3.1.3 Vi khuẩn lên men lactic

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vi khuẩn lactobacillus casei

Chủng này ñang ở dạng ñông khô nên chúng tôi tiến hành hoạt hóa chủng Sau khi hoạt hóa, vi khuẩn có dạng như hình 3.2, sau ñó chúng tôi chọn những ñốm khuẩn

có màu trắng sữa, tròn ñều và nhân giống các cấp theo thời gian, bảo quản ở nhiệt

ñộ thấp ñể phục vụ cho nghiên cứu

Hình 3.2 Vi khuẩn L.casei sau khi hoạt hóa

3.2 Nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột

Theo quy trình ñề xuất ở mục 2.2.2.2, chúng tôi cân 30 gam bột hạt mít hòa

trong 100ml nước, khuấy ñều và ñun cách thủy ở nhiệt ñộ sôi, thời gian 45 phút nhằm hồ hóa hoàn toàn lượng bột có trong dịch bột Để dịch hóa, chúng tôi ñiều

chỉnh pH về 5,5 – 6, ñồng thời bổ sung chế phẩm α-amylaza với tỷ lệ 0,1% so với

lượng bột có trong dịch bột, hạ nhiệt ñộ xuống ñến 95o

C và giữ trong bể ổn nhiệt

120 phút Sau khi kết thúc quá trình dịch hóa, ñưa nhiệt ñộ xuống 60oC và ñiều

chỉnh pH = 4,25, bổ sung chế phẩm γ – amylaza với các tỷ lệ khác nhau: 0,12%;

0,14%; 0,16%; 0,18% và 0,20% Giữ ở bể ổn nhiệt trong thời gian 175 -180 phút Sau quá trình thủy phân thì lọc lấy dịch ñường và ñịnh lượng hàm lượng ñường khử

tạo thành Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng hai loại chế phẩm enzyme

α-amylaza và γ – α-amylaza ñể thủy phân tinh bột hạt mít Nhưng chế phẩm enzyme α-amylaza tại thời ñiểm nghiên cứu có nguồn gốc sản xuất từ hãng Novozyme,

hoàn toàn giống với chế phẩm enzyme của tác giả Nguyễn Minh Hiền, Nguyễn

Thúy Hương (Trường ĐH Bách khoa TP.HCM) [42] mà chúng tôi tham khảo và

thừa hưởng nên chúng tôi không khảo sát tỷ lệ chế phẩm enzyme này bổ sung vào

ñể dịch hóa là bao nhiêu Hơn nữa, chế phẩm γ – amylaza chúng tôi sử dụng do

Genencor Bio-products Co.Ltd, China sản xuất, không cùng nguồn gốc xuất xứ của

chế phẩm enzyme γ – amylaza như trong tài liệu [42] nên chúng tôi tiến hành khảo

sát lượng chế phẩm enzyme γ – amylaza bổ sung ñể ñường hóa tinh bột hạt mít

Sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột hạt mít là dịch ñường khử Để

ñịnh lượng hàm lượng ñường khử tạo thành chúng tôi sử dụng phương pháp DNS

như ñã trình bày ở mục 2.2.1.4 và phụ lục 3.6 Trong phương pháp này, chúng tôi

tiến hành xây dựng ñường chuẩn ñường glucose

3.2.1 Xây dựng ñường chuẩn ñường glucose

Với nguyên tắc cơ bản ñã trình bày ở mục 2.2.1.4, chúng tôi tiến hành ño

OD ở các mức nồng ñộ dịch ñường chuẩn (ñường glucose chuẩn) khác nhau nhằm

xây dựng ñược ñường chuẩn và thể hiện ở hình 3.3

Hình 3.3 Đường chuẩn glucoza

Từ ñồ thị ñường chuẩn, chúng tôi xác ñịnh hàm lượng ñường khử tạo thành

ở các mức bổ sung chế phẩm enzyme γ – amylaza khác nhau như trình bày ở trên

Mục ñích là ñể tìm ra hàm lượng chế phẩm γ – amylaza thích hợp cho quá trình

ñường hoá sao cho sau khi kết thúc quá trình thủy phân thì lượng ñường khử tạo

thành là cao nhất

Tương tự như vậy, trong các lần lên men sau này, chúng tôi thực hiện xây dựng ñường chuẩn và từ ñó ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường sau thủy phân ñể thích hợp cho từng mẻ lên men khác nhau

3.2.2 Khảo sát hàm lượng chế phẩm γ – amylaza cần dùng

Dịch ñường sau thủy phân, chúng tôi tiến hành pha loãng 100 lần và ño OD

Dựa vào ñồ thị ñường chuẩn ở mục 3.3, kết quả ñược thể hiện ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Hàm lượng ñường khử tạo thành sau quá trình thủy phân

enzyme γ – amylaza bổ sung càng tăng thì lượng dịch ñường tạo thành càng cao

Khi hàm lượng enzyme là 0,18% dịch bột thì lượng ñường tạo thành là cao nhất, ñồng thời hiệu suất thủy phân ñạt ñược cũng cao nhất (ñồ thị ở phụ lục 5.1) Nếu tiếp tục tăng hàm lượng enzyme bổ sung, vì có sự cạnh tranh giữa enzyme và cơ chất nên lúc này hàm lượng ñường tạo thành giảm dần Chính vì vậy, những nghiên

cứu tiếp theo tôi thủy phân tinh bột bởi 0,1% chế phẩm enzyme α-amylaza và 0,18% chế phẩm enzyme γ – amylaza ñể tạo dịch ñường cho quá trình lên men lactic

Nhận xét: Từ kết quả thực nghiệm thu ñược, chúng tôi thấy dưới sự xúc tác của hai loại chế phẩm enzyme trên, tinh bột của hạt mít ñược thủy phân khá triệt ñể

Hình 3.4 Dịch ñường sau thủy phân

Dịch sau thủy phân tiến hành lọc trên giấy lọc nhiều lần Hàm lượng ñường

thu ñược sau thủy phân ñủ ñiều kiện cho quá trình lên men lactic

Từ kết quả thu ñược, chúng tôi ñiều chỉnh nồng ñộ dịch ñường theo các mức

khác nhau ñể lên men

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến qúa trình lên men lactic

Trong quá trình lên men lactic, dưới sự hoạt ñộng của vi khuẩn lactobacillus

casei, chịu sự ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt ñộ, nồng ñộ dịch ñường, hàm

lượng vi khuẩn bổ sung, thời gian lên men…dịch ñường bị chuyển hóa và sản phẩm

tạo thành cuối cùng chủ yếu là axit lactic, ngoài ra có một số sản phẩm phụ khác

như ethanol, axit acetic, CO2, aceton

Chúng tôi tiến hành thực hiện quá trình lên men với các ñiều kiện và yếu tố

khảo sát khác nhau Trước khi khảo sát quá trình lên men, chúng tôi chọn phương

pháp so màu sử dụng axit dinitrosalycilic (DNS), ñược trình bày ở mục 2.2.1.4 và

mục 3.2 ñể xác ñịnh và ñiều chỉnh nồng ñộ của dịch ñường chuẩn bị lên men Đồng

thời với quá trình trên, chúng tôi chuẩn bị trước dịch vi khuẩn ñể khảo sát ñộng thái

sinh trưởng và phát triển của loại vi khuẩn này nhằm thuận lợi cho quá trình lên

men và rút ngắn thời gian lên men

Dịch ñường sau khi ñã ñiều chỉnh về nồng ñộ khảo sát, chúng tôi tíến hành

bổ sung thành phần dinh dưỡng như ñã trình bày ở mục 2.2.2.3 Tiếp ñến là hấp

thanh trùng môi trường và lên men

Hình 3.5 Dịch ñường ñã khảo sát nồng ñộ trước lúc lên men

3.3.1 Khảo sát khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactobacillus casei

Dựa vào nguyên tắc ñã trình bày ở mục 2.2.3.2 và phụ lục 3.8, chúng tôi

tiến hành thực nghiệm như sau:

- Cho 100ml dịch ñường có nồng ñộ 5% vào bình tam giác có dung tích 250ml

- Bổ sung thành phần môi trường lên men vào dịch ñường trên như ñã trình

bày ở mục 2.2.2.3

- Hấp thanh trùng môi trường ở nhiệt ñộ 121o

C trong thời gian 20 phút

- Làm nguội môi trường và tiến hành cấy vi khuẩn lactibacillus casei trong

ñiều kiện vô trùng

- Nuôi ở nhiệt ñộ 37o

C trong 24 giờ

- Pha loãng môi trường trên trong nước cất ñã hấp vô trùng bằng cách sử dụng 7 ống nghiệm, mỗi ống chứa 9ml nước cất vô khuẩn và một số ống hút 1ml ñã hấp tiệt khuẩn Mức ñộ pha loãng khác nhau như sau:

+ Hút 1ml mẫu dịch vi khuẩn trên cho vào ống nghiệm thứ nhất chứa 9ml nước cất, khuấy ñều Ta có mức ñộ pha loãng lúc này là 10-1

lần + Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm thứ nhất cho vào ống nghiệm thứ hai chứa 9ml nước cất vô khuẩn Trộn ñều và ta ñược ñộ pha loãng là 10-2

+ Tiếp tục chúng tôi làm tương tự và có các mức ñộ pha loãng khác nhau như sau: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7

Ở mỗi ñộ pha loãng phải khuấy ñều và lắc kỹ Tương ứng với mỗi ñộ pha

+ Dùng hộp petri ñã vô khuẩn chưa có môi trường Chuẩn bị môi trường

MRS như ñã trình bày ở mục 2.2.3.1, hấp thanh trùng ở nhiệt ñộ 121oC trong thời

gian 20 phút, ñể nguội ñến 50 -55o

C

+ Dùng pipet vô khuẩn hút 1 ml canh trường trên, hé mở hộp petri rồi cho

vào, ñậy nắp lại ñồng thời xoay nhẹ hộp trên bàn phẳng ñể chúng dàn trải ñều ở ñáy hộp

+ Hé mở nắp hộp, nhanh tay ñổ thạch vào, ñậy nắp và xoay nhẹ hộp trên bàn

cho thạch và vật gieo cấy ñược trộn ñều, dàn thành một lớp trên ñáy hộp

+ Để thạch ñặc lại, lật ngược hộp petri, dán nhãn lên các hộp tương ứng với

từng ñộ pha loãng, gói giấy báo và ñặt vào tủ ấm có nhiệt ñộ 30oC, cứ mỗi ñộ pha

loãng chuẩn bị 3 hộp petri Thao tác phải thật nhanh và ñược thực hiện trong môi

trường vô trùng

Sau 2 ngày, lấy các hộp ra quan sát nếu thấy trên bề mặt thạch xuất hiện các

khuẩn lạc, bề mặt khô, nhẵn bóng, có màu trắng sữa thì ñó là dấu hiệu của những

khuẩn lạc vi khuẩn Mỗi khuẩn lạc là tập hợp tế bào ñược phát triển từ một tế bào

ñơn Đếm và xác ñịnh số lượng khuẩn lạc ở mỗi mức ñộ pha loãng khác nhau Kết

quả ñược tính theo phụ lục 3.8

Ở mức ñộ pha loãng10-3 lần trên 3 ñĩa petri theo thứ tự từng ñĩa là: 48, 53 và

Hình 3.6 Các khuẩn lạc Lactobacillus casei ở các mức pha loãng 10-3

Đồng thời với việc hút và cấy canh trường vào môi trường MRS Chúng tôi tiến hành ño OD ở bước sóng 620nm của từng mật ñộ pha loãng khác nhau Kết quả của việc ño OD tương ứng với số lượng khuẩn lạc ñếm ñược ở mỗi mức ñộ pha loãng khác nhau, chúng tôi xác ñịnh ñược số lượng khuẩn lạc ở mỗi

OD ñể thuận lợi cho các lần lên men sau này

Hình 3.7 Đường cong biểu diễn mật ñộ tế bào ở các mức pha loãng khác nhau

Từ ñường cong trên, chúng tôi suy luận ñược lượng khuẩn lạc có trong dịch khuẩn chuẩn bị ñể cân ñối lượng vi khuẩn cho từng mẽ lên men trong nghiên cứu

Ở ñây chúng tôi thấy ở bước sóng 620nm thì OD = 0,173, tương ứng với mức ñộ pha loãng 10-3

lần, số lượng vi khuẩn ñếm ñược là 51.103

tế bào/ml

Pha loãng 10-3

3.3.2 Quá trình lên men và xử lí sau lên men

Dịch ñường sau khi lọc và xác ñịnh nồng ñộ dịch ñường theo mục 3.2.1

Dịch vi khuẩn chuẩn bị như trình bày ở phần 3.3 Trước khi lên men, dịch vi khuẩn

này ñã ñược nuôi trong 24 giờ, tiến hành ño OD ở bước sóng 620nm và dựa vào kết

quả OD ño ñược, từ ñường cong biểu diễn mật ñộ tế bào hình 3.7, chúng tôi ước

lượng hàm lượng vi khuẩn có trong dịch khuẩn ñể ñiều chỉnh cho quá tình lên men

Hình 3.8 Dịch ñường ñã chuẩn bị trước lúc lên men

Ở nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các bình tam giác nhỏ ñể lên men Ở

mỗi bình tam giác, chúng tôi lấy chính xác một lượng dịch ñường ñã ñiều chỉnh

nồng ñộ, bổ sung thành phần dinh dưỡng cần thiết cho môi trường như mục 2.2.2.3

ñã trình bày Sau ñó hấp thanh trùng ở 121oC trong 20 phút và tiến hành lên men

theo như quy trình sau:

Bổ sung thành phần dinh dưỡng Bổ sung thành phần dinh dưỡng và cấy vi khuẩn

CaCO3 Lên men Nuôi trong 24 giờ

Dịch sau lên men

Xử lý

Axit lactic ở dạng thô

Trong suốt thời gian lên men, nhằm tăng sự tiếp xúc giữa môi trường và vi khuẩn, chúng tôi bố trí lên men bằng cách ñặt các bình tam giác trên máy lắc IKA-VIBRAX-VXR (hình 3.9), mẫu ñược ñặt trong tủ bảo ôn nhằm ñiều chỉnh dễ dàng nhiệt ñộ lên men Dịch sau lên men theo các ñiều kiện khảo sát khác nhau Axit lactic tạo thành làm cho pH của dịch lên men chuyển dần về axit mạnh Trong quá trình lên men, ñể trung hòa lượng axit tạo thành, cứ 3 ÷ 4 lần/ngày ñêm chúng tôi

bổ sung CaCO3 dạng bột Lúc này lượng axit lactic tạo thành sẽ kết hợp với CaCO3 như sau:

2CH3-CHOH-COOH + CaCO3 = Ca(CH3CHOHCOO)2 + CO2 + H2O Kết thúc quá trình lên men, nâng nhiệt ñộ của dịch sau lên men ñến nhiệt ñộ

80 – 90o

C, bổ sung CaCO3 và ñưa pH của dịch lên bằng 10 – 11, giữ yên ở nhiệt

ñộ này từ 3 - 5 giờ (có thể lâu hơn) [7] Trong khoảng thời gian này các chất lắng

và sinh khối vi sinh vật sẽ lắng xuống ñáy Lọc dịch nhiều lần và thu lấy dịch trong, ñồng thời loại bỏ các tế bào chết và lượng CaCO3 thừa Sau ñó tiến hành ñun nóng dịch ñến nhiệt ñộ 60 -70oC, bổ sung H2SO4 nhằm tạo kết tủa CaSO4 Loại bỏ kết tủa thu ñược lượng axit lactic dạng thô Định lượng ñược lượng axit lactic tạo thành

Hình 3.9 Quá trình lên men lactic

Như vậy trong quá trình lên men, chúng tôi nhận thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng lên men cũng như hàm lượng axit lactic tạo thành Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu và khảo sát một số yếu tố sau nhằm ở các ñiều kiện nhất ñịnh, chúng tôi thu ñược hàm lượng axit lactic là cao nhất

3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên men

Kiểm soát mật ñộ tế bào trước khi thực hiện cấy giống cho quá trình lên

men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị

OD620nm ≈ 0,173 (sau khi pha loãng 10-3 lần)

Tiến hành lên men trong cùng một chế ñộ lắc như nhau Nồng ñộ dịch

ñường ban ñầu là 4%, pH = 6, hàm lượng giống là 5% [1], [10], trong thời gian là

72 giờ Lên men ñược tiến hành ở các nhiệt ñộ khác nhau từ 35 – 40oC Ảnh hưởng

của nhiệt ñộ lên men thông qua hàm lượng axit lactic tạo thành Lượng axit lactic

tạo thành ñược tính như cách tính ñược trình bày ở phụ lục 3.6 Kết quả ñược biểu

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

Vì các phản ứng này phụ thuộc chặt chẽ vào nhiệt ñộ nên yếu tố nhiệt ñộ rõ

ràng ảnh hưởng sâu sắc ñến quá trình sinh trưởng và tổng hợp axit lactic của tế bào

Vấn ñề này thể hiện rất rõ ở ñồ thị trên, ở nhiệt ñộ thích hợp thì sinh khối tăng kéo

theo lượng axit lactic tăng

Khi nhiệt ñộ thấp hoặc cao ñều ảnh hưởng ñến các hoạt ñộng của vi khuẩn dẫn ñến hiệu quả thu hồi kém, ngược lại khi nhiệt ñộ ñạt ñiểm thích hợp thì sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn là cao nhất, do ñó kết quả là hàm lượng axit lactic tạo thành là nhiều nhất

Từ ñây chúng tôi kết luận rằng: với ñiều kiện nhiệt ñộ thích hợp trong nuôi cấy và lên men tạo axit lactic là 37o

C

3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ giống vi khuẩn lên men

Kiểm soát mật ñộ tế bào trước khi thực hiện cấy giống cho quá trình lên men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị OD620nm ≈ 0,173 (sau khi pha loãng 10-3 lần)

Cố ñịnh nồng ñộ dịch ñường 4%, nhiệt ñộ là 370

C, pH = 6, chế ñộ lắc như khảo sát trên Tiến hành bố trí nhiều thí nghiệm với các tỷ lệ giống ban ñầu khác nhau theo tỉ lệ thể tích nuôi cấy Kết quả ñược thể hiện ở phụ lục 4.2 và hình 3.11

14 14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5

Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống ñến lượng axit lactic tạo thành

Nhận xét: Kết qủa thể hiện ở ñồ thị cho thấy lượng giống ban ñầu thích hợp nhất cho việc lên men tạo axit lactic là 5% v/v Sinh trưởng và phát triển là thuộc

tính cơ sở của sinh vật Sự sinh tổng hợp axit lactic của lactobacillus casei cao hay

ít Tỷ lệ giống ban ñầu thích hợp sẽ giúp cho quá trình lên men và sinh tổng hợp

axit lactic tốt Điều này cho thấy lượng giống ban ñầu cho quá trình lên men là rất

quan trọng, nó góp phần quyết ñịnh hiệu suất lên men

Nếu lượng giống ban ñầu môi trường khá cao, quần thể tế bào sẽ sớm rơi

vào pha ổn ñịnh, lúc này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng ñộng học và như

vậy tốc ñộ sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp axit lactic sẽ giảm

Còn nếu lượng giống ban ñầu quá thấp so với lượng cơ chất có trong môi

trường lên men thì quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp axit lactic sẽ

kéo dài thời gian lên men hoặc tạo ra một số sản phẩm phụ không mong muốn như

rượu etylic, axit bay hơi và không kinh tế cho việc lên men ở quy mô công nghiệp

3.3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường

Kiểm soát mật ñộ tế bào trước khi thực hiện cấy giống cho quá trình lên

men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị

OD620nm ≈ 0,173 (sau khi pha loãng 10-3

lần)

Môi trường lên men là Fer, trong ñó nguồn cacbon chính là dịch ñường sau

khi thủy phân tinh bột hạt mít và ñược bố trí thành nhiều phần với nồng ñộ dịch

ñường là khác nhau như bảng 4.3, phụ lục 4.3 Nuôi cấy ở nhiệt ñộ là 37oC, pH như

khảo sát ban ñầu, hàm lượng giống là 5%, trong ñiều kiện lắc như ñã khảo sát ở

trên Sau 72 giờ lên men, xác ñịnh hàm lượng axit lactic tạo thành như biểu diễn ở

ñồ thị hình 3.12 bên dưới

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng ñộ dịch ñường ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

Nguồn cacbon cần cho sự sinh trưởng và lên men của chủng nghiên cứu là không thể thiếu, ở nghiên cứu này dịch thủy phân ñược xem là nguồn cacbon chính cho quá trình lên men thu nhận axit lactic

Thông qua ñồ thị trên cho thấy hàm lượng ñường trong dịch ñường thích hợp cho việc tạo axit lactic cao nhất ở nồng ñộ ñường là 5% (g/100ml) Thực tế cho thấy một trong những thành phần chủ chốt của môi trường trong quá trình lên men

là gluxit Gluxit không những là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng cần thiết ñể sinh tổng hợp các cấu tử của tế bào Trong ñiều kiện thí nghiệm, nguồn gluxit ñược cho vào dưới dạng chủ yếu ñường ñơn khử Hàm lượng ñường này nếu ñược ñưa vào môi trường nuôi cấy với một lượng thích hợp thì sẽ giúp chủng nghiên cứu sinh trưởng và sinh tổng hợp tốt Ngược lại, lượng ñường thấp thì không ñủ nguồn cacbon cung cấp cho vi sinh vật phát triển hoặc lượng ñường quá cao sẽ tạo một áp lực thẩm thấu ra môi trường và làm ảnh hưởng ñến trạng thái sinh lý của tế bào dẫn ñến hiệu suất của quá trình không cao Nếu xét về hiệu suất lên men ta thấy, ứng với mỗi nồng ñộ dịch ñường khác nhau thì có một khối lượng riêng nhất ñịnh Chúng tôi tính hiệu suất lên men và kết quả ñược thể hiện ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Hiệu suất lên men theo nồng ñộ dịch ñường STT Nồng ñộ dịch

ñường, %

Khối lượng riêng ρ, kg/m 3

Lượng axit lactic tạo thành, gam/lít

Hiệu suất lên men, %

Với cách tính hiệu suất lên men ñược trình bày ở phụ lục 5.3

Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy, ở nồng ñộ dịch ñường 3% thì hiệu suất

khá cao nhưng hàm lượng axit lactic tạo thành không nhiều bằng ở nồng ñộ dịch

ñường là 5% Hơn nữa, với hiệu suất lên men chỉ ñạt 35,82% tuy thấp hơn so với ở

nồng ñộ dịch ñường 2%, 3% và 4% nhưng sự chênh lệch về các nồng ñộ này không

lớn lắm Chính vì thế mà chúng tôi chọn lên men ở nồng ñộ dịch ñường 5% ñể thu

ñược hàm lượng axit lactic là cao nhất

3.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men

Kiểm soát mật ñộ tế bào trước khi thực hiện cấy giống cho quá trình lên

men Dịch nuôi cấy từ bình nhân giống cấp sang bình lên men phải ñạt giá trị

OD620nm ≈ 0,173 (sau khi pha loãng 10-3 lần)

Quá trình lên men ñược thực hiện ở nhiệt ñộ, pH, nồng ñộ dịch ñường và tỷ

lệ giống thích hợp như ñã khảo sát ở các thí nghiệm trên Lấy mẫu theo những

khoảng thời gian nhất ñịnh là 8 giờ, xác ñịnh khả năng sinh tổng hợp axit lactic của

chủng khảo sát tại những thời ñiểm thời gian xác ñịnh ñó Kết qủa thu ñược thể

hiện ở bảng 4.4 phụ lục 4.4 và ñồ thị hình 3.13

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thời gian lên men ñến hàm lượng axit lactic tạo thành

Chúng tôi ñã xác ñịnh với khoảng thời gian 72 giờ thì lượng axit lactic sinh

ra là cao nhất Vi khuẩn lactobacillus casei khi ñược ñưa vào môi trường, chúng sử

dụng ngay những dưỡng chất ñể sinh trưởng và diễn ra qua 4 giai ñoạn thích nghi,

giống trên môi trường có thành phần giống thành phần môi trường lên men Quá trình phát triển tạo sinh khối nhiều ñồng thời cũng tạo ra lượng axit lactic tăng tương ứng Như vậy theo thời gian thì axit lactic tạo ra nhiều hơn ñược biểu thị qua hàm lượng axit lactic tăng dần theo thời gian Tuy nhiên, không phải thời gian càng dài thì axit lactic càng tăng mà khi quần thể ñạt bão hòa thì axit lactic sẽ giảm ñi ñáng kể do cơ chất trong môi trường giảm, và nếu môi trường không ñược ñiều chỉnh pH thì yếu tố này theo thời gian cũng sẽ kìm hãm sự phát triển và tổng hợp lactic của chúng ta nghiên cứu

Hình 3.14 Các mẫu dịch sau khi kết thúc quá trình lên men 3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ñồng thời của hai yếu tố ñến quá trình lên men lactic

Theo thực nghiệm chúng tôi thấy có nhiều yếu tố ảnh hưởng ñến quá trình lên men lactic ñể thu nhận axit lactic Nhưng ở ñây chúng tôi xét 2 yếu tố theo ñiều kiện tối ưu ñể lượng axit lactic tạo thành là cao nhất: nồng ñộ dịch ñường và thời gian lên men Do ñó, ñể có thể nâng cao hiệu suất của quá trình lên men chúng tôi phải tìm mức thích hợp nhất thông qua tối ưu hóa hai yếu tố này

3.4.1 Lập ma trận quy hoạch thực nghiệm và xác ñịnh các hệ số của phương trình

Căn cứ vào các giá trị thích hợp như ñã khảo sát ở mục 3.3.2.3 và 3.3.2.4,

chúng tôi chọn mức trên, mức dưới cho 2 yếu tố như sau:

- Các yếu tố ảnh hưởng z1 là nồng ñộ dịch ñường ban ñầu (%)