Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học củ trà hoa vàng ở thái nguyên

Mặc dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế.. Từ thực tế đó, đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học

TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016

TRÀ HOA VÀNG Ở THÁI NGUYÊN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Thảo- người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học, dìu dắt tôi từ những ngày

đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ

bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

- PGS TS Nguyễn Thị Kiều Anh – Phòng Quản lý khoa học, Trường Đại

học Dược Hà Nội, DS Phạm Thị Linh Giang và DS Nguyễn Thị Thùy

Linh, người đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, giải đáp thắc mắc, khó khăn

mà tôi gặp phải trong quá trình thực hiện khóa luận

- Các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực

nghiệm

- Ban Giám Hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo, các cán bộ nhân viên

trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong

suốt 5 năm học tại đây

- Các bạn sinh viên khóa 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài ở bộ môn Thực vật

đã giúp đỡ, động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn

khích lệ, giúp đỡ và cổ vũ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Hà Ly

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L 2

1.1 1.1.1 Vị trí phân loại của chi Camellia L 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Camellia L 2

1.1.3 Phân bố 2

1.1.4 Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 3

1.2 Thành phần hóa học 4

1.2.1 Nhóm alcaloid trong Camellia L 4

1.2.2 Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L 4

1.2.3 Nhóm tinh dầu trong Camellia L 5

1.3 Về tác dụng sinh học 6

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 6

1.3.2 Tác dụng chống ung thư 6

1.4 Một số phương pháp định lượng polyphenol 7

1.5 Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng phần mềm VideoScan 8

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

Nguyên liệu, thiết bị 9

2.1 2.1.1 Nguyên liệu 9

2.1.2 Thiết bị 9

2.1.3 Dung môi, hóa chất 9

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 10

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái 10

3.1 Kết quả nghiên cứu 23

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật 23

3.1.2 Kết quả nghiên cứu hóa học 27

3.1.3 Kết quả nghiên cứu tác dụng sinh học in vitro 35

3.2 BÀN LUẬN 36

3.2.1 Về thực vật 36

3.2.2 Về thành phần hóa học 37

3.2.3 Về tác dụng sinh học 39

KẾT LUẬN 40

ĐỀ XUẤT 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DPPH 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl

DĐVN Dược điển Việt Nam

EGCG Epigalo catechin gallat

ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay - Phương pháp hấp thụ

miễn dịch liên kết với enzyme

GC Gas Chromatography - Sắc ký khí

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng hiệu

năng cao

HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp

mỏng hiệu năng cao

IC 50 Inhibit Cellular Proliferation by 50% - Nồng độ ức chế 50% sự

phát triển của tế bào

IUCN International Union for Conservation of Nature and Natural

Resources - Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên và Tài nguyên Thiên nhiên

OD Optical Density - Mật độ quang

Rf Retention factor - Hệ số lưu giữ

RSB Sulforhodamine B

RSD Relative Standard Deviation - Độ lệch chuẩn tương đối

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TLC Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng

VQG Vườn Quốc gia

Bảng 1.1 Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam 3

Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp 10

Bảng 2.2 Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic 16

Bảng 3.1 Kết quả định tính 27

Bảng 3.2 Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ 28

Bảng 3.3 Độ hấp thụ của dãy chuẩn 29

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp trên mẫu nghiên cứu 30

Bảng 3.5 Kết quả xây dựng đường chuẩn EGCG 32

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên 33

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 34

Bảng 3.8 Kết quả bán định lượng EGCG 34

Bảng 3.9 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử 35

Bảng 3.10 Kết quả ức chế tế bào ung thư in vitro của lá Trà hoa vàng Thái Nguyên 36

Bảng 3.11 Một số đặc điểm tương đồng về hình thái của Camellia euphlebia và Trà hoa vàng Thái Nguyên 37

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần 17

Hình 3.1 Hình thái mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên 23

Hình 3.2 Vi phẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên 25

Hình 3.3 Vi phẫu thân Trà hoa vàng Thái Nguyên 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ của chuẩn EGCG và mẫu thử hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 ở ánh sáng thường 28

Hình 3.5 Hình ảnh quét phổ của dung dịch chuẩn acid gallic nồng độ 50 µg/ml 29 Hình 3.6 Đường chuẩn acid gallic 30

Hình 3.7 Kết quả chồng pic của mẫu thử, mẫu chuẩn và mẫu trắng 31

Hình 3.8 Sắc ký đồ dãy chuẩn EGCG 32

Hình 3.9 Đường chuẩn EGCG 32

Hình 3.10 Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại trên mẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên 33 Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát độ đúng của phương pháp 33 Hình 3.12 Đồ thị sự phụ thuộc Tỷ lệ gốc tự do bị trung hòa theo nồng độ mẫu thử35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Trà (Camellia L.) là một chi lớn trong họ Chè (Theaceae), rất nổi tiếng với cây Trà xanh (C Sinensis (L.) O Ktze) đã được sử dụng trong cuộc sống từ rất

lâu đời vai trò làm thức uống và thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc với các tác

dụng sinh học tốt [37] Bên cạnh đó, trong chi Camellia L còn có rất nhiều loài

khác cũng có hoạt tính sinh học rất đáng quan tâm như tác dụng chống oxy hóa, tác dụng chống ung thư, tác dụng kháng nấm, kháng virus, v.v [47] Trà hoa vàng là

một nhóm trong số các loài thuộc chi Camellia L với màu vàng đặc trưng của hoa Đây là nguồn gen vô cùng quý hiếm của chi Camellia L chỉ gặp ở miền Bắc Việt

Nam và Nam Trung Quốc [11]

Ở Việt Nam, Trà hoa vàng lần đầu tiên được người Pháp phát hiện ở miền Bắc vào năm 1910 [11] Tuy nhiên, cho đến những năm gần đây, Trà hoa vàng mới được quan tâm nghiên cứu và khai thác để sử dụng Mặc dù vậy, các nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài Trà hoa vàng còn rất hạn chế Cho đến nay, các nghiên cứu về Trà hoa vàng mới chỉ tập trung chủ yếu vào phần thực vật với việc tìm ra các loài Trà hoa vàng mới ở Việt Nam Ước tính có khoảng

30 loài Trà hoa vàng đã được công bố có ở Việt Nam, tập trung chủ yếu ở miền Bắc (VQG Tam Đảo) hoặc một số khu vực miền Nam (VQG Cát Tiên, VQG Bù Gia Mập) [31], [32], [34] Tuy nhiên, vẫn còn một số khu vực cũng phát hiện có Trà hoa vàng nhưng chưa được nghiên cứu như ở Ba Chẽ (Quảng Ninh) hoặc Yên Ninh (Thái Nguyên), v.v

Từ thực tế đó, đề tài “ Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học

và tác dụng sinh học của Trà hoa vàng ở Thái Nguyên” được thực hiện nhằm đạt

được các mục tiêu sau:

- Mô tả đặc điểm hình thái và cấu tạo giải phẫu của cây Trà hoa vàng Thái Nguyên

- Xác định thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu, định lượng thành phần hóa học chính trong lá của mẫu nghiên cứu

- Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc tế bào ung thư in vitro của lá mẫu nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN

Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật chi Camellia L

1.1

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Camellia L

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan công bố năm 2009 [22], chi Trà hoa

vàng (Camellia L.) có vị trí phân loại như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Camellia L

Theo các tài liệu Từ điển thực vật thông dụng của Võ Văn Chi [7], sách Trà hoa

vàng của Trần Ninh [11] chi Camellia L có đặc điểm:

Cây bụi hoặc cây nhỏ, thường xanh, cành nhẵn hay có lông Lá thường có cuống, đơn, mọc so le, không có lá kèm; chóp lá nhọn, có đầu nhọn hoặc kéo dài thành đuôi; gốc lá hình nêm hẹp, nêm rộng, tròn hay hình tim; mép có răng cưa nhọn hoặc tù Hoa đều, lưỡng tính, kích thước lớn hoặc nhỏ, mọc đơn độc ở nách lá hoặc đầu cành Hoa màu đỏ, trắng hoặc vàng Cuống hoa ngắn hoặc gần như không

Lá bắc 2 - 10, mọc xoắn trên cuống hoa Cánh hoa 4 - 19, hợp một phần ở gốc cùng với vòng nhị ngoài Nhị nhiều, dính với nhau ở phía gốc, vòng nhị phía trong rời nhau, chỉ nhị dài Bầu trên, 1 - 5 ô, vòi nhụy 1 - 5, dạng sợi, rời hoặc dính nhau; bầu

và vòi nhụy nhẵn hay phủ lông mịn Quả nang, hình cầu dẹt hoặc hình trứng, khi khô chẻ ô từ trên xuống thành 3, 4 hay 5 mảnh; có trụ hay không; vỏ quả dày hay mỏng, hóa gỗ Hạt 1 đến nhiều hạt trong mỗi ô, hình cầu, nửa cầu hay hình nêm, vỏ hạt màu nâu, nâu hạt dẻ nhạt hoặc nâu hồng, phủ lông hay nhẵn

1.1.3 Phân bố

Trên thế giới, chi Camellia L có khoảng 280 loài, phân bố chủ yếu ở nhiệt đới

và á nhiệt đới, có nguồn gốc ở khu vực miền đông và miền nam châu Á, từ dãy Himalaya về phía đông tới Nhật Bản và Indonesia Cho tới nay, có rất nơi trên thế giới có các loài thuộc chi này Đó là các nước ở châu Á (Ấn độ, Bangladesh, Đài

Loan, Hàn Quốc, Indonesia, Iran, Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-lanka, Trung Quốc, Việt Nam); châu Âu (Thổ Nhĩ Kỳ, Liên Xô cũ); châu Phi (Burundi, Ethiopia, Kenya, Maritius, Nam Phi, Uganda); khu vực Nam Mỹ (Argentina, Brazil, Ecuador, Peru) và châu Đại Dương (Australia, New-Ghine) [11], [39]

Ở Việt Nam, chi Camellia L có khoảng 77 loài, phân bố từ Bắc vào Nam (Yên

Bái, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Quảng Ninh, Lâm Đồng, Bình Phước, v.v) [32], [33], [34]

1.1.4 Một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam [13], [14], [16], [17], [29], [31], [32], [33], [34], [41], [43], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57] được trình bày trong Bảng 1.1 Đặc điểm hình thái của các loài này được trình bày trong Bảng 1và Bảng 2, Phụ lục 2

Bảng 1.1 Danh mục một số loài Trà hoa vàng ở Việt Nam

1 Camellia bugiamapensis Orel, Curry, Luu & Q.D Trà bù gia mập

2 Camellia capitata Orel Trà đầu

3 Camellia cattienensis Orel Trà cát tiên

4 Camellia crassiphylla Ninh et Hakoda Trà vàng lá dày

5

Camellia cucphuongensis Ninh & Rosmann Trà mi Cúc

Phương

6 Camellia Chrysantha (Hu) Tuyama Trà hoa vàng

7 Camellia chrysanthoides Hung T Chang

8 Camellia dalatensis V.D.Luong, Ninh & Hakoda Trà mi đà lạt

9 Camellia dilinhensis Tran & Luong Trà mi di linh

10

Camellia dongnaiensis Orel Trà hoa vàng

đồng nai

11 Camellia dormoyana (Pierre) Sealy Trà vàng đo môi

12 Camellia euphlebia Merr ex Sealy Trà gân

13 Camellia flava (Pitard) Sealy

14 Camellia fleuryi (A Chev.) Sealy Chè sốp

15 Camellia gilberti (A.Chev.) Sealy Trà vàng Ginbéc

16 Camellia hakodae Ninh, Tr Trà vàng Hakoda

17

Camellia hirsuta Hakoda et Ninh Trà vàng nhiều

lông

18 Camellia inusitata Orel, Curry & Luu Trà mi cành dẹt

19

Camellia luteocerata Orel Trà hoa vàng

trắng

20 Camellia luteopallida Luong, T.Q.T Nguyen & Luu

21 Camellia ninhii Luong & Le

22 Camellia oconoriana Orel, Curry & Luu Trà âu-con- nơ

23 Camellia petelotii (Merr.) Sealy Trà vàng Pêtêlô

24 Camellia phanii Hakoda et Ninh Trà vàng phan

25 Camellia sonthaiensis Luu, Luong, Q.D Nguyen &

T.Q.T Nguyen Trà sơn thái

26 Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh Trà vàng tam đảo

27 Camellia tienii Ninh, Tr Hải đường vàng

28 Camellia tonkinensis (Pit.) Cohen-Stuart

1.2 Thành phần hóa học

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi

Camellia L Các thành phần hoá học chính có hoạt tính sinh học cao thường gặp trong Camellia L là nhóm alcaloid (cafein, theobromin, theophylin, adenin,

guanin); các polyphenol và tinh dầu (metyl salicylat, citronellol, v.v) Ngoài ra,

trong lá của các loài Camellia L còn có các nhóm flavonoid (kaempferol,

quercetin), saponin triterpenoid (camelliasid A, B), acid hữu cơ (acid oxalic, acid nicotinamic, acid ascorbic,v.v), protein, acid amin, pectin và đường khử Bên cạnh

lá, trong hạt của Camelilia L còn có các acid béo palmitic, stearic, oleic, linoleic,

myristic và arachidic [17] Trong các nhóm chất này, ba nhóm chất đầu luôn được coi là các thành phần quan trọng nhất quyết định tính chất của trà

1.2.1 Nhóm alcaloid trong Camellia L

Đối với Trà xanh (C sinensis (L.) O Ktze), thành phần quan trọng nhất

trong lá Trà xanh là alcaloid nhân purin, chẳng hạn như cafein, nó quyết định chất lượng của trà và không biến đổi trong quá trình chế biến Ngoài ra, trong Trà xanh còn có theophylin, theobromin, xanthin [17], [39]

1.2.2 Nhóm tanin (các polyphenol) trong Camellia L

Nhóm tanin (các polyphenol) được coi là quan trọng thứ hai trong trà Tanin

có ở chi Camellia L thuộc loại tanin ngưng tụ (pyrocathechic), được tạo thành do

sự ngưng tụ từ các đơn vị flavan - 3 - ol như catechin Lượng chất polyphenol toàn

phần có thể được định lượng bằng phương pháp HPLC [23]

Đối với lá Trà xanh (C sinensis (L.) O Ktze), tanin chiếm 15-30%, sau khi

chế biến thì nó trở thành vị chát Đây là nhóm bị biến đổi khi chế biến trà Các

polyphenol trong lá là loại polyphenol trung bình, gồm một lượng nhỏ acid gallic, chiếm 48% [38] Từ Trà xanh Nhật bản, đã phân lập được các chất polyphenol là epicatechin (EC), galocatechin (GC), epicatechin gallat(ECG), epigallocatechin

gallat (EGCG) (Hình 1.1.) Đây là những chất được quan tâm nhiều nhất do có

nhiều tác dụng sinh – dược học đáng chú ý như: giúp ổn định huyết áp, giảm nguy

cơ đột quỵ và bệnh tim mạch, bảo vệ da khỏi tác dụng của tia UV Trong các thành

phần này, EGCG là thành phần polyphenol chủ yếu, làm giảm các nguy cơ bệnh tim

mạch và ung thư, chiếm khoảng 48 - 55% polyphenol toàn phần trong lá Trà xanh

[11], [17], [38]

Đây cũng là định hướng chính của đề tài này khi nghiên cứu thành phần hóa học với việc định tính, định lượng polyphenol và EGCG có trong mẫu nghiên cứu

1.2.3 Nhóm tinh dầu trong Camellia L

Tinh dầu cất được từ lá tươi của Trà xanh vào mùa xuân là 0,014% và mùa

hè là 0,007% Thành phần chủ yếu trong tinh dầu Trà xanh là hexenal, hexenol và các aldehyd Ngoài ra, còn có một lượng nhỏ các chất butyraldehyd, isobutyraldehyd và isovaleraldehyd, cùng với n-hexyl, benzyl, phenylethylalcon,

geraniol, linalool, acetophenon và citral [17]

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số loại catechin

1.3 Về tác dụng sinh học

1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa

Nhiều nghiên cứu đã khẳng định khả năng chống oxy hóa của trà là do hoạt tính

của các hợp chất polyphenol [23], [36], [37], [38], [45], [49] Lá của loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thể hiện qua khả năng trung hòa gốc tự do [38] Các chất được xác định trong lá của loài Camellia chrysantha (Hu) Tuyama có tác dụng trung hòa gốc tự do là: epicatechin, vitexin,

isovitexin, quercetin-7-O-β-D-glucopyranoside và kaempferol [36] Tác dụng chống oxy hóa của polyphenol thu được từ lá Trà xanh đã được đánh giá theo khả năng bảo quản dầu hạt cải và khi so sánh với các chất có tính chống oxy hóa đã biết như acid ascorbic và tocopherol [34] Một nghiên cứu khác chỉ ra rằng, polyphenol chiết xuất từ lá Trà xanh thứ phẩm có tác dụng chống oxy hóa rất rõ rệt và mạnh hơn nhiều so với acid ascorbic và tocopherol [38]

Nghiên cứu của Lixia Song và cộng sự đánh giá khả năng chống oxy hóa của

polyphenol trong 6 mẫu Trà hoa vàng thu hái ở Trung Quốc: C impressinervis, C euphlebia, C microcarpa, C nitidissima, C tunghinensis và C chrysantha theo mô

hình DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl), được phân tích bằng phương pháp HPLC cho thấy có phản ứng rõ rệt giữa các thành phần catechin trong trà với DPPH thể hiện rõ khi mà các đỉnh tương ứng tồn tại trong sắc

ký đồ ban đầu của các chiết xuất ban đầu biến mất sau khi thêm DPPH [49]

polyphenol có độc tính thấp như những chất chống oxy hóa để nghiên cứu lâm sàng điều trị một số dạng ung thư và cho rằng cơ chế chống khối u của flavonoid không chỉ do khả năng chống oxy hóa mà còn tác dụng tổng hợp do khả năng phản ứng đa dạng của phân tử flavonoid Dịch chiết polyphenol trong trà xanh có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào của dòng tế bào ung thư phổi LU -1 và dòng tế bào ung thư gan Hep – G2, tác dụng rõ nhất trên dòng LU – 1 với giá trị IC50 là 3, 84 µM của EGCG Trà xanh Bước đầu phát hiện sự tăng hoạt độ của enzym caspase – 3 trên dòng tế bào LU -1 được bổ sung EGCG Trà xanh vào môi trường nuôi cấy [47]

Như vậy, các loài trong chi Trà Camellia L với những nghiên cứu hiện có đã thể

hiện tác dụng nổi bật là chống oxy hóa và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

Vì vậy, trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử tác dụng chống oxy hóa

và tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư in vitro của mẫu Trà hoa vàng Thái

Nguyên

1.4 Một số phương pháp định lượng polyphenol

Hàm lượng polyphenol toàn phần có thể xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau: quang phổ hồng ngoại, sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [26]

Năm 2010, một nhóm nghiên cứu và phát triển công nghệ hóa sinh đã tiến hành định lượng polyphenol tổng số của 16 mẫu trà (8 mẫu tươi và 8 mẫu khô) bằng phương pháp đo quang, sử dụng thuốc thử Folin - Denis

Năm 2013, Bộ khoa học và công nghệ Việt Nam đã đưa ra tiêu chuẩn quốc gia TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1:2005) quy định phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần trong Trà xanh và Trà đen bằng phương pháp đo màu

sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu [4]

Với Trà hoa vàng, do chưa có phương pháp nào được công bố chính thức để định lượng polyphenol toàn phần nên trong phạm vi nghiên cứu, chúng tôi áp dụng phương pháp định lượng theo TCVN 9745 - 1:2013

Nguyên tắc: Polyphenol có trong mẫu trà được chiết bằng methanol 70% ở

60oC Định lượng polyphenol tổng trong trà bằng phương pháp đo quang, dùng thuốc thử Folin- Ciocalteu Thuốc thử này chứa acid phospho-vonframic, phản ứng xảy ra theo cơ chế oxy hóa- khử Nhóm hydroxyl trong pholyphenol dễ bị oxy hóa,

sản phẩm của phản ứng có màu xanh lam của vonfram và molypden, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765 nm Xây dựng đường chuẩn dựa trên acid gallic [4], [30],

Phản ứng xảy ra nhanh ở pH kiềm và xảy ra chậm hơn ở pH acid [45]

1.5 Vài nét về phương pháp bán định lượng bằng sắc ký lớp mỏng bằng phần mềm VideoScan

Khái niệm bán định lượng: Bán định lượng là xác định một các gần đúng hàm

lượng của một chất, kết quả bán định lượng rơi vào khoảng giữa của một kết quả định lượng và một kết quả định tính [21]

Khi bán định lượng các chất bằng TLC, độ chính xác của kết quả phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật xác định và lượng giá vết trên sắc ký đồ Nếu sử dụng kỹ thuật

xử lý ảnh sắc ký với camera kỹ thuật số thì độ chính xác của kết quả phần lớn phụ thuộc vào phần mềm xử lý dữ liệu hình ảnh

Phần mềm xử lý ảnh VideoScan là một phần mềm có hạn chế về độ chính xác khi đọc kết quả dữ liệu ảnh Vì vậy, khi sử dụng phần mềm này để xử lý ảnh sắc ký

đồ thì chỉ có thể xác định được sơ bộ hàm lượng các chất trong mẫu phân tích (bán định lượng)

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, thiết bị

2.1

2.1.1 Nguyên liệu

Các mẫu Trà hoa vàng thu hái tại Yên Ninh (Thái Nguyên) ngày 31/12/2015 được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội

Thiết bị nghiên cứu đặc điểm thực vật:

- Kính lúp soi nổi Leica EZ4

- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Canon 100mm f2.8 Macro

Thiết bị nghiên cứu thành phần hóa học:

 Máy cô quay Buchi

 Máy đo quang Hitachu U-1900

 Bản mỏng silicagel GF 254 Merck

 Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao CAMAG gồm: máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng triển khai ADC2, mấy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát hiện TLC Visualizer, phần mềm phân tích winCATS và VideoScan

 Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, bình gạn

Thiết bị nghiên cứu tác dụng sinh học:

- Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad)

2.1.3 Dung môi, hóa chất

- Chất chuẩn Epigallo catechin gallat (EGCG) 96,54%, Viện Kiểm Nghiệm thuốc Trung ương

- Chất chuẩn acid gallic 97%, Trung tâm kiểm nghiệm Thành phố Hà Nội

- Dung môi: methanol, aceton, chloroform, acid formic, nước cất

- Thuốc thử: vanilin - dung dịch acid sulfuric

- FBS của GIBCO, Invitrogen,; TCA(Sigma, Mỹ), SRB (Sigma, Mỹ), DPPH (Sigma, Mỹ)

- Acid ascorbic (Sigma, Mỹ), Ellipticine (Sigma, Mỹ),

- Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v

Các hoá chất và thuốc thử đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược Điển Việt Nam IV

Các dòng tế bào ung thư: do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và

GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp: ung thư phổi, ung thư

vú, ung thư gan, ung thư trực tràng, ung thư da

2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái

2.2.1.1 Phân tích hình thái

Mô tả phân tích đặc điểm hình thái của các mẫu nghiên cứu theo phương pháp mô tả phân tích [2], [6] Trong nghiên cứu các đặc điểm được mô tả thuộc các nhóm: Dạng sống, thân, lá, hoa (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Đặc điểm hình thái mô tả các loài trong chi Camellia sp

Stt Cơ quan Các đặc điểm mô tả

1 Dạng sống Dạng sống, chiều cao

2 Thân Hình dạng thân già, bề mặt cành non

3 Lá Cách mọc của lá, cuống lá, hình dạng phiến, hình dạng mép, số

cặp gân chính, kích thước, bề mặt trên, bề mặt dưới

4 Hoa

Kiểu cụm hoa, số hoa mỗi cụm, lá bắc, đài (hình dạng, bề mặt), tràng (hình dạng, tràng phụ), bộ nhị (số lượng, hình dạng, kích thước, liền/rời), bộ nhụy (hình dạng kích thước lá noãn, vòi nhụy)

2.2.1.2 Giám định tên khoa học

Tên khoa học được xác định dựa trên khóa phân loại và mô tả loài trong các tài liệu về thực vật trong nước và các tài liệu ngoài nước Các mẫu sau khi tra khóa được so sánh đối chiếu với các tiêu bản tại các phòng tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất trong ống nghiệm

a Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa

Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng 50 ml ether dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo, tinh dầu và sterol

Định tính chất béo:

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy

Định tính sterol (phản ứng Liebermann – Burchardt):

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa Bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá

b Định tính các thành phần có trong dịch chiết cồn

Cân khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn 900

, đun sôi cách thủy vài phút Dịch chiết được lọc và cô còn khoảng 10 ml để làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin, acid amin

Định tính coumarin

- Phản ứng mở đóng vòng lacton: Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun sôi cách thủy cả 2 ống nghiệm trong vài phút Để nguội rồi quan sát thấy ống 1 có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, ống 2 trong Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống

2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát, thấy ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục Acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục như ống 2

- Phản ứng diazo hóa: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào đó 2

ml dung dịch NaOH 10% Đun cách thủy đến sôi, để nguội Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo (mới pha), thấy xuất hiện tủa màu đỏ gạch

Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô rồi để trên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên Nhỏ 1 giọt khác làm chứng

- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa xanh đen

Định tính acid amin

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài tinh thể ninhydrin thấy xuất hiện màu xanh tím

c Định tính các thành phần trong dịch chiết nước

Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 nước cất, đun sôi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm đường khử, acid hữu cơ và tanin

Định tính đường khử

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A

và 0,5 ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ gạch

Định tính acid hữu cơ

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm vài tinh thể natri carbonat

thấy xuất hiện bọt khí

- Ống 2: thêm 2 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông

- Ống 3: thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng

Ngoài ra, chúng tôi còn tiến hành định tính tanin catechic trong mẫu nghiên cứu bằng phản ứng đặc trưng: Lấy 0,2 g bột dược liệu, thêm 10 ml methanol, đun cách thủy đến sôi, để nguội, lọc Lấy 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch vanilin 1% và 1 ml dung dịch HCl đậm đặc thấy xuất hiện màu đỏ đậm

Định tính saponin (phản ứng tạo bọt): cho vào ống nghiệm 0,1 g bột dược liệu,

thêm 5 ml nước cất Lắc mạnh trong 5 phút, để yên Nếu còn bọt bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

d Định tính các nhóm chất khác

Định tính alcaloid

Lấy 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch

H2SO4 1N, đun đến sôi trong vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa bằng dung dịch amoniac 6N đến pH = 9 – 10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid base bằng ether hoặc cloroform 3 lần, mỗi lần 5 ml Dịch chiết ether hoặc cloroform được gộp lại, lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết nước, cho vào 3 ống nghiệm, mối ống 1ml, nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

- Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu trắng đến vàng

- Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu

- Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa cam đến đỏ

Định tính anthranoid: (phản ứng Borntraeger):

Cho vào ống nghiệm 0,5 g bột dược liệu, thêm 5 ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi trực tiếp trên nguồn nhiệt, lọc dịch chiết còn nóng vào bình gạn, để nguội rồi lắc với 5 ml ether hoặc cloroform Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ thấy lớp nước có màu đỏ sim

Định tính glycosid tim

Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml cồn 25% rồi ngâm 24 giờ ở nhiệt độ phòng Gạn dịch chiết vào cốc có mỏ, loại tạp bằng dung dịch chì acetat 30% đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn, lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml Gộp dịch chiết cloroform vào cốc có mỏ, loại nước bằng natrisulfat khan Dịch chiết được chia vào các ống nghiệm, cô cách thủy đến cắn để làm các phản ứng sau:

- Phản ứng Liebermann – Burchardt: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1

ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 450 Cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh

lá

- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900, lắc đều cho cắn tan hết Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet mới pha đến khi thấy xuất hiện màu đỏ cam Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

- Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm chứa cắn ở trên 0,5 ml cồn 900, lắc đều cho cắn tan hết Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều thấy xuất hiện màu đỏ cam Làm song song với một ống chứng không có cắn, ống thử có màu đỏ cam đậm hơn ống chứng

2.2.2.2 Định tính EGCG bằng sắc ký lớp mỏng

Nguyên liệu: mẫu lá Trà hoa vàng sấy khô ở 45o

C, xay nhỏ

Chiết xuất: Cân 0,5 g mẫu, làm ẩm bằng methanol, chiết với 10 ml methanol

bằng phương pháp chiết siêu âm trong 30 phút Lọc lấy dịch chiết, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến còn 1 ml thì dùng để chấm sắc ký

Chuẩn bị mẫu chuẩn EGCG trong methanol nồng độ 1 mg/ml

Lựa chọn điều kiện triển khai sắc ký

- Bản mỏng: bản mỏng TLC silica gel 60 F254 (Merck) hoạt hóa ở 110oC trong

30 phút Kích thước bản mỏng 20 × 10 cm

- Đưa mẫu lên bản mỏng: mẫu được tiêm lên bản mỏng bằng máy Linomat 5

Vị trí tiêm mẫu cách mép dưới bản mỏng 8 mm, cách mép dung môi 3,0 mm

Khoảng cách giữa vết ngoài cùng và mép ngoài bản mỏng 15,0 mm Độ dài băng chấm 8,0 mm

- Thể tích tiêm mẫu 3 µl

- Điều kiện chạy TLC:

+ Điều kiện môi trường: nhiệt độ 26oC; độ ẩm tương đối 65%

+ Thể tích dung môi bão hòa: 25,0 ml; dung môi khai triển: 10,0 ml

+ Thời gian bão hòa dung môi: 20 phút

+ Thời gian bão hòa bản mỏng: 3 phút

+ Khoảng cách dịch chuyển của pha động: 75,0 mm

Khảo sát sắc ký với một số hệ dung môi sau:

 Hệ 1: Chloroform – methanol – aicd formic (6:3:1)

 Hệ 2: Chloroform – aceton – acid formic (5:5:1)

 Hệ 3: n- Butanol – aceton – acid acetic (5:5:3)

Lựa chọn hệ dung môi và điều kiện phát hiện tốt nhất để đánh giá kết quả và

sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo

Đánh giá: Mẫu thử được coi là có EGCG khi trên sắc ký đồ của mẫu thử, tại

vị trí Rf của EGCG chuẩn có vết với màu sắc giống như mẫu chuẩn

2.2.2.3 Định lượng Polyphenol toàn phần

Nguyên tắc: Dựa trên phương pháp định lượng polyphenol toàn phần trong

Trà xanh theo TCVN 9745 - 1:2013 (ISO 14502 - 1: 2005), tiến hành định lượng polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu bằng phương pháp đo quang với chất chuẩn là acid gallic Do mẫu nghiên cứu là Trà hoa vàng, không giống với đối tượng Trà xanh trong TCVN 9745 - 1: 2013 và một số tài liệu cho thấy rằng sản phẩm của phản ứng với polyphenol có độ hấp thụ cực đại khác với TCVN 9745 - 1:

2013 [4], [30], [45], nên khi tiến hành định lượng cần xác định bước sóng hấp thụ cực đại của sản phẩm và độ lặp lại của phương pháp để cho kết quả chính xác

Tiến hành:

Chuẩn bị dung môi và thuốc thử

- Dung môi chiết (Methanol / nước): cho 700 ml methanol vào bình định

mức 1 vạch 1l, pha loãng bằng nước đến vạch

- Thuốc thử: pha loãng dung dịch thuốc thử Folin- Ciocalteu 10 lần ngay

trước khi tiến hành phản ứng

- Dung dịch Na 2 CO 3 7,5%: Cân 37,5 ± 0,01 gam natri carbonat (Na2CO3) cho vào bình định mức 1 vạch 500 ml Thêm nước ấm đến nửa bình, lắc để hòa tan,

để nguội đến nhiệt độ phòng và pha loãng bằng nước cho đủ thể tích

- Dung dịch chuẩn gốc acid gallic nồng độ chính xác khoảng 1000 µg/ml: Cân chính xác khoảng 0,110 ± 0,001 gam acid gallic chuẩn 97% cho vào bình định mức một vạch 100 ml Hòa tan bằng nước và pha loãng đến đủ thể tích

- Dung dịch chuẩn gallic: dùng pipet chính xác chuyển các thể tích dung dịch

chuẩn gốc gallic vào bình định mức 1 vạch 100 ml và pha loãng bằng nước theo Bảng 2.2

Bảng 2.2 Xây dựng dãy dung dịch chuẩn acid gallic

Dung dịch chuẩn

acid gallic

Thể tích dung dịch chuẩn gốc (ml)

Nồng độ lý thuyết của dung dịch chuẩn pha loãng (µg/ml)

Tiến hành lặp lại 6 lần với mẫu nghiên cứu

- Lấy một lượng nhỏ mẫu để xác định hàm ẩm bằng cân hàm ẩm

- Chiết polyphenol toàn phần trong mẫu nghiên cứu: Cân chính xác khoảng 0,3000 g bột dược liệu cho vào ống chiết 10 ml, thêm 5 ml dung môi chiết, đun cách thủy ở 600C trong 10 phút, trộn đều trên máy votex trong 5 phút, ly tâm với tốc

độ 3500 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch chiết lần 1 Bổ sung thêm 5 ml dung môi, lặp lại thao tác trên, thu dịch chiết lần 2 Gộp dịch chiết 2 lần Pha loãng dịch chiết 100 lần để làm mẫu thử

Tiến hành phản ứng theo sơ đồ Hình 2.1

Dãy chuẩn Mẫu thử Mẫu trắng

Lắc đều

Để yên 60 phút ở nhiệt độ phòng Quét phổ chuẩn và đo mật độ quang ở bước sóng cực đại

Hình 2.1 Sơ đồ các bước tiến hành định lượng polyphenol toàn phần

Xử lý kết quả

Quét phổ của mẫu chuẩn acid gallic ở nồng độ 50 µg/ml

Dựng đường chuẩn tuyến tính acid gallic, tính hệ số tương quan r2

Xác định độ dốc đường chuẩn và giá trị giao điểm với trục tung của đồ thị

Hàm lượng polyphenol toàn phần w T được tính bằng công thức sau:

w T = (D mẫu - D giao điểm ) x V mẫu x d x 100

S chuẩn x m mẫu x 10 000 x w DM,mẫu

Trong đó:

Dmẫu là mật độ quang của mẫu thử

Dgiao điểm là mật độ quang tại điểm đường chuẩn giao với trục tung

Schuẩn là độ dốc của đường chuẩn

mmẫu là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

Vmẫu là thể tích dịch chiết mẫu trước khi pha loãng, tính bằng mililit (ml)

d là hệ số pha loãng mẫu trước khi phản ứng

wDM, mẫu là hàm lượng chất khô của mẫu (%)

2.2.2.4 Xây dựng phương pháp bán định lượng EGCG trong lá Trà hoa vàng bằng sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc: Do EGCG là một thành phần chính trong Trà hoa vàng nên việc

bán định lượng EGCG đã được thực hiện bằng sắc ký lớp mỏng Để xây dựng phương pháp này, sau khi lựa chọn được pha động và điều kiện phát hiện sắc ký đồ theo mục 2.2.2.2, đề tài đã thực hiện khảo sát độ đặc hiệu, xây dựng đường chuẩn,

độ đúng và độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành: Tiến hành sắc ký theo điều kiện tốt nhất đã khảo sát ở mục 2.2.2.2

Ảnh chụp sắc ký đồ được chuyển sang xử lý bằng phần mềm VideoScan Phần mềm này sẽ dựa trên hình ảnh sắc ký đồ vừa chụp được để ghi lại thành các pic và tính toán diện tích pic hoặc chiều cao tương ứng

Xử lý kết quả: Giá trị trung bình, độ lệch chuẩn tương đối RSD, phương trình hồi

quy tuyến tính được xử lý bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2013

Đánh giá phương pháp

Phương pháp phân tích được đánh giá qua các chỉ tiêu: tính đặc hiệu, đường chuẩn và khoảng tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng

a Độ đặc hiệu

Tiến hành: Sử dụng mẫu trắng là methanol Tiến hành tiêm 3 mẫu: mẫu trắng,

mẫu chuẩn và mẫu nghiên cứu trên cùng 1 bản mỏng, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã xây dựng, quan sát số lượng vết, hình dáng các vết và so sánh giá trị RSD của Rf [18], [21]

Đánh giá kết quả: Đánh giá dựa trên giá trị RSD của Rf Phương pháp được coi

là có tính đặc hiệu hay chọn lọc đối với chất cần phân tích nếu: (i) Sắc ký đồ của mẫu thử cho các vết chính có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn; (ii) Sắc ký đồ các mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn [21]

b Đường chuẩn

Tiến hành: Tiến hành tiêm 5 vết dung dịch chuẩn có thể tích lần lượt là 1 µl, 2

µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl Khai triển sắc ký theo điều kiện đã xây dựng được theo mục 2.2.2.2

Đánh giá kết quả: Xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu diễn mối tương

quan giữa diện tích pic và nồng độ chất chuẩn, xác định hệ số tương quan r2

Theo AOAC: Nếu r2 ≥ 0,99 thì đường chuẩn có độ tuyến tính cao trong khoảng nồng độ khảo sát [21]

c Độ lặp lại:

Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần mẫu thử với thể tích 3 µl, triển khai sắc ký theo

theo điều kiện đã xây dựng theo mục 2.2.2.2

Đánh giá kết quả: Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD của kết quả giữa các lần

phân tích

Giới hạn độ lặp lại đối với một phương pháp theo AOAC là RSD ≤ 2% ở nồng

độ chất phân tích ≥ 1% và RSD ≤ 3% ở nồng độ chất phân tích ≥ 0,1% [21]

d Độ đúng:

Độ đúng được đánh giá qua độ thu hồi, sử dụng phương pháp thêm chuẩn

Tiến hành: Thêm 2 µl chuẩn (C) vào 6 dung dịch thử (C) với tỷ lệ 1:1 về thể tích

được các dung dịch thử (T + C) Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã khảo sát

Đánh giá kết quả: Tính độ thu hồi theo công thức:

H% = (C T+C - C T ) x 100/C c

Trong đó: H% là độ thu hồi

CT+C : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (T + C)

CT : nồng độ chất phân tích trong mẫu thử (T)

Cc là nồng độ chuẩn (C) thêm Theo AOAC, giới hạn hệ số thu hồi đối với 1 phương pháp định lượng là từ

92 - 105% ở nồng độ chất phân tích ≥ 1%, từ 90 - 108% ở nồng độ chất phân tích ≥ 0,1% [21]

2.2.3 Nghiên cứu một số tác dụng sinh học

Chuẩn bị mẫu thử: Cân 10 g bột lá trà, cho vào bình nón, thấm ẩm bằng

methanol, ngâm với 50 ml methanol trong bình kín 3 ngày ở nhiệt độ phòng, chiết lặp lại 2 lần Gộp dịch chiết 2 lần, lọc, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn để thử tác dụng chống oxy hóa và tác dụng độc đế bào ung thư

2.2.3.1 Thử tác dụng chống oxy hóa bằng phép thử DPPH

Thử tác dụng chống oxy hóa được tiến hành tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam

Nguyên tắc: Phân tử DPPH là phân tử mang gốc tự do ổn định thông qua sự chuyển

dịch vị trí của một nguyên tử tự do trên toàn bộ phân tử của nó Khi hòa tan trong cồn tuyệt đối sẽ tạo ra dung dịch màu tím thẫm có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng

517 nm Gốc tự do DPPH có thể nhận một điện tử hoặc một gốc hydro để trở thành một phân tử nghịch từ và có màu tím nhạt [37]

Khi một cơ chất được đưa vào dung dịch chứa DPPH và tạo ra màu tím nhạt thì hoạt chất đó có khả năng trung hòa gốc tự do DPPH và có hoạt tính chống oxy hóa Nếu khả năng trung hòa gốc tự do của mẫu thử càng mạnh thì màu tím càng nhạt,

và ngược lại Đo độ hấp thụ của mẫu thử ở bước sóng cực đại 517 nm và so với mẫu đối chứng, không chứa chất thử [37]

- Dùng DPPH pha trong methanol (100%) nồng độ 100 µM

- Chuyển 100 l mẫu nghiên cứu vào mỗi giếng của đĩa 96 giếng Mỗi nồng

- Giếng có dung môi hòa mẫu nghiên cứu và dung dịch DPPH là giếng trắng

- Giếng có sử dụng aicd ascorbic là chất đối chứng dương

- Khả năng trung hòa gốc oxy hóa tự do (SA) sinh ra từ DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

% SA = (OD đối chứng – OD mẫu thử )*100/OD đối chứng (%)

Trong đó: ODđối chứng : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử

ODmẫu thử : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử

Tiêu chí đánh giá: Giá trị SC50 (nồng độ trung hòa được 50% gốc tự do của DPPH) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve Giá trị SC50

càng nhỏ thì khả năng chống oxy hóa càng cao

Phương pháp xử lý số liệu:

- Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích: sử dụng phương pháp thống kê, với công cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Office Excel 2013 và phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4

2.2.3.2 Phép thử sinh học xác định tính gây độc tế bào in vitro

Thử tác dụng gây độc tế bào ung thư in vitro được tiến hành tại Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

công nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm phát hiện các chất có khả năng

kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro Phép thử được

thực hiện theo phương pháp của Monks (1991), tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang (OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn [48]

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 l)

sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng acid trichloracetic (TCA)

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC Đổ bỏ SRB

và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí

ở nhiệt độ phòng

- Sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515 nm Khả năng sống sót của tế bào khi

có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% tế bào sống sót = [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0)

% ức chế tế bào = 100% ─ % tế bào sống sót

Trong đó: OD (đối chứng âm) : Độ hấp thụ tại giếng không chứa chất thử

OD (chất thử) : Độ hấp thụ tại giếng chứa chất thử

- Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm

Tiêu chí đánh giá: Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào), được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây

độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1.1 Đặc điểm hình thái của Trà hoa vàng Thái Nguyên

Chú thích: 1 Cành mang hoa 2 Đỉnh lá 3 Gốc lá

4 Mép lá 5 Mặt trên lá 6 Mặt dưới lá

7 Cấu tạo hoa 8 Hoa 9 Lá bắc

10 Cánh hoa 11 Bộ nhị 12 Bộ nhụy

13 Mặt cắt ngang bầu nhụy

Hình 3.1 Hình thái mẫu Trà hoa vàng Thái Nguyên

Cây gỗ nhỏ, lâu năm, cành nhẵn không có lông Cành non màu nâu nhạt, cành già màu nâu sẫm Lá có cuống dài 0,8 -1,2cm, nhẵn, lõm ở mặt trong Phiến lá hình elip đến bầu dục, nhẵn, dài 8,1 – 18,7cm, rộng 4,2 - 9,8cm, lá non dai và mỏng,

lá già cứng và dày, màu xanh đậm ở mặt trên, xanh sáng hơi vàng ở mặt dưới, mặt

dưới lá có nhiều điểm tuyến màu nâu nhạt, mật độ điểm tuyến 52 - 64/cm2 Gốc lá non hình nêm, lá già hơi tròn Đỉnh lá nhọn, dài 0,7 – 1,0cm Mép lá có răng cưa kiểu cùn, tương đối đều, khoảng cách lớn nhất giữa 2 răng là 4mm Gân chính nổi

rõ, lõm ở mặt trên, lồi ở mặt dưới, gân bên rõ có 9 - 13 cặp, không có lông Hoa đều, lưỡng tính, mọc đơn độc hay thành cụm 2 - 3 hoa ở đầu cành hoặc nách lá Đường kính hoa khi nở 4 - 4,5cm Cuống hoa nhẵn, dài 0,9cm Lá bắc hình móng, màu vàng hơi xanh, có lông rất mịn ở mặt trong, mặt ngoài nhẵn Lá đài 6, có lông mịn màu trắng ở mép, màu vàng, hình gần tròn đến trứng ngược Cánh hoa 6, màu vàng, nhẵn, dài khoảng 3, cm, rộng khoảng 1,5cm Cánh hoa vòng trong dính với chỉ nhị vòng ngoài ở gốc 0,9 cm Bộ nhị nhiều, chỉ nhị dài 2,7 - 3,2cm, không có lông, chỉ nhị vòng ngoài dính nhau ở gốc 1/2, chỉ nhị vòng trong rời Bộ nhụy 3 lá noãn hợp thành bầu 3 ô, mỗi ô chia 2 ngăn, vòi nhụy rời, không có lông, dài 1,9 - 2,1cm

Dựa trên các đặc điểm hình thái, sơ bộ xác định mẫu Trà hoa vàng Thái

Nguyên thuộc chi Camellia sp., họ Theaceae, chưa xác định được đến loài do chưa

thu được quả và hạt

3.1.1.2 Đặc điểm vi phẫu của Trà hoa vàng Thái Nguyên

a Vi phẫu lá

Chú thích: 1 Biểu bì dưới 2 Mô dày dưới

3 Mô mềm 4 Thể cứng

5 Mô cứng 6 Libe

7 Mạch gỗ 8 Mô dày trên

9 Biểu bì trên 10 Mô giậu

Hình 3.2 Vi phẫu lá Trà hoa vàng Thái Nguyên

Mặt cắt ngang phiến lá gồm 2 phần: Gân và phiến lá

Phần gân lá lồi cả 2 mặt, mặt dưới lồi rõ Từ dưới lên trên gồm các phần:

Biểu bì dưới (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật kích thước không đều, có phủ một lớp cutin mỏng Mô dày (2) gồm 4-5 lớp tế bào hình đa giác, thành dày ở góc, kích thước không đều, xếp sít nhau Mô mềm (3) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều nhau Mô cứng (5) gồm 2-5 lớp tế bào hình đa giác kích thước

không đều nhau sắp xếp tạo thành một cung bao quanh bó libe-gỗ Bó libe-gỗ có gỗ

ở trên, libe phía dưới; libe (6) gồm nhiều lớp tế bào hình đa giác kích thước đều, xếp lộn xộn thành từng đám; mạch gỗ (7) hình đa giác hay vuông xếp thành dãy xen

lẫn với mô mềm gỗ (tế bào hình vuông hay đa giác) hóa mô cứng Nằm rải rác trong

mô mềm là thể cứng (4) kích thước lớn nhánh nhọn, đa hình dạng và các tinh thể calci oxalat (8) hình cầu gai

Phần phiến lá: Biểu bì (1), (9) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật, tế bào

biểu bì trên (9) lớn hơn tế bào biểu bì dưới (1); lỗ khí có thể quan sát được ở biểu bì

dưới Mô giậu (10) gồm các tế bào thuôn dài xếp xít nhau Mô khuyết (11) gồm các

lớp tế bào đa giác hoặc tròn, sắp xếp lộn xộn

Hình 3.3 Vi phẫu thân Trà hoa vàng Thái Nguyên

Mặt cắt ngang thân cây có thiết diện gần tròn, gồm những bộ phận sau:

Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật tương đối đều nhau, phía ngoài

có phủ lớp cutin Mô mềm vỏ (2) gồm nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước không đều, sắp xếp lộn xộn Vòng mô cứng (3) gồm 2-3 lớp tế bào sợi, kích thước không

đều, thành dày hóa gỗ, bắt màu xanh, kích thước không đều nhau Bó libe gỗ cấp

hai có libe ở ngoài, gỗ nằm phía trong Libe cấp hai (4) gồm các tế bào hình tròn,

kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm Trong libe xuất hiện rải rác các thể

cứng với kích thước khác nhau Gỗ cấp hai (5) gồm các mạch gỗ xếp rất sít nhau, tia ruột hẹp Mô mềm ruột (7) gồm các lớp tế bào hình tròn, kích thước không đều nhau, xuất hiện rải rác thể cứng (6) với kích thước khác nhau