Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn rễ đinh lăng (polyscias fruticosa (l ) harms) trên chuột thực nghiệm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM QUỲNH HIÊN MSV: 1101172 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA CAO CHIẾT CỒN RỄ ĐINH LĂNG 2... Nhưng các phương pháp

CỒN RỄ ĐINH LĂNG (POLYSCIAS

FRUTICOSA (L.) HARMS) TRÊN

CHUỘT THỰC NGHIỆM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM QUỲNH HIÊN

MSV: 1101172

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA CAO CHIẾT CỒN RỄ ĐINH LĂNG

2 Phòng dược lý - sinh hóa Viện Dược liệu

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian từ khi em bắt đầu học tập tại giảng đường đại học cho đến khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em đã nhận được rất nhiều

sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới:

TS Phạm Thị Nguyệt Hằng - Trưởng khoa Dược lý - Sinh hóa Viện Dược liệu trung ương

PGS TS Vũ Văn Điền - Phó trưởng Bộ môn Dược học Cổ truyền - Đại học Dược Hà Nội

- Những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ phòng Dược lý - Sinh hóa - Viện Dược liệu trung ương đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên em lúc khó khăn, cho em thêm động lực để hoàn thành khóa luận này

Em xin cảm ơn toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giảng dạy cho em cũng như các bạn trong những năm học qua, cho em nhiều kiến thức quý báu

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ,

là chỗ dựa vững chắc cho em trong những năm vừa qua

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016 Sinh viên

Phạm Quỳnh Hiên

MỤC LỤC :

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN 3

1 Tổng quan về cây Đinh Lăng 3

1.1 Tổng quan về chi Polyscias 3

1.1.1 Vị trí phân loại [31] 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Polyscias 3

1.2 Tổng quan về loài Polyscias fruticosa 3

1.2.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Bộ phận sử dụng và thu hái 5

1.2.3 Tính vị và công dụng [23] 6

1.2.4 Chế phẩm có Đinh lăng 6

1.2.5 Tác dụng dược lý và độc tính cấp của Đinh lăng 6

1.2.6 Thành phần hóa học 9

1.2.7 Một số bài thuốc y học cổ truyền từ rễ Đinh lăng 15

2 Tổng quan về chứng sa sút trí tuệ 16

2.1 Các khái niệm 16

2.2 Phân loại 17

2.3 Bệnh Alzheimer (AD) 17

2.4 Cơ chế bệnh sinh 18

2.5 Thuốc điều trị 18

2.5.1 Thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase 18

2.5.2 Thuốc ức chế receptor NMDA (N-methyl-D-aspartat): Memantin 21

2.5.3 Vitamin E, selegilin và các thuốc khác 21

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 22

1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 23

1.1 Nguyên liệu 23

1.2 Hóa chất, thuốc thử 23

2 Trang thiết bị 23

2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 23

2.2 Đánh giá tác dụng dược lý 24

3 Phương pháp nghiên cứu 25

3.1 Điều chế và định tính cao đặc 25

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 25

3.1.2 Quy trình điều chế cao đặc rễ Đinh lăng 25

3.1.3 Định tính thành phần hóa học trong cao đặc 28

3.1.3.1 Cảm quan, tính chất 28

3.1.3.2 Xác định chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô của cao 28

3.1.3.3 Định tính các nhóm chất [1], [2] 28

3.2 Đánh giá tác dụng dược lý trên chuột thực nghiệm 33

3.2.1 Gây suy giảm trí nhớ bằng Trimethyltin (TMT) 35

3.2.2 Dùng chế phẩm nghiên cứu và thuốc chứng 36

3.2.3 Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT) [72] 37

3.2.4 Thử nghiệm mê cung chữ Y (Y maze) [67] 38

3.2.5 Xử lý thống kê 40

PHẦN III: KẾT QUẢ 41

1 Điều chế và định tính cao đặc 41

1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 41

1.2 Chiết, cô đặc tạo cao rễ Đinh lăng 41

1.3 Định tính thành phần hóa học trong cao đặc 41

2 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm nhận dạng đồ vật 43

3 Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ bằng thử nghiệm Y maze 46

PHẦN IV: BÀN LUẬN 49

1 Nghiên cứu điều chế và định tính cao đặc 49

2 Phương pháp đánh giá tác dụng dược lý 49

3 Tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn rễ Đinh lăng 51

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ORT Object Recognition Test - Thử nghiệm nhận diện

cao

42

Bảng 3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ qua thử nghiệm ORT 44 Bảng 3.3 Tác dụng cải thiện trí nhớ qua thử nghiệm Y maze 47

Danh mục hình, sơ đồ

Hình 1.1 Hình thái thực vật và tiêu bản cây Đinh lăng 4

Hình 1.3 Công thức saponin triterpenoid 10

Hình 3.1 Hình ảnh sắc ký đồ cao và dược liệu 43 Hình 3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ qua thử nghiệm

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đinh lăng là dược liệu được dùng phổ biến hiện nay, dễ trồng, ít sâu hại, trồng được ở nhiều nơi khác nhau, và đã được đưa vào Dược điển Việt Nam với công năng bổ khí, chủ trị suy nhược cơ thể, thần kinh, lợi sữa, giải độc, kém phát dục [3]

Từ lâu đời Đinh lăng đã được ứng dụng trong nhiều bài thuốc cổ truyền khác nhau Đã có nhiều sản phẩm thương mại chứa Đinh lăng như các loại hoạt huyết dưỡng não của HD pharma, hoạt huyết kiện não của DNA Pharma, Cebraton của Traphaco với tác dụng hoạt huyết, cải thiện trí nhớ

Sa sút trí tuệ rất phổ biến với người cao tuổi, gây sa sút trí nhớ, kèm theo những rối loạn về hành vi, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng hoạt động hàng ngày và chất lượng sống của bệnh nhân Chứng sa sút trí tuệ còn tăng gánh nặng cho gia đình bệnh nhân, cho hệ thống chăm sóc sức khỏe và cho nền kinh tế quốc gia [66] Theo hiệp hội Alzheimer quốc tế, Alzheimer và chứng sa sút trí tuệ là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ 6 ở Bắc Mỹ Trong năm 2012, nước Mỹ cần tới 15,4 triệu người chăm sóc dành cho các bệnh nhân, trị giá hơn

200 tỷ USD [40] Nhưng các phương pháp và thuốc điều trị hiện nay còn chưa hiệu quả, gây nhiều tác dụng không mong muốn và độc tính trên bệnh nhân

Do vậy, rất cần nghiên cứu hướng điều trị từ dược liệu

Việc sử dụng Đinh lăng theo hướng tác dụng cải thiện trí nhớ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm Đã có nhiều nghiên cứu trên tác dụng sinh học của Đinh lăng: tăng cân, tăng hồi phục, tăng cường thể trọng trên chuột [24] Nhưng chưa có nhiều nghiên cứu đến tác dụng tăng cường trí nhớ và khả năng học tập Mặt khác, Đinh lăng trồng ở các vùng khác nhau có thể khác nhau về thành phần hóa học và tác dụng, vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu cây này thu hái tại Tiền Hải, Thái Bình theo hướng đánh giá về khả năng cải thiện trí nhớ

Với các mục tiêu sau:

- Điều chế cao đặc từ rễ Đinh lăng bằng ethanol 70% và định tính các thành phần trong cao

- Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết cồn rễ Đinh lăng trên chuột

bị gây suy giảm trí nhớ bởi trimethyltin (TMT)

PHẦN I: TỔNG QUAN

1 Tổng quan về cây Đinh Lăng

1.1 Tổng quan về chi Polyscias

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Polyscias

Cây gỗ nhỏ hay nhỡ, có dáng mảnh và có tán đẹp, thường xanh, không gai Lá kép chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các

lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van Bộ nhị 5; bao phấn hình trứng hay thuôn Bầu dưới 2 ô, ít khi 3-4 ô; vòi nhụy 2-4 rời hay hợp ở gốc Quả dẹt, ít khi gần hình cầu Hạt dẹt [4]

Phân bố của chi Polyscias chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới,

nhiều nhất ở vùng đảo Thái Bình Dương, trên thế giới hiện có trên 100 loài Tại Việt Nam, hiện nay có trên 10 loài Đinh lăng, đa số các cây Đinh lăng hiện nay được sử dụng làm cây cảnh, chỉ có vài loài được sử dụng làm thuốc, loài

được sử dụng làm thuốc nhiều nhất là Polyscias fruticosa (L.) Harms., loài có

đặc tính như nhân sâm [10]

1.2 Tổng quan về loài Polyscias fruticosa

1.2.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật

- Mô tả: Cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms., họ Nhân sâm

(Araliaceae) là một loại cây nhỏ, thân nhẵn, không có gai, thường cao 0,8-1,5

m Lá kép 3 lần, xẻ lông chim dài 20-40 cm, không có lá kèm rõ Lá chét chia thùy nhọn không đều, màu xanh, bóng mặt dưới nhiều hơn, gốc lá và phiến lá thuôn nhọn dài 3-5 cm, rộng 0,5-1,5 cm; gân lá hình lông chim, gân chính nổi

rõ, 3-4 cặp gân phụ Lá chét có cuống gầy dài 3-10 mm, lá có mùi thơm Cụm hoa hình chùy ngắn 7-18 mm gồm nhiều tán, tán tụ thành chùm ở ngọn cành mang nhiều hoa nhỏ Tràng 5, nhị 5 và chỉ nhị gầy, bầu hạ 2 ngăn có rìa trắng nhạt Quả bẹt dài 3-4 mm, dày 1 mm có vòi tồn tại [4]

Hình 1.1 Hình thái thực vật và tiêu bản cây Đinh lăng [73]

- Sinh thái: Cây có khả năng tái sinh dinh dưỡng cao, trồng chủ yếu bằng

cách giâm cành, chọn những cành già, chặt thành đoạn ngắn 15-20 cm, cắm

nghiêng xuống đất Trồng vào tháng 2-4 hoặc tháng 8-10 Đinh lăng ưa đất cao ráo, hơi ẩm nhiều [6]

- Phân bố: Cây có nguồn gốc từ các đảo Thái Bình Dương, được trồng chủ

yếu để làm cảnh ở các đình chùa, các vườn gia đình Từ năm 1961, do biết tác dụng bổ dưỡng của rễ Đinh lăng, người ta trồng nhiều ở các bệnh viện, trạm

xá, vườn thuốc [6]

1.2.2 Bộ phận sử dụng và thu hái

Rễ Đinh lăng [3], thu hoạch rễ của những cây đã trồng 3 năm trở lên (cây trồng càng lâu năm càng tốt)

Hình 1.2 Dược liệu rễ Đinh lăng

Rễ Đinh lăng (củ), được rửa sạch, thái lát mỏng ngang, phơi sấy khô Lát cắt có độ dày 0,5 cm; màu trắng ngà, trên mặt vết cắt nhìn rõ gỗ xếp thành tia

từ giữa tỏa ra Lớp vỏ rễ dày, mặt ngoài vỏ rễ màu trắng đục, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con còn sót lại Dễ bẻ gãy, mặt bẻ lởm chởm, nhấm có bột, mùi thơm, vị ngọt, hơi mặn [4]

Thu hái: thu hoạch quanh năm, nhất là vào tháng 11-12 Củ và rễ tươi thu hoạch cần chế biến ngay, không để quá 5 ngày [5], [36]

1.2.3 Tính vị và công dụng [23]

- Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình Lá vị nhạt, hơi đắng

- Rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, tăng lực, chữa cơ thể suy nhược, gầy yếu, mệt mỏi, tiêu hóa kém, phụ nữ sau khi đẻ ít sữa Có nơi còn dùng chữa ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ và làm thuốc lợi tiểu, chống độc

- Ở Ấn Độ, Đinh lăng được dùng làm thuốc trị sốt Rễ và lá sắc uống có tác dụng lợi tiểu chữa sỏi thận, sỏi bàng quang, chứng khó tiểu tiện Bột

lá rã với muối và đắp trị vết thương

1.2.4 Chế phẩm có Đinh lăng

- Viên Đinh lăng chứa cao Đinh lăng tương đương 0,15g bột dược liệu trong 1 viên (Xí nghiệp dược phẩm 1)

- Rượu bổ Sampana (cao lỏng Đinh lăng, Học viện Quân Y)

- Hoạt huyết dưỡng não (viên bao, công ty cổ phần dược phẩm Traphaco)

1.2.5 Tác dụng dược lý và độc tính cấp của Đinh lăng

- Tác dụng dược lý:

Đinh lăng là thuốc có tác dụng tăng lực, làm tăng sức chịu đựng của cơ thể đối với các yếu tố bất lợi như kiệt sức, mệt mỏi, nóng Hơn nữa, Đinh lăng làm cho nhịp tim trở lại bình thường sau khi chạy dai sức, và làm cho cơ thể chịu được nóng Người bệnh bị suy mòn, uống Đinh lăng chóng hồi phục cơ thể, ăn ngon, ngủ tốt, tăng cân và làm tử cung co bóp mạnh hơn Đinh lăng ít độc hơn nhân sâm và khác với nhân sâm, nó không làm tăng huyết áp [5], [36] Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng tăng sự dẻo dai của cơ thể trên thí nghiệm cấp tính tương tự như nhân sâm [22]

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương [27], [29]: Cao Đinh lăng có tác dụng rút ngắn thời gian ngủ của Natri barbital ở khoảng liều từ 45-180 mg/kg Cao Đinh lăng có tác dụng làm gia tăng vận động tự nhiên của chuột nhắt trắng

ở khoảng liều từ 45-90 mg/kg thể trọng và làm giảm vận động tự nhiên ở khoảng liều > 180 mg/kg Do đó, cao Đinh lăng có khả năng kích thích thần kinh trung ương ở khoảng liều < 180 mg/kg

Tác dụng tăng lực, chống nhược sức [27], [29]: Cao Đinh lăng có tác dụng tăng lực ở khoảng liều < 180 mg/kg được xác định bằng hai biện pháp thực nghiệm trên chuột nhắt là mô hình chuột bơi kiệt sức của Brekman và chuột leo dây của Cabureb

Tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [30]: Đinh lăng còn thể hiện tác dụng nội tiết tố sinh dục (hiệu lực androgen và hiệu lực estrogen) trên cơ địa động vật bình thường và cơ địa động vật bị gây thiểu năng sinh dục

Tác dụng chống xơ vữa động mạch [28]: cao Đinh lăng 90-180 mg/kg thể trọng làm giảm sự gia tăng cholesterol huyết và lipid toàn phần trong huyết thanh của động vật bị gây xơ vữa động mạch thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu cholesterol (gây tăng cholesterol ngoại sinh) và bằng Tween 80 (gây tăng cholesterol nội sinh)

Tác dụng kháng khuẩn [11]: tác dụng trên các chủng Staphylococus mạnh

hơn trên các chủng vi khuẩn và nấm mốc khác Tác dụng kháng khuẩn của dịch

ether dầu hỏa > dịch chiết ethanol trên các chủng Staphylococus, đặc biệt là chủng Staphylococus gây bệnh

Tác dụng lợi tiểu [27]: thể hiện tác dụng lợi tiểu nhẹ trên chuột nhắt trắng

ở liều 300 mg/kg thể trọng

Tác dụng chống trầm cảm [14], [13]: Trong thực nghiệm của Porsolt, cao Đinh lăng ở 3 liều thực nghiệm đường uống 45, 90, và 180 mg/kg có tác dụng làm giảm bớt thời gian bất động ở động vật thử và đạt ý nghĩa thống kê so với

lô chứng ở liều 180 mg/kg Kết quả cho thấy liều 45 mg/kg không có tác dụng chống trầm cảm đạt ý nghĩa thống kê khi sử dụng 1 liều duy nhất, khi cho uống trong 3-7 ngày thì thể hiện tác dụng chống trầm cảm

Tác dụng chống stress [13], [56], [57]: cao Đinh lăng làm gia tăng ngưỡng chịu đựng độ nóng của động vật thử nghiệm trong stress vật lý (stress nhiệt độ 37-42ᵒC) Cao Đinh lăng thể hiện tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress cô lập ở liều 45-180 mg/kg Khoảng liều này cũng là khoảng liều được báo cáo có tác dụng dược lý khác như: tăng lực, kích thích hoạt động não bộ và nội tiết, gia tăng sức đề kháng của cơ thể trong stress nhiệt độ, kháng viêm và phòng chống xơ vữa động mạch

Tác dụng cải thiện trí nhớ của cao Đinh lăng liều 50, 100 và 200 mg/kg, thử nghiệm cho thấy liều 100 mg/kg làm tăng thời gian bơi trong vùng có phao, thể hiện tác dụng cải thiện trí nhớ trên thực nghiệm gây suy giảm trí nhớ bằng scopolamin [15], [16], [58]

Tác dụng chống oxy hóa [12], [17], [18]: trên thực nghiệm gây stress tâm

lý với liều 100 mg/kg/ngày, cao rễ Đinh lăng cho thấy tác dụng ức chế peroxy hóa lipid Tác dụng của Đinh lăng tương tự như vitamin E - một chất chống oxy hóa điển hình

Tác dụng bảo vệ gan [18], [57]: Cao rễ Đinh lăng liều 100 mg/kg/ngày, uống trong 7 ngày có tác dụng bảo vệ gan trong thực nghiệm gây viêm gan cấp bằng CCl4 thông qua ức chế peroxyd hóa lipid màng tế bào, duy trì mức bình thường MDA trong gan chuột bị gây tổn thương Tác dụng tương tự như các thuốc đối chiếu vitamin E và Omitan (biệt dược chứa 25 mg biphenyl dimethyl dicarboxylat) được sử dụng để bảo vệ gan trong bệnh lý viêm gan cấp hay mạn tính

Tác dụng kích thích miễn dịch [20]: gia tăng chức năng của các cơ quan liên quan đến hệ miễn dịch như tuyến ức, lách, thực bào… Kích thích hoạt động của hệ thống lưới nội sinh chất (reticuloendothelial system) là hệ thống giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sự hằng định nội môi và khả năng miễn dịch

không đặc hiệu Kết quả thể hiện trên động vật thực nghiệm gây suy giảm miễn dịch bởi cyclophophamid

- Độc tính cấp [27], [29]: Cao rễ Đinh lăng không thể hiện độc tính cấp

đường uống ở liều tối đa có thể cho uống là 40 g/kg thể trọng (tương đương với 258g dược liệu khô) Cao phối hợp rễ - lá Đinh lăng (Cao Đinh lăng) có độc tính cấp diễn đường uống với LD50 là 8,51 ± 0,59 g/kg thể trọng (tương đương với 38,72g dược liệu khô)

1.2.6 Thành phần hóa học

Rễ Đinh lăng có glycosid, alcaloid, saponin, flavonoid, tanin, vitamin tan trong nước (B1, B2, B6, C, ), polyacetylen, các phytosterol, và tới 20 acid amin [19], [24], [53] Các saponin triterpenoid trong rễ Đinh lăng đều có phần sapogenin là acid oleanolic và phần đường là glucose, galactose, rhamnose, [24], [26], [63], với tỷ lệ hàm lượng là rễ 0,49%; vỏ rễ 1,00%; lõi rễ 0,11% [24], [25]

Các saponin trong rễ và lá đã phân lập được [43], [62], [63]:

 Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuropyranosyloleanolic (1)

 Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuropyranosyloleanolic (2)

 Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), β-D-glucuronopyranosyloleanolic (3)

(1→4)]- Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2),

β-D-glucuropyranosyl-(1→4)]-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (4)

 Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), β-D-glucuronopyranosyloleanolic (5)

β-D-glucopyranosyl-(1→3)]- 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuropyranosyloleanolic β-D-glucopyranosyl ester (6)

28-O- 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (7)

D- 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), D-glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (8)

β-D-glucuropyranosyl-(1→4)]-β- 3-O-[β-D-galactopyranosyl-(1→2), glucuronopyranosyloleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl ester (9)

β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-β-D- 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucuronopyranosyloleanolic O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronopyranosyl ester (10)

28- 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2), glucuronopyranosyloleanolic 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosyl ester (11)

β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D- Acid 3-O-[β-D-galactopyranosyl (1→2)-β-D-glucopyranosyl] oleanolic (12)

 Acid glucopyranosyl] oleanolic (13)

3-O-[α-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl]-28-O-β-D-Hình 1.3 Công thức saponin triterpenoid

R1O

COOR 2

Bảng 1.1 Tóm tắt các saponin triterpenoid trong cây Đinh lăng [43], [62],

Bảng 1.2 Một số acid amin có trong cây Đinh lăng [19]

Lysin

Tryptophan

Bảng 1.3 Một số vitamin có trong cây Đinh lăng [19]

Vitamin B1

Vitamin B2

Vitamin C Vitamin B6 (Pyridoxamin)

Vitamin B6 (Pyridoxin) Vitamin B6 (Pyridoxal)

Bảng 1.4 Một số polyacetylen có trong cây Đinh lăng [53]

Panaxydol

Bảng 1.5 Một số tinh dầu có trong cây Đinh lăng [51]

 Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: rễ Đinh lăng phơi khô, thái mỏng 0,50g thêm 100ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2-3 lần uống trong ngày [22]

 Thông tia sữa, chữa căng vú sữa: rễ Đinh lăng 30-40g Thêm 500 ml nước sắc còn 250 ml, uống nóng, uống 2-3 ngày, vú hết nhức, sữa chảy ra bình thường [22]

 Chữa sốt lâu ngày, nhức đầu, háo khát, ho, đau tức ngực, nước tiểu vàng: Đinh lăng tươi (rễ, cành) 30g, lá hoặc vỏ chanh 10g, vỏ quýt 10g, sài hồ (rễ, lá, cành) 20g, lá tre tươi 20g, cam thảo dây hoặc cam thảo đất 30g, rau má tươi 30g, chua me đất 20g Các vị cắt nhỏ, đổ ngập nước, sắc đặc lấy 250 ml, chia uống 3 lần/ngày [23]

 Chữa thiếu máu: rễ Đinh lăng, hà thủ ô, thục địa, hoàng tinh, mỗi vị 100g, tam thất 20g, tán bột, sắc uống ngày 100g [23]

 Chữa viêm gan mạn tính: rễ Đinh lăng 12g, nhân trần 20g, ý dĩ 16g, hoài sơn, biển đậu, rễ cỏ tranh, xa tiền tử, ngũ gia bì, mỗi vị 12g, uất kim, nghệ, ngưu tất, mỗi vị 8g Sắc uống ngày một thang [23]

 Chữa liệt dương: rễ Đinh lăng, hoài sơn, ý dĩ, hoàng tinh, hà thủ ô, kỉ tử, long nhãn, cám nếp, mỗi vị 12g, trâu cổ, cao ban long, mỗi vị 8g, sa nhân 6g Sắc uống, ngày một thang [23]

 Chữa sốt rét: rễ Đinh lăng, sài hồ, mỗi vị 20g, rau má 16g, lá tre, cam thảo nam, mỗi vị 12g, bán hạ sao vàng 8g, gừng 6g, sắc uống [23]

 Ho suyễn lâu năm: rễ Đinh lăng, bách bộ, đậu sắn, rễ cây dâu, nghệ vàng, rau tần dày lá mỗi vị đều 8g, củ xương bồ 6g, gừng khô 4g, đổ 600ml nước, sắc còn 250ml, chia làm 2 lần uống trong ngày, uống lúc thuốc còn nóng [23]

 Phong thấp, thấp khớp: rễ Đinh lăng 12g, cối xay, hà thủ ô, huyết rồng,

rễ cỏ xước, thiên nên kiện, tất cả 8g, vỏ quýt, quế chi 4g (riêng vị quế chi bỏ vào sau cùng khi sắp nhắc xuống) Đổ 600ml nước vào sắc còn 250ml, chia 2 lần uống trong ngày Uống khi còn nóng [23]

2 Tổng quan về chứng sa sút trí tuệ

2.1 Các khái niệm

Theo WHO, sa sút trí tuệ là thuật ngữ tiếng Việt dịch từ “Dementia” Từ

“Dementia” có nghĩa là “mất sự thông minh” (“out of sense”), nói chệch của từ latinh: “de” = “no” (“không”), “mens” = “mind” (“trí tuệ”) [65]

Chứng sa sút trí tuệ (Dementia) còn được định nghĩa là sự suy giảm khả năng nhận thức và giảm khả năng thực hiện thành công các hoạt động sinh hoạt hàng ngày

Hội chứng sa sút trí tuệ hay gặp ở bệnh Alzheimer, bệnh mạch máu não,

và trong các bệnh khác là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát ảnh hưởng tới não bộ [71] Trong đó, bệnh Alzheimer là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng 50-70% số trường hợp rối loạn chức năng nhận thức [44], [50]

2.2 Phân loại

Chứng sa sút trí tuệ được phân loại trên cơ sở các yếu tố gây bệnh khác nhau và những con đường sinh lý khác nhau Chứng sa sút trí tuệ được phân thành các typ gồm [41], [44], [46], [50]:

 Sa sút trí tuệ trong bệnh Alzheimer (Dementia in Alzheimer disease)

 Sa sút trí tuệ bệnh mạch máu (Vascular dementia)

 Sa sút trí tuệ do thể Lewy (Lewy body dementia)

 Sa sút trí tuệ thùy trán - thái dương, gồm cả bệnh Pick (Frontotemporal dementia, Pick’s disease)

 Sa sút trí tuệ dưới vỏ: Bệnh Parkinson, liệt trên nhân tiến triển, thoái hóa

vỏ - hạch nền, bệnh Huntington, bệnh Wilson……

 Sa sút trí tuệ do các nguyên nhân khác: ngộ độc, rối loạn chuyển hóa (thiếu B1), bệnh nội tiết, nghiện rượu, nghiện ma túy, bệnh lý viêm nhiễm, suy giảm miễn dịch do virus (HIV, giang mai thần kinh, bệnh Prion)

AD thường được mô tả là giảm trí nhớ gần Trí nhớ gần bị suy giảm do thông tin mới không được lưu trữ một cách đầy đủ để sau có thể nhớ lại Hậu quả là bệnh nhân khó nhớ các sự kiện mới xảy ra [65]

2.4 Cơ chế bệnh sinh

Cho đến nay người ta đã thừa nhận Alzheimer là một bệnh thoái hóa não

do nhiều nguyên nhân gây ra, không đồng nhất về mặt di truyền, phát sinh và tiến triển theo những cơ chế không hoàn toàn giống nhau giữa các bệnh nhân Tuy nhiên, người ta đã đưa ra một giả thuyết để liên kết vai trò của tất cả các thành tố cơ bản trong bệnh nguyên Với giả thuyết này, amyloid đóng vai trò cốt lõi Các yếu tố căn nguyên tuy rất đa dạng xong đều có một tác động đồng quy vào quá trình chuyển hóa của APP để tạo ra một sản phẩm là protein Aβ

42 acid amin Sự lắng đọng, kết tập Aβ 42 sẽ tạo ra các mảng lão suy, các đám rối sợi thần kinh… dẫn đến chết nơron, mất synap và các phản ứng viêm tổ chức thần kinh

Các tổn thương đặc hiệu này xảy ra ở các khu vực khác nhau ở não, đặc biệt là vỏ não thùy trán, nền não trước và hồi hải mã thùy thái dương…Tổn thương các vùng này sẽ dẫn đến sự thiếu hụt các chất dẫn truyền thần kinh, đặc biệt là acetylcholin - chất được coi là có vai trò cơ bản trong rối loạn sinh hóa não, gây suy giảm nhận thức và trí nhớ ở bệnh nhân Alzheimer Sự suy giảm lượng acetylcholin này tương ứng với mức độ trầm trọng của sa sút trí tuệ trên lâm sàng Các chất dẫn truyền thần kinh khác cũng thấy có bị rối loạn trong não bệnh nhân Alzheimer (tuy không đặc hiệu) như serotonin, GABA, somatostatin, noradrenalin [35]

2.5 Thuốc điều trị

2.5.1 Thuốc ức chế enzym acetylcholinesterase

Có 4 thuốc ức chế AChE được FDA phê duyệt sử dụng điều trị bệnh Alzheimer bao gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin Các thuốc này đều có tác dụng theo cơ chế ức chế có hồi phục AChE, làm tăng hàm lượng acetylcholin trong não Ngoài ra, rivastigmin còn ức chế có hồi phục Butyrylcholinesterase, galantamin còn có tác dụng trong việc điều biến các thụ thể nicotinic Các thuốc này được chỉ định điều trị các triệu chứng của bệnh từ nhẹ đến nặng, giúp cải thiện một phần về nhận thức và chức năng trong vòng 12- 24 tuần Lợi ích điều trị thường kéo dài trên 1 năm trừ dopenezil có thể duy trì hiệu quả đến ít nhất 2 năm [34], [48], [64]

Có một số bằng chứng cho thấy các thuốc kháng AChE còn có lợi cho bệnh nhân sa sút trí tuệ thuộc mạch, sa sút trí tuệ hỗn hợp, sa sút trí tuệ thể Lewy Với bệnh nhân sa sút trí tuệ nặng có thể ngừng thuốc kháng AChE nhưng

có thể dùng lại khi bệnh trở nặng do không có thuốc khác để điều trị [54]

Tacrin có nhiều tác dụng không mong muốn bao gồm buồn nôn, nôn, tiêu chảy, đặc biệt là có độc tính trên gan (có tới 30% các trường hợp dùng tacrin được xét nghiệm thấy chức năng gan bất thường như tăng transaminase) Mặt khác, nhiều thuốc cùng nhóm ra đời có ít độc tính hơn nên tacrin không còn được sử dụng hoặc được sử dụng như là lựa chọn thứ 2 trong điều trị bệnh Alzheimer [34], [59]

Liều dùng của tacrin: 80-160 mg/ngày [34]

 Donepezil:

Donepezil là chất ức chế AChE thứ 2 được FDA phê duyệt lưu hành và điều trị bệnh Alzheimer năm 1996 Thuốc này là dẫn chất của piperidin tác động chuyên biệt trên AChE nhiều hơn BuChE nên ít có độc tính ngoại biên hơn Thêm vào đó, chế độ ngày dùng 1 lần đã giúp donepezil trở thành thuốc được lựa chọn ưu tiên trong điều trị tổn thương nhận thức của bệnh Alzheimer

từ mức độ nhẹ đến trung bình Các nghiên cứu pha III cho thấy sử dụng donepezil trên 5 năm, nhận thức được cải thiện 6-9 tháng đầu sau đó giảm từ

từ

Liều dùng của donepezil: 5-10 mg/ngày, uống 1 lần trước khi đi ngủ Khi điều trị nên bắt đầu với liều 5 mg/ngày, sau 4-6 tuần có thể tăng liều lên 10 mg/ngày nếu bệnh nhân không đáp ứng với liều thấp [70]

Liều dùng của rivastigmin: 2 lần mỗi ngày và tăng dần liều để giảm nguy

cơ gặp tác dụng không muốn Bắt đầu với liều 1,5 mg/lần, 2 lần mỗi ngày sau

đó tăng lên 3 mg/lần, 2 lần mỗi ngày; 4,5 mg/lần, 2 lần mỗi ngày; 6 mg/lần, 2 lần mỗi ngày, tối thiểu giữa các lần tăng liều là 2 tuần [71]

 Galantamin:

Galantamin là một thuốc ức chế AChE và cạnh tranh với thụ thể nicotinic làm tăng giải phóng acetylcholin có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại Aβ gây

độc thần kinh Nghiên cứu mù đôi có nhóm chứng cho thấy galantamin có hiệu quả trong điều trị bệnh Alzheimer tương tự như các thuốc ức chế AChE khác Tác dụng không mong muốn của galantamin bao gồm ngất xỉu, chuột rút, rối loạn giấc ngủ, thuốc này không có độc tính với gan

Liều dùng của galantamin: thuốc được khuyên dùng 2 lần/ngày, bắt đầu dùng thuốc hàng ngày với liều 4 mg/lần, 2 lần mỗi ngày, sau đó 8 mg/lần, 2 lần mỗi ngày, tiếp theo là 12 mg/lần, 2 lần mỗi ngày Tuy nhiên nên hạn chế tăng liều, bệnh nhân có rối loạn chức năng gan hoặc thận nặng không nên dùng quá

16 mg/ngày [68]

2.5.2 Thuốc ức chế receptor NMDA (N-methyl-D-aspartat): Memantin

Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích ở vỏ não và hồi hải mã, đảm trách nhiều chức năng của não, nhưng khi lượng chất này tăng cao sẽ gây chết tế bào Memantin là chất đối kháng không cạnh tranh với glutamat tại receptor NMDA (là receptor đảm trách sự học hỏi và trí nhớ) được dùng để điều trị bệnh Alzheimer và các rối loạn do thoái hóa thần kinh khác

Hai nghiên cứu lâm sàng lớn đã được tiến hành để đánh giá tác dụng của memantin trên bệnh nhân Alzheimer từ trung bình đến nặng như sau: Ở liều 10 mg/ngày trong 12 tuần, memantin làm tăng khả năng thực hiện các công việc hàng ngày như mặc quần áo, vệ sinh cá nhân, tham gia sinh hoạt nhóm… và làm giảm sự chăm sóc so với nhóm chứng dùng placebo Thử nghiệm trong 28 ngày với liều 20 mg/ngày làm cải thiện hoạt động hàng ngày và chức năng chung Memantin được FDA công nhận tháng 10/2003 để điều trị Alzheimer

từ trung bình đến nặng [49], [54]

2.5.3 Vitamin E, selegilin và các thuốc khác

Selegilin và vitamin E: Đã ghi nhận được có sự tăng nồng độ và hoạt tính

enzym MAO-B ở bệnh nhân Alzheimer Đây là cơ sở để nghiên cứu tác dụng

điều trị bệnh Alzheimer của chất ức chế MAO-B là selegilin Kết quả từ một

số nghiên cứu lâm sàng cho thấy thuốc có khả năng cải thiện trí nhớ, sự tập

trung, quan hệ xã hội và giảm lo âu, trầm cảm, căng thẳng Tuy nhiên, một số

nghiên cứu khác lại không ghi nhận được hiệu quả Một số nghiên cứu sử dụng

selegilin và vitamin E (2000 UI/ngày) đơn độc hay phối hợp, tuy nhiên hiệu

quả làm chậm sự tiến triển Alzheimer của mỗi thuốc tốt hơn là khi dùng phối

hợp Cần lưu ý, sử dụng vitamin E trên 400 UI/ngày trên bệnh nhân tim mạch

có thể làm tăng nguy cơ tử vong [12]

Estrogen: Nghiên cứu của The Women Health Initiative cho thấy phụ nữ

dùng estrogen phối hợp với progestin ít mắc sa sút trí tuệ hơn người không

dùng thuốc với tỷ lệ mắc bệnh giữa 2 nhóm là 2,05 Tuy nhiên, một nghiên cứu

gần đây cho thấy không có mối liên quan giữa bệnh Alzheimer và estrogen ở

người không hút thuốc nhưng nguy cơ có tăng ở người hút thuốc Tóm lại, hiện

chưa đủ bằng chứng để ủng hộ sử dụng estrogen cho bệnh nhân Alzheimer

Dựa trên các dữ liệu điều trị thay thế hormon để phòng ngừa tiên phát

Alzheimer, điều trị thay thế hormon có thể gây hại vì tăng nguy cơ mắc bệnh

này [32]

Chất Egb 761: được chiết xuất từ cây bạch quả (Ginko biloba) tỏ ra an

toàn nhưng các bằng chứng về hiệu quả điều trị bệnh chưa được thuyết phục

Thêm vào đó tác dụng không mong muốn và độc tính lâu dài của thuốc hiện

chưa rõ cũng như thành phần của dược liệu còn chưa được chuẩn hóa [32]

PHẦN II: ĐỐI TƯỢNG, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dung môi chiết: ethanol 70%

Dung môi chấm và chạy sắc ký: Cloroform, Methanol, nước cất

Phát hiện vết chấm: đèn tử ngoại bước sóng 254nm và 365nm,

dung dịch H2SO4 loãng, hơ nóng trên bếp đến khi vết chất hiện màu

Thuốc thử định tính dược liệu, cao chiết: anhydrid acetic, H2SO4 đặc, TT Fehling A và Fehling B, dung dịch FeCl3 5%, thuốc thử Dragendorff…

Tacrin, Trimethyltin do hãng Sigma Hoa Kỳ cung cấp

2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

Dụng cụ điều chế cao đặc bao gồm: máy cất quay Buchi Rotavapor R-220, cốc thủy tinh, tủ sấy, máy xay, bát sứ, bếp cách thủy

Hình 2.1 Máy cất quay Hình 2.2 Bếp cách thủy

Dụng cụ khảo sát thành phần hóa học bao gồm: bình nón, ống nghiệm, pipet, ống đong chia vạch, tủ sấy, dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng

2.2 Đánh giá tác dụng dược lý

 Hệ thống mô hình nhận diện đồ vật (Object Recognition Test) gồm [72]:

- Hộp quan sát được làm bằng thủy tinh, dạng hình hộp chữ nhật không nắp, tiết diện vuông cạnh 50cm, cao 40cm, nền đen (hình 5) Trong có đặt 2 vật thể

để nhận diện, giống hoặc khác nhau, đủ cao để chuột không thể trèo lên được Hộp và vật thể được làm sạch bằng ethanol 70% trước mỗi thử nghiệm để đảm bảo chuột không bị ảnh hưởng bởi mùi

- Cả hộp được đặt trong buồng kín, được đảm bảo đồng đều về cường độ ánh sáng đều giữa các góc trong hộp thuộc khoảng 12-16 lux

- Camera kết nối với máy tính và phần mềm phân tích ANY maze của hãng Stoeling, Mỹ

Hình 2.3 Hệ thống nhận diện đồ vật

 Hệ thống mê cung chữ Y (Y maze) gồm:

- Mê cung chữ Y: được làm bằng gỗ với 3 cánh A, B, C tạo thành mê cung hình chữ Y (hình 6), mỗi cánh có chiều dài 40cm, chiều rộng 12cm ở phía trên và 3cm ở đáy, chiều cao 18cm và các tấm để ngăn giữa các cánh tay và ngăn trung tâm Mê cung được đặt trong phòng kín, có đặt sẵn những hình ảnh định hướng không gian, những hình ảnh này không được thay đổi trong suốt quá trình thí nghiệm

- Camera được kết nối với máy tính và phần mềm phân tích kết quả ANY maze của hãng Stoeling, Mỹ

Hình 2.4 Hệ thống mê cung chữ Y

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Điều chế và định tính cao đặc

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu

- Phương pháp mất khối lượng do làm khô là sự giảm khối lượng của mẫu thử

biểu thị bằng phần trăm (kl/kl) khi được làm khô trong điều kiện xác định [5]

- Tiến hành: dùng dụng cụ sấy thủy tinh rộng miệng, đáy bằng và có nắp mài làm bì đựng mẫu thử, làm khô bì trong 30 phút, cân bì Cân vào bình 3g ± 10% bột mẫu thử, dàn mỏng không quá 5 mm Sấy 1 giờ ở 105 ± 2°C trong tủ sấy,

để nguội, cân ngay để xác định lại khối lượng

3.1.2 Quy trình điều chế cao đặc rễ Đinh lăng

- Quy trình chiết xuất:

Rễ được rửa sạch, phơi khô, thái lát mỏng và xay nhỏ thành bột Toàn bộ lượng bột cho vào bình chiết và được làm ẩm bằng ethanol 70% trong 1 giờ Phương pháp chiết hồi lưu trong máy cất quay hồi lưu

Lần 1: 250g bột dược liệu đã được làm ẩm bằng ethanol 70%, cho vào bình cất quay, thêm 2l ethanol 70%, lắp vào máy cất quay, chiết hồi lưu trong 3 giờ, thu được dịch chiết 1

Lần 2: tiếp tục thêm 1,5l ethanol 70%; chiết hồi lưu trong 2,5 giờ; thu được dịch chiết 2

Lần 3: tiếp tục thêm 1,5l ethanol 70%; chiết hồi lưu trong 2 giờ, thu được dịch chiết 3

Gộp 3 dịch chiết, cô cạn dung môi trong bát sứ trên bếp cách thủy với nhiệt độ 80°C đến khi thu được cao với thể chất thích hợp