Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học củ cây rận trâu (dioscorea sp ) họ củ nâu (dioscoreaceae)

Nhu cầu về lượng thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn, trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [22], [29], [31]..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI ANH

1101017 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI ANH

1101017

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY

1 Bộ môn Dược liệu

2 Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2016

Tôi xin cảm ơn toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu

đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi xuyên suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo và toàn thể thầy cô giáo giảng viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền cho tôi kiến thức cùng nhiệt huyết của thầy cô trong suốt những năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên, khích lệ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Mai Anh

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chi Dioscorea L 3

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Dioscorea L 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Dioscorea L 3

1.1.3 Phân bố 4

1.1.4 Ứng dụng của chi Dioscorea L 4

1.1.4.1 Ứng dụng trong đời sống 4

1.1.4.2 Ứng dụng trong y học 4

1.2 Diosgenin 5

1.2.1 Ứng dụng của diosgenin 5

1.2.2 Các loài thuộc chi Dioscorea dùng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin 6

1.2.3 Các phương pháp chiết xuất diosgenin 8

1.2.4 Các phương pháp định lượng diosgenin 9

1.3 Nần gừng (Dioscorea dissimulans) 10

1.3.1 Đặc điểm thực vật 10

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố 11

1.3.3 Ứng dụng 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 13

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 13

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 14

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật 15

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và xác định tên khoa học của cây Rận trâu 15

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 19

3.1.2.1 Vi phẫu lá 19

3.1.2.2 Vi phẫu thân 20

3.1.2.3 Vi phẫu thân rễ 21

3.1.3 Đặc điểm bột 22

3.1.3.1 Đặc điểm bột lá 22

3.1.3.2 Đặc điểm bột thân 23

3.1.3.3 Đặc điểm bột thân rễ 24

3.2 Kết quả nghiên cứu về hóa học 25

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 25

3.2.1.1 Định tính flavonoid 25

3.2.1.2 Định tính alcaloid 26

3.2.1.3 Định tính glycosid tim 26

3.2.1.4 Định tính coumarin 28

3.2.1.5 Định tính tanin 29

3.2.1.6 Định tính anthranoid 29

3.2.1.7 Định tính chất béo, caroten, sterol 30

3.2.1.8 Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin 30

3.2.1.10 Định tính saponin 31

3.2.2 Chiết xuất, phân lập và xác minh diosgenin 34

3.2.2.1 Chiết xuất 34

3.2.2.2 Phân lập diosgenin 35

3.2.2.3 Xác minh chất D2 36

3.2.3 Định lượng diosgenin 37

3.2.3.1 Chuẩn bị mẫu 37

3.2.3.2 Phân tích mẫu 38

3.3 Bàn luận 40

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

16 – DPA: 16-dehydro pregnenolon acetat

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

HPTLC : High Performance Thin Layer Chromatography

(Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) SKLM : Sắc ký lớp mỏng

STT : Số thứ tự

TT : Thuốc thử

SD : Standard deviation (Độ lệch chuẩn)

UV : Ultra violet (Phổ tử ngoại)

DD : Dung dịch

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các loài Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp 7 Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của cây Rận trâu với loài có đặc điểm gần

nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae) 17

Bảng 3.2 Tiến hành xác định chỉ số phá huyết 32 Bảng 3.3 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong thân rễ Rận trâu 33 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của diosgenin 38 Bảng 3.5 Hàm lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu 39

Trang Hình 3.1.1 Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu 16 Hình 3.1.2 Vi phẫu lá Rận trâu 20 Hình 3.1.3 Vi phẫu thân Rận trâu 21 Hình 3.1.4 Vi phẫu thân rễ Rận trâu 22 Hình 3.1.5 Một số đặc điểm bột lá Rận trâu 23 Hình 3.1.6 Một số đặc điểm bột thân Rận trâu 24 Hình 3.1.7 Một số đặc điểm bột thân rễ Rận trâu 25 Hình 3.2.1 Sắc ký lớp mỏng chất D2 với diosgenin đối chiếu 37 Hình 3.2.2 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn của diosgenin 39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, có thảm thực vật rất phong phú và đa dạng với hơn một nghìn loài thực vật bậc cao, trong đó có hàng nghìn loài cây có ích, được sử dụng làm thuốc, rau, gỗ, nhuộm… Cha ông ta từ xưa đã biết dùng cây cỏ để phòng và chữa bệnh, tuy nhiên việc sử dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm của nhân dân từng địa phương Do đó việc nghiên cứu cây thuốc nhằm làm sáng tỏ cơ

sở khoa học của kinh nghiệm dân gian là vấn đề rất cấp bách và cần thiết

Ngày nay, Dược liệu không những được sử dụng trong những bài thuốc hay bào chế dưới dạng các biệt dược mà còn là nguồn nguyên liệu chiết xuất ra các chất tinh khiết để bào chế thuốc hoặc làm nguyên liệu bán tổng hợp ra các thuốc khác Nhờ những tiến bộ khoa học kỹ thuật, con người có thể tách được ngày càng nhiều chất tinh khiết từ dược liệu, trong đó không thể không nhắc đến diosgenin

Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất từ diosgenin Tuy chất này có mặt trong nhiều họ thực vật, song “chỉ có họ Dioscoreaceae

(chi Dioscorea L.) thì mới có giá trị thực tế” trong việc khai thác chiết xuất diosgenin

[17] Hằng năm, ước tính ngành Dược cần 10.000 tấn thân rễ các loài thuộc chi

Dioscorea để sản xuất diosgenin [29] Nhu cầu về lượng thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea để sản xuất diosgenin ngày càng lớn, trong khi nguồn nguyên liệu cung cấp

ngày càng giảm do sự khai thác quá mức [22], [29], [31] Điều này đòi hỏi cần tìm thêm những nguồn nguyên liệu khác cung cấp diosgenin

Gần đây chúng tôi mới phát hiện một loài Dioscorea sp tại Đà Nẵng mà người dân

địa phương gọi là cây Rận trâu Cho đến nay, theo tổng quan tài liệu chưa thấy có nghiên cứu nào sâu về cây này ở Việt Nam Để góp phần vào việc tìm hiểu và nâng cao giá trị sử dụng dược liệu Rận trâu, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật và thành phần hóa học của cây Rận trâu (Dioscorea sp.) họ Củ nâu

(Dioscoreaceae)” với mục tiêu:

 Góp phần xây dựng tiêu chuẩn dược liệu và giám định tên khoa học cây Rận trâu

 Chiết xuất và phân lập diosgenin trong thân rễ Rận trâu

 Định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Chi Dioscorea L

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Dioscorea L

Vị trí phân loại của chi Dioscorea L trong hệ thống phân loại thực vật của

Takhatajan 1987 [4] như sau:

1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Dioscorea L

 Thực vật chí Trung Quốc [33] mô tả:

Cây thảo có thân quấn Thân rễ hay rễ củ, đa dạng về màu sắc, hình dạng, thành phần hóa học và khả năng cắm sâu dưới mặt đất Có hành con ở nách lá hoặc không có hành con Lá có cuống, mọc so le hay mọc đối, đơn hay kép chân vịt, có 3 – 9 gân chính Hoa đơn tính (cây khác gốc, hiếm khi lưỡng tính), sắp xếp theo hình xoắn ốc ở nách lá, cụm hoa bông thon dài hay chùm, hay theo cụm hoa xim, thường kết hợp đồng thời nhiều kiểu, đôi lúc tập hợp lại thành chùm kép ở ngọn hay nách lá bằng cách giảm bớt những lá mọc đối diện Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có Hoa cái mọc thành cụm bông dài 3,5 – 10cm, hoa thưa, bộ nhụy gồm 3 lá noãn, bầu dưới 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn Quả nang 3 cánh, mở từ đỉnh khi chín Hạt nhỏ thường có cánh chạy dọc quả

 Thực vật chí Đông Dương [21] mô tả:

Cây cỏ lâu năm hoặc hàng năm Bộ phận dưới mặt đất giàu chất dự trữ (tinh bột) Thân leo, có những loài thì thân quấn sang phải, số khác thì quấn sang trái Lá nguyên,

một số ít trường hợp là lá kép, lá mọc xen kẽ hoặc mọc đối Kiểu hoa: đa phần là hoa đơn tính, hiếm khi gặp kiểu hoa khác Hoa thường không có cuống hoặc có cuống rất ngắn, mọc thành chùm hay bông rủ xuống Lá đài và cánh hoa giống nhau, lá đài 3, cánh hoa 3 Hoa đực: nhị 6 hoặc 3 có khi lép hay không có và nhị rất ngắn Hoa cái giữa các loài trong chi không khác nhau lắm, các đặc điểm không phong phú như hoa đực Bầu 3 ô, mỗi ô chứa 2 noãn, noãn ngược, đầu nhụy 6 tạo thành 3 cặp Quả nang chẻ ô có 3 cánh Quả mở bằng cách nứt dọc theo mép của cánh với trục quả Hạt 6, có cánh ở tất cả các loài

1.1.3 Phân bố

Chi có khoảng 600 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới châu Á, Australia, châu Mỹ [9] Ở châu Á có khoảng 140 loài [21] Ở Việt Nam có khoảng hơn 40 loài [4], [6], [9], [33]

1.1.4 Ứng dụng của chi Dioscorea L

1.1.4.1 Ứng dụng trong đời sống

 Do thân rễ chứa nhiều chất dinh dưỡng nên một số loài thuộc chi Dioscorea

được sử dụng làm lương thực, chế biến thức ăn, đặc biệt khi thiếu đói, giáp hạt như:

Khoai mỡ (D alata), Củ từ (D esculenta), Khoai rạng (D glabra), Củ mài (D

persimilis)… [4], [6], [9], [20]

 Thân rễ chứa tanin, dùng để nhuộm lưới và quần áo như: Củ nâu (D cirrhosa),

Từ ngược mùa (D intempestiva) … [4], [6], [9], [20]

 Thân rễ một số loài có độc, dùng để diệt chấy rận, duốc cá, tẩm mũi tên như:

củ Mài gừng (D zingiberensis), Từ poilane (D poilanei), Từ tam giác (D deltoidea),

Củ nần (D hispida)… [6], [9], [20]

1.1.4.2 Ứng dụng trong y học

 Một số loài dùng để chiết xuất diosgenin từ thân rễ Ngoài ra, nhiều loài thuộc

chi Dioscorea được sử dụng làm thuốc Dưới đây là một số tác dụng của các loài

Dioscorea:

 Bổ dưỡng, nhất là khi cơ thể suy nhược, thận suy: D alata, D esculenta, D

glabra, D persimilis… [4], [6]

 Chỉ huyết, tiêu ứ huyết: D bulbifera, D cirrhosa, D esculenta… [4], [6], [9]

 Mạnh gân xương, trị phong thấp, đau lưng, mỏi gối: D hispida, D

pentaphylla, D collettii… [4], [6], [9]

 Trị sưng tấy, vết thương phần mềm: D esculenta, D chingii, D subcalva, D

pentaphylla, D hispida …[4], [6], [9]

 Giải các loại thuốc độc: D esculenta [4], [6], [9]

 Các loài thuộc chi Dioscorea có chứa phytoestrogens, các chất này có nhiều

tác dụng kháng độc tố như làm chậm quá trình lão hóa của cơ thể và tăng cường sức

khỏe toàn diện nhất là ở phụ nữ Gần đây, thân rễ của các loài thuộc chi Dioscorea

được xác định có tác dụng điều chỉnh đáp ứng miễn dịch, kháng viêm, chống loãng xương Thêm nữa, tác dụng chống oxy hóa của dioscorin – một protein dự trữ trong

thân rễ của các loài thuộc chi Dioscorea cũng được nghiên cứu rộng rãi Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng sử dụng thân rễ các loài thuộc chi Dioscorea có thể cải

thiện một số bất thường về chuyển hóa, bao gồm tăng đường huyết, bất thường chức năng ruột và chuyển hóa lipid [30]

1.2 Diosgenin

1.2.1 Ứng dụng của diosgenin

Diosgenin được chứng minh là có tác dụng duy trì ổn định mức cholesterol máu và

là nguyên liệu khởi đầu cho việc tổng hợp một số sản phẩm nội tiết như: dehydroepiandrosteron, progesteron Diosgenin có tác dụng ngăn ngừa sự mất xương ở mức độ tương tự estrogen Do vậy diosgenin được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân sau mãn kinh để làm giảm sự tiến triển loãng xương [34]

Diosgenin có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu và huyết khối, kéo dài thời gian thromboplastin (APTT), thời gian thrombin (TT), thời gian prothrombin (PT) Do đó,

nó có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về tim mạch như bệnh mạch vành và cơn đau thắt ngực [25]

Bên cạnh đó diosgenin còn có khả năng ức chế sự tồn tại, sự phát triển và gia tăng của các tế bào ung thư vú [23], [26]

Ứng dụng quan trọng của diosgenin đó là nguồn nguyên liệu bán tổng hợp ra 16 – dehydro pregnenolon acetat (16 – DPA), là chất trung gian để tổng hợp các dẫn xuất steroid Khoảng 50 – 60% dẫn chất steroid dùng làm thuốc trên toàn cầu được sản xuất

từ diosgenin Hàng năm, ước tính ngành dược cần 10.000 tấn thân rễ các loài thuộc chi

Dioscorea để sản xuất diosgenin [29], [31]

Trong số hàng trăm sapogenin steroid được biết cho đến nay, thực tế cũng chỉ có khoảng mười chất có giá trị kinh tế lớn vì 2 lí do:

 Có nguồn nguyên liệu tự nhiên dồi dào hoặc trồng trọt dễ, có năng suất cao

 Hệ thống Spiroketal trong cấu trúc của chúng dễ dàng bị phá để cho ra hợp chất trung gian là dehidropregnenolon acetat (DPA) là khung cơ bản để tổng hợp các thuốc steroid

Diosgenin là chất có ưu thế nhất về 2 phương diện trên [8]

1.2.2 Các loài thuộc chi Dioscorea dùng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin

Trong thực tế, để tổng hợp các hormon steroid, người ta dùng chủ yếu diosgenin vì khoảng 90% các dẫn chất steroid dùng làm thuốc được sản xuất đều đi từ nguyên liệu

là diosgenin Mặc dù diosgenin có gặp trong họ Liliaceae (chi Trillium), họ Zygophyllaceae (chi Tribulus), họ Solanaceae (chi Solanum), họ Leguminosaceae (chi

Trigoella), họ Zingiberaceae (chi Costus), họ Taccaceae (chi Tacca) nhưng chỉ có họ

Dioscoreaceae mới có giá trị thực tế [17]

Theo số liệu của Barua và cộng sự năm 1954, 1956 có trên 50 loài thuộc chi

Dioscorea chứa diosgenin [30] Những loài thuộc chi Dioscorea như D deltoidea

Wall, D composita Hemsl., D floribunda M.Martens & Galeotti chứa hàm lượng

saponin steroid đáng kể thường có thân quấn ngược chiều kim đồng hồ [17] Phần lớn

diosgenin được sản xuất trên thế giới xuất xứ từ các loài Trung Mỹ, chủ yếu là D

floribunda và D composita, cả hai loài đều mọc hoang ở bản địa [30] Trong thân rễ

của D floribunda và D composita có thành phần diosgenin và yamogenin chiếm gần 90% glycosid toàn phần, cả hai đều là những tiền chất steroid có giá trị, D deltoidea

chứa diosgenin ở trạng thái tinh khiết nhất, nên có giá cao trên thị trường steroid [24] Tuy nhiên đáng buồn là các công ty đã khai thác một lượng lớn thân rễ loài này từ các khu rừng, bất chấp những quy định nghiêm ngặt về khai thác, những vùng ở Kashmir

và Himachal Prades bị khai thác cạn kiệt hoàn toàn Nghiêm trọng hơn là ở những nơi

D deltoidea còn sót lại, thành phần diosgenin giảm mạnh so với trước [22] Ngày nay,

đa phần thuốc tránh thai Tân dược được tổng hợp toàn phần, song ở Ấn Độ và Trung Quốc thuốc tránh thai đường uống và một số thuốc có khung steroid khác lại được bán

tổng hợp từ diosgenin – một chất được chiết xuất từ các loài thuộc chi Dioscorea

D nipponica và D zingiberensis chứa diosgenin và được trồng nhiều ở Trung

Quốc, nước sản xuất diosgenin nhiều nhất hiện nay [21]

Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Dioscorea quan trọng được sử dụng để sản xuất

diosgenin trong công nghiệp trên thế giới [31]

Loài Xuất xứ

D composita Hemsl

Mexico

D mexicana Scheidw

D floribunda M.Martens & Galeotti

D deltoidea Wall ex Griseb Ấn Độ

D sylvatica Eckl Nam Phi, Zimbabue

Việt Nam trong 4 họ: Dioscoreaceae (chi Dioscorea), Costaceae (chi Costus), Zygophyllaceae (chi Tribulus), Taccaceae (chi Tacca) Qua đó phát hiện 4 loài có triển

vọng làm nguyên liệu chiết xuất diosgenin [10], [11]:

+ D dissimulans (hàm lượng diosgenin 2%)

+ D membranaceae (hàm lượng diosgenin 2 – 2,3%)

+ D collettii (hàm lượng diosgenin 2,5 – 4,4%)

+ D zingiberensis (hàm lượng diosgenin 1,4 – 2,4%)

Về mối liên quan giữa hình thái thực vật và thành phần hóa học, các loài thuộc chi

Dioscorea có hàm lượng saponin steroid đáng kể ở Việt Nam, bên cạnh đặc điểm thân

rễ và dây leo quấn trái, đều có những cặp gai cong ở gốc cuống lá [10]

Cũng trong thời gian này, Viện Dược liệu [18], [20] di thực 3 loài thuộc chi

Dioscorea vào Việt Nam: D composita, D floribunda và D deltoidea và đã xác định

điều kiện trồng, chăm sóc phù hợp với 3 loài trên Tuy nhiên, sapogenin thu được từ D

composita và D floribunda đều có tạp chất pennogenin (hàm lượng pennogenin trong

sản phẩm từ vết đến 35% đối với D composita và từ 1 – 5% đối với D floribunda)

Các nhà khoa học đã nghiên cứu xử lý tạp chất pennogenin song không thành công Nghiên cứu bán tổng hợp 16 – DPA từ hỗn hơp diosgenin – pennogenin chưa biết tỷ lệ

thành phần, chiết xuất từ D composita và D floribunda cho thấy hiệu suất chỉ bằng 1/2

so với điều chế từ diosgenin có hàm lượng trên 90%

Các nhà khoa học tại Viện Dược liệu đã xây dựng quy trình chiết xuất diosgenin từ

dược liệu, áp dụng để chiết diosgenin từ D floribunda trên quy mô phòng thí nghiệm

và quy mô bán công nghiệp Từ diosgenin chiết được đã tổng hợp 16 – DPA và các dẫn xuất steroid [7], [18]

1.2.3 Các phương pháp chiết xuất diosgenin

Bột dược liệu sau khi thủy phân bằng acid, trung tính hóa và sấy khô ta được bột dược liệu đã xử lý và là nguyên liệu chiết xuất diosgenin

 Chiết bằng Soxhlet

Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, gói lại bằng giấy lọc Chuyển gói dược liệu vào trong Soxhlet, tiến hành chiết xuất diosgenin Sử dụng dung môi chloroform để chiết xuất

 Chiết bằng CO2 siêu tới hạn

Cân 1 lượng dược liệu đã xử lý, ngâm trương nở dược liệu trong một lượng đồng dung môi (tùy theo điều kiện khảo sát) trong khoảng 30 phút – 1 giờ

Tiến hành chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn trong các điều kiện khảo sát cụ thể

về dung môi, áp suất, nhiệt độ, thời gian… Dịch chiết thu vào bình nón có nút Cất quay loại dung môi ta thu được cắn chiết [27]

1.2.4 Các phương pháp định lượng diosgenin

 Phương pháp cân

Bột dược liệu được thủy phân bằng acid, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó bốc hơi dung môi, sấy, cân [16]

 Phương pháp đo quang

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành sắc ký lớp mỏng để xác minh diosgenin Diosgenin được chiết bằng chloroform, lên màu bằng FeCl3 và H3PO4 – H2SO4 (10:1) (tt/tt), đo ở bước sóng 485nm [16]

 Phương pháp sắc ký khí

Bột dược liệu được ủ men, thủy phân, trung tính hóa, sấy khô, hòa tan trong dung môi với chất nội chuẩn cholesterol rồi phân tích bằng máy sắc ký khí [13]

 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan trong methanol rồi phân tích bằng máy HPLC [32]

 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC)

Bột dược liệu được thủy phân, chiết bằng dung môi hữu cơ, bốc hơi dung môi, hòa tan cắn trong chloroform Chấm sắc ký của mẫu, cùng với dãy diosgenin đối chiếu Sau

đó đo mật độ quang vết sắc ký bằng Densitometer [2], [28]

1.3 Nần gừng (Dioscorea dissimulans)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

 Sách đỏ Việt Nam mô tả [3]:

Dây leo bằng thân quấn về bên trái; dài 1,5 – 3m; đường kính thân leo 0,25 – 0,35

cm Thân rễ nạc, nằm ngang, phân nhánh, màu vàng nhạt Rễ chùm nhiều, cứng Lá có cuống, mọc so le, cuống dài 2,5 – 4 cm, gốc cuống lá có 2 u nhỏ giống như gai Phiến

lá gồm 3 lá chét, hình thuôn hay elip nhọn đầu, 6 – 9 × 2 – 3 cm, lá chét giữa lớn hơn 2

lá bên, gốc 2 lá chét bên gần tròn và hơi lệch; 5 gân chính, gân phụ hơi rõ ở mặt dưới Hoa đơn tính khác gốc, cụm hoa dạng bông, mọc ở kẽ lá Hoa đực không cuống, dạng chuông, trên miệng xẻ 6 răng; 6 nhị, dẹt Hoa cái có cuống ngắn, 2 mm; lá bắc nhỏ; bao hoa 6 cánh; bầu 3 ngăn Quả nang gồm 3 cánh, dài 25 – 28 mm, rộng 18 mm Hạt hình ovan, hơi dẹt, 5 × 8 mm, có cánh mỏng

 Nguyễn Hoàng và cộng sự mô tả [14]:

Thân dây leo (hoặc bò lan trên mặt đất ở những bãi đất trống) quấn sang trái, dài đến 5m, đường kính thân 2 – 3mm, thân có từng cặp gai cong, dài 1 – 2mm ở hai gốc cuống lá Lá mọc so le có cuống dài 5 – 7cm mang 3 lá chét, lá chét ở giữa to và dài hơn, hình trứng nhọn ở đầu, hai lá bên bé hơn, hình trứng lệch, phiến lá có 3 gân xuất phát từ gốc Củ có nhiều nhánh, nhìn hao hao giống củ gừng, có nhiều gai nhọn và rễ con cứng phân bố đều trên mặt củ Cây tập trung ở những khu rừng thưa có ánh sáng hoặc đồi chè, đất pha cát, ven các bờ mương, bờ suối

 Cây cỏ Việt Nam mô tả [12]:

Củ dài 20 cm, to 3 – 4 cm, có u do đáy rễ, nạc trắng; thân leo, quấn qua trái, không gai Lá mọc xen, do 3 lá phụ thon dài, mỏng, không lông, lá giữa to hơn, gân từ đáy 5; đáy cuống có u như gai Chùm như gié thòng; hoa có cọng ngắn, 2 – 2,5 mm Nang có cánh cao 18 mm; hột xoan, to 5 – 8 mm, có một cánh nâu dợt quanh

 Thực vật chí Việt Nam mô tả [9]:

Dây leo nhiều năm, dài 5 – 10 m, quấn trái; thân nhẵn hình trụ, không có lông; thân

rễ dạng củ, nằm ngang, có thể phân nhánh, dài 20 cm, đường kính 3 – 4 cm, có u lồi to,

vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu trắng Lá kép, 3 lá chét, mỏng, mọc cách, cuống dài

5 – 6 cm, 2 bên gốc cuống có u như gai; lá chét giữa to nhất, hình mũi giáo, dai, nhẵn,

5 gân từ gốc, kích thước 8 × 3 – 5 cm, chất giấy, mép nguyên, 2 mặt không có lông, chóp nhọn, gốc tù, cuống ngắn; các lá chét bên kích thước chỉ bằng 1/2 lá chét giữa, gốc lệch Hoa đều, đơn tính, khác gốc, mẫu 3 Cụm hoa bông đực chưa thấy, có thể

giống với cụm hoa đực của loài Dioscorea simulans của Trung Quốc Cụm hoa bông

cái rủ xuống Hoa cái: cuống hoa dài 0,2 – 0,3 cm; bao hoa 6 mảnh, hình trứng hoặc hình trứng rộng Bầu hạ, 3 ô, mỗi ô 2 – nhiều noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy hình trụ; đầu nhụy 3 thùy, 6 nhị thoái hóa, đính đối diện với mảnh bao hoa Quả nang, cuống dài 0,5 – 0,6 cm, cong gập lại, 3 cạnh dạng cánh, dài 2,5 – 2,8 cm, rộng 1,8, đỉnh tròn,

mở theo khe dọc từ đỉnh Hạt hình trứng, kích thước 0,8 × 0,5 cm, có cánh dạng màng, bao xung quanh

1.3.2 Đặc điểm sinh học, sinh thái và phân bố

Mùa hoa tháng 6 – 7, quả tháng 7 – 9 Nhân giống tự nhiên chủ yếu từ hạt Phần thân leo lụi hàng năm vào mùa đông và mọc lại vào đầu năm sau

Cây ưa sáng hoặc hơi chịu bóng Thường leo lên cây bụi nhỏ hay cỏ ở ven rừng, nhất là hành lang ven suối ở cửa rừng, hay bờ các nương rẫy, ở độ cao 400 – 600 m Phân bố: + Ở Việt Nam: Quảng Nam (Trà My: Trà Giác, Duy Xuyên), Quảng Ngãi, Bình Định (An Lão: An Toàn), Khánh Hòa (Khánh Sơn: Trung Hạp; Khánh Vĩnh), Đà Nẵng (Bà Nà), Phú Yên (Đồng Xuân: Đa Lộc) [3], [9]

+ Trên thế giới: Trung Quốc [3]

1.3.3 Ứng dụng

Thân rễ có diosgenin, làm nguyên liệu bán tổng hợp thuốc chống viêm, hormon sinh dục, thuốc tránh thụ thai… (chú ý độc không ăn được) [3], [9]

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu Rận trâu thu hái ở Đà Nẵng vào tháng 2 năm 2015

Thân rễ được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 600C, nghiền thành bột thô, bảo quản nơi khô thoáng

Một phần thân, lá, thân rễ được bảo quản trong cồn 600C để nghiên cứu đặc điểm

 Diosgenin đối chiếu của Viện Dược liệu

 Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck (kích thước hạt 9,5 – 11,5µm)

 Silica gel 60 F254 Merck (kích thước hạt 60 – 200 µm) dùng cho sắc ký cột pha thường

 Silica gel GF254 Merck (kích thước hạt 5 – 30 µm) dùng cho sắc ký điều chế

 Hóa chất:

+ Acid sulfuric, acid clohydric, natri hydroxyd, natri carbonat…

+ Các thuốc thử dùng trong các phản ứng định tính: TT Mayer, Dragendorff, Ninhydrin, Diazo…

+ Cloramin, cloralhydrat, acid acetic, xanh methylen, đỏ son phèn

+ Thuốc thử vanillin trong acid sulfuric đặc

+ Dung dịch đệm phosphat – natri clorid

 Dung môi: Chloroform, methanol công nghiệp, methanol Merck, ethanol, aceton, nước cất

 Dụng cụ: bát sứ, ống nghiệm, pipet chính xác, pipet paster, bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, ống đong

2.1.3 Thiết bị

 Bếp cách thủy, sinh hàn hồi lưu, Soxhlet

 Máy đo quang phổ UV

 Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

 Máy đo độ ẩm Sartorius

 Tủ sấy (Memmert, Đức)

 Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 366nm

 Kính hiển vi Labomed

 Máy cắt vi phẫu cầm tay

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo khóa phân loại theo đơn vị thứ để xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu

 Mô tả đặc điểm vi phẫu của mẫu nghiên cứu:

+ Vi phẫu: thân, thân rễ, lá

+ Soi bột: thân, thân rễ, lá

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất có trong mẫu Rận trâu

 Chiết xuất, phân lập, định lượng diosgenin trong mẫu Rận trâu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu về thực vật

 Đặc điểm hình thái thực vật:

 Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo phương pháp mô tả phân tích [5]

 Thu hái, làm tiêu bản mẫu cây khô

 Nghiên cứu đặc điểm vi học

 Đặc điểm vi phẫu: vi phẫu được cắt bằng máy cắt cầm tay, tẩy và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu

và chụp ảnh dưới kính hiển vi [5]

 Đặc điểm bột: lá, thân, thân rễ được sấy khô ở 600C, nghiền nhỏ thành bột bằng cối sứ, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [15]

 Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu:

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu trữ tại một số phòng tiêu bản mẫu khô, đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong các tài liệu chuyên sâu

về thực vật [4], [6], [7], [9], [32] cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

 Định tính sơ bộ các nhóm chất: tiến hành các phản ứng định tính đặc trưng cho từng nhóm chất [5]

 Chiết xuất diosgenin tham khảo phương pháp chiết xuất diosgenin từ D floribunda

trong tài liệu [18] Phân lập diosgenin bằng sắc ký cột, sử dụng pha tĩnh là Silicagel

60 Merck, rửa giải bằng các dung môi thích hợp và sắc ký điều chế Xác minh diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng với chất đối chiếu

 Định lượng diosgenin bằng phương pháp HPLC

Tiến hành định lượng diosgenin trong thân rễ Rận trâu bằng HPLC [1], [13], [14]

sử dụng phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm.Tham khảo

quy trình định lượng diosgenin trong D zingiberensis bằng HPLC [25]

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu về thực vật

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của cây Rận trâu

 Mô tả đặc điểm thực vật:

Dây leo bằng thân quấn về bên trái, dài 2 – 4 m (Hình 3.1.1.A), thân leo nhẵn, không lông, có những đốm màu tía nằm rải rác dọc thân và dày dần ở gốc cuống lá (Hình 3.1.1.B,C) Thân leo hình trụ, nhỏ, đường kính 2,5 – 3,5 mm (Hình 3.1.1.B,C) Thân rễ dài 10 – 15 cm, đường kính 0,8 – 1,5 cm, nạc, nằm ngang, có thể phân nhánh, lớp vỏ ngoài sần sùi, màu vàng nâu, ruột màu trắng, hơi vàng, vị đắng (Hình 3.1.1.N) Thân rễ có những u lồi, đường kính khoảng 2mm (Hình 3.1.1.O) Rễ chùm nhiều, cứng (Hình 3.1.1 L, M)

Lá có cuống, mọc so le, cuống dài 2 – 3 cm, thiết diện tròn, không lông, có đốm màu tía, đốm thưa ở phần gốc cuống lá và dày dần khi đến gần thân; gốc cuống lá sát với thân, tròn, hơi lõm, có kích thước lớn hơn phần cuống giữa, dài khoảng 5 mm, mọc võng xuống dưới và không có đốm màu tía (Hình 3.1.1.E) Gốc cuống lá có 1 cặp gai cong, nhọn, dài 1 – 2 mm (Hình 3.1.1.D) Lá kép hình chân vịt gồm 3 lá chét, phiến lá hình bầu dục hay hình trứng, ngọn lá nhọn, gốc thuôn, kích thước 7 – 10 x 3 – 5 cm, màu xanh lục, mặt dưới màu sậm hơn, cả 2 mặt đều không có lông, mép lá nguyên, hơi gợn sóng Lá chét giữa to và dài hơn; hai lá bên bé hơn, hình trứng lệch; phiến lá có 3 gân tỏa ra từ gốc, gân chính hơi lõm ở mặt trên, lồi lên ở mặt dưới Gốc các lá chét ngắn, có màu tía cả ở mặt trên và mặt dưới (Hình 3.1.1.F, G, H)

Cụm hoa chùm kép, mọc ở kẽ lá Hoa nhỏ, đều, kích thước khoảng 1 × 1 mm, màu xanh, có cuống rất ngắn, đơn tính khác gốc Chùm đơn mọc ra từ kẽ mỗi lá bắc Cả cụm hoa được bao phủ bởi lớp lông tơ mềm (Hình 3.1.1.J, K)

Quả nang có 3 cánh, dài 1 – 2 cm, rộng 1,5 cm (Hình 3.1.1.I)

Mùa hoa tháng 6 – 7, mùa quả tháng 7 – 9

Hình 3.1.1: Một số đặc điểm hình thái của cây Rận trâu

A – Dạng sống; B,C – Thân; D – Cặp gai cong; E, F, G, H – Lá; I – Quả; J, K – Cụm

hoa; L, M, N, O – Thân rễ

 Xác định tên khoa học:

Bảng 3.1 So sánh đặc điểm thực vật của cây Rận trâu với loài có đặc điểm gần

nhất thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae)

Dài 5 – 6 cm Dài 2,5 – 4

cm, mọc so

le

Dài 5 – 7cm, mọc so le

Cặp

gai

Gốc cuống lá có

1 cặp gai cong, nhọn, dài 1 – 2

mm

2 bên gốc cuống lá có u như gai

Gốc cuống có

2 u nhỏ giống như gai

Gốc cuống lá có cặp gai cong, dài 1 – 2 mm

Phiến

lá

3 lá chét, hình bầu dục/ hình trứng, nhọn đầu, gốc thuôn,mép nguyên, không lông, kích thước

7 – 10 x 3 – 5

cm, cuống ngắn

3 lá chét, mép nguyên, không lông, gốc tù, chóp nhọn, cuống ngắn

3 lá chét, hình thuôn/

elip nhọn đầu, kích thước 6 – 9 × 2 – 3

Lớn hơn 2 lá chét bên

Lớn hơn 2 lá chét bên

Lớn hơn 2 lá chét bên, hình trứng nhọn ở đầu

Lá chét Bé hơn lá chét Kích thước chỉ Gốc gần tròn Bé hơn lá chét Loài

Đặc điểm

bên giữa, hình trứng

lệch

bằng 1/2 lá chét giữa, gốc lệch

Quấn trái, dài

5 – 10 m, nhẵn, hình trụ, không lông

Quấn trái, dài 1,5 – 3m, đường kính 2,5 – 3,5 cm

Quấn trái, dài đến 5m, đường kính 2 – 3mm

Thân

rễ

Nạc, nằm ngang,

có thể phân nhánh, dài 10 –

15 cm, đường kính 0,8 – 1,5

cm, có u lồi, đường kính khoảng 2 mm,

vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu trắng, hơi vàng Rễ chùm nhiều, cứng

Dạng củ, nằm ngang, có thể phân nhánh, dài 20 cm, đường kính 3 –

4 cm, có u lồi

to, vỏ ngoài màu vàng nâu, ruột màu trắng

Thân rễ nạc, nằm ngang, phân nhánh, màu vàng nhạt Rễ chùm nhiều, cứng

Củ có nhiều nhánh, nhìn hao hao giống củ gừng, nhiều gai nhọn và rễ con cứng phân bố đều trên mặt củ

3 cánh, dài 2,5 – 2,8 cm, rộng 1,8 mm

Từ bảng so sánh, nhận thấy mẫu Rận trâu thu được có nhiều điểm giống với loài D

dissimulans thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae) được mô tả trong các

tài liệu [3], [9], [14]

Qua phân tích các đặc điểm hình thái mẫu cây Rận trâu thu được; kết hợp với bảng

so sánh; cùng với việc tra cứu các tài liệu khóa phân loại thuộc chi Dioscorea L., căn

cứ vào tài liệu [3], [4], [6], [9], [33]; so sánh mẫu tiêu bản thực vật (Phụ lục 3) với mẫu tiêu bản thực vật số hiệu P00642258 của phòng Tiêu bản Thực vật – Bảo tàng lịch sử

tự nhiên Paris (Phụ lục 4) và với sự giúp đỡ của TS Nguyễn Hoàng, chúng tôi mới sơ

bộ kết luận mẫu Rận trâu thu hái tại Đà Nẵng là một loài thuộc chi Dioscorea L., họ Củ nâu (Dioscoreaceae) và dự đoán tên khoa học của cây là Dioscorea dissimulans Prain

Phần gân lá: mặt trên hơi lồi, mặt dưới lồi tròn Từ ngoài vào trong quan sát thấy

các đặc điểm sau: Ngoài cùng là hai lớp biểu bì trên (1) và biểu bì dưới (2) cấu tạo bởi những tế bào nhỏ, hình chữ nhật hoặc đa giác, không đều, xếp xít nhau thành hàng Mô cứng (3) gồm những tế bào hình đa giác, có vách dày, xếp thành vòng mô cứng, bao xung quanh các bó libe – gỗ Libe (4), gỗ (5) Mô mềm (6) là những tế bào hình trứng hay hình đa giác có kích thước không đều nhau, vách mỏng

Phần phiến lá: Tế bào biểu bì trên to hơn tế bào biểu bì dưới Mô khuyết cấu tạo

bởi những tế bào không đều, để hở những khoảng gian bào to lớn (7) Giữa 2 lớp biểu

bì có thể gặp một vài bó sợi hay bó mạch nhỏ (8) (Hình 3.1.2)

Hình 3.1.2: Vi phẫu lá Rận trâu

1 Biểu bì trên, 2 Biểu bì dưới, 3 Mô cứng, 4 Libe, 5 Gỗ, 6 Mô mềm,

7 Mô khuyết, 8 Bó mạch 3.1.2.2 Vi phẫu thân

Thân Rận trâu có thiết diện tròn Đi từ ngoài vào trong: ngoài cùng là lớp biểu bì (1) cấu tạo bởi 1 lớp tế bào sống, mặt ngoài phủ cutin màu xanh hình răng cưa, hình gần tròn xếp đều đặn Mô mềm vỏ (2) gồm 5 – 8 lớp tế bào hình tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều, to hơn tế bào biểu bì, vách mỏng Nội bì (3) là lớp tế bào trong cùng của phần vỏ, gồm 1 hàng tế bào khá đều đặn, có vách dày lên đáng kể, phần hóa bần tạo thành khung chữ U

Dưới nội bì là trụ bì (4) Trụ bì hóa mô cứng làm nhiệm vụ nâng đỡ, cấu tạo bởi 4 –

5 lớp tế bào Dưới trụ bì là các yếu tố dẫn nhựa của thân cây, đó là các bó libe – gỗ (5) Các bó libe – gỗ trong trụ giữa rất nhiều và xếp không có trật tự, gỗ phân hóa li tâm

Sợi gỗ (6) tập trung thành từng bó nằm trong các bó libe – gỗ và thường bao lấy một phần bó libe Libe cấp I (7), gỗ cấp I (8)

Trong cùng là mô mềm ruột (9) hóa mô cứng, gồm những tế bào tròn hay bầu dục, vách mỏng, kích thước lớn, khá đều nhau (Hình 3.1.3)

Hình 3.1.3 Vi phẫu thân Rận trâu

1 Biểu bì, 2 Mô mềm vỏ, 3 Nội bì, 4 Trụ bì, 5 Bó libe – gỗ,

6 Bó sợi gỗ, 7 Libe I, 8 Gỗ I, 9 Mô mềm ruột 3.1.2.3 Vi phẫu thân rễ

Vi phẫu tiết diện tròn Lớp bần (1) dày, gồm 4-5 lớp tế bào, vách hơi uốn lượn, xếp xuyên tâm Mô mềm vỏ (2), gồm các tế bào hình đa giác, kích thước không đều

Trụ bì (3) gồm 1 – 2 lớp tế bào kích thước không đều, có xu hướng bị ép dẹp bởi các

bó libe – gỗ nằm gần đó Các bó libe – gỗ (4), gỗ bao quanh libe, kích thước không đều, nằm rải rác trong phần trung trụ Libe (5), gỗ (6) Mô mềm ruột (7) là các tế bào hình tròn, to hơn tế bào mô mềm vỏ, hóa gỗ ít nhiều (Hình 3.1.4)

Hình 3.1.4: Vi phẫu thân rễ Rận trâu

1 Bần, 2 Mô mềm vỏ, 3 Trụ bì, 4 Bó libe – gỗ, 5 Libe, 6 Gỗ, 7 Mô mềm ruột 3.1.3 Đặc điểm bột

3.1.3.1 Đặc điểm bột lá

Bột màu xanh đậm, không mùi, không vị Quan sát dưới kính hiển vi thấy: có nhiều mảnh mạch xoắn (1), bó sợi (2) và tinh thể calci oxalat hình kim (3) nằm rải rác hay tụ thành đám Lỗ khí hình hạt đậu (4), nằm riêng lẻ hoặc nằm trong mảnh biểu bì Mảnh