Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây ụp đất (kaempferia sp ), họ gừng (zingiberaceae)

Thái Lan được biết đến là vùng đa dạng sinh học nhất của chi này với khoảng 16 loài và cũng là nước có nhiều nghiên cứu về các loài thuộc chi Kaempferia [11].. Qua tra cứu các tài liệu t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô, gia đình và bạn bè Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới TS Nguyễn Hoàng Tuấn người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Tối xin cảm ơn thầy Ths Nghiêm Đức Trọng đã giúp đỡ tôi giám định tên khoa học và chỉ bảo tôi tận tình về phần đặc điểm thực vật

Tôi xin cảm ơn thầy DS Nguyễn Thanh Tùng cùng toàn thể các thấy cô, các anh chị kỹ thuật viên ở bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi để có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể bạn bè làm khóa luận cùng bộ môn dược liệu đã giúp đỡ và động viên tôi trong những ngày làm khóa luận

Và cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến gia đình đã ủng

hộ, luôn bên tôi, cổ vũ tôi trong suốt 5 năm học đại học và quãng thời gian thực hiện khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Hoa

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ………

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN………

1.1 Tổng quan về họ gừng (Zingiberaceae)………

1.1.1 Vị trí phân loại………

1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng………

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng………

1.2 Tổng quan về chi Kaempferia L………

1.2.1 Lịch sử chi Kaempferia L …………

1.2.2 Nghiên cứu về thực vật chi Kaempferia L ……….………….……

1.2.3 Thành phần hóa học của chi Kaempferia L …….………

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ……… ………

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu……….………

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu……… ………

2.2 Phương pháp nghiên cứu………

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan……… …

2.2.2 Phương pháp giám định tên khoa học ………

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi ……… …

2.2.4 Phương pháp hóa học………

2.2.5 Phương pháp sắc ký lớp mỏng………

2.2.6 Phương pháp xác định hàm ẩm………

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu trong dược liệu………

1

3

3

3

3

3

6

6

7

17

18

18

18

18

19

19

19

19

19

25

26

27

3.1.1 Đặc điểm thực vật………

3.1.2 So sánh đặc điểm của mẫu nghiên cứu với một số loài có hình thái gần nhất………

3.2 Nghiên cứu về vi học vi phẫu dược liệu………

3.2.1 Đặc điểm vi phẫu lá……….……… ……

3.2.2 Đặc điểm vi phẫu rễ……… …

3.3 Nghiên cứu vi học bột dược liệu ………

3.3.1 Bột lá………

3.3.2 Bột thân rễ………

3.4 Định tính bằng phản ứng hóa học………

3.5 Xác định hàm lượng tinh dầu trong thân rễ dược liệu………

3.6 Sắc ký dịch chiết thân rễ………

3.7 Sắc ký lớp mỏng tinh dầu thân rễ dược liệu………

3.8 Sắc ký khí kết hợp khối phổ tinh dầu ………… ………

3.9 Bàn luận……… ………

3.9.1 Về thực vật………

3.9.2 Về hóa học………

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………

4.1 Kết luận………

4.2 Kiến nghị……… ……… TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

29

31

35

35

35

36

36

37

38

40

41

42

44

45

45

46

48

48

48

Trang Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp

theo hệ thống J Kress & al (2002)

Hình 3.1 Ảnh chụp cây và một số bộ phận của cây Ụp đất 29

Hình 3.6 Sắc ký đồ dịch chiết ethyl acetat thân rễ Ụp đất

Hệ dung môi khai triển: Toluen – EtOAc – Acid formic (5:4:1)

39

Hình 3.7 Sắc ký đồ tinh dầu thân rễ Ụp đất

Hệ dung môi khai triển : n- hexan : EtOAc (8:2)

41

ĐẶT VẤN ĐỀ Chi Địa liền là một chi có số lượng loài trung bình trong họ Gừng với khoảng

60 loài trên thế giới, phần lớn phân bố từ Ấn Độ tới Đông Nam Á Thái Lan được biết đến là vùng đa dạng sinh học nhất của chi này với khoảng 16 loài và cũng là

nước có nhiều nghiên cứu về các loài thuộc chi Kaempferia [11] Ở Việt Nam, số

lượng các loài thuộc chi này tính đến nay có 7 loài, trong đó có loài được sử dụng

làm thuốc và trồng rộng rãi như Địa liền (K galanga) [1] Nghiên cứu cho thấy một

số hợp chất trong một số loài Kaempferia như flavon (5-hydroxy- 7- methoxyflavon

và 5,7- dimethoxyflavon) ở loài K parviflora có tác dụng ức chế enzym protease của virut, flavonoid từ K galanga có tác dụng kháng khuẩn chống lại

Mycobacterium tuberculosis và Candida albicans [11], hợp chất chiết từ thân rễ Địa

liền (K galanga) bằng ethanol có tác dụng gây độc với dòng Hela gây bệnh ung thư

tử cung [8] Nhân dân ta nhiều nơi từ lâu đã có thói quen dùng Địa liền làm thuốc

kích thích tiêu hóa, giúp ăn ngon.Thân rễ Địa liền được giã nhỏ đem ngâm rượu làm thuốc xoa bóp chữa đau đầu, đau xương [8] Với tiềm năng như vậy thì việc nghiên

cứu về các loài thuộc chi này là vô cùng cần thiết

Trong chuyến điều tra thực địa tại Đắk Lắk, chúng tôi đã phát hiện một loài

thuộc chi Kaempferia (tên địa phương là Ụp đất) Qua tra cứu các tài liệu trên thế

giới [12], [13] và ở Việt Nam [1], [7] tôi nhận thấy loài này mang những đặc điểm khác hoàn toàn với các loài đã được mô tả trước đó ở Việt Nam và trong khu vực.Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây

Ụp đất (Kaempferia sp.), họ Gừng (Zingiberaceae)” được thực hiện với mục tiêu nhằm cung cấp thông tin cơ sở về loài này, góp phần xây dựng hệ dữ liệu của chi

Kaempferia, ứng dụng trong nghiên cứu phát triển và kiểm nghiệm thuốc từ dược

liệu

Để thực hiện được mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

 Xác định đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học, đặc điểm vi phẫu lá và thân rễ, đặc điểm bột lá và thân rễ của mẫu nghiên cứu

 Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ có trong thân rễ mẫu nghiên cứu thông qua phản ứng hóa học và SKLM

 Xác định hàm lượng tinh dầu trong mẫu khô tuyệt đối của dược liệu nghiên cứu

 Xác định thành phần cấu tử trong tinh dầu cất được bằng sắc ký khí kết hợp khối phổ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ gừng Zingiberaceae

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo Thực vật chí Đông Dương [18] và hệ thống phân loại của Takhtajan [17] vị trí của họ Gừng (Zingiberaceae) trong giới thực vật như sau:

Giới (Kingdom) Thực vật (Planta)

Ngành (Division) Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class) Hành (Liliopsida)

Phân lớp (Subclass) Loa kèn (Liliidae)

Bộ (Order) Gừng (Zingiberales)

Họ (Family) Gừng (Zingiberaceae) 1.1.2 Đặc điểm thực vật họ Gừng

Cây cỏ, sống lâu năm Thân rễ khỏe, có khi phồng lên như củ Thân khí sinh không có hoặc mọc lên rất cao, do các bẹ lá ôm nhau tạo thành Lá đơn, nguyên, xếp thành 2 dãy song song Bẹ lá kéo dài tạo thành lưỡi nhỏ Phiến lá có gân song song Cụm hoa dạng bông, chùm, mọc ở gốc (từ thân rễ) hay trên ngọn (trên thân khí sinh) Hoa có màu, lớn, dễ nhàu nát, đối xứng 2 bên, lưỡng tính Đài 3, dính nhau tạo thành ống, trên chia 3 thùy, thùy giữa lớn hơn 2 thùy bên [18] Nhị 1, bao phấn 2 ô, chỉ nhị nạc, hình lòng máng 3 nhị thoái hóa dính nhau tạo thành cánh môi lớn, màu sắc sặc sỡ, 2 nhị còn lại tiêu giảm ở mức độ khác nhau, có khi lớn hơn cánh hoa, hay thành dạng rìu ở 2 bên gốc chỉ nhị hữu thụ, có khi tiêu giảm hoàn toàn Bộ nhụy 2 lá noãn, dính nhau tạo thành bầu dưới, 3 ô, đính noãn trung trụ, mỗi

ô nhiều noãn, có khi chỉ còn 1 ô Vòi nhụy thò ra ngoài, 2 vòi còn lại không sinh sản, tiêu giảm ở gốc vòi hữu thụ Quả nang, ít khi là quả mọng Hạt có nội nhũ và ngoại nhũ [4] Có các tế bào tiết tinh dầu nằm rải rác ở mô mềm Do đó các bộ phận của cây đều có mùi đặc biệt [4]

1.1.3 Phân loại thực vật họ Gừng

Tại hội nghị chuyên đề lần III về Zingiberaceae tổ chức tại Thái Lan từ ngày

7-12 tháng 7 năm 2002, Dr W John Kress đã đề nghị một cách phân loại họ Gừng

mới, dựa trên phương pháp hình thái và phương pháp sinh học phân tử Tính đến nay, đây được coi là hệ thống phân loại đầy đủ nhất Theo hệ thống phân loại này thì họ Gừng được xếp thành 4 phân họ là: Siphonochiloideae, Tamijoideae, Alpinioideae và Zingiberoideae với 53 chi và 6 tông [1]

Ở Việt Nam, các chi trong họ Gừng được sắp xếp trong 2 phân họ và 3 tông như bảng sau [1]:

Bảng 1.1 Hệ thống phân loại thực vật họ Gừng ở Việt Nam sắp xếp theo hệ

thống J Kress & al (2002)

Phân họ 1 Alpinioideae Phân họ 2 Zingiberoideae

Tông 1 Alpinieae Tông 2 Zingibereae Tông 3 Gobbeae

Cụ thể khóa định loại các chi họ Gừng ở Việt Nam như sau:

1A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi, hiếm khi là dạng trứng hẹp (Phân họ.1 Alpinioideae) (Tông.1 Alpinieae)

2A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

3A Nhị lép bên tiêu giảm hay dạng răng, dạng dùi; quả hình cầu, bầu dục, hiếm

khi là hình thoi……….……… ……1 Alpinia

3B Nhị lép bên hình trứng ngược hẹp; quả dạng quả

cải……… ……… ………… …… 2 Siliquamomum

2B Cụm hoa mọc từ thân rễ, riêng với thân có lá

4A Hoa nhiều, xếp sít nhau trên trục cụm hoa; các lá bắc xếp lợp lên nhau

5A Lá bắc con hình trứng, mở đến gốc …….……… ………….3 Hornstedtia

5B Lá bắc con hình ống, không mở

6A Các hoa xếp theo vòng tròn đồng tâm……… ….……4 Etlingera

6B Các hoa xếp dọc theo trục cụm hoa; cánh môi hình tròn, trứng hay hình

bầu dục……… 5 Amomum

4B Hoa ít, xếp thưa trên trục cụm hoa; các lá bắc không xếp lợp lên nhau

7A Lá bắc con hình ống; phần trên đài xẻ một bên ………… 6 Geostachys

7B Lá bắc con mở đến gốc; phần trên đài xẻ thành 2-3 răng ngắn

8A Trục cụm hoa mảnh, dài, cong xuống; lá bắc bao 1 cụm nhò có 3-4

10A Nhị lép bên dạng cánh tràng dính với cánh môi; vòi nhụy được bao bởi

phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài……… ………9 Zingiber

10B Nhị lép bên dạng cánh tràng không dính với cánh môi; vòi nhụy không được bao bởi phần phụ trung đới của bao phấn kéo dài

11A Cụm hoa được bao bởi lá bắc hình chuông……….…10 Stahlianthus

11B Cụm hoa không được bao bởi lá bắc hình chuông

12A Các lá bắc dính với nhau ở nửa dưới làm thành dạng

túi……… … … …… 11 Curcuma

12B Các lá bắc không dính nhau ở nửa dưới và không thành dạng túi

13A Cụm hoa trên ngọn thân có lá

14A Lá bắc con hình ống……… ….…… …12 Hedychium

14B Lá bắc con không hình ống, mở đến gốc hay tiêu giảm

15A Lá bắc hình mũi mác hẹp, bao một cụm nhỏ có 1-4 hoa; gốc 2 thùy

tràng bên không dính với cánh môi……… ……… 13 Caulokaempferia

15B Lá bắc dạng thuyền chỉ bao 1 hoa; gốc 2 thùy tràng dính với cánh

9B Bầu 1 ô, noãn đính vách (Tông.3.Globbeae)

18A Cánh môi khía mép hay chia thùy, không có thùy giữa; cụm hoa trên ngọn

thân có lá……… ……….……….…….18 Globba

18B Cánh môi chia 3 thùy, thùy giữa nhỏ như chỉ, 2 thùy bên dạng cánh hoa,

cụm hoa mọc từ gốc thân……… ………19 Gagnepainia 1.2 Tổng quan về chi Kaempferia L

1.2.1 Lịch sử chi Kaempferia L

Chi Kaempferia L được thiết lập đầu tiên vào năm 1753 với 2 loài: K galanga

L và K rotunda L Hai loài này được mô tả bởi nhà sinh học người Đức, Engelbert Kaempfer (1651-1716) và được chọn làm đại diện cho chi Kaempferia L

Baker (1890) đã liệt kê 4 phân chi với tổng số 22 loài của chi Kaempferia L ở

Ấn Độ: Sincorus Horan (12 loài), Protanthium Horan (2 loài), Onolophus Wall (7 loài), và Stachyantheis Benth (1 loài) Tuy nhiên, một số đơn vị phân loại này hiện

đã được chuyển sang chi khác, như Boesenbeigia Kuntze, Camptandra Ridl.,

Caulokaempferia K.Larsen, và Stahlianthus Kuntze Mãi về sau, Kam (1980) đã

nghiên cứu và chỉ ra rằng phân chi Sincorus (Horan) Baker có cùng kiểu gen và do

đó nó trở thành phân chi của chi Kaempferia Bà đã dự kiến chia các loài ở châu Á thành 3 nhóm: nhóm K.galanga, nhóm K.rotunda, và nhóm Stachyanthis Benth với duy nhất 1 loài, K scaposa (Dalz.) Benth

Gagnepain (1908) đã liệt kê được 13 loài ở Đông Dương Mặc dù phần lớn các loài này hiện đã được chấp nhận, duy chỉ có 3 loài được xếp lại dưới chi khác – chi

Boesenbergia Kuntze Vào năm 1924, Ridley đã báo cáo 5 loài trong đợt nghiên

cứu ở Malay Penninsula Holttum (1950) đã chấp nhận 4 loài của Ridley, nhưng đã

chuyển K cyanescens Ridl thành Haniffia cyanescens (Ridl.) Holtt [13]

1.2.2 Nghiên cứu về thực vật chi Kaempferia L

1.2.2.1 Đặc tính chi Kaempferia L

Schumann (1903) đã xem xét bầu 3 ô có đính noãn trung trụ là đặc điểm mấu

chốt của chi Kaempferia L Tuy nhiên, đặc tính này cũng có ở các chi khác và

dường như đa dạng giữa các chi Do đó, sự kết hợp của các đặc điểm chẩn đoán, hình thái thực vật và hoa, là thiết yếu để xác định loài

Đặc điểm thực vật của chi này ở Đông Nam Á thường liên quan tới thân rễ nạc, thường ngắn, rễ dạng chùm Lá ít, dạng mảnh tới gần tròn, phát triển từ thân rễ, cuống lá ngắn đến dài, nhỏ, không rõ hoặc không có bẹ lá Lá ít và phiến lá hình

trứng lan rộng hoặc bám vào mặt đất là đặc tính của một số loài như K galanga L.,

K laotica Gagnep., K.marginata Carey Phiến lá hẹp, mảnh có duy nhất ở một

nhóm, là K.fissa Gagnep., K.fallax Gagnep và K filifolia K.Larsen Tuy nhiên, từ

các nghiên cứu chuyên sâu trên các mẫu tiêu bản có sẵn và khảo sát trên các mẫu vật sống, thì những đặc tính này có thể khác nhau rất nhiều trong cùng một loài

Sự kết hợp giải phẫu hoa toàn thể là đặc tính của các loài Kaempferia châu Á

Cánh môi được tách rời khỏi nhị lép bên, và thường có 2 thùy, ngoại trừ K

parviflora Wall Ex Baker Nhị lép bên thường có hình cánh hoa và đầu bao phấn

luôn dễ thấy và có thể nguyên khối hoặc có răng cưa, thẳng hoặc uốn cong, hẹp hoặc tròn Thêm vào đó, đầu nhụy luôn có hình phễu với các lông mi ở rìa và có cặp tuyến mật hình kim

Tuy nhiên, đặc tính giải phẫu rất đa dạng, thậm chí là trong cùng một loài Do đó, cho đến khi sự xếp loại các đặc tính đa dạng của chi được hiểu cặn kẽ, thì một đặc tính đơn lẻ không thể dùng cho việc quyết định phân loại [13]

1.2.2.2 Mối quan hệ

Theo Holttum (1971), chi Kaempferia L có hình thái liên quan gần với chi

Boesenbergia O.Kuntze và Scaphochlamys Baker Cả 2 chi Kaempferia và Boesenbergia đều có 1 hoa ở kẽ của mỗi lá bắc, có 1 hoặc 2 lá bắc con Ngược với

chi Kaempferia các lá bắc không xếp so le và cánh môi có 2 thùy thì ở chi

Boesenbergia các lá bắc mọc đối, cánh môi có hình túi, mép nguyên hoặc có hình

răng cưa, và thường có màu hơi đỏ ở đỉnh Những đặc tính này đủ dể phân biệt 2 chi

Thân rễ của chi Kaempferia ngắn nạc, trong khi đó thân rễ của chi

Scaphochlamys ít nạc, thường dài hơn Cụm hoa của chi Kaempferia bao gồm 1 hoa

và 1 lá bắc Hoa có kèm theo nhiều hoặc ít lá bắc có thùy xẻ sâu hoặc 2 lá bắc con

Cánh môi có 2 thùy xẻ sâu (trừ K parviflora Wall ex Baker), đỉnh bao phấn

thường rộng và có hình cánh hoa, chỉ nhị thường rất ngắn Trong khi đó, cụm hoa

của chi Scaphochlamys có nhiều hoa kèm mỗi lá bắc; cánh môi không bao giờ xẻ 2

thùy sâu và chỉ nhị rất dễ thấy

Chi Kaempferia L còn có liên hệ với chi Cornukaempferia J.Mood & K.Larsen

ở cách mọc Tuy nhiên, chi Kaempferia luôn phát triển rộng, bằng và có bao phấn hình cánh hoa Chi Kaempferia còn được phân biệt bởi các lá bắc con có 2 thùy, trong khi chi Cornukaempferia không có lá bắc con [13]

1.2.2.3 Đặc điểm thực vật và phân bố chi Kaempferia L ở Việt Nam

 Đặc điểm thực vật:

Cây thân thảo nhỏ, đầu rễ thường phình lên thành dạng củ Thân giả rất ngắn hoặc không có Lá ít, phiến lá gần tròn đến dạng chỉ; cuống lá ngắn; lưỡi thường nhỏ hay không có Cụm hoa mọc giữa các bẹ lá hay từ thân rễ, hoa xuất hiện trước hay sau khi có lá Các lá bắc xếp xoắn, mỗi lá bắc chứa một hoa, lá bắc con nhỏ, đầu xẻ thành hai thùy, đôi khi xẻ sâu đến gốc Hoa có đài dạng ống ở phần dưới, phần trên xẻ vát xuống một bên, đầu chia 2-3 thùy Tràng có phần dưới dạng ống, dài bằng hay hơn đài; phần trên xẻ thành 3 thùy Cánh môi màu trắng hay hồng, đôi khi có đốm và màu sắc khác ở gần gốc cánh môi, đầu xẻ nông hay sâu thành 2 thùy Nhị có chỉ nhị dạng bản rất ngắn hay không có; bao phấn 2 ô; phần phụ trung đới

kéo dài thành mào Nhị lép bên dạng cánh tràng Bầu 3 ô, noãn nhiều Quả nang hình cầu hay bầu dục dài Hạt gần tròn hay bầu dục dài, áo hạt xẻ không đều [1]

 Phân bố ở vùng nhiệt đới châu Phi, Ấn Độ và châu Á, sống nơi đất mùn ẩm, ven

nương rẫy, dưới tán rừng [1]

1.2.2.4 Phân loại chi Kaempferia L ở Việt Nam

Tính đến 2011 ở Việt Nam có 7 loài thuộc chi Kaempferia [1]

Khóa định loại các loài Kaempferia ở Việt Nam [1]:

1A Cụm hoa mọc từ thân rễ, xuất hiện trước lá

2A Lá bắc hình trứng hay bầu dục; trung đới kéo dài lên trên thành mào, chia thành 2 thùy rõ

3A Cánh môi màu trắng, gốc màu vàng; mặt dưới phiến lá không có màu nâu

đỏ, không lông……… … 1 K candida

3B Cánh môi màu tím hồng nhạt, mặt dưới phiến lá màu nâu đỏ, có

1B Cụm hoa mọc từ giữa các lá, xuất hiện sau lá

5A Cụm hoa có cuống dài 3-4 cm hay hơn; nhị lép màu tím … 5 K elegans

5B Cụm hoa không có cuống, nhị lép màu trắng

6A Phiến lá dạng trái xoan hay bầu dục, cỡ 14-20 x 3-5(-7-8) cm; cánh môi

màu tím, giữa có nhiều đốm nhỏ màu hồng……… … 6 K angustifolia

6B Phiến lá gần tròn, cỡ 8-10(-15) x 6-7 (-10) cm; cánh môi màu trắng, phía

gốc có đốm rộng màu tím……… …… … 7 K galanga 1.2.2.5 Đặc điểm các loài thuộc chi Kaemfperia L đã được phát hiện ở Việt

Nam

Đặc điểm của các loài thuộc chi Kaempferia L ở Việt Nam được thể hiện ở bảng

sau [1], [7]:

Bảng 1.2 Đặc điểm các loài thuộc chi Kaempferia ở Việt Nam

Đặc điểm Kaempferia

candida Wall [1]

Kaempferia rotunda L [1]

Kaempferia fallax

Gagnep [1]

Kaempferia fissa

Gagnep [1]

Kaempferia elegans

(Wall) Baker [1]

Kaempferia angustifolia

Rosc [1]

Kaempferia galanga L

Lá dạng dải, dài 12-14 cm

lá dạng dài, dải 6-7 cm

Phiến lá cỡ 20(-25) x 6-9(-15) cm; cuống lá dài 1,2-1,5 cm;

10-lưỡi lá nhỏ

Phiến lá dạng trái xoan, cỡ 14-20 x 3-5(-7-8) cm, nhẵn

cả 2 mặt, cuống lá dài

Phiến lá gần tròn, cỡ 8-10(-15) x 6-7(-10) cm; cuống lá và

bẹ lá dài 1-3

ở giữa có dải màu xanh sẫm hình tháp;

cuống lá dài 1,2-1,5 cm; bẹ

Cụm hoa mọc

từ thân rễ, xuất hiện trước lá

Lá bắc hình trứng, cỡ 2,2-2,4 cm; lá bắc con dài 1,1-1,3

cm, phần trên

xẻ thành 2 thùy nhỏ

Cụm hoa mọc từ thân

rễ, xuất hiện trước lá

Lá bắc dạng dải

Cụm hoa không cuống, mọc

từ thân rễ, xuất hiện trước lá

Các lá bắc dạng đài, dài 2,5-3 cm;

các lá bắc con ngắn hơn

Cụm hoa ở giữa các bẹ lá, xuất hiện sau lá, cỡ 3-

4 x 0,6-0,7 cm;

cuống mảnh dài 3-4 cm, đôi khi dài 6-9 cm Lá bắc ngoài cùng dài 2,5-3,5 cm;

lá bắc trong ngắn hơn; lá bắc con dài đến 1 cm

Cụm hoa rất nhỏ, mọc giữa các lá, không cuống, xuất hiện sau lá

Các lá bắc bắc cỡ 2,5-3 x 0,7-0,9; lá bắc con cỡ 9-12 x 0,2-0,3 mm

Cụm hoa không cuống, mọc giữa các

lá, xuất hiện sau lá

Các lá bắc cỡ 2,5-4,5 x 0,8-1cm, ngắn và nhỏ dần từ ngoài vào; lá bắc con dài 3-

3,5 cm

Hoa Số lượng 6-10,

màu trắng Ống đài dài đến 2,5 cm Phần dưới tràng dạng ống;

các thùy dài đến 2,5 cm

Ống đài dài 5,5 cm, phía giữa phình to

5-ra, đầu xẻ vát một bên Ống tràng dài 6-6,5 cm; các thùy

cỡ 5-6 cm x

2-3 mm, màu trắng

Các hoa dài 12-14 cm

Đài dạng ống, dài 6-7

cm Ống tràng dài 10-

12 cm; các thùy dạng dải, dài 2,8-3

cm

Hoa 1-3

Ống đài mỏng, dài 3-

4 cm Ống tràng rất mảnh, dài 6-

7 cm; các thùy cỡ 2-2,2 cm x 2,5-3 mm

Ống đài dài 3,5 cm Ống tràng dài 3,5-5 cm; các thùy cỡ 1,2-1,5 cm x 3

2,5-mm

Hoa màu trắng Ống đài dài 4-5 cm

Ống tràng dài 6-8 cm, các thùy cỡ 3-3,5

x 0,2-0,3 cm

Đài dài 3-3,5

cm Ống tràng dài 4-5 cm; các thùy dài 2,2-2,5 cm, màu trắng

Cánh môi Cánh môi cỡ

3,5-4 x 3-3,5 cm, màu trắng, có vết màu vàng ở phía gốc, đầu cánh môi thành 2 thùy

Cánh môi dài 3-5 cm, màu tím-hồng nhạt,

xẻ thành 2 thùy hình bầu dục

Đầu cánh môi xẻ sâu xuống 2/3 chiều dài thành 2 thùy hình trái xoan, to rộng

Cánh môi xẻ đến gốc chia thành 2 thùy bằng nhau, giống như nhị lép, dài 1,8- 2,2 cm

Cánh môi màu tím trừ phần gốc màu trắng và vàng, xẻ đến gốc thành 2 thùy, gần tròn, đường kính mỗi thùy

Cánh môi hình trứng ngược, cỡ 2,5-3 x 2-2,5

cm, màu tím, giữa có nhiều đốm nhỏ màu

Cánh môi cỡ 2,1-2,3 x 2,3-2,5 cm, xẻ sâu xuống thành 2 thùy, nguyên, màu trắng, phía gốc có

hơn nhị lép, rộng 1,6-1,8

cm

đến 2 cm hồng, xẻ 2 sâu

xuống thành 2 thùy

đốm rộng màu tím

ngược rộng, gốc dạng móng ngắn

Nhị lép hình trứng

ngược-nêm

Nhị lép bên dài 1,6-19(-2,5) cm, màu tím

Nhị lép bên

cỡ 2-2,2 x 1,2-1,4 cm, màu trắng Bao phấn Dài bằng chỉ nhị;

mào 2 thùy

Chỉ nhị dài 1-2 mm; bao phấn dài 5-6 mm;

mào xẻ thành

2 thùy, dài hơn bao phấn

mào bao phấn cao đến

3 mm, hình vuông, đầu lượn sóng

Chỉ nhị dạng dải;

mào bao phấn hình vuông, hơi rách mép

Mào bao phấn dạng thìa, dài 6-

7 mm, nguyên,

Chỉ nhị dài đến 3 mm;

màu trắng

Bao phấn màu trắng; mào xẻ thành 2 thùy nhọn

núm nhụy có lông mi

Bầu nhẵn; núm nhụy khía tai bèo

Bầu nhẵn Bầu hình trụ,

cỡ 5 x 2 mm

Chưa có thông tin

Thường sống ven rừng nơi sáng trên các bãi cỏ hay ở các khu rừng núi thấp trong khu rừng rụng

lá hỗn hợp ở

độ cao đến

1000 m

Cây sống nơi đất mùn ẩm, dưới tán rừng hay trên những dải cát ẩm ven sông

Cây sống nơi đất mùn

ẩm, dưới tán rừng

Mùa hoa tháng

7 Sống nơi đất

ẩm, dọc suối hay trong rừng rụng

lá hỗn hợp, rừng thường xanh hay rừng tre nứa, độ cao đến 1000 m

Mùa hoa tháng 5-7

Thường sống nơi đất mùn

ẩm, ven nương rẫy, dưới tán rừng,

ở độ cao tới

1200 m

Mùa hoa tháng 5-8 Sống nơi đất mùn ẩm, ven nương rẫy, các bãi cỏ hay được trồng trong vườn ở

độ cao đến

1200 m

Phân bố Thành phố Hồ

Chí Minh, Ấn

Độ, Mianma, Trung Quốc, Campuchia

Hà Nội (Từ Liêm), Hòa Bình, Kon Tum (Đăk Lăk), thành phố Hồ Chí Minh, ngoài

ra còn có ở

Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Malaixia, Inđônesia

Trung và Nam Bộ, ngoài ra còn có ở Thái Lan, Lào

Miền Nam Việt Nam, ngoài ra còn có ở Lào

Bình Phước, Bình Dương, Thành phố Hồ Chí Minh, An Giang (Châu Đốc), ngoài ra trên thế giới còn có ở Ấn

Độ, Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaixia, Inđonêxia, Borneo

Gia Lai (Kon Ch’ro), Đắk Lắk, Khánh Hòa (Nha Trang), Thành phố

Hồ Chí Minh (Thủ Đức)

Còn có Ấn

Độ, Thái Lan, Bănglađet, Lào, Campuchia, Malaixia, Inđônêxia

Mọc hoang dại và được trồng nhiều nơi ở Việt Nam, ngoài

ra còn có ở

Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaixia, Phillipin, Inđônexia, Ôxtrâylia

1.2.3 Thành phần hóa học của chi Kaempferia L

Hiện nay chưa có nghiên cứu nào nghiên cứu một cách tổng quát về thành phần

hóa học của các loài thuộc chi Kaempferia L., các thông tin về thành phần hóa học

chủ yếu dựa trên các nghiên cứu về loài đơn lẻ Thành phần hóa học chính của các

loài thuộc chi Kaempferia bao gồm:

 Tinh dầu là thành phần điển hình của các loài thuộc chi này Nghiên cứu về ở một số loài thuộc chi này cho thấy có sự khác nhau về số lượng, hàm lượng các

thành phần trong tinh dầu giữa các loài Tinh dầu từ thân rễ K galanga khá cao (có

thể thay đổi trong khoảng từ 2,4 đến 3,9%), còn ở các loài khác thì tương đối thấp

(trong thân rễ của loài Cẩm địa – K rotunda chỉ có khoảng 0,2-0,3 %) [8]

Thành phần chính trong tinh dầu ở các loài Kaempferia cũng thay đổi theo loài

Ở K angustifolia, chủ yếu là n-pentadecane, camphene, camphor và bornyl format [10] Ở K rotunda tinh dầu chủ yếu chứa benzyl benzoat, n-pentadecane và camphene [15] Ở K galanga, thành phần chủ yếu là acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và p-methoxy ethylcinamat, trong đó hợp chất ethyl cinamat chiếm tới 30

%, ngoài ra còn có n-pentadecan, A3-caren, camphen, O-methoxy ethylcinamat, borneol, aldehyd cinamic [8]

 Các flavonoid như: 9 chất flavonoid đã được phân lập từ loài K parviflora

trong đó có 5,7,4’-trimethoxyflavon; 5,7,3’,4’-tetramethoxyflavon và

3,5,7,4'-tetramethoxyflavon ở [11], ở loài K.galanga có kaempferol và kaempferid [8]

 Các flavon: 5-hydroxy-7-methoxyflavon và 5,7-dimethoxyflavon ở loài K

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là phần trên mặt đất (lá) và phần dưới mặt đất (thân rễ), hoa được thu hái vào tháng 9/2015 tại khu bảo tồn thiên nhiên Ea Sô, Đắk Lắk Sau khi thu hái, lá và thân rễ được sấy khô ở 60oC và bảo quản trong túi nilon

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

 Dung môi, hóa chất dùng trong nghiên cứu đặc điểm thực vật: cloramin B, nước Javen, cloralhydrat 75%, đỏ son phèn, xanh methylen, glycerin, nước cất

 Dung môi, hóa chất dùng trong định tính sơ bộ thành phần hóa học và sắc ký lớp mỏng

 Hóa chất: các thuốc thử định tính (FeCl3 5%, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Bouchardat, acid picric…)

 Dung môi: toluen, chloroform, methanol, ethyl acetat, acid formic, n-hexan,…

 Bản mỏng Silicagel 60 - F254 của Merk

 Thuốc thử vanilin/cồn/H2SO4 đặc

Tất cả các hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn DĐVN IV

2.1.2.2 Dụng cụ, thiết bị, máy móc

 Dụng cụ thủy tinh (cốc có mỏ, phễu, bình gạn, pipet, ống nghiệm…) và các dụng

cụ khác trong phòng thí nghiệm (cối sứ, khay tráng men…)

 Dao lam, máy xay

 Tủ sấy, bếp điện

 Cân kỹ thuật

 Bộ dụng cụ cất tinh dầu theo dược điển Mỹ

 Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm theo DĐVN IV

 Máy sắc ký khí kết hợp khối phổ Agilent Technologies

 Kính hiển vi LABOMED, máy ảnh kĩ thuật số SONY Cybershot

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu cảm quan

Đặt mẫu cây ở nơi có đủ ánh sáng tự nhiên, tốt nhất là ánh sáng mặt trời Quan sát và mô tả cây về các đặc điểm thực vật, hình dáng, kích thước, màu sắc, mùi bằng mắt thường và chụp ảnh

2.2.2 Phương pháp giám định tên khoa học

Giám định tên khoa học của cây trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái, đặc điểm của bộ phận sinh sản, so sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản lưu trữ tại một số phòng tiêu bản mẫu khô, đối chiếu với khóa phân loại thực vật trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật [7], [18] cùng với sự hỗ trợ của các chuyên gia phân loại thực vật để xác định tên khoa học của loài

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu hiển vi

- Đặc điểm vi phẫu: Mẫu dược liệu (thân rễ, lá) được cắt, nhuộm, lên tiêu bản theo các bước như trong tài liệu [9]

- Soi bột: lá và thân rễ của dược liệu được nghiền nhỏ thành bột bằng thuyền tán, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản và quan sát, mô tả đặc điểm của bột và chụp ảnh [9] 2.2.4 Phương pháp hóa học

Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng hóa học [2], [3]

2.2.4.1 Định tính flavonoid

Tiến hành: Lấy 20 g dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm 40 ml ethanol 90

% Đun cách thủy sôi 5 phút Lọc nóng, dịch lọc thu được đem đun cách thủy ở nhiệt độ 80oC Gạn lấy phần dịch, bỏ phần tạp tách ra dưới đáy bình, cô cách thủy đến cắn Hòa tan cắn trong 5 ml ethanol 70%, được dịch chiết cồn, thực hiện các phản ứng định tính sau:

a Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm một ít bột magnesi kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3 – 5 giọt) Để yên một vài phút, phản ứng dương tính nếu dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ

b Phản ứng với kiềm

 Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng thấy màu vàng của vết đậm lên rõ rệt thì phản ứng dương tính

 Phản ứng với dd NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%, phản ứng dương tính khi thấy dịch chiết chuyển từ vàng sang vàng đậm

Tiến hành: Lấy khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 30ml

cồn 90° Đun cách thủy 5 phút, lọc nóng qua bông Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:

a Phản ứng mở đóng vòng lacton :

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết

 Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

 Ống 2 để nguyên

Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi Để nguội rồi quan sát

 Ống 1: không có màu vàng hoặc tủa đục màu vàng

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều, đun nóng trên nồi cách thủy trong vài phút, phản ứng dương tính khi dd có màu đỏ gạch

c Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc Nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ Che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một đồng xu rồi chiếu tia

tử ngoại trong một vài phút Bỏ đồng xu ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che

d Vi thăng hoa

Cho một ít bột dược liệu vào nắp chai bằng nhôm Đặt lên bếp điện có lưới amian, cho bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt trên miệng nắp nhôm một phiến kính trên đó có đặt ít bông thấm nước lạnh Đun nhẹ dưới nắp nhôm, sau 5 phút lấy lam kính ra, để nguội, soi dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim Nhỏ thêm 1 giọt

dd KI 10% lên phiến kính, soi dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim

2.2.4.3 Định tính saponin

Tiến hành: Quan sát hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm lớn 1g bột dược liệu, thêm 5ml nước Lắc mạnh trong 5 phút Để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì

sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

2.2.4.4 Định tính alcaloid

Tiến hành: Cân 15g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml Thêm 40

ml dung dịch acid sulfuric 1N Đun đến sôi Để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến

pH = 9 - 10 (thử bằng giấy quỳ) Chiết alcaloid base bằng chloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết chloroform, loại nước bằng natrisulfat khan, sau

đó dùng để làm phản ứng định tính

Lấy một phần dịch chiết chloroform đã được chuẩn bị ở trên, đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 - 3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

 Ống 1: thuốc thử Mayer, cho tủa màu từ trắng đến vàng – phản ứng dương tính

 Ống 2: thuốc thử Bouchardat, cho tủa nâu đến đỏ nâu – phản ứng dương tính

 Ống 3: thuốc thử Dragendorff, cho tủa vàng cam đến đỏ - phản ứng dương tính

2.2.4.5 Định tính tanin

Tiến hành: Lấy khoảng 10 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml,

thêm 30 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để định tính

a Ống 1: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% (TT) sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt – phản ứng dương tính

b Ống 2: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT) sẽ xuất hiện tủa bông – phản ứng dương tính

c Ống 3: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng – phản ứng dương tính

2.2.4.6 Định tính anthranoid

Tiến hành: Lấy khoảng 15 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml Thêm

30 ml nước cất Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 100 ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5 ml ether (hoặc chloroform) Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước Giữ lớp ether (hoặc chloroform) để làm phản ứng

a Phản ứng Borntraeger: Định tính anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do):

- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm 1ml dung dịch amoniac Lắc nhẹ Phản ứng dương tính nếu lớp nước có màu đỏ sim

- Lấy 1ml dịch chiết chloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10% Lắc nhẹ Phản ứng dương tính khi lớp nước có màu đỏ sim

b Vi thăng hoa:

Trải bột dược liệu thành lớp mỏng trong một nắp chai bằng nhôm, đốt nhẹ trên đèn cồn để loại nước Sau đó đậy lên nắp nhôm một miếng lam kính, bên trên có miếng bông đã thấm nước, tiếp tục đun nóng trong khoảng 5 – 10 phút Lấy lam kính ra để nguội, quan sát dưới kính hiển vi thấy tinh thể hình kim màu vàng Sau khi nhỏ dd NaOH lên lam kính, phản ứng dương tính khi dd có màu đỏ

2.2.4.7 Định tính glycosid tim

Tiến hành: Cho vào bình nón 250 ml khoảng 20 g dược liệu, đun cách thủy với

80 ml ethanol 50% trong 30 phút, lọc lấy dịch lọc Dịch chiết thu được đem loại tạp bằng chì acetat 30%, khuấy đều Thêm dd Na2SO4 15 % để loại chì dư Lọc bỏ tủa, đun cách thủy tới cắn Hòa tan cắn vào CHCl3, lọc lấy dịch và đem cô bay hơi thu được cắn Cắn đem làm các phản ứng sau:

a Phản ứng của khung steroid: Phản ứng Liebermann – Burchardat

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Ở mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuất hiện một vòng màu tím đỏ Phản ứng dương tính khi lớp chất lỏng ở phía dưới có màu hồng, lớp trên có màu xanh lá – phản ứng dương tính

b Phản ứng của vòng lacton 5 cạnh

 Phản ứng Baljet: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%) mới pha, phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện màu đỏ da cam

 Phản ứng Legal: Cho vào ống nghiệm có chứa cắn ở trên 0,5ml ethanol 90% Lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung